CN108136045B - 加利车霉素-抗体-药物缀合物和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明大体上涉及用离去基团来活化的加利车霉素分子。本发明还大体上涉及抗体‑药物缀合物，所述缀合物包含通过二硫键直接缀合至一个或多个加利车霉素分子的抗体。

Description

加利车霉素-抗体-药物缀合物和使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年10月20日提交的美国临时申请序列号62/243,967的优先权。

发明领域

本发明的领域大体上涉及包含与一种或多种加利车霉素分子直接缀合的抗体的抗体-药物缀合物。

背景

加利车霉素和加利车霉素衍生物是指抗细菌剂和抗肿瘤剂的家族，如例如在美国专利号4,970,198(其整体并入本文)中描述。本公开范围内的加利车霉素衍生物包括但不限于如美国专利号5,037,651中所述的二氢衍生物和美国专利号5,079,233中所述的N-酰化衍生物(两者均整体并入本文)。如本文所用，加利车霉素衍生物是指在一个或多个位置被取代以获得不同化合物的加利车霉素。

抗生素的加利车霉素家族及其衍生物和类似物能够在亚皮摩尔浓度下引起双链DNA断裂(Hinman等人,(1993)Cancer Research53:3336-3342；Angew Chem.Intl.Ed.Engl.(1994)33:183-186；Lode等人,(1998)Cancer Research 58:2925-2928)。加利车霉素包含含有烯二炔环结构(包含侧接有三键的双键的环)和甲基三硫醚(即-S-S-S-CH₃)基团的弹头。据信，弹头是通过还原二硫键而活化的，并且活化的弹头通过在双链DNA中引起断裂而起作用。Bouchard，H.等人，Ab-drug conjugates-A new wave of cancer drugs，Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 24(2014)5357-5363提出了作用机制，其中烯二炔环通过以下步骤的二硫键的还原裂解而得以活化：(i)通过甲基三硫醚部分的亲核攻击和CH₃-S-S-的裂解形成加利车霉素＝CHCH₂SH部分，(ii)由加利车霉素＝CHCH₂SH形成稠合的2,5-二氢噻吩环，和(iii)由烯二炔形成稠苯双自由基。活化的加利车霉素然后将双链DNA裂解。

加利车霉素具有细胞内作用位点，但在某些情况下不易于跨越质膜。因此，在一些实施方案中，这类药剂经由抗体介导的内化实现的细胞摄取可极大增强细胞毒性作用。已知加利车霉素-接头-抗体缀合物提供抗体的特异性和有效的质膜渗透性(内化)以及加利车霉素的细胞毒性效力。因此，在某些方面，加利车霉素的细胞摄取可能大大增强其细胞毒性作用。形成加利车霉素-接头-抗体药物缀合物的方法是已知的，并且例如在美国专利号5,877,296、5,773,001、5,712,374、5,714,586、5,739,116和5,767,285(其每一个通过引用并入本文)中进行了描述。

包含抗体-接头-药物缀合物的抗体-药物缀合物是有吸引力的靶向化疗分子，因为它们通过将有效的细胞毒性药物靶向表达抗原的肿瘤细胞，由此增强了它们的抗肿瘤活性，从而将抗体和细胞毒性药物的理想特性结合起来。针对给定靶抗原的成功的抗体-药物缀合物开发取决于抗体选择、接头稳定性、细胞毒性药物效力和与抗体的接头-药物缀合模式的优化。更特别地，有效的抗体-药物缀合物的特征在于以下至少一种或多种：(i)抗体-药物缀合物形成方法，其中所述抗体对靶抗原保留足够的特异性并且其中药物功效得以维持；(ii)抗体-药物缀合物稳定性足以限制血液中的药物释放以及伴随的对非靶向细胞的损害；(iii)足够的细胞膜转运效率(胞吞作用)以实现治疗性细胞内抗体-药物缀合物浓度；(iv)足以实现治疗药物浓度的来自抗体-药物缀合物的足够的细胞内药物释放；和(v)纳摩尔或亚纳摩尔量的药物细胞毒性。

常规连接手段，即通过接头将药物部分与抗体共价键结，通常产生分子的异质混合物，其中药物部分连接于抗体上多个位点。例如，细胞毒性药物一般通过抗体中通常大量的赖氨酸残基缀合于抗体，从而产生异质抗体-药物缀合物混合物。根据反应条件，异质混合物通常含有具有0至约8个或者更多的连接药物部分的抗体的分布。此外，在药物部分与单一抗体具有特定整数比率的缀合物的各亚群中，可能存在其中药物部分连接于抗体上的不同位点的异质混合物。分析和制备方法不足以将由缀合反应产生的异质混合物内的抗体-药物缀合物物质分子加以分离和表征。抗体是大型的、复杂的和结构多样的生物分子，通常具有许多反应性官能团。与接头试剂和药物-接头中间体的抗体反应性取决于诸如pH、浓度、盐浓度和共溶剂等因素。此外，由于难以控制反应条件和表征反应物和中间体，所以多步缀合过程可能不可重现。

通常通过将一个或多个抗体半胱氨酸硫醇基团缀合到与药物结合的一个或多个接头部分来形成抗体-药物缀合物，由此形成抗体-接头-药物复合物。半胱氨酸硫醇在中性pH值下具有反应性，这一点不同于在pH 7附近被质子化并且具有较低亲核性的大多数胺。因为游离硫醇基(RSH，巯基)具有相对反应性，所以具有半胱氨酸残基的蛋白质通常以其氧化形式作为二硫键连接的寡聚物存在或者具有内部桥接二硫键。抗体半胱氨酸硫醇基比抗体氨基或羟基对于亲电子性缀合试剂通常更具反应性，即更具亲核性。通过使蛋白质的各种氨基酸残基突变成半胱氨酸氨基酸来工程化半胱氨酸硫醇基可能存在问题，尤其是在未配对(游离Cys)残基或者相对易于发生反应或氧化的情况下。在蛋白质的浓缩溶液中，无论是在大肠杆菌的周质、培养上清液还是部分或完全纯化的蛋白质中，蛋白质表面上的未配对的Cys残基可以配对并氧化形成分子间二硫化物，并因此形成蛋白质二聚体或多聚体。二硫键二聚体的形成使得新Cys对于与药物、配体或其他标记的缀合不起反应。此外，如果蛋白质在新近工程工程化的Cys与现有Cys残基之间氧化形成分子内二硫键，那么这两个Cys基团都不可用于参与活性位点和相互作用。此外，由于错误折叠或失去三级结构，蛋白质可能变得无活性或非特异性(Zhang等人(2002)Anal.Biochem.311:1-9)。

已经开发了改进的抗体-药物缀合物THIOMAB^TM，其通过在某些位点处的半胱氨酸取代而提供药物与抗体的位点特异性缀合，在所述位点处，工程化半胱氨酸可用于缀合但不干扰免疫球蛋白折叠和装配或改变抗原结合和效应子功能(Junutula等人,2008bNature Biotech.,26(8):925-932；Dornan等人(2009)Blood 114(13):2721-2729；US7521541；US 7723485；WO2009/052249)。然后可以通过工程化半胱氨酸硫醇基团将这些THIOMAB^TM抗体缀合至细胞毒性药物以获得具有统一化学计量的THIOMAB^TM药物缀合物(TDC)(例如，在具有单个工程化半胱氨酸位点的抗体中多达2种药物/抗体)。针对不同抗原的多种抗体的研究已经表明，TDC在异种移植模型中与常规抗体-药物缀合物一样有效并且在相关临床前模型中在较高剂量下是可耐受的。THIOMAB^TM抗体已经被工程化用于在抗体的不同位置(例如，轻链-Fab、重链-Fab和重链-Fc内的特定氨基酸位置(即位点))处连接药物。THIOMAB^TM抗体的体外和体内稳定性、功效和PK特性与常规抗体-药物缀合物相比具有独特的优势，这是由于它们的均质性和与细胞毒性药物的位点特异性缀合。

制备和使用抗体-药物缀合物，特别是抗体-加利车霉素衍生物缀合物还存在其他限制或挑战。例如，一些接头可能在血流中不稳定，从而在靶细胞中内化之前释放不可接受量的药物。其他接头可以在血流中提供稳定性，但是细胞内释放有效性可能受到负面影响。提供所需细胞内释放的接头通常在血流中具有较差的稳定性。或者说，血流稳定性和细胞内释放通常是逆相关的。其次，在标准缀合过程中，负载到载体蛋白上的加利车霉素的量(载药量)，缀合反应中形成的聚集物的量以及可获得的最终纯化的缀合物的产量是相互关联的。例如，聚集物形成通常与缀合于载体-抗体的加利车霉素及其衍生物的当量数正相关。因为药物效力和功效随着加利车霉素含量而增加，所以期望最大化在抗体载体上的加利车霉素负载，同时保持抗体的亲和力。然而，在高载药量下，必须移动所形成的聚集物以便用于治疗应用。结果，载药量介导的聚集物形成降低了抗体-药物缀合物的产量，并且可能导致过程放大较困难。例如，已经发现使用接头的现有技术缀合方法由于限制添加到缀合反应中的加利车霉素的量而导致需要在较高的载药量和抗体-药物缀合物产量之间达成折衷。

因此，持续需要改进的提供优化的安全性和功效的有效加利车霉素-抗体缀合物。

附图简述

图1显示了在以0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、6mg/kg和10mg/kg剂量的Thio Hu抗-Ly6E LC K149C-p-硝基-PDS-加利车霉素来IV给药，并且在以3mg/kg的Thio Hu抗-CD22LCK149C-p-硝基-PDS-加利车霉素对照来IV给药后，在SCID Beige小鼠中的HCC1569X2异种移植模型中随时间的体内肿瘤体积变化的图

图2显示了在以0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、6mg/kg和10mg/kg剂量的Thio Hu抗-CD22 10F4v3LC K149C-p-硝基-PDS-加利车霉素来IV给药，并且在以3mg/kg的Thio Hu抗-Ly6E 9B12v12LC K149C-p-硝基-PDS-加利车霉素对照来IV给药后，CB-17Fox Chase SCID小鼠中WSU-DLCL2异种移植模型中体内肿瘤体积随时间变化的图

图3A显示了与非靶向对照Thio Hu抗-Ly6E 9B12.v12LC K149C-加利车霉素相比，靶向Thio Hu抗-CD22 10F4v3LC K149C-加利车霉素IC50相对于CD22阳性伯基特人淋巴瘤细胞(BJAB)的IC₅₀功效相比于对数浓度的图。靶向效力比非靶向效力大1500倍以上。

图3B显示了与非靶向对照Thio Hu抗-Ly6E 9B12.v12LC K149C-加利车霉素相比，靶向Thio Hu抗-Ly6E 10F4v3LC K149C-加利车霉素IC₅₀功效相对于CD22阳性WSU-DLCL2人弥漫大B细胞淋巴瘤来源的细胞系的IC₅₀功效相比于对数浓度的图。靶向效力比非靶向效力大2000倍以上。

图3C显示了Thio Hu抗-Ly6E 10F4v3LC K149C-加利车霉素相对于Jurkat细胞的IC₅₀功效相比于对数浓度和Thio Hu抗-Ly6E9B12.v12LC K149C-加利车霉素的IC₅₀功效相比于对数浓度的图。

概述

在本公开的一个方面，提供式I和式II的药物中间体：

在这些方面，R选自H、-C(O)R¹、-C(O)NR¹R²、-S(O)₂R¹和-S(O)2NR²R¹；R¹和R²独立地选自C₁-C₆烷基和C₆-C₂₀芳基；R³选自NO₂、Cl、F、CN、CO₂H和Br；并且q是0、1或2。

在本公开的另一方面，提供式III的抗体-药物缀合物或其药学上可接受的盐：

在这些方面，R选自H、-C(O)R¹、-C(O)NR¹R²、-S(O)₂R¹和-S(O)₂NR²R¹，并且R¹和R²独立地选自C₁-C₆烷基和C₆-C₂₀芳基。符号p为1至8的整数。Ab是结合选自如(1)-(53)中的一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体的抗体，如本文所列：(1)BMPR1B(骨形成蛋白受体IB型)；(2)E16(LAT1，SLC7A5)；(3)STEAP1(***的六跨膜上皮抗原)；(4)MUC16(0772P，CA125)；(5)MPF(MPF，MSLN，SMR，巨核细胞强化因子(megakaryocyte potentiatingfactor)，间皮素)；(6)Napi3b(NAPI-3B；NPTIIb；SLC34A2；溶质载体家族34(磷酸钠)，成员2，II型钠依赖性磷酸盐转运蛋白3b)；(7)Sema 5b(FLJ10372，KIAA1445，Mm.42015，SEMA5B，SEMAG，脑信号蛋白(Semaphorin)5b Hlog，sema结构域，七凝血栓蛋白重复序列(1型和1型样的)，跨膜结构域(TM)和短胞质结构域，(脑信号蛋白)5B)；(8)PSCA hlg(2700050C12Rik，C530008O16Rik，RIKEN cDNA 2700050C12，RIKEN cDNA 2700050C12基因)；(9)ETBR(内皮素B型受体)；(10)MSG783(RNF124，假定蛋白FLJ20315)；(11)STEAP2(HGNC_8639，IPCA-1，PCANAP1，STAMP1，STEAP2，STMP，***癌相关基因1，***癌相关蛋白1，***的六跨膜上皮抗原2，六跨膜***蛋白)；(12)TrpM4(BR22450；FLJ20041；TRPM4；TRPM4B；瞬时受体电位阳离子通道，亚家族M，成员4)；(13)CRIPTO(CR，CR1，CRGF，CRIPTO，TDGF1，畸胎癌衍生的生长因子)；(14)CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/埃-巴二氏病毒(Epstein Barrvirus)受体)或Hs73792)；(15)CD79b(CD79B，CD79β，IGb(免疫球蛋白相关β)，B29)；(16)FcRH2(IFGP4，IRTA4，SPAP1A(含SH2结构域的磷酸酶锚定蛋白1a)，SPAP1B，SPAP1C)；(17)HER2；(18)NCA；(19)MDP；(20)IL20Rα；(21)短蛋白聚糖；(22)EphB2R；(23)ASLG659；(24)PSCA；(25)GEDA；(26)BAFF-R(B细胞活化因子受体，BLyS受体3，BR3)；(27)CD22(B细胞受体CD22-B同种型)；(28)CD79a(CD79A，CD79α，免疫球蛋白相关α)；(29)CXCR5(伯基特淋巴瘤受体1)；(30)HLA-DOB(MHC II类分子的β亚基(Ia抗原))；(31)P2X5(嘌呤能受体P2X配体门控离子通道5)；(32)CD72(B细胞分化抗原CD72，Lyb-2)；(33)LY64(淋巴细胞抗原64(RP105)，富含亮氨酸重复序列(LRR)家族的I型膜蛋白)；(34)FcRH1(Fc受体样蛋白1)；(35)FcRH5(IRTA2，免疫球蛋白超家族受体易位相关2)；(36)TENB2(推定的跨膜蛋白聚糖)；(37)PMEL17(银同系物；SILV；D12S53E；PMEL17；SI；SIL)；(38)TMEFF1(具有EGF样和两个卵泡抑素样结构域的跨膜蛋白1；Tomoregulin-1)；(39)GDNF-Ra1(GDNF家族受体α1；GFRA1；GDNFR；GDNFRA；RETL1；TRNR1；RET1L；GDNFR-α1；GFR-α-1)；(40)Ly6E(淋巴细胞抗原6复合物，基因座E；Ly67，RIG-E，SCA-2，TSA-1)；(41)TMEM46(shisa同系物2(非洲爪蛙)；SHISA2)；(42)Ly6G6D(淋巴细胞抗原6复合物，基因座G6D；Ly6-D，MEGT1)；(43)LGR5(含有富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5；GPR49，GPR67)；(44)RET(ret原癌基因；MEN2A；HSCR1；MEN2B；MTC1；PTC；CDHF12；Hs.168114；RET51；RET-ELE1)；(45)LY6K(淋巴细胞抗原6复合物，基因座K；LY6K；HSJ001348；FLJ35226)；(46)GPR19(G蛋白偶联受体19；Mm.4787)；(47)GPR54(KISS1受体；KISS1R；GPR54；HOT7T175；AXOR12)；(48)ASPHD1(含有天冬氨酸β-羟化酶结构域的1；LOC253982)；(49)酪氨酸酶(TYR；OCAIA；OCA1A；酪氨酸酶；SHEP3)；(50)TMEM118(环指蛋白，跨膜2；RNFT2；FLJ14627)；(51)GPR172A(G蛋白偶联受体172A；GPCR41；FLJ11856；D15Ertd747e)；(52)CD33；和(53)CLL-1。

在本公开的一些其他方面，提供了包含本公开的抗体-药物缀合物的药物组合物，所述药物组合物还包含稀释剂、载体和赋形剂中的至少一种。

在其他方面，提供了包含本公开的抗体-药物缀合物和稀释剂、载体和赋形剂中的至少一种的药物组合物用于向患者施用以治疗癌症。

在其他方面，提供本公开的抗体-药物缀合物用于制造动物的癌症治疗的药剂。

在其他方面，提供了用本公开的抗体-药物缀合物治疗癌症的方法。

在其他方面，提供了制备本公开的抗体-药物缀合物的方法，其中所述方法包括使与选自(1)-(53)的一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体结合的抗体与本文其他地方所述的式I或式II的药物-离去基团中间体组合物反应。

在其他方面，提供了一种制品，所述制品包含：本公开的抗体-药物缀合物和稀释剂、载体和赋形剂中的至少一种；容器；和指示该药物组合物可用于治疗癌症的包装说明书或标签。

详述

现将详细参考本发明的某些实施方案，其实施例以所附的结构和化学式来说明。虽然本发明将结合列举的实施方案来描述，但应理解其不意图将本发明限于那些实施方案。相反地，本发明意欲涵盖所有替代方案、修改方案和等价方案，它们均可包括在如由权利要求书所限定的本发明的范畴之内。

本领域技术人员将认识到，与本文所描述的方法和材料类似或等同的许多方法和材料可用于实践本发明。本发明决不限于所述的方法和材料。

本公开大体上涉及抗体-药物缀合物，其包含在不存在接头或连接部分的情况下直接缀合至一种或多种加利车霉素衍生物的抗体。本公开还涉及包含离去基团的加利车霉素衍生物中间体组合物。此类中间体组合物是用于形成抗体-药物缀合物的合适底物，其中在失去离去基团并且不存在常规接头或连接部分的情况下，抗体与加利车霉素衍生物直接共价结合。本公开还涉及这种抗体-加利车霉素缀合物在治疗疾病，特别是癌症中的用途。如本文所用，除非另有说明，否则加利车霉素是指本公开所涵盖的加利车霉素衍生物化合物。

就此而言，应注意的是用于形成抗体-加利车霉素和抗体-加利车霉素衍生物缀合物的现有技术方法(例如U.S.55,877,296和5,773,001中公开的方法)产生大比例的缀合物聚集物，导致放大变得不可行并且造成纯化问题(参见通过引用并入本文的美国公开号2007/0213511A1，例如在段落[0008]和[0009]中)。进一步已知的是，U.S.5,714,586和US5,712,374中公开的方法产生具有50％至60％的不希望的低缀合部分的抗体-药物缀合物(参见例如美国公布号2007/0213511 A1的段落[0010])。此外，问题在于，接头可能在血流中不稳定，由此在内化之前导致显著的药物释放。此外，这种加利车霉素-接头-抗体缀合物的使用可能受已知缀合过程的能力限制，特别是当每个抗体分子的载药量增加时通常导致形成聚集物。

基于迄今为止的实验证据，已经发现在不存在接头的情况下，通过抗体和加利车霉素衍生物之间的二硫键共价键的直接缀合提供了改进的抗体-加利车霉素缀合物，其特征在于可重现的每个抗体的加利车霉素载药量(DAR)、减少的聚集物形成、改善的血流稳定性和改善的细胞内释放。因此，认为通过二硫键将抗体与加利车霉素直接缀合有效地分离了血流稳定性和细胞内释放，从而使改善的血流稳定性和改善的细胞内释放成为可能。

定义

除非另外定义，否则本文使用的技术术语和科学术语所具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义，并且与以下一致：Singleton等人(1994)Dictionaryof Microbiology and Molecular Biology,第2版,J.Wiley&Sons,New York,NY；和Janeway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik(2001)Immunobiology,第5版,GarlandPublishing,New York。

“亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指示，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力可通常由解离常数(Kd)表示。亲和力可通过本领域中已知的常用方法(包括本文所述的)加以测量。测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案在下文中描述。

本文的术语“抗体”以最广泛的意义使用并且具体地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展现出所需生物活性(Miller等人(2003)Jour.of Immunology 170:4854-4861)。抗体可以是鼠的、人的、人源化的、嵌合的或衍生自其他物种。抗体是由免疫***生成的能够识别并结合特异性抗原的蛋白质。(Janeway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik(2001)Immuno Biology，第5版，Garland Publishing，New York)。靶抗原通常具有多个结合位点，也称作表位，其由多种抗体上的CDR识别。特异性结合不同表位的每一抗体具有不同结构。因此，一种抗原可具有多于一种的对应抗体。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含免疫特异性地结合目标靶标抗原或其部分的抗原结合位点的分子，这些靶标包括但不限于癌细胞或产生与自体免疫疾病相关的自身免疫抗体的细胞。本文公开的免疫球蛋白可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。免疫球蛋白可以来自任何物种。然而，在一个方面，免疫球蛋白来源于人、鼠或兔。

“抗体片段”包括全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；微型抗体(Olafsen等人(2004)Protein Eng.Design&Sel.17(4):315-323)，由Fab表达文库产生的片段，抗独特型(抗Id)抗体，CDR(互补决定区)和免疫特异性结合癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的本文所述的任何抗体的表位结合片段，单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指自大致上均质抗体的群体获得的抗体，即除可以少量存在的可能天然存在的突变之外，构成所述群体的个别抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，从而针对单一抗原位点。此外，与包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，各单克隆抗体针对抗原上的单一决定子。除特异性外，单克隆抗体的优势还在于，其合成不会受到其他抗体的污染。修饰语“单克隆”指示抗体是从大致上均质的抗体群体获得的特性，且不应解释为需要通过任何特定方法来产生所述抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过首先由Kohler等人(1975)Nature 256：495描述的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见例如：US 4816567；US 5807715)。单克隆抗体也可以使用例如Clackson等人(1991)Nature,352:624-628；Marks等人(1991)J.Mol.Biol.,222:581-597所述的技术从噬菌体抗体文库中分离。

本文中的单克隆抗体尤其包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体种类或子类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与来自另一个物种或属于另一个抗体种类或子类的抗体中的相应序列相同或同源，以及这类抗体的片段，只要其展现所需生物活性(US 4816567；和Morrison等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855)。本文中的目标嵌合抗体包括包含源于非人灵长类动物(例如旧世界猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列的“灵长类化”抗体。

本文中的“完整抗体”是包含VL结构域和VH结构域，以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域、CH1、CH2及CH3的抗体。恒定结构域可为天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。完整抗体可具有一种或多种“效应子功能”，其指可归因于抗体Fc恒定区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；以及细胞表面受体(诸如B细胞受体和BCR)的下调。

取决于其重链的恒定结构域的氨基酸序列，完整抗体可分成不同的“类别”。存在五种主要类别的完整免疫球蛋白抗体：IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM，并且这些类别中的几种可进一步分成“亚类”(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA以及IgA2。对应于不同抗体类别的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ以及μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。Ig形式包括铰链修饰或无铰链形式(Roux等人(1998)J.Immunol.161:4083-4090；Lund等人(2000)Eur.J.Biochem.267:7246-7256；US 2005/0048572；US2004/0229310)。

“半胱氨酸工程化抗体”或“半胱氨酸工程化抗体变体”是其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代的抗体。根据本公开，半胱氨酸工程化抗体的硫醇基可以与加利车霉素缀合以形成THIOMAB^TM抗体(即，THIOMAB^TM药物缀合物(TDC)，其中根据本公开，所述药物是加利车霉素衍生物)。在特定实施方案中，取代的残基存在于抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基由此定位在抗体的可及位点处且可用于使抗体缀合至药物部分以产生如本文进一步所述的免疫缀合物。例如，THIOMAB^TM抗体可以是在轻链(例如根据Kabat编号的G64C，K149C或R142C)或重链(例如根据Kabat编号的D101C或V184C或T205C)中具有非半胱氨酸天然残基到半胱氨酸的单一突变的抗体。在具体实例中，THIOMAB^TM抗体在重链或轻链中具有单一半胱氨酸突变，使得每种全长抗体(即具有两条重链和两条轻链的抗体)具有两个工程化半胱氨酸残基。US 2012/0121615A1(通过引用整体并入本文)公开了半胱氨酸工程化抗体和制备方法。

术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物的特征通常在于细胞生长/增殖不受调控的生理病状。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤(例如霍奇金氏和非霍奇金氏淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤和白血病。这些癌症的更具体实例包括急性骨髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性髓单核细胞性白血病、急性早幼粒细胞白血病(APL)、慢性骨髓增殖性疾病、血小板白血病、前体B细胞急性淋巴母细胞白血病(前B-ALL)、前体T细胞急性淋巴母细胞白血病(前T-ALL)、多发性骨髓瘤(MM)、肥大细胞疾病、肥大细胞白血病、肥大细胞肉瘤、骨髓肉瘤、淋巴样白血病和未分化的白血病。在一些实施方案中，癌症是骨髓性白血病。在一些实施方案中，癌症是急性骨髓性白血病(AML)。

术语“嵌合”抗体是指重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同来源或物种的抗体。

抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要的抗体类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些抗体中的若干种还可分成亚类(同种型)，例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。

“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；以及B细胞活化。

药剂(例如药物制剂)的“有效量”是指在必需的剂量和时间段内有效实现期望的治疗或预防结果的量。

术语“表位”是指抗原分子上的抗体所结合的特定位点。在一些实施方案中，抗体结合的抗原分子上的特定位点通过羟基足迹法确定。

本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的含有恒定区的至少一部分的C端区。所述术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226或Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可存在或可不存在。除非本文另有规定，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据EU编号***，也称为EU索引，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中所描述。

“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基以外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常按以下顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

术语“全长抗体”、“完全抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，是指具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有如本文中定义的Fc区的重链的抗体。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用且是指其中已引入外源性核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和自其衍生的后代，而不考虑传代次数。子代在核酸内含物方面可能不完全与母细胞相同，而是可能含有突变。本文包括具有如在原始转化细胞中所筛选或选择的相同功能或生物活性的突变型子代。

“人抗体”为具有某一氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于由人或人细胞产生或来源于利用人抗体全部组成成分或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

“人共有框架”为代表在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常存在的氨基酸残基的框架。一般说来，人免疫球蛋白VL或VH序列选自可变结构域序列的亚组。通常，序列的亚组是如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组为如Kabat等(上文)中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组为如Kabat等(上文)中的亚组III。

“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个并且通常两个可变结构域的大致上全部，其中全部或大致上全部HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的HVR，并且全部或大致上全部FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已进行人源化的抗体。

术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链中参与使抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有类似结构，其中各结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见例如Kindt等人KubyImmunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。)单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可使用来自结合所述抗原的抗体的VH或VL结构域来分离以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见例如Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。

如本文所用的术语“载体”是指能够使其所连接的另一种核酸增殖的核酸分子。所述术语包括呈自我复制核酸结构的载体，以及并入其已引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。

如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变域的在序列方面高度可变和/或形成结构确定环(“高变环”)的各区。一般说来，天然四链抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环的氨基酸残基和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列可变性和/或参与抗原识别。示例性高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)处。(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)。)示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基24-34、L2的氨基酸残基50-56、L3的氨基酸残基89-97、H1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-65及H3的氨基酸残基95-102处。(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。除VH中的CDR1之外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含作为接触抗原的残基的“特异性决定残基”或“SDR”。SDR包含在CDR的称为缩短CDR或a-CDR的区域内。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2及a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34、L2的氨基酸残基50-55、L3的氨基酸残基89-96、H1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-58及H3的氨基酸残基95-102处。(参见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)。)除非另外指示，否则HVR残基和可变结构域中的其他残基(例如FR残基)在本文中是根据Kabat等(上文)加以编号。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如奶牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类(例如人和非人灵长类，诸如猴)、兔以及啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者为人。

“分离的抗体”为已与天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至纯度大于95％或99％，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)所测定的。关于评价抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。

“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二硫键键合的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N末端至C末端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重结构域或重链可变结构结构域，其后是三个恒定结构域(CH1，CH2和CH3)。类似地，从N末端至C末端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻结构域或轻链可变结构域，之后是恒定轻(CL)结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以指定为两种类型之一，称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)。

术语“包装说明书(package insert)”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明，其包含关于适应症、用法、剂量、施用、联合治疗、禁忌症和/或关于使用这种治疗产品的警告的信息。

关于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列并且必要时引入间隙以实现最大序列同一性百分比，并且不考虑任何保守性取代作为序列同一性的一部分之后，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于测定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以属于本领域中的技能的多种方式实现，所述方式例如使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大对齐所需的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司创造，且原始码已与用户文件一起在美国版权办公室(U.S.Copyright Office,WashingtonD.C.,20559)备案，其中其在美国版权登记号TXU510087下登记。ALIGN-2程序可公开从Genentech公司(South San Francisco,California)获得，或可从源代码编译。ALIGN-2程序应编译用于UNIX操作***(包括数字UNIX V4.0D)上。所有序列比较参数皆由ALIGN-2程序设置且不改变。

在其中使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A相对于、与或针对给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(其可以可替代地表述为给定氨基酸A具有或包含相对于、与或针对给定氨基酸序列B的特定氨基酸序列同一性％)如下计算：100乘以分数X/Y，其中X是在序列比对程序ALIGN-2的A和B的比对中由该程序记录为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应当理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A与B的氨基酸序列同一性％将不等于B与A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别说明，否则本文使用的所有氨基酸序列同一性％值如在紧接的前述段落中所述的那样使用ALIGN-2计算机程序获得。

术语“药物制剂”是指以下制剂：其呈允许其中所含的活性成分的生物活性有效的形式，且不含对将施用制剂的受试者具有不可接受毒性的另外组分。

“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

术语“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”是指治疗性治疗和预防性或防范性措施，其目的是预防或减缓(减少)不希望的生理变化或紊乱，例如癌症的发展或扩散。出于本发明的目的，有益的或所需的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进程的延缓或减慢、疾病状态的改善或缓和，以及缓解(无论是部分缓解或是全部缓解)，无论是可检测或是不可检测。“治疗”还可意指与未接受治疗时期望的存活相比延长存活。需要治疗的对象包括已经患有病状或病症的对象，以及易患病状或病症的对象或要预防其病状或病症的对象。

术语“治疗有效量”是指有效治疗哺乳动物的疾病或病症的药物量。在癌症的情况下，药物的治疗有效量可减少癌细胞的数量；减小肿瘤的尺寸；抑制(即，在某种程度上减慢并优选阻止)癌细胞对周边器官的浸润；抑制(即，在某种程度上减慢并在优选阻止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；和/或在某种程度上减轻与癌症相关的一种或多种症状。在药物可防止生长和/或杀死现有的癌细胞的程度上，它可为细胞抑制的和/或细胞毒性的。对于癌症的治疗，功效可例如通过评估疾病进展时间(TTP)和/或测定反应率(RR)来测定。

术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物的特征通常在于细胞生长/增殖不受调控的生理病状。“肿瘤”包含一种或多种癌性细胞。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。此类癌症的更特定实例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌(“NSCLC”)、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子***、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、***癌、***癌以及头颈癌。

如本文所用的术语“离去基团”是指在涉及如本文所述的基团的化学反应过程中离开的巯基部分。

如本文所用的术语“烃基”描述了仅由元素碳和氢组成的有机化合物或基团。这些部分包括但不限于烷基、烯基、炔基和芳基部分。这些部分还包括被其他脂族或环状烃基取代的烷基、烯基、炔基和芳基部分，如烷芳基、烯芳基和炔芳基。除非另外指示，否则这些部分优选包含1至20个碳原子、1至10个碳原子或1至6个碳原子。

除非另外指示，否则本文所述的烷基优选是在主链中含有1至8个碳原子的低级烷基。所述基团可以是直链或支链或环状的，包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、烯丙基、苄基、己基等。

除非另外指示，否则本文所述的炔基优选是在主链中含有2至8个碳原子且至多20个碳原子的低级炔基。它们可以是直链或支链，包括但不限于乙炔基、丙炔基、丁炔基、异丁炔基、己炔基等。

本文单独或作为另一基团的一部分使用的术语“芳基”表示任选取代的碳环芳族基团，优选在环部分中含有5至20个碳、5至10个碳或5至6个碳的单环或双环基团，包括但不限于苯基、联苯基、萘基、取代的苯基、取代的联苯基或取代的萘基。芳基部分可以任选地包含一个或多个选自O、S和N的杂原子。这样的杂芳族化合物可以在环中包含1或2个氮原子、1或2个硫原子、1或2个氧原子及其组合，其中每个杂原子通过碳来键合到分子的其余部分。非限制性示例性基团包括吡啶、吡嗪、嘧啶、吡唑、吡咯、咪唑、噻吩、噻喃鎓、帕拉塞嗪、吲哚、嘌呤、苯并咪唑、喹诺酮、吩噻嗪。非限制性示例性取代基包括一个或多个以下基团：烃基、取代烃基、烷基、烷氧基、酰基、酰氧基、烯基、烯氧基、芳基、芳氧基、氨基、酰氨基、缩醛、氨基甲酰基、碳环基、氰基、酯、醚、卤素、杂环、羟基、酮、缩酮、磷酸、硝基和硫代。

本文所述的“取代的”部分是被至少一个除碳以外的原子取代的例如烃基、烷基和芳基的部分，包括其中碳链原子被杂原子如氮、氧、硅、磷、硼、硫或卤素原子取代的部分。这些取代基包括但不限于卤素、杂环、烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳氧基、羟基、酮基、酰基、酰氧基、硝基、叔氨基、酰氨基、硝基、氰基、硫代、亚磺酸酯、磺酰胺、缩酮、缩醛、酯和醚。

本文单独或作为另一基团的一部分使用的术语“卤素”是指氯、溴、氟和碘。

抗体

在本公开的任何实施方案中，抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗体包含如本公开任何以上实施方案中的HVR，且还包含人接受体框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在某些实施方案中，人受体框架为人VLκI共有(VLKI)框架和/或VH框架VH1。在某些实施方案中，人受体框架为人VLκI共有(VLKI)框架和/或VH框架VH1，包含以下突变中的任何一个。

在另一方面，抗体包含如本文提供的任何实施方案中的VH和如本文提供的任何实施方案中的VL。

在本发明的另一方面，根据本文中的任何实施方案的抗体为单克隆抗体，包括人抗体。在一个实施方案中，抗体为抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体或F(ab’)2片段。在另一实施方案中，抗体为大致上全长抗体，例如IgG1抗体、IgG2a抗体或如本文定义的其他抗体类别或同种型。

另一方面，根据本文中任何实施方案的抗体可以单独或组合地并入本文所述的任何特征。

1.抗体亲和力

在某些实施方案中，本文提供的抗体的解离常数(Kd)≤1μM、≤100nM、≤50nM、≤10nM、≤5nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM，并且任选地≥10^-13M。(例如10^-8M或更低，例如10^-8M至10^-13M，例如10^-9M至10^-13M)。

在一个实施方案中，Kd是如以下测定所述，通过用目标抗体的Fab形式及其抗原进行放射性标记的抗原结合测定(RIA)来测量。Fab对抗原的溶液结合亲和力是通过在滴定系列的未标记抗原存在下，使Fab与最小浓度的(¹²⁵I)标记的抗原平衡，然后用抗Fab抗体包被的板捕获所结合抗原来测量(参见，例如Chen等J.Mol.Biol.293:865-881,1999)。为了建立测定条件，将

多孔板(Thermo Scientific)用5μg/ml的在50mM碳酸钠(pH9.6)中的捕获抗Fab抗体(Cappel Lab包被过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(约23℃)封闭2至5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[¹²⁵I]-抗原与目标Fab的系列稀释液混合(例如，与Presta等人，Cancer Res.57:4593-4599(1997)中的抗VEGF抗体Fab-12的评估一致)。然后将目标Fab孵育过夜；然而，孵育可持续较长时期(例如约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获板，以在室温下孵育(例如1小时)。然后除去溶液，并用在PBS中的0.1％聚山梨酯20(TWEEN-

)洗涤板8次。当板已干燥时，添加150μl/孔的闪烁剂(MICROSCINT-20^TM；Packard)，并在TOPCOUNT^TMγ计数器(Packard)上对板计数10分钟。选择产生小于或等于最大结合的20％的各Fab的浓度以用于竞争性结合测定中。

根据另一个实施方案，使用

-2000、

-T200或

-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，用固定的抗原CM5芯片在约10个反应单位(RU)下在25℃下使用表面等离子体共振测定来测量Kd。简而言之，根据供应商的说明书，用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。在注射之前将抗原用10mM乙酸钠(pH 4.8)稀释至5μg/ml

和/或HBS-P(0.01M Hepes pH7.4、0.15M NaCl、0.005％表面活性剂P20)，流速为5μl/分钟和/或30μl/分钟以实现约10个反应单位(RU)的偶联蛋白质。在注射抗原之后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。对于动力学测量，在25℃下将Fab的两倍系列稀释液(0.78nM至500nM)以约25μl/min的流速注入到含有0.05％聚山梨酯20(TWEEN-20^TM)表面活性剂(PBST)的PBS中。通过同时拟合缔合和解离传感图，使用简单的一对一Langmuir结合模型(

Evaluation Software版本3.2)计算缔合速率(k缔合)和解离速率(k解离)。平衡解离常数(Kd)被计算为比率k解离/k缔合。参见例如Chen等J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过上述表面等离振子共振测定测得的缔合速率超过106M-1s-1，则可以通过使用荧光淬灭技术测定缔合速率，所述荧光淬灭技术在25℃下在如在分光光度计中测量的增加浓度的抗原存在下测量在pH 7.2的PBS中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm，发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少，所述分光光度计如装备有停流的风光光度计(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)或带有搅拌比色皿的8000系列SLM-AMINCO^TM分光光度计(ThermoSpectronic)。

2.抗体片段

在某些实施方案中，本文提供的抗体为抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段以及本文所述的其他片段。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人Nat.Med.9:129-134(2003)。对于scFv的综述，参见，例如Pluckthün，在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)中；还参见WO93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含补救受体结合表位残基并且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。

双抗体是可为二价或双特异性的具有两个抗原结合位点的抗体片段。参见，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)；及Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也描述于Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)。

单结构域抗体是包含抗体的全部或一部分重链可变结构域或全部或一部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。

抗体片段可通过各种技术制备，所述技术包括但不限于如本文所述的完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)产生。

3.嵌合抗体和人源化抗体

在某些实施方案中，本文提供的抗体为嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利号4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类诸如猴的可变区)和人恒定区。在又一个实例中，嵌合抗体为“类别转换”抗体，其中类别或亚类与亲本抗体的类别或亚类相比已经改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。

在某些实施方案中，嵌合抗体为人源化抗体。通常，非人抗体被人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般说来，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR例如CDR(或其部分)来源于非人抗体，并且FR(或其部分)来源于人抗体序列。人源化抗体任选还将包含至少一部分人恒定区。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如HVR残基所来源的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。

人源化抗体及其制备方法例如在Almagro和Fransson，Front.Biosci.Biosci.13:1619-1633(2008)中综述，并且在例如以下中进一步描述：Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人,Methods36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall’Acqua等人,Methods36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等人,Methods36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR改组的“引导选择”方法)。

可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如Sims等人，J.Immunol.151:2296(1993))；源自轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见例如Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等人J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和源自筛选FR文库的框架区(参见，例如，Baca等人，J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人，J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。

4.人抗体

在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。人抗体可以使用本领域已知的各种技术来产生。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。

可以通过向转基因动物施用免疫原制备人抗体，所述转基因动物已经被修饰以响应抗原性攻击产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座，该基因座替换内源免疫球蛋白基因座或者存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已经失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg，Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如描述XENOMOUSE^TM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述

技术的美国专利号5,770,429；描述K-

技术的美国专利号7,041,870和描述

技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900)。可以进一步修饰例如通过与不同的人恒定区组合来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区。

也可以通过基于杂交瘤的方法制备人抗体。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991)。)通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。另外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的那些方法。人杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein，Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmers和Brandlein，Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)中。

还可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生人抗体。然后，可将此类可变结构域序列与期望的人恒定结构域组合。下文描述了从抗体文库中选择人抗体的技术。

5.文库衍生的抗体

可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库和筛选具有所需结合特性的抗体的此类文库。此类方法综述于例如Hoogenboom等人于Methods in Molecular Biology178:1-37(O'Brien等人编，Human Press,Totowa,NJ,2001)，并进一步描述于例如McCafferty等人，Nature 348:552-554；Clackson等人，Nature 352:624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury，于Methods in MolecularBiology 248:161-175(Lo编，Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人，J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)。

在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆VH和VL基因的组库，并在噬菌体文库中随机重组，然后其可以用来筛选抗原结合噬菌体，如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中描述。噬菌体通常展示作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段的抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以克隆(例如，从人)初始库(naive repertoire)以给多种非自体抗原也和没有任何免疫作用的自体抗原提供单一来源的抗体，如由Griffiths等人，EMBO J,12:725-734(1993)描述。最后，还可以通过克隆来自干细胞的未重排的V基因片段和使用含有编码高度可变的CDR3区并实现体外重排的随机序列的PCR引物来通过合成制备初始文库，如由Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)描述。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括例如：美国专利号5,750,373和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。

认为从人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。

6.多特异性抗体

在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。术语“多特异性抗体”以最广泛的含义使用并且具体涵盖包含具有多表位特异性的抗原结合结构域的抗体(即，能够特异性结合一个生物分子上的两个或更多个不同表位，或者能够特异性结合两种或更多种不同生物分子上的表位)。在一些实施方案中，多特异性抗体为对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体(诸如双特异性抗体)的抗原结合结构域包含两个VH/VL单元，其中第一VH/VL单元特异性结合第一表位并且第二VH/VL单元特异性结合第二表位，其中每个VH/VL单元包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。这样的多特异性抗体包括但不限于全长抗体，具有两个或更多个VL和VH结构域的抗体，诸如Fab、Fv、dsFv、scFv、双抗体、双特异性双抗体和三抗体的抗体片段，已经共价或非共价连接的抗体片段。还包含重链可变区的至少一部分和/或轻链可变区的至少一部分的VH/VL单元也可称为“臂”或“半聚体”或“半抗体”。在一些实施方案中，半聚体包含重链可变区的足够部分，以允许与第二半聚体形成分子内二硫键。在一些实施方案中，半聚体包含结突变或穴突变，例如以允许与包含互补穴突变或结突变的第二半聚体或半抗体异源二聚化。本文将进一步讨论结突变和穴突变。

在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗体可以是双特异性抗体。术语“双特异性抗体”以最广泛的含义使用并且涵盖包含抗原结合结构域的多特异性抗体，该抗原结合结构域能够特异性结合一个生物分子上的两个不同表位，或能够特异性结合两个不同生物分子上的表位。双特异性抗体在本文中也可以被称为具有“双特异性”或“是双特异性的”。双特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段。本文使用的术语“双互补位抗体”是指其中第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域结合相同抗原分子上的两个不同表位，或其可结合两种不同抗原分子上的表位的双特异性抗体。

在一些实施方案中，双互补位抗体的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以结合同一抗原分子内的两个表位(分子内结合)。例如，双互补位抗体的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以结合相同抗体分子上的两个不同表位。在某些实施方案中，双互补位抗体结合的两个不同表位是通常不被一个单特异性抗体例如常规抗体或一个免疫球蛋白单可变结构域同时结合的表位。

在一些实施方案中，双互补位抗体的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以结合位于两个不同抗原分子内的表位。

用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两种免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983))，WO 93/08829，及Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991))和“结-入-穴”(knob-in-hole)工程化(参见例如美国专利号5,731,168)，WO2009/089004，US2009/0182127，US2011/0287009，Marvin和Zhu,Acta Pharmacol.Sin.(2005)26(6):649-658，和Kontermann(2005)ActaPharmacol.Sin.,26:1-9)。本文使用的术语“结入穴”或“KnH”技术是指在体外或体内将两个多肽配对在一起的技术，这种技术是通过在它们相互作用的界面处将突起(结)引入一个多肽中并且将空腔(穴)引入到另一个多肽中来进行的。例如，KnH已被引入抗体的Fc:Fc结合界面、CL:CH1界面或VH/VL界面(参见例如US 2011/0287009、US2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431和Zhu等人,1997,Protein Science 6:781-788)。在一些实施方案中，在制造多特异性抗体期间，KnH驱动两种不同重链的配对。例如，在Fc区中具有KnH的多特异性抗体可以进一步包含与每个Fc区连接的单个可变结构域，或者还包含与相似或不同的轻链可变结构域配对的不同重链可变结构域。KnH技术也可以用于将两个不同的受体胞外结构域或任何其他包含不同靶识别序列(例如，包括亲和体、肽体和其他Fc融合体)的多肽序列配对。

如本文所用的术语“结突变”是指在其中多肽与另一种多肽相互作用的界面处将突起(结)引入多肽中的突变。在一些实施方案中，另一种多肽具有穴突变。

“突起”是指从第一多肽的界面突出并因此可位于相邻界面(即第二多肽的界面)中的互补空腔中以使异源多聚体稳定，并因此例如有利于异源多聚体形成而非同源多聚体形成的至少一个氨基酸侧链。突起可存在于原始界面中或可合成引入(例如通过改变编码界面的核酸)。在一些实施方案中，将编码第一多肽的界面的核酸改变以编码突起。为了实现这一点，将编码第一多肽的界面中的至少一个“原始”氨基酸残基的核酸用编码至少一个“输入”氨基酸残基的核酸置换，所述“输入”氨基酸残基具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积。应理解，可存在多于一个原始残基和相应输入残基。各种氨基残基的侧链体积示于例如US2011/0287009的表1中。引入“突起”的突变可以被称为“结突变”。

在一些实施方案中，用于形成突起的输入残基是天然存在的选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)的氨基酸残基。在一些实施方案中，输入残基是色氨酸或酪氨酸。在一些实施方案中，用于形成突起的原始残基具有小的侧链体积，例如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。

“空腔”是指从第二多肽的界面凹入并且因此容纳第一多肽的相邻界面上的相应突起的至少一个氨基酸侧链。空腔可存在于原始界面中或可合成引入(例如通过改变编码界面的核酸)。在一些实施方案中，编码第二多肽的界面的核酸经过改变来编码空腔。为了实现这一点，将编码第二多肽的界面中的至少一个“原始”氨基酸残基的核酸用编码至少一个“输入”氨基酸残基的DNA置换，所述“输入”氨基酸残基具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积。应理解，可存在多于一个原始残基和相应输入残基。在一些实施方案中，用于形成空腔的输入残基是天然存在的选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)的氨基酸残基。在一些实施方案中，输入残基是丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸。在一些实施方案中，用于形成空腔的原始残基具有大的侧链体积，例如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。引入“空腔”的突变可以被称为“穴突变”。

突起“可定位”在空腔中意指分别第一多肽和第二多肽的界面上的突起和空腔的空间位置以及突起和空腔的大小是这样的，即突起可位于空腔中而不显著扰乱界面处第一多肽和第二多肽的正常缔合。因为诸如Tyr、Phe和Trp的突起通常不从界面的轴垂直延伸并且具有优选的构象，所以在一些情况下，突起与相应空腔的对准依赖于基于三维结构(诸如通过X射线晶体学或核磁共振(NMR)获得的三维结构)建模突起/空腔对。这可以使用本领域中广泛接受的技术来实现。

在一些实施方案中，IgG1恒定区中的结突变是T366W。在一些实施方案中，IgG1恒定区中的穴突变包含选自T366S、L368A和Y407V的一个或多个突变。在一些实施方案中，IgG1恒定区中的穴突变包含T366S、L368A和Y407V。

在一些实施方案中，IgG4恒定区中的结突变是T366W。在一些实施方案中，IgG4恒定区中的穴突变包含选自T366S、L368A和Y407V的一个或多个突变。在一些实施方案中，IgG4恒定区中的穴突变包含T366S、L368A和Y407V。

多特异性抗体也可通过以下方法来制备：工程化用于制备抗体Fc-异二聚体分子的静电转向效应(WO2009/089004A1)；交联两种或更多种抗体或片段(参见例如US 4676980和Brennan等人，Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等人，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术制备双特异性抗体片段(Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(Gruber等人，J.Immunol.,152:5368(1994))；和如例如Tutt等人J.Immunol.147:60(1991)所述制备三特异性抗体。

本文还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼状抗体”或“双重可变结构域免疫球蛋白”(DVD)(US2006/0025576A1和Wu等人(2007)NatureBiotechnology)。

在某些实施方案中，可以将一种或多种氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如，取代)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。

在某些实施方案中，本发明涵盖具有一些而非所有效应子功能的抗体变体，所述效应子功能使所述抗体变体成为抗体的体内半衰期较为重要但某些效应子功能(诸如补体和ADCC)不必要或有害的应用所需要的候选物。可进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的降低/减少。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达Fc(RIII，而单核细胞表达Fc(RI、Fc(RII和Fc(RIII。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。用于评估目标分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性实例描述于US 5500362中(参见例如Hellstrom,I.等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTI^TM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox

非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI)。用于此类测定的有用效应子细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者或另外，可以在体内评估目标分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如公开于Clynes等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA95:652-656(1998)。还可进行C1q结合测定以确认抗体不能结合C1q并且因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以实施CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域中已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定(Petkova,S.B.等人,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。

具有降低的效应功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的取代的抗体(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有取代的Fc突变体，包括残基265和297取代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(US 7332581)。

在某些实施方案中，野生型人Fc区的Pro329被甘氨酸或精氨酸或足够大的氨基酸残基取代，以破坏在Fc的脯氨酸329与FcgRIII的色氨酸残基Trp 87和Trp 110之间形成的Fc/Fcγ受体界面内的脯氨酸夹心(Sondermann等人：Nature 406,267-273(2000年7月20日))。在另一个实施方案中，Fc变体中的至少一个另外的氨基酸取代是S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S，仍然在另一个实施方案中，所述至少一个另外的氨基酸取代是人IgG1Fc区的L234A和L235A或人IgG4Fc区的S228P和L235E(US8969526，其通过引用整体并入)。

在某些实施方案中，多肽包含野生型人IgG Fc区的Fc变体，其中所述多肽具有被甘氨酸取代的人IgG Fc区的Pro329，并且其中所述Fc变体在人IgG1Fc区域的L234A和L235A或人IgG4Fc区域的S228P和L235E处包含至少两个另外的氨基酸取代，并且其中所述残基根据Kabat的EU索引(美国专利号8,969,526，其通过引用整体并入)编号。在某些实施方案中，包含P329G、L234A和L235A取代的多肽显示对人FcγRIIIA和FcγRIIA的降低的亲和力，用于将ADCC下调至由包含野生型人IgG Fc区域的多肽诱导的ADCC的至少20％，和/或用于ADCP的下调(美国专利号8,969,526，其通过引用整体并入)。

在具体的实施方案中，包含野生型人Fc多肽的Fc变体的多肽包含三重突变：Pro329位置处的氨基酸取代、L234A和L235A突变(P329/LALA)(美国专利号8,969,526，其通过引用整体并入)。在具体的实施方案中，该多肽包含以下氨基酸取代：P329G、L234A和L235A。

描述了与FcR的结合改善或削弱的某些抗体变体。(参见例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312和Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。

在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个改善ADCC的氨基酸取代(例如在Fc区的位置298、333和/或334(EU残基编号)处的取代)的Fc区。

在一些实施方案中，对Fc区做出改变，其导致改变的(即，改善的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如描述于美国专利号6,194,551、WO 99/51642、及Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)。

具有延长的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等人)，所述抗体负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)及Kim等,J.Immunol.24:249(1994))。那些抗体包含其中具有改善Fc区与FcRn的结合的一个或多个取代的Fc区。此类Fc变体包括在Fc区残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一处或多处具有取代，例如，Fc区残基434的取代的那些(美国专利号7,371,826)。

关于Fc区变体的其他实例还参见Duncan和Winter,Nature322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；及WO 94/29351。

7.经半胱氨酸工程化抗体变体

在某些实施方案中，可能需要产生半胱氨酸工程化抗体，例如“THIOMAB^TM抗体”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施方案中，取代的残基存在于抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基由此定位在抗体的可及位点处且可用于使抗体缀合至药物部分以产生如本文进一步所述的免疫缀合物。在某些实施方案中，以下残基中的任一种或多种均可被半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；轻链的K149(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。可如例如美国专利号7,521,541中所述来生成半胱氨酸工程化抗体。

在一些方面，THIOMAB^TM抗体包含下表1中列出的重链或轻链半胱氨酸取代之一。

表1

在其他方面，THIOMAB^TM抗体包含表2中列出的重链半胱氨酸取代之一。

表2

在一些其他方面，THIOMAB^TM抗体包含表3中列出的轻链半胱氨酸取代之一。

表3

在一些其他方面，THIOMAB^TM抗体包含表4中列出的重链或轻链半胱氨酸取代之一。

表4

可用于本发明的抗体-药物缀合物的癌症治疗中的半胱氨酸工程化抗体包括但不限于针对细胞表面受体和肿瘤相关抗原(TAA)的抗体。肿瘤相关抗原是本领域已知的，并且可以使用本领域公知的方法和信息来制备用于产生抗体。在试图发现用于癌症诊断和治疗的有效细胞靶标时，研究人员试图鉴定跨膜或其他肿瘤相关多肽，与在一种或多种正常的非癌细胞上表达相比，这些多肽在一种或多种特定类型的癌细胞表面上特异性表达。通常，与非癌细胞表面上表达相比，这些肿瘤相关多肽在癌细胞表面上更丰富地表达。这种肿瘤相关细胞表面抗原多肽的鉴定已经产生了通过基于抗体的疗法来特异性靶向癌细胞以便进行破坏的能力。

肿瘤相关抗原TAA的实例包括但不限于本文列出的TAA(1)-(53)。为了方便起见，本文列出了与这些抗原有关的信息，所有这些都是本领域已知的，并包括名称、替代名称、Genbank登录号和主要参考文献，遵循美国国家生物技术信息中心(NCBI)的核酸和蛋白质序列鉴定惯例。对应于TAA(1)-(53)的核酸和蛋白质序列可在公共数据库如GenBank中获得。由抗体靶向的肿瘤相关抗原包括以下所有氨基酸序列变体和同种型，其相对于在所引用参考文献中鉴定的序列具有至少约70％、80％、85％、90％或95％序列同一性，或展现与具有在所引用的参考文献中发现的序列的TAA大致上相同的生物学性质或特性。例如，具有变体序列的TAA通常能够特异性结合与具有列出的相应序列的TAA特异性结合的抗体。本文特别引用的参考文献中的序列和公开内容明确地通过引用并入。

肿瘤相关抗原

(1)BMPR1B(骨形成蛋白受体IB型，Genbank登录号NM_001203)ten Dijke,P.等Science 264(5155):101-104(1994),Oncogene 14(11):1377-1382(1997))；WO2004063362(权利要求2)；WO2003042661(权利要求12)；US2003134790-A1(第38-39页)；WO2002102235(权利要求13；第296页)；WO2003055443(第91-92页)；WO200299122(实施例2；第528-530页)；WO2003029421(权利要求6)；WO2003024392(权利要求2；图112)；WO200298358(权利要求1；第183页)；WO200254940(第100-101页)；WO200259377(第349-350页)；WO200230268(权利要求27；第376页)；WO200148204(实施例；图4)；NP_001194骨形成蛋白受体，IB型/pid＝NP_001194.1-交叉参考：MIM:603248；NP_001194.1；AY065994。

(2)E16(LAT1，SLC7A5，Genbank登录号NM_003486)Biochem.Biophys.Res.Commun.255(2),283-288(1999),Nature 395(6699):288-291(1998),Gaugitsch,H.W.,等人(1992)J.Biol.Chem.267(16):11267-11273)；WO2004048938(实施例2)；WO2004032842(实施例IV)；WO2003042661(权利要求12)；WO2003016475(权利要求1)；WO200278524(实施例2)；WO200299074(权利要求19；第127-129页)；WO200286443(权利要求27；第222、393页)；WO2003003906(权利要求10；第293页)；WO200264798(权利要求33；第93-95页)；WO200014228(权利要求5；第133-136页)；US2003224454(图3)；WO2003025138(权利要求12；第150页)；NP_003477溶质载体家族7(阳离子氨基酸转运蛋白，y+***)，成员5/pid＝NP_003477.3-智人交叉参考：MIM:600182；NP_003477.3；NM_015923；NM_003486_1。

(3)STEAP1(***的六跨膜上皮抗原，Genbank登录号NM_012449)Cancer Res.61(15),5857-5860(2001),Hubert,R.S.,等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(25):14523-14528)；WO2004065577(权利要求6)；WO2004027049(图1L)；EP1394274(实施例11)；WO2004016225(权利要求2)；WO2003042661(权利要求12)；US2003157089(实施例5)；US2003185830(实施例5)；US2003064397(图2)；WO200289747(实施例5；第618-619页)；WO2003022995(实施例9；图13A，实施例53；第173页，实施例2；图2A)；NP_036581***的六跨膜上皮抗原交叉参考：MIM:604415；NP_036581.1；NM_012449_1。

(4)0772P(CA125，MUC16，Genbank登录号AF361486)J.Biol.Chem.276(29):27371-27375(2001))；WO2004045553(权利要求14)；WO200292836(权利要求6；图12)；WO200283866(权利要求15；第116-121页)；US2003124140(实施例16)；US 798959。交叉参考：GI:34501467；AAK74120.3；AF361486_1。

(5)MPF(MPF，MSLN，SMR，巨核细胞增强因子，间皮素，Genbank登录号NM_005823)Yamaguchi,N.,等人Biol.Chem.269(2),805-808(1994),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(20):11531-11536(1999),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93(1):136-140(1996),J.Biol.Chem.270(37):21984-21990(1995))；WO2003101283(权利要求14)；(WO2002102235)(权利要求13；页287-288)；WO2002101075(权利要求4；第308-309页)；WO200271928(第320-321页)；WO9410312(第52-57页)；交叉参考：MIM:601051；NP_005814.2；NM_005823_1。

(6)Napi3b(NAPI-3B；NPTIIb；SLC34A2；溶质载体家族34(磷酸钠)，成员2，II型钠依赖性磷酸盐转运蛋白3b，Genbank登录号NM_006424)J.Biol.Chem.277(22):19665-19672(2002),Genomics 62(2):281-284(1999),,J.A.等人(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.258(3):578-582)；WO2004022778(权利要求2)；EP1394274(实施例11)；WO2002102235(权利要求13；第326页)；EP875569(权利要求1；第17-19页)；WO200157188(权利要求20；第329页)；WO2004032842(实施例IV)；WO200175177(权利要求24；第139-140页)；交叉参考：MIM:604217；NP_006415.1；NM_006424_1。

(7)Sema 5b(FLJ10372，KIAA1445，Mm.42015，SEMA5B，SEMAG，脑信号蛋白5b Hlog，sema结构域，七凝血栓蛋白重复序列(1型和1型样的)，跨膜结构域(TM)和短胞质结构域，(脑信号蛋白)5B，Genbank登录号AB040878)Nagase T.等人(2000)DNA Res.7(2):143-150)；WO2004000997(权利要求1)；WO2003003984(权利要求1)；WO200206339(权利要求1；第50页)；WO200188133(权利要求1；第41-43页、第48-58页)；WO2003054152(权利要求20)；WO2003101400(权利要求11)；登录：Q9P283；EMBL；AB040878；BAA95969.1.Genew；HGNC:10737。

(8)PSCA hlg(2700050C12Rik，C530008O16Rik，RIKEN cDNA2700050C12，RIKENcDNA 2700050C12基因，Genbank登录号AY358628)；Ross等人(2002)Cancer Res.62:2546-2553；US2003129192(权利要求2)；US2004044180(权利要求12)；US2004044179(权利要求11)；US2003096961(权利要求11)；US2003232056(实施例5)；WO2003105758(权利要求12)；US2003206918(实施例5)；EP1347046(权利要求1)；WO2003025148(权利要求20)；交叉参考：GI:37182378；AAQ88991.1；AY358628_1。

(9)ETBR(内皮素B型受体，Genbank登录号AY275463)；Nakamuta M.等人Biochem.Biophys.Res.Commun.177,34-39,1991；Ogawa Y.等人Biochem.Biophys.Res.Commun.178,248-255,1991；Arai H.等人Jpn.Circ.J.56,1303-1307,1992；Arai H.等人J.Biol.Chem.268,3463-3470,1993；Sakamoto A.,Yanagisawa M.等人Biochem.Biophys.Res.Commun.178,656-663,1991；Elshourbagy N.A.等人J.Biol.Chem.268,3873-3879,1993；Haendler B.等人J.Cardiovasc.Pharmacol.20,s1-S4,1992；Tsutsumi M.等人Gene 228,43-49,1999；Strausberg R.L.等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99,16899-16903,2002；Bourgeois C.等人J.Clin.Endocrinol.Metab.82,3116-3123,1997；Okamoto Y.等人Biol.Chem.272,21589-21596,1997；Verheij J.B.等人Am.J.Med.Genet.108,223-225,2002；Hofstra R.M.W.等人Eur.J.Hum.Genet.5,180-185,1997；Puffenberger E.G.等人Cell 79,1257-1266,1994；Attie T.等人,Hum.Mol.Genet.4,2407-2409,1995；Auricchio A.等人Hum.Mol.Genet.5:351-354,1996；Amiel J.等人Hum.Mol.Genet.5,355-357,1996；Hofstra R.M.W.等人Nat.Genet.12,445-447,1996；Svensson P.J.等人Hum.Genet.103,145-148,1998；FuchsS.等人Mol.Med.7,115-124,2001；Pingault V.等人(2002)Hum.Genet.198-206；WO2004045516(权利要求1)；WO2004048938(实施例2)；WO2004040000(权利要求151)；WO2003087768(权利要求1)；WO2003016475(权利要求1)；WO2003016475(权利要求1)；WO200261087(图1)；WO2003016494(图6)；WO2003025138(权利要求12；第144页)；WO200198351(权利要求1；第124-125页)；EP522868(权利要求8；图2)；WO200177172(权利要求1；第297-299页)；US2003109676；US6518404(图3)；US5773223(权利要求1a；第31-34栏)；WO2004001004。

(10)MSG783(RNF124，假定蛋白质FLJ20315，Genbank登录号NM_017763)；WO2003104275(权利要求1)；WO2004046342(实施例2)；WO2003042661(权利要求12)；WO2003083074(权利要求14；第61页)；WO2003018621(权利要求1)；WO2003024392(权利要求2；图93)；WO200166689(实施例6)；交叉参考：LocusID:54894；NP_060233.2；NM_017763_1。

(11)STEAP2(HGNC_8639，IPCA-1，PCANAP1，STAMP1，STEAP2，STMP，***癌相关基因1，***癌相关蛋白1，***的六跨膜上皮抗原2，六跨膜***蛋白，Genbank登录号AF455138)Lab.Invest.82(11):1573-1582(2002))；WO2003087306；US2003064397(权利要求1；图1)；WO200272596(权利要求13；第54-55页)；WO200172962(权利要求1；图4B)；WO2003104270(权利要求11)；WO2003104270(权利要求16)；US2004005598(权利要求22)；WO2003042661(权利要求12)；US2003060612(权利要求12；图10)；WO200226822(权利要求23；图2)；WO200216429(权利要求12；图10)；交叉参考：GI:22655488；AAN04080.1；AF455138_1。

(12)TrpM4(BR22450；FLJ20041；TRPM4；TRPM4B；瞬时受体电位阳离子通道，亚家族M，成员4，Genbank登录号NM_017636)Xu,X.Z.,等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(19):10692-10697(2001),Cell 109(3):397-407(2002),J.Biol.Chem.278(33):30813-30820(2003))；US2003143557(权利要求4)；WO200040614(权利要求14；第100-103页)；WO200210382(权利要求1；图9A)；WO2003042661(权利要求12)；WO200230268(权利要求27；第391页)；US2003219806(权利要求4)；WO200162794(权利要求14；图1A-D)；交叉参考：MIM:606936；NP_060106.2；NM_017636_1。

(13)CRIPTO(CR，CR1，CRGF，CRIPTO，TDGF1，畸胎癌衍生的生长因子，Genbank登录号NP_003203或NM_003212)；Ciccodicola,A.等EMBO J.8(7):1987-1991(1989),Am.J.Hum.Genet.49(3):555-565(1991))；US2003/224411(权利要求1)；WO2003/083041(实施例1)；WO2003/034984(权利要求12)；WO2002/88170(权利要求2；第52-53页)；WO2003/024392(权利要求2；图58)；WO2002/16413(权利要求1；第94-95、105页)；WO2002/22808(权利要求2；图1)；US5854399(实施例2；第17-18栏)；US5792616(图2)；交叉参考：MIM:187395；NP_003203.1；NM_003212_1。

(14)CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/埃-巴二氏病毒受体)或Hs.73792Genbank登录号M26004)Fujisaku等人(1989)J.Biol.Chem.264(4):2118-2125)；Weis J.J.,等人J.Exp.Med.167,1047-1066,1988；Moore M.,等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84,9194-9198,1987；Barel M.,等人Mol.Immunol.35,1025-1031,1998；Weis J.J.,等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83,5639-5643,1986；Sinha S.K.,等人(1993)J.Immunol.150,5311-5320；WO2004045520(实施例4)；US2004005538(实施例1)；WO2003062401(权利要求9)；WO2004045520(实施例4)；WO9102536(图9.1-9.9)；WO2004020595(权利要求1)；登录:P20023；Q13866；Q14212；EMBL；M26004；AAA35786.1。

(15)CD79b(CD79B，CD79β，IGb(免疫球蛋白相关的β)，B29，Genbank登录号NM_000626或11038674)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(7):4126-4131,Blood(2002)100(9):3068-3076,Muller等人(1992)Eur.J.Immunol.22(6):1621-1625)；WO2004016225(权利要求2，图140)；WO2003087768，US2004101874(权利要求1，第102页)；WO2003062401(权利要求9)；WO200278524(实施例2)；US2002150573(权利要求5，第15页)；US5644033；WO2003048202(权利要求1，第306和309页)；WO 99/558658，US6534482(权利要求13，图17A/B)；WO200055351(权利要求11，第1145-1146页)；交叉参考：MIM:147245；NP_000617.1；NM_000626_1。

(16)FcRH2(IFGP4，IRTA4，SPAP1A(含SH2结构域的磷酸酶锚定蛋白1a)，SPAP1B，SPAP1C，Genbank登录号NM_030764，AY358130)Genome Res.13(10):2265-2270(2003),Immunogenetics 54(2):87-95(2002),Blood 99(8):2662-2669(2002),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(17):9772-9777(2001),Xu,M.J.等人(2001)Biochem.Biophys.Res.Commun.280(3):768-775；WO2004016225(权利要求2)；WO2003077836；WO200138490(权利要求5；图18D-1-18D-2)；WO2003097803(权利要求12)；WO2003089624(权利要求25)；交叉参考：MIM:606509；NP_110391.2；NM_030764_1。

(17)HER2(ErbB2，Genbank登录号M11730)Coussens L.等人Science(1985)230(4730):1132-1139)；Yamamoto T.等人Nature 319,230-234,1986；Semba K.等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82,6497-6501,1985；Swiercz J.M.等人J.Cell Biol.165,869-880,2004；Kuhns J.J.等人J.Biol.Chem.274,36422-36427,1999；Cho H.-S.等人Nature 421,756-760,2003；Ehsani A.等人(1993)Genomics 15,426-429；WO2004048938(实施例2)；WO2004027049(图1I)；WO2004009622；WO2003081210；WO2003089904(权利要求9)；WO2003016475(权利要求1)；US2003118592；WO2003008537(权利要求1)；WO2003055439(权利要求29；图1A-B)；WO2003025228(权利要求37；图5C)；WO200222636(实施例13；第95-107页)；WO200212341(权利要求68；图7)；WO200213847(第71-74页)；WO200214503(第114-117页)；WO200153463(权利要求2；第41-46页)；WO200141787(第15页)；WO200044899(权利要求52；图7)；WO200020579(权利要求3；图2)；US5869445(权利要求3；第31-38栏)；WO9630514(权利要求2；第56-61页)；EP1439393(权利要求7)；WO2004043361(权利要求7)；WO2004022709；WO200100244(实施例3；图4)；登录：P04626；EMBL；M11767；AAA35808.1.EMBL；M11761；AAA35808.1。

(18)NCA (CEACAM6,Genbank登录号M18728)；Barnett T.等Genomics 3,59-66,1988；Tawaragi Y.等Biochem.Biophys.Res.Commun.150,89-96,1988；Strausberg R.L.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:16899-16903,2002；WO2004/063709；EP1439393(权利要求7)；WO2004/044178(实施例4)；WO2004/031238；WO2003/042661(权利要求12)；WO2002/78524(实施例2)；WO2002/86443(权利要求27；第427页)；WO2002/60317(权利要求2)；登录号：P40199；Q14920；EMBL；M29541；AAA59915.1.EMBL；M18728。

(19)MDP(DPEP1，Genbank登录号BC017023)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26):16899-16903(2002))；WO2003016475(权利要求1)；WO200264798(权利要求33；第85-87页)；JP05003790(图6-8)；WO9946284(图9)；交叉参考：MIM:179780；AAH17023.1；BC017023_1。

(20)IL20Rα(IL20Ra，ZCYTOR7，Genbank登录号AF184971)；Clark HF等人，GenomeRes.13,2265-2270,2003；Mungall A.J.等人Nature 425,805-811,2003；Blumberg H.等人Cell 104,9-19,2001；Dumoutier L.等人J.Immunol.167,3545-3549,2001；Parrish-NovakJ.等人J.Biol.Chem.277,47517-47523,2002；Pletnev S.等人(2003)Biochemistry 42:12617-12624；Sheikh F.等人(2004)J.Immunol.172,2006-2010；EP1394274(实施例11)；US2004005320(实施例5)；WO2003029262(第74-75页)；WO2003002717(权利要求2；第63页)；WO200222153(第45-47页)；US2002042366(第20-21页)；WO200146261(第57-59页)；WO200146232(第63-65页)；WO9837193(权利要求1；第55-59页)；登录号：Q9UHF4；Q6UWA9；Q96SH8；EMBL；AF184971；AAF01320.1。

(21)短蛋白聚糖(BCAN，BEHAB，Genbank登录号AF229053)Gary S.C.等人Gene256,139-147,2000；Clark H.F.等人Genome Res.13,2265-2270,2003；Strausberg R.L.等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99,16899-16903,2002；US2003186372(权利要求11)；US2003186373(权利要求11)；US2003119131(权利要求1；图52)；US2003119122(权利要求1；图52)；US2003119126(权利要求1)；US2003119121(权利要求1；图52)；US2003119129(权利要求1)；US2003119130(权利要求1)；US2003119128(权利要求1；图52)；US2003119125(权利要求1)；WO2003016475(权利要求1)；WO200202634(权利要求1)。

(22)EphB2R(DRT，ERK，Hek5，EPHT3，Tyro5，Genbank登录号NM_004442)Chan,J.和Watt,V.M.,Oncogene 6(6),1057-1061(1991)Oncogene 10(5):897-905(1995),Annu.Rev.Neurosci.21:309-345(1998),Int.Rev.Cytol.196:177-244(2000))；WO2003042661(权利要求12)；WO200053216(权利要求1；第41页)；WO2004065576(权利要求1)；WO2004020583(权利要求9)；WO2003004529(第128-132页)；WO200053216(权利要求1；第42页)；交叉参考：MIM:600997；NP_004433.2；NM_004442_1。

(23)ASLG659(B7h，Genbank登录号AX092328)US20040101899(权利要求2)；WO2003104399(权利要求11)；WO2004000221(图3)；US2003165504(权利要求1)；US2003124140(实施例2)；US2003065143(图60)；WO2002102235(权利要求13；第299页)；US2003091580(实施例2)；WO200210187(权利要求6；图10)；WO200194641(权利要求12；图7b)；WO200202624(权利要求13；图1A-1B)；US2002034749(权利要求54；第45-46页)；WO200206317(实施例2；第320-321页，权利要求34；第321-322页)；WO200271928(第468-469页)；WO200202587(实施例1；图1)；WO200140269(实施例3；第190-192页)；WO200036107(实施例2；第205-207页)；WO2004053079(权利要求12)；WO2003004989(权利要求1)；WO200271928(第233-234,452-453页)；WO 0116318。

(24)PSCA(***干细胞抗原前体，Genbank登录号AJ297436)Reiter R.E.等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95,1735-1740,1998；Gu Z.等人Oncogene 19,1288-1296,2000；Biochem.Biophys.Res.Commun.(2000)275(3):783-788；WO2004022709；EP1394274(实施例11)；US2004018553(权利要求17)；WO2003008537(权利要求1)；WO200281646(权利要求1；第164页)；WO2003003906(权利要求10；第288页)；WO200140309(实施例1；图17)；US2001055751(实施例1；图1b)；WO200032752(权利要求18；图1)；WO9851805(权利要求17；第97页)；WO9851824(权利要求10；第94页)；WO9840403(权利要求2；图1B)；登录：O43653；EMBL；AF043498；AAC39607.1。

(25)GEDA(Genbank登录号AY260763)；AAP14954脂肪瘤HMGIC融合伴侣样蛋白/pid＝AAP14954.1-智人(Homo sapiens)物种：智人(人)WO2003054152(权利要求20)；WO2003000842(权利要求1)；WO2003023013(实施例3，权利要求20)；US2003194704(权利要求45)；交叉参考：GI:30102449；AAP14954.1；AY260763_1。

(26)BAFF-R(B细胞活化因子受体，BLyS受体3，BR3，Genbank登录号AF116456)；BAFF受体/pid＝NP_443177.1-智人Thompson,J.S.等人Science 293(5537),2108-2111(2001)；WO2004058309；WO2004011611；WO2003045422(实施例；第32-33页)；WO2003014294(权利要求35；图6B)；WO2003035846(权利要求70；第615-616页)；WO200294852(第136-137栏)；WO200238766(权利要求3；第133页)；WO200224909(实施例3；图3)；交叉参考：MIM:606269；NP_443177.1；NM_052945_1；AF132600。

(27)CD22(B-细胞受体CD22-B同种型，BL-CAM，Lyb-8，Lyb8，SIGLEC-2，FLJ22814，Genbank登录号AK026467)；Wilson等人(1991)J.Exp.Med.173:137-146；WO2003072036(权利要求1；图1)；交叉参考：MIM:107266；NP_001762.1；NM_001771_1。

(28)CD79a(CD79A，CD79α，免疫球蛋白相关α，一种与Igβ(CD79B)共价相互作用并与Ig M分子形成表面复合物的B细胞特异性蛋白，其转导参与B细胞分化的信号)，pI：4.84，MW：25028TM：2[P]基因染色体：19q13.2，Genbank登录号NP_001774.10)WO2003088808，US20030228319；WO2003062401(权利要求9)；US2002150573(权利要求4，第13-14页)；WO9958658(权利要求13，图16)；WO9207574(图1)；US5644033；Ha等人(1992)J.Immunol.148(5):1526-1531；Mueller等人(1992)Eur.J.Biochem.22:1621-1625；Hashimoto等人(1994)Immunogenetics40(4):287-295；Preud’homme等人(1992)Clin.Exp.Immunol.90(1):141-146；Yu等人(1992)J.Immunol.148(2)633-637；Sakaguchi等人(1988)EMBO J.7(11):3457-3464。

(29)CXCR5(伯基特淋巴瘤受体1，一种由CXCL13趋化因子激活的G蛋白偶联受体，在淋巴细胞迁移和体液防御中起作用，在HIV-2感染中起作用并且可能在AIDS、淋巴瘤、骨髓瘤和白血病的发展中中起作用)；372aa，pI：8.54MW：41959TM：7[P]基因染色体：11q23.3，Genbank登录号NP_001707.1)WO2004040000；WO2004015426；US2003105292(实施例2)；US6555339(实施例2)；WO200261087(图1)；WO200157188(权利要求20，第269页)；WO200172830(第12-13页)；WO200022129(实施例1，第152-153页，实施例2，第254-256页)；WO9928468(权利要求1，第38页)；US5440021(实施例2，第49-52栏)；WO9428931(第56-58页)；WO9217497(权利要求7，图5)；Dobner等人(1992)Eur.J.Immunol.22:2795-2799；Barella等人(1995)Biochem.J.309:773-779。

(30)HLA-DOB(MHC II类分子的β亚基(Ia抗原)，其结合肽并将它们呈递到CD4+T淋巴细胞)；273aa,pI:6.56,MW:30820.TM:1[P]基因染色体：6p21.3,Genbank登录号NP_002111.1)Tonnelle等人(1985)EMBO J.4(11):2839-2847；Jonsson等人(1989)Immunogenetics 29(6):411-413；Beck等人(1992)J.Mol.Biol.228:433-441；Strausberg等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci USA99:16899-16903；Servenius等人(1987)J.Biol.Chem.262:8759-8766；Beck等人(1996)J.Mol.Biol.255:1-13；Naruse等人(2002)Tissue Antigens 59:512-519；WO9958658(权利要求13,图15)；US6153408(第35-38栏)；US5976551(第168-170栏)；US6011146(第145-146栏)；Kasahara等人(1989)Immunogenetics30(1):66-68；Larhammar等人(1985)J.Biol.Chem.260(26):14111-14119。

(31)P2X5(嘌呤能受体P2X配体门控离子通道5，由胞外ATP门控的离子通道，可能涉及突触传递和神经发生，缺陷可能有助于特发性逼尿肌不稳定的病理生理状况)；422aa),pI:7.63,MW:47206TM:1[P]基因染色体：17p13.3,Genbank登录号NP_002552.2)Le等人(1997)FEBS Lett.418(1-2):195-199；WO2004047749；WO2003072035(权利要求10)；Touchman等人(2000)Genome Res.10:165-173；WO200222660(权利要求20)；WO2003093444(权利要求1)；WO2003087768(权利要求1)；WO2003029277(第82页)。

(32)CD72(B细胞分化抗原CD72，Lyb-2)蛋白质序列完整配基...tafrfpd(1..359；359aa)，pI：8.66，MW：40225TM：1[P]基因染色体：9p13.3，Genbank登录号NP_001773.1)WO2004042346(权利要求65)；WO2003026493(第51-52,57-58页)；WO200075655(第105-106页)；Von Hoegen等人(1990)J.Immunol.144(12):4870-4877；Strausberg等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci USA 99:16899-16903。

(33)LY64(淋巴细胞抗原64(RP105)，富含亮氨酸重复序列(LRR)家族的I型膜蛋白，调节B细胞活化和细胞凋亡，功能的丧失与患有***性红斑狼疮的患者的疾病活性增加相关)；661aa，pI:6.20，MW:74147TM:1[P]基因染色体：5q12,Genbank登录号NP_005573.1)US2002193567；WO9707198(权利要求11，第39-42页)；Miura等人(1996)Genomics 38(3):299-304；Miura等人(1998)Blood 92:2815-2822；WO2003083047；WO9744452(权利要求8,第57-61页)；WO200012130(第24-26页)。

(34)FcRH1(Fc受体样蛋白1，免疫球蛋白Fc结构域的推定受体，其包含C2型Ig样和ITAM结构域，在B-淋巴细胞20分化中可以具有作用)；429aa，pI:5.28，MW:46925TM:1[P]基因染色体：1q21-1q22，Genbank登录号NP_443170.1)WO2003077836；WO200138490(权利要求6，图18E-1-18-E-2)；Davis等人(2001)Proc.Natl.Acad.Sci USA 98(17):9772-9777；WO2003089624(权利要求8)；EP1347046(权利要求1)；WO2003089624(权利要求7)。

(35)IRTA2(免疫球蛋白超家族受体易位相关2，在B细胞发育和淋巴瘤发生中可能有作用的推定的免疫受体；由易位引起的基因失调发生在一些B细胞恶性疾病中)；977aa，pI:6.88，MW:106468，TM:1[P]基因染色体：1q21，Genbank登录号人:AF343662，AF343663，AF343664，AF343665，AF369794，AF397453，AK090423，AK090475，AL834187，AY358085；小鼠:AK089756，AY158090，AY506558；NP_112571.1.WO2003024392(权利要求2，图97)；Nakayama等人(2000)Biochem.Biophys.Res.Commun.277(1):124-127；WO2003077836；WO200138490(权利要求3，图18B-1-18B-2)。

(36)TENB2(TMEFF2，tomoregulin，TPEF，HPP1，TR，假定的跨膜蛋白聚糖，与EGF/调蛋白家族生长因子和卵泡抑素有关)；374aa，NCBI登录号：AAD55776，AAF91397，AAG49451，NCBI RefSeq：NP_057276；NCBI基因：23671；OMIM：605734；SwissProt Q9UIK5；Genbank登录号AF179274；AY358907，CAF85723，CQ782436，WO2004074320(SEQ ID NO 810)；JP2004113151(SEQ ID NOS 2,4,8)；WO2003042661(SEQ ID NO580)；WO2003009814(SEQ IDNO 411)；EP1295944(第69-70页)；WO200230268(第329页)；WO200190304(SEQ ID NO2706)；US2004249130；US2004022727；WO2004063355；US2004197325；US2003232350；US2004005563；US2003124579；Horie等人(2000)Genomics 67:146-152；Uchida等人(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.266:593-602；Liang等人(2000)Cancer Res.60:4907-12；Glynne-Jones等人(2001)Int J Cancer.Oct 15；94(2):178-84。

(37)PMEL17(银同系物；SILV；D12S53E；PMEL17；SI；SIL)；ME20；gp100)BC001414；BT007202；M32295；M77348；NM_006928；McGlinchey，R.P.等人(2009)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106(33),13731-13736；Kummer,M.P.等人(2009)J.Biol.Chem.284(4),2296-2306。

(38)TMEFF1(具有EGF样和跨膜蛋白抑制素样结构域1的跨膜蛋白；Tomoregulin-1)；H7365；C9orf2；C9ORF2；U19878；X83961；NM_080655；NM_003692；Harms,P.W.(2003)Genes Dev.17(21),2624-2629；Gery,S.等人(2003)Oncogene 22(18):2723-2727。

(39)GDNF-Ra1(GDNF家族受体α1；GFRA1；GDNFR；GDNFRA；RETL1；TRNR1；RET1L；GDNFR-α1；GFR-α-1)；U95847；BC014962；NM_145793NM_005264；Kim，M.H.等人(2009)Mol.Cell.Biol.29(8),2264-2277；Treanor,J.J.等人(1996)Nature 382(6586):80-83。

(40)Ly6E(淋巴细胞抗原6复合物，基因座E；Ly67，RIG-E，SCA-2，TSA-1)；NP_002337.1；NM_002346.2；de Nooij-van Dalen，A.G.等人(2003)Int.J.Cancer 103(6),768-774；Zammit,D.J.等人(2002)Mol.Cell.Biol.22(3):946-952。

(41)TMEM46(shisa同系物2(非洲爪蛙)；SHISA2)；NP_001007539.1；NM_001007538.1；Furushima，K.等人(2007)Dev.Biol.306(2),480-492；Clark,H.F.等人(2003)Genome Res.13(10):2265-2270。

(42)Ly6G6D(淋巴细胞抗原6复合物，基因座G6D；Ly6-D，MEGT1)；NP_067079.2；NM_021246.2；Mallya,M.等人(2002)Genomics 80(1):113-123；Ribas,G.等人(1999)J.Immunol.163(1):278-287。

(43)LGR5(含有富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5；GPR49，GPR67)；NP_003658.1；NM_003667.2；Salanti,G.等人(2009)Am.J.Epidemiol.170(5):537-545；Yamamoto,Y.等人(2003)Hepatology 37(3):528-533。

(44)RET(ret原癌基因；MEN2A；HSCR1；MEN2B；MTC1；PTC；CDHF12；Hs.168114；RET51；RET-ELE1)；NP_066124.1；NM_020975.4；Tsukamoto,H.等人(2009)Cancer Sci.100(10):1895-1901；Narita,N.等人(2009)Oncogene 28(34):3058-3068。

(45)LY6K(淋巴细胞抗原6复合物，基因座K；LY6K；HSJ001348；FLJ35226)；NP_059997.3；NM_017527.3；Ishikawa,N.等人(2007)Cancer Res.67(24):11601-11611；deNooij-van Dalen,A.G.等人(2003)Int.J.Cancer 103(6):768-774。

(46)GPR19(G蛋白偶联受体19；Mm.4787)；NP_006134.1；NM_006143.2；Montpetit,A.和Sinnett,D.(1999)Hum.Genet.105(1-2):162-164；O'Dowd,B.F.等人(1996)FEBSLett.394(3):325-329。

(47)GPR54(KISS1受体；KISS1R；GPR54；HOT7T175；AXOR12)；NP_115940.2；NM_032551.4；Navenot,J.M.等人(2009)Mol.Pharmacol.75(6):1300-1306；Hata,K.等人(2009)Anticancer Res.29(2):617-623。

(48)ASPHD1(含有天冬氨酸β-羟化酶结构域的1；LOC253982)；NP_859069.2；NM_181718.3；Gerhard,D.S.等人(2004)Genome Res.14(10B):2121-2127。

(49)酪氨酸酶(TYR；OCAIA；OCA1A；酪氨酸酶；SHEP3)；NP_000363.1；NM_000372.4；Bishop,D.T.等人(2009)Nat.Genet.41(8):920-925；Nan,H.等人(2009)Int.J.Cancer 125(4):909-917。

(50)TMEM118(环指蛋白，跨膜2；RNFT2；FLJ14627)；NP_001103373.1；NM_001109903.1；Clark，H.F.等人(2003)Genome Res.13(10):2265-2270；Scherer,S.E.等人(2006)Nature 440(7082):346-351。

(51)GPR172A(G蛋白偶联受体172A；GPCR41；FLJ11856；D15Ertd747e)；NP_078807.1；NM_024531.3；Ericsson,T.A.等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(11):6759-6764；Takeda,S.等人(2002)FEBS Lett.520(1-3):97-101。

(52)CD33是唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素家族的成员，是一种67-kDa的糖基化跨膜蛋白。除了定型的骨髓单核细胞和红系祖细胞之外，CD33在大多数骨髓细胞和单核细胞白血病细胞上表达。它在最早的多能干细胞、成熟粒细胞、淋巴样细胞或非造血细胞上未见到(Sabbath等人(1985)J.Clin.Invest.75:756-56；Andrews等人,(1986)Blood 68:1030-5)。CD33在其胞质尾部含有两个酪氨酸残基，每个残基后面跟着与许多抑制性受体中所见的免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)相似的疏水残基。

(53)CLL-1(CLEC12A，MICL和DCAL2)，其编码C型凝集素/C型凝集素样结构域(CTL/CTLD)超家族的成员。这个家族的成员拥有共同的蛋白质折叠，并具有不同的功能，例如细胞粘附、细胞信号传导、糖蛋白转换以及炎症和免疫应答中的作用。由该基因编码的蛋白质是粒细胞和单核细胞功能的负调节剂。已经描述了该基因的几种可变剪接转录物变体，但是其中一些变体的全长性尚未确定。该基因与染色体12p13上的自然杀伤基因复合物区域中的其他CTL/CTLD超家族成员紧密连锁(Drickamer K(1999)Curr.Opin.Struct.Biol.9(5):585–90；van Rhenen A等人,(2007)Blood 110(7):2659–66；Chen CH等人(2006)Blood107(4):1459–67；Marshall AS等人(2006)Eur.J.Immunol.36(8):2159–69；Bakker AB等人(2005)Cancer Res.64(22):8443–50；Marshall AS,等人(2004)J.Biol.Chem.279(15):14792–802)。已经显示CLL-1是II型跨膜受体，其包含单一C型凝集素样结构域(预测其不结合钙或糖)、茎区、跨膜结构域和含有ITIM基序的短胞质尾部。

抗体衍生物

在某些实施方案中，可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域已知的且易于获得的额外非蛋白质部分。适于使抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/顺丁烯二酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)，以及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性可具有制造优势。所述聚合物可具有任何分子量，并且可为分支或未分支的。连接到抗体的聚合物的数目可变化，并且如果连接多于一个聚合物，那么其可为相同或不同分子。一般说来，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可基于包括但不限于有待改善的抗体的特定特性或功能、抗体衍生物是否将在确定条件下用于疗法中等考虑因素加以确定。

在另一个实施方案中，提供抗体与可通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白质部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可具有任何波长，并且包括但不限于不损害普通细胞但会将非蛋白质部分加热至杀死邻近于抗体-非蛋白质部分的细胞的温度的波长。

可使用例如如US 4816567中所述的重组方法和组合物来产生抗体。此类核酸可编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在又一个实施方案中，提供一种或多种包含此类核酸的载体(例如表达载体)。在又一个实施方案中，提供包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如已用以下转化)：(1)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。

对于抗体的重组产生，将编码抗体的核酸(例如如上文所描述的)分离，并***一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸可易于使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)进行分离和测序。

适于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，抗体可在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还参见Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ,2003),第245-254页，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。)在表达之后，可从可溶性部分中的细菌细胞糊状物中分离抗体并且可将其进一步纯化。

除原核生物之外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物也为适于抗体编码性载体的克隆或表达宿主，包括糖基化路径已被“人源化”从而产生具有部分或完全人糖基化形式的抗体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004),及Li等人,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。

适于表达糖基化抗体的宿主细胞还来源于多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴别可与昆虫细胞联合使用，尤其是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的众多杆状病毒株。

植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIES^TM技术)。

脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，可使用适于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是由SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系；人胚胎肾系(例如，在Graham等人J.Gen Virol.36:59(1977)中所述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(TM4细胞，如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠***肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如Mather等Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR^-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适合于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu,Methods inMolecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ),第255-268页(2003)。

抗体-药物缀合物

本发明提供了具有与一种或多种加利车霉素衍生物化合物缀合的抗体的抗体-药物缀合物。更具体地说，本公开提供了一种抗体-药物缀合物，其中加利车霉素衍生物化合物通过共价键直接缀合至抗体，而不是更常规的接头、接头-间隔子、接头-反应性基团等手段。

抗体-药物缀合物允许将药物部分靶向递送至肿瘤，并且在一些实施方案中，导致在所述肿瘤中细胞内积聚，其中全身施用未缀合的药物可能导致对正常细胞的不可接受的毒性水平(Polakis P.(2005)Current Opinion in Pharmacology 5：382-387)。

抗体-药物缀合物为靶向化疗分子，其通过使有效细胞毒性药物靶向表达抗原的肿瘤细胞而组合抗体与细胞毒性药物两者的性质(Teicher,B.A.(2009)Current CancerDrug Targets 9:982-1004)，由此通过使功效增至最大且使脱靶毒性降至最低来增强治疗指数(Carter,P.J.和Senter P.D.(2008)The Cancer Jour.14(3):154-169；Chari,R.V.(2008)Acc.Chem.Res.41:98-107)。

本发明的抗体-药物缀合物化合物包括具有抗癌活性的化合物。在一些实施方案中，抗体-药物缀合物化合物包括与加利车霉素药物部分或衍生物直接缀合的抗体(即，在失去离去基团之后，抗体直接连接或结合至加利车霉素药物部分或衍生物并且没有在其之间存在的连接基团或部分)。本发明的抗体-药物缀合物将有效剂量的药物选择性递送至肿瘤组织，由此可实现更高的选择性(即，更低的有效剂量)，同时增加治疗指数(“治疗窗”)。

如下所述，抗体-药物缀合物化合物的示例性实施方案包含靶向肿瘤细胞的抗体(Ab)和通过共价键直接连接到其上的加利车霉素药物部分(D)。

在这样的实施方案中，R适当地选自H、-C(O)R¹、-C(O)NR¹R²、-S(O)₂R¹和-S(O)₂NR²R¹。R¹和R²可以独立地选自氢、任选取代的C_1-6烷基和C_6-20芳基。在一些特定方面，R可以是-C(O)CH₃。p是指每Ab当量的加利车霉素当量。

在一些方面，Ab是如本文其他地方所述结合一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体的抗体。在一些其他方面，Ab选自BMPR1B、E16、STEAP1、MUC16、MPF、Napi2b、Sema 5b、PSCA hlg、ETBR、MSG783、STEAP2、TrpM4、CRIPTO、CD21、CD79b、FcRH2、HER2、NCA、MDP、IL20Rα、短蛋白聚糖、EphB2R、ASLG659、PSCA、GEDA、BAFF-R、CD22、CD79a、CXCR5、HLA-DOB、P2X5、CD72、LY64、FcRH1、FcRH5、TENB2、PMEL17、TMEFF1、GDNF-Ra1、Ly6E、TMEM46、Ly6G6D、LGR5、RET、Ly6K、GPR19、GPR54、ASPHD1、酪氨酸酶、TMEM118、GPR172A、CD33和CLL-1。在其他方面，Ab是半胱氨酸工程化抗体。合适的半胱氨酸工程化抗体是选自LC K149C、HC A140、HCA118C和HC L177C的突变体。在其他方面，Ab选自抗-HER2 4D5、抗-CD22、抗-CD33、抗-Ly6E、抗-Napi3b、抗-HER2 7C2和抗-CLL-1。

载药量由p，即式I的分子中每个抗体的药物部分的数目来表示。载药量可在每个抗体1至20个药物部分(D)的范围内。式I的抗体-药物缀合物包括缀合有一定范围(1至20个)的药物部分的抗体的集合。在一些实施方案中，可缀合于抗体的药物部分的数目受限于游离半胱氨酸残基的数目。在一些实施方案中，通过本文所述的方法将游离半胱氨酸残基引入抗体氨基酸序列中。在这样的方面，p可以是1、2、3、4、5、6、7或8以及其范围，例如1至8或2至5。在任何这样的方面，p和n是相等的(即，p＝n＝1、2、3、4、5、6、7或8，或其间的一些范围)。式I的示例性抗体-药物缀合物包括但不限于具有1、2、3或4个工程化的半胱氨酸氨基酸的抗体(Lyon,R.等人(2012)Methods in Enzym.502:123-138)。在一些实施方案中，一个或多个游离半胱氨酸残基在未使用工程化的情况下已存在于抗体中，在所述情况下，存在的游离半胱氨酸残基可用于使抗体与药物缀合。在一些实施方案中，使抗体暴露于还原条件，随后进行抗体的缀合以生成一个或多个游离半胱氨酸残基。由缀合反应获得的抗体-药物缀合物制剂中每个抗体的药物部分的平均数(DAR)可通过如质谱法、ELISA测定及HPLC的常规手段表征。还可以关于p测定抗体-药物缀合物的定量分布。在一些情况下，可以借助如反相HPLC或电泳的手段来实现均质抗体-药物缀合物(其中p是来自具有其他载药量的抗体-药物缀合物某个值)的分离、纯化以及表征。

对于一些抗体-药物缀合物，p可受限于抗体上连接位点的数目。举例来说，当连接为如本文所述某些示例性实施方案中的半胱氨酸硫醇时，抗体可仅具有一个或有限数目个半胱氨酸硫醇基，或可仅具有一个或有限数目个可供连接药物的具有足够反应性的硫醇基。在某些实施方案中，更高的载药量(例如p>5)可导致某些抗体-药物缀合物的聚集、不溶性、毒性或细胞渗透性丧失。在某些实施方案中，抗体-药物缀合物的平均载药量在1至约8；约2至约6；或约3至约5的范围内。实际上，已显示对于某些抗体-药物缀合物，每个抗体的药物部分的最佳比率可小于8，且可为约2至约5(参见例如美国专利号7,498,298)。

在某些实施方案中，少于理论最大值的药物部分在缀合反应期间与抗体缀合。如本文所讨论的，抗体可以含有例如不与药物反应的赖氨酸残基。一般说来，抗体不含许多可连接于药物部分的游离和反应性半胱氨酸硫醇基；实际上，抗体中的大多数半胱氨酸硫醇残基以二硫桥形式存在。在某些实施方案中，抗体可用如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)的还原剂在部分或完全还原性条件下还原以产生反应性半胱氨酸硫醇基。在某些实施方案中，使抗体经受变性条件以显露反应性亲核基团，如赖氨酸或半胱氨酸。

抗体-药物缀合物的负载量(药物/抗体比率)可以不同方式且例如通过以下加以控制：(i)限制药物相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制缀合反应时间或温度，及(iii)部分或限制用于半胱氨酸硫醇修饰的还原性条件。

应了解当多于一个亲核基团与药物反应时，则所得产物为具有一个或多个连接于抗体的药物部分的分布的抗体-药物缀合物化合物的混合物。每个抗体的药物平均数可通过对抗体具有特异性且对药物具有特异性的双重ELISA抗体测定由混合物计算。在混合物中的单独的抗体-药物缀合物分子可以通过质谱并通过HPLC分离，例如，疏水相互作用色谱来鉴定(参见例如McDonagh等人(2006)Prot.Engr.Design&Selection 19(7):299-307；Hamblett等人(2004)Clin.Cancer Res.10:7063-7070；Hamblett,K.J.,等人“Effect ofdrug loading on the pharmacology,pharmacokinetics,and toxicity of an anti-CD30antibody-drug conjugate,”摘要编号624,American Association for CancerResearch,2004Annual Meeting,2004年3月27-31日,Proceedings of the AACR,第45卷,2004年3月；Alley,S.C.,等人“Controlling the location of drug attachment inantibody-drug conjugates,”摘要编号627,American Association for CancerResearch,2004Annual Meeting,2004年3月27-31日,Proceedings of the AACR,第45卷,2004年3月)。在某些实施方案中，具有单一负载量值的均质抗体-药物缀合物可通过电泳或色谱从缀合混合物中分离。

在本公开的一些其他方面，提供了包含硫代吡啶基离去基团或苯并咪唑离去基团的加利车霉素衍生物组合物。这种组合物被称为“活化的加利车霉素”。然后可将活化的加利车霉素与如本文别处所述的抗体缀合。示例性加利车霉素衍生物-离去基团组合物在下面描述为式I和II：

在这样的方面，R选自H、-C(O)R¹、-C(O)NR¹R²、-S(O)₂R¹和-S(O)₂NR²R¹；R¹和R²独立地选自C₁-C₆烷基和C₆-C₂₀芳基；R³选自NO₂、Cl、F、CN、CO₂H；和Br，并且q是0、1或2。

在示例性的实施方案中，R是-C(O)CH₃。

在示例性实施方案中，R³是NO₂并且q是1。

在一个示例性实施方案中，药物中间体具有式Ia：

在另一个示例性实施方案中，药物中间体具有式IIa：

活化的加利车霉素的形成由以下方案表示，其中X是如本文其他地方所定义的离去基团：

在该反应中，加利车霉素的甲基三硫醚部分与离去基团硫醇部分反应形成二硫化物，其中S_c是加利车霉素硫原子，且S_x是指离去基团硫原子。例如在美国专利号5,053,394、5,712,374、5,714,586、5,739,116和5,767,285中给出了这种反应的实例。用于形成反应混合物的合适溶剂的非限制性实例包括极性非质子溶剂如乙腈、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和二氯甲烷。反应混合物中的加利车霉素浓度不是非常关键的，并且可以从约0.0005至约0.01mmol/mL，例如约0.0005、约0.001、约0.005或约0.01mmol/mL适当地变化。离去基团以化学计量过量存在，例如约1.1:1摩尔/摩尔、约1.5:1摩尔/摩尔、约2:1摩尔/摩尔、约2.5:1摩尔/摩尔或约3:1摩尔/摩尔。反应温度适当地为约-30℃、约-20℃、约-10℃、约0℃或约10℃及其范围，如约-30℃至约10℃、约-30℃至约0℃或约-30℃至约-10℃。完成的反应时间可以从约4小时至约4天，例如约8小时至约36小时或约18小时至约36小时适当地变化。

在本公开的一些方面中，可将活化的加利车霉素纯化并分离为固体。本领域已知纯化和分离方法，包括沉淀、结晶、过滤、离心、超滤和各种色谱技术。色谱法可涉及任何许多方法，包括例如：反相和正相；尺寸排阻；离子交换；高、中和低压液相色谱方法和装置；小规模分析；模拟移动床(SMB)和制备型薄层或厚层色谱法，以及小规模薄层和快速色谱法的技术。在一些这样的方面，可以将完成的反应混合物蒸发至干，然后再溶解于极性非质子溶剂中。溶液可以过滤，然后通过将溶液与非极性反溶剂例如己烷或环己烷合并而沉淀。然后通过过滤来收集沉淀物，任选洗涤，然后干燥。

加利车霉素-抗体缀合物的形成由以下方案表示：

在该方案中，p是指活化的加利车霉素等效物的数目，S_c是加利车霉素硫原子，X是本文其他地方定义的离去基团，S_x是离去基团硫原子，Ab是如本文其他地方所述的抗体，S_aH是如本文其他地方所述的适用于缀合的Ab游离巯基部分，n是每Ab等效物的Ab游离巯基部分的当量数。每个p和n都在本文的其他地方定义。在一些方面，Ab-(S_aH)_n可以是如本文别处所述的半胱氨酸工程化抗体和/或可以用还原剂处理以便在缀合反应中具有反应性。Ab溶解于本领域已知的生理缓冲***中，所述生理缓冲***将不会不利地影响抗体的稳定性或抗原结合特异性。在一些方面，使用磷酸盐缓冲盐水。活化的加利车霉素溶解于包含至少一种如本文其他地方所述的极性非质子溶剂的溶剂***中。在一些这样的方面，在pH 8Tris缓冲液(例如50mM Tris)中，将活化的加利车霉素溶解至约5mM、10mM、约20mM、约30mM、约40mM或约50mM以及其范围如约50mM至约50mM或约10mM至约30mM的浓度。在一些方面中，活化的加利车霉素溶于DMSO或乙腈或DMSO中。在缀合反应中，将当量过量的活化的加利车霉素溶液稀释并与冷却抗体溶液(例如约1℃至约10℃)合并。活化的加利车霉素溶液可适当地用至少一种极性非质子溶剂和至少一种极性质子溶剂稀释，其实例包括水、甲醇、乙醇、正丙醇和乙酸。在一些特定方面中，活化的加利车霉素溶解于DMSO中，并在与抗体溶液混合之前用乙腈和水稀释。加利车霉素与抗体的当量可适当地为约1.5:1、约3:1、约5:1、约10:1约15:1或约20:1及其范围，例如约1.5:1至约20:1、约1.5:1至约15:1、约1.5:1至约10:1、约3:1至约15:1、约3:1至约10:1、约5:1至约15:1或约5:1至约10:1。可以通过本领域已知的方法如LC-MS(如本文别处所述)适当地监测反应完成，并且反应通常在约1小时至约24小时内完成。反应完成后，将试剂添加到反应混合物中以猝灭反应并且封闭未反应的抗体硫醇基团。合适的试剂的实例是马来酰亚胺。

缀合后，抗体-加利车霉素缀合物可以通过本领域已知的纯化方法纯化并与未缀合的反应物和/或缀合物聚集物分离，所述纯化方法例如但不限于尺寸排阻色谱法、疏水相互作用色谱法、离子交换色谱法、色谱聚焦、超滤、离心超滤及其组合。例如，可以在纯化之前稀释抗体-加利车霉素缀合物，例如在20mM琥珀酸钠(pH 5)中。将稀释的溶液施加到阳离子交换柱上，然后用例如至少10个柱体积的20mM琥珀酸钠(pH 5)洗涤。缀合物可以适当地用PBS洗脱。

药物制剂

通常将本发明的治疗性抗体-药物缀合物的药物制剂制备成用于肠胃外施用，即以冻干制剂或水溶液的形式，以具有所需纯度并且具有一种或多种任选药学上可接受载体、赋形剂和/媒介物的单位剂量注射剂形式进行快速浓注、静脉内、肿瘤内注射(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.编辑(1980)。一般地，药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，而且包括但不限于缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐，和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性的药学上可接受的载体进一步包括间质(insterstitial)药物分散剂诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(

Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP(包括rHuPH20)和使用方法描述于美国专利公布号2005/0260186和2006/0104968中。在一方面，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。

示例性冻干抗体或免疫缀合物制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体或免疫缀合物制剂包括美国专利号6,171,586及WO2006/044908中所述的制剂，后述制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。

本文的制剂还可含有多于一种如为所治疗的具体适应症所必需的活性成分，优选为具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些。

活性成分可包封在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，在胶状药物递送***中(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)，或在粗乳状液中。此类技术公开于例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.编(1980)。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的适合实例包括含有抗体或免疫缀合物的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。

用于体内施用的制剂一般是无菌的。无菌性可例如通过经由无菌滤膜过滤容易地实现。

抗体-药物缀合物治疗方法

预期本发明的抗体-药物缀合物可用于治疗各种疾病或病症，例如特征为肿瘤抗原过表达的疾病或病症。示例性病状或过度增殖性病症包括良性或恶性实体肿瘤和血液病症例如白血病和淋巴恶性肿瘤。其他病状或过度增生性病症包括神经元、神经胶质、星形细胞、下丘脑、腺体、巨噬细胞、上皮、间质、囊胚腔、炎症性、血管生成和免疫病症(包括自身免疫性病症)。

在一个方面，本文提供的抗体-药物缀合物用于抑制癌细胞增殖的方法中，所述方法包括在允许抗体或抗体-药物缀合物结合至细胞表面的肿瘤相关抗原的条件下将所述细胞暴露于抗体-药物缀合物，由此抑制细胞增殖。在某些实施方案中，该方法是体外或体内方法。在进一步的实施方案中，细胞是淋巴细胞、成淋巴细胞、单核细胞或骨髓单核细胞。

体外细胞增殖的抑制可以使用从Promega(Madison，WI)商购的CellTiter-Glo^TM发光细胞活力测定法进行测定。所述测定基于对存在的ATP定量来测量培养物中的活细胞数目，ATP是代谢活性细胞的指示物。参见Crouch等人(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88,美国专利号6602677。该测定可以96或384孔形式进行，使其适用于自动化高通量筛选(HTS)。参见Cree等人(1995)AntiCancer Drugs6:398-404。分析过程涉及将单一试剂(CellTiter-

试剂)直接添加到培养的细胞中。这导致细胞溶解并产生由萤光素酶反应产生的发光信号。发光信号与存在的ATP量成比例，存在的ATP量与培养物中存在的活细胞的数目成正比。数据可以通过光度计或CCD相机成像设备进行记录。发光输出以相对光单位(RLU)表示。

另一方面，提供一种用作药剂的抗体-药物缀合物。在其他方面，提供一种用于治疗方法的抗体-药物缀合物。在某些实施方案中，提供了用于治疗癌症的抗体-药物缀合物。在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗个体的方法中的抗体-药物缀合物，所述方法包括向个体施用有效量的抗体-药物缀合物。在一个此类实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如下所述。

在另一方面，本发明提供抗体-免疫缀合物用于制造或制备药剂的用途。在一个实施方案中，药剂用于治疗CLL-1阳性癌症。在另一实施方案中，药剂用于治疗CLL-1阳性癌症的方法中，所述方法包括向患有CLL-1阳性癌症的个体施用有效量的所述药剂。在一个此类实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如下所述。

另一方面，本发明提供一种用于治疗癌症的方法。在一个实施方案中，该方法包括向患有此类癌症的个体施用有效量的本发明的抗体-药物缀合物，其特征在于检测肿瘤相关表达抗原。在一个此类实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，如下所述。

本发明的抗体-免疫缀合物可单独或与另外的药剂组合用于疗法中。举例来说，本发明的抗体或免疫缀合物可与至少一种另外的治疗剂共同施用。在一些实施方案中，另外的治疗剂为蒽环霉素。在一些实施方案中，蒽环霉素为柔红霉素或伊达比星。在一些实施方案中，另外的治疗剂为阿糖胞苷。在一些实施方案中，另外的治疗剂为克拉屈滨。在一些实施方案中，另外的治疗剂是氟达拉滨或拓扑替康。在一些实施方案中，另外的治疗剂是5-氮杂胞苷或地西他滨。

以上指示的这类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或分开的制剂中)以及及分开施用，在所述情况下，施用本发明的抗体或免疫缀合物可在施用另外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后进行。本发明的抗体或免疫缀合物还可与放射疗法组合使用。

本发明的抗体或免疫缀合物(及任何另外的治疗剂)可通过任何适合的手段施用，包括胃肠外、肺内及鼻内施用，且必要时，对于局部治疗来说，包括病灶内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射进行，部分地取决于施用是短暂的还是长期的。本文涵盖各种给药时间安排，包括但不限于单次施用或各种时间点内的多次施用、推注施用和脉冲输注。

本发明的抗体或免疫缀合物将以符合优良医学规范的方式配制、给药及施用。在此情形下的考虑因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、单个患者的临床病状、病症的病因、药剂递送部位、施用方法、施用时间安排和医学从业者已知的其他因素。抗体或免疫缀合物无需但任选地与一种或多种当前用于预防或治疗所述病症的药剂一起配制。这类其他药剂的有效量取决于制剂中存在的抗体或免疫缀合物的量、病症或治疗的类型及以上论述的其他因素。这些通常以如本文所述的相同剂量以及用如本文所述的施用途径，或以本文所述的剂量的约1％至99％，或以凭经验/临床上确定为适当的任何剂量且通过凭经验/临床上确定为适当的任何途径加以使用。

对于预防或治疗疾病，本发明的抗体或免疫缀合物(当单独或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)的适当剂量将取决于有待治疗疾病的类型、抗体或免疫缀合物的类型、疾病的严重性及病程、施用抗体或免疫缀合物是出于预防目的抑或治疗目的、先前疗法、患者的临床病史及对抗体或免疫缀合物的反应、以及主治医师的判断。抗体或免疫缀合物适合一次性或历经一系列治疗向患者施用。取决于疾病的类型及严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体或免疫缀合物可为向患者施用的初始候选剂量，无论例如通过一或多次分开施用或通过连续输注。取决于上述提及的因素，一个典型的日剂量可在约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围内。对于几天或更长时间内的重复施用，根据病状，治疗将通常持续直至出现期望的疾病症状抑制。抗体或免疫缀合物的一个示例性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一个或多个剂量。这类剂量可间歇施用，例如每周或每三周(例如以使患者接受约两个至约二十个，或例如约六个剂量的抗体)。可施用初始的较高负荷剂量，随后施用一次或多次较低剂量。然而，可使用其他给药方案。此疗法的进展易于通过常规技术及测定进行监测。

认为在靶细胞中，加利车霉素从抗体-加利车霉素缀合物的胞内释放是由谷胱甘肽对二硫键的还原性裂解产生的。与现有技术中已知的某些接头如酸不稳定肼接头相比，谷胱甘肽介导的释放提供了优点。更具体地说，已知谷胱甘肽的血液浓度非常低，例如在微摩尔范围内，而细胞内谷胱甘肽浓度通常高出三个数量级，例如在毫摩尔范围内。进一步认为，由于还原酶的活性增加，癌细胞中的谷胱甘肽浓度甚至更高。因此，据信本公开的加利车霉素-抗体缀合物提供改善的血流稳定性和改善的细胞内释放速率。

制品

在本发明的另一方面，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上文所描述的病症的材料。制品包含容器和容器上或与容器相关的标签或包装说明书。适合的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料。容器容纳单独的组合物或与有效治疗、预防和/或诊断病症的另一组合物组合的组合物且可具有无菌进入端口(例如容器可为具有可由皮下注射针刺穿的塞的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂为本发明的抗体或免疫缀合物。标签或包装说明书指示使用组合物来治疗选择的病症。此外，所述制品可包含(a)含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体或免疫缀合物；及(b)含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另一细胞毒性剂或另外的治疗剂。在本发明的此实施方案中的制品可以进一步包括包装说明书，其指示可以使用组合物来治疗特定的病症。或者或另外，所述制品还可包含第二(或第三)容器，其包含药学上可接受的缓冲液，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液或右旋糖溶液。它可以进一步包括从商业和用户观点来看期望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。

实施例

以下为本发明的方法和组合物的实施例。应理解，鉴于上文提供的一般性描述，可以实践各种其他实施方案。

实施例1-半胱氨酸工程化抗体的制备

对于大规模的抗体产生，在CHO细胞中产生抗体。将编码VL及VH的载体转染至CHO细胞中且通过蛋白质A亲和色谱从细胞培养基中纯化IgG。

如最初分离的，抗体中工程化的半胱氨酸残基作为具有细胞硫醇(例如谷胱甘肽)的混合二硫化物存在，因此不可用于缀合。这些抗体的部分还原(例如用DTT)，纯化和用脱氢抗坏血酸(DHAA)再氧化产生具有可用于缀合的游离半胱氨酸巯基基团的抗体，如先前例如在Junutula等人(2008)Nat.Biotechnol.26:925-932和US 2011/0301334中所述。简言之，将抗体与活化的加利车霉素药物部分组合以允许缀合至抗体的游离半胱氨酸残基。几个小时后，将抗体-药物缀合物纯化。

在某些条件下，通过在含有2mM EDTA的50mM Tris pH 7.5中，用还原剂例如DTT(Cleland试剂，二硫苏糖醇)或TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐；Getz等人(1999)Anal.Biochem.Vol 273:73-80；Soltec Ventures,Beverly,MA)处理，在37℃下持续3小时或在室温过夜，使半胱氨酸工程化抗体与药物缀合反应。用约50倍过量的DTT，使在CHO细胞中表达的全长半胱氨酸工程化的单克隆抗体(THIOMAB^TM)(Gomez等(2010)Biotechnologyand Bioeng.105(4):748-760；Gomez等(2010)Biotechnol.Prog.26:1438-1445)例如在室温下还原过夜以还原可能在新引入的半胱氨酸残基和存在于培养基中的半胱氨酸之间形成的二硫键。将还原的THIOMAB^TM稀释并负载到HiTrap S柱上的10mM乙酸钠pH 5中，并用含有0.3M氯化钠的PBS洗脱。或者，通过添加1/20体积的10％乙酸来使抗体酸化，用10mM琥珀酸pH 5稀释，负载到柱上，然后用10个柱体积的琥珀酸盐缓冲液洗涤。该柱用50mM TrispH7.5、2mM EDTA洗脱。

根据Kabat(Kabat等人，Sequences of proteins of immunological interest,(1991)第5版,US Dept of Health and Human Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD)对轻链氨基酸进行编号。根据EU编号***(Edelman等人(1969)Proc.Natl.Acad.of Sci.63(1):78-85)对重链氨基酸进行编号，除了注明为Kabat***以外。使用单字母氨基酸缩写。

由于细胞培养条件，在CHO细胞中表达的全长半胱氨酸工程化的单克隆抗体(THIOMAB^TM)带有半胱氨酸加合物(胱氨酸)或在工程化的半胱氨酸上谷胱甘肽化。为了释放工程化半胱氨酸的反应性硫醇基团，将THIOMAB^TM溶解于约pH 8.0的500mM硼酸钠和500mM氯化钠中并用约50-100倍过量的1mM TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐(Getz等人(1999)Anal.Biochem.第273卷:73-80；Soltec Ventures,Beverly,MA)在37℃还原约1-2小时。或者，将DTT用作还原剂。通过非还原性SDS-PAGE或通过变性反相HPLC PLRP柱色谱监测链间二硫键的形成。将还原的THIOMAB^TM稀释并负载到HiTrap S FF柱上的10mM乙酸钠(pH 5)中，并用含有0.3M氯化钠的PBS或含有150mM氯化钠的50mM Tris-Cl(pH 7.5)洗脱。

通过进行再氧化，在存在于亲代Mab中的半胱氨酸残基之间重新建立二硫键。将洗脱的还原THIOMAB^TM用15X或2mM脱氢抗坏血酸(dhAA)在pH 7下处理约3小时或在50mM Tris-Cl(pH7.5)中处理约3小时或在室温下用200nM至2mM硫酸铜水溶液(CuSO₄)处理过夜。可以使用本领域已知的其他氧化剂，即氧化剂和氧化条件。环境空气氧化也可能有效。这种温和的部分再氧化步骤以高保真度有效形成链内二硫键。通过Sephadex G25树脂洗脱来交换缓冲液并用含有1mM DTPA的PBS洗脱。通过从溶液的280nm处的吸光度来测定还原的抗体浓度，并且通过与DTNB(Aldrich，Milwaukee，WI)反应并确定412nm处的吸光度来测定硫醇浓度，从而检查硫醇/抗体值。

液相色谱/质谱分析在具有扩展质量范围的TSQ Quantum Triple quadrupole^TM质谱仪(Thermo Electron，San Jose California)上进行。将样品在加热至75℃的PRLP-

1000A，微孔柱(50mm×2.1mm，Polymer Laboratories，Shropshire，UK)上进行色谱。使用30-40％B(溶剂A：水中0.05％TFA，溶剂B：乙腈中0.04％TFA)的线性梯度，并使用电喷雾源直接将洗脱液电离。数据由

数据***收集，并使用

(Novatia，LLC，New Jersey)进行解卷积。在LC/MS分析之前，将抗体或药物缀合物(50微克)在37℃用PNGase F(2单位/ml；PROzyme，San Leandro，CA)处理2小时以除去N-连接的碳水化合物。

将疏水性相互作用色谱(HIC)样品注射到丁基HIC NPR柱(2.5微米粒径，4.6mm×3.5cm)(Tosoh Bioscience)上，并以0至70％B的线性梯度以0.8ml/min(A：在50mM磷酸钾(pH 7)中的1.5M硫酸铵，B：50mM磷酸钾pH 7，20％异丙醇)进行洗脱。使用配备有多波长检测器和Chemstation软件的Agilent 1100系列HPLC***来分辨和定量抗体种类，具有不同的每个抗体药物比率。

实施例2-加利车霉素与抗体的缀合

在实施例1的还原和再氧化程序之后，将半胱氨酸工程化抗体(THIOMAB^TM)溶解于PBS(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液中并在冰上冷却。将用硫醇反应性吡啶基二硫化物基团活化的过量(约1.5摩尔至20当量)加利车霉素溶解于DMSO中，用乙腈和水稀释，并添加到PBS中的冷却的还原、再氧化的抗体中。通常，将药物以在50mM Tris(pH 8)中的约20mM浓度从DMSO储备溶液中添加到抗体中并监测约1至约24小时直至反应完成，如通过反应混合物的LC-MS分析所测定。当反应完成时，添加过量的马来酰亚胺以猝灭反应并且封闭任何未反应的抗体硫醇基团。可以通过HiTrap SP FF柱来负载和洗脱缀合混合物以去除过量的药物和其他杂质。通过离心超滤来浓缩反应混合物，并通过在PBS中的G25树脂中洗脱，将半胱氨酸工程化抗体-药物缀合物纯化并脱盐，在无菌条件下通过0.2μm过滤器过滤，并冷冻保存。

例如，在用20mM琥珀酸钠(pH 5)稀释后，将粗制抗体-药物缀合物施加到阳离子交换柱。用至少10个柱体积的20mM琥珀酸钠(pH5)来洗涤柱，并用PBS洗脱抗体。使用凝胶过滤柱将抗体-药物缀合物配制到具有240mM蔗糖的20mM His/乙酸盐(pH 5)中。抗体-药物缀合物通过紫外光谱法来表征以确定蛋白质浓度，用赖氨酸C内肽酶处理之前和之后，使用分析型SEC(尺寸排阻色谱法)来进行聚集分析和LC-MS表征。

尺寸排阻色谱使用Shodex KW802.5柱在具有0.25mM氯化钾和15％IPA的0.2M磷酸钾pH 6.2中以0.75ml/min的流速进行。通过280nm洗脱峰面积吸光度的积分来确定缀合物的聚集状态。

LC-MS分析可使用Agilent QTOF 6520ESI仪器进行。作为实例，抗体-药物缀合物在37℃用Tris(pH 7.5)中的1:500w/w内蛋白酶Lys C(Promega)处理30分钟。将所得裂解片段负载到加热至80℃的

8μm(微米)PLRP-S(高度交联的聚苯乙烯)柱上，并在5分钟内用30％B至40％B的梯度洗脱。流动相A为具有0.05％TFA的H₂O，并且流动相B为具有0.04％TFA的乙腈。流速为0.5ml/min。在电喷雾电离和MS分析之前，通过在280nm的UV吸光度检测来监测蛋白质洗脱。通常实现未缀合的Fc片段、残余未缀合的Fab和药物化Fab的色谱分辨。使用Mass Hunter^TM软件(Agilent Technologies)将获得的m/z谱解卷积以计算抗体片段的质量。

实施例3-体外细胞增殖测定

抗体-药物缀合物Thio Hu抗-CD22 10F4v3LC K149C加利车霉素和Thio Hu抗-Ly6E 9B12.v12LC K149C加利车霉素的功效通过使用以下方案的细胞增殖测定来测量(CELLTITER GLO^TM发光细胞存活力测定，Promega Corp.Technical Bulletin TB288；Mendoza等人(2002)Cancer Res.62:5485-5488)：

1.将培养基中含有约10⁴个细胞(CD22-阳性BJAB，CD22-阳性WSU-DLCL2或Jurkat)的100μl细胞培养物的等分试样沉积在96孔不透明壁板的每个孔中。

2.制备含有培养基且不含细胞的对照孔。

3.将抗体-药物缀合物添加到实验孔中并孵育3-5天。

4.将板平衡至室温约30分钟。

5.添加与每个孔中存在的细胞培养基体积相等的CELLTITER GLO^TM试剂体积。

6.将内容物在定轨振荡器上混合2分钟，以诱导细胞溶解。

7.将板在室温下孵育10分钟以稳定发光信号。

8.记录发光并在图中报告为RLU＝相对发光单位。

数据在图3A至3C中绘制并示出为每组重复测试的发光的平均值，其中具有标准偏差误差棒。该方案是对CELLTITER GLO^TM发光细胞的修改。

实施例4-肿瘤生长抑制，在高表达HER2转基因外植体小鼠中的体内功效

建立肿瘤并允许在第0天单次治疗之前使其体积增长至150-200mm³(用卡尺测量)。使用卡尺根据以下公式测量肿瘤体积：V(mm³)＝0.5AXB²，其中A和B分别是长直径及短直径。在肿瘤体积达到3000mm³之前或当肿瘤显示逼近溃烂的迹象时对小鼠实施安乐死。将从每个实验组(每组10只小鼠)收集的数据表示为平均值±SE。

使用Fo5小鼠***肿瘤模型来评估本发明的抗体-药物缀合物在单次剂量静脉内注射后的体内功效，并且如先前所述(Phillips GDL,Li GM,Dugger DL等人TargetingHER2-Positive Breast Cancer with Trastuzumab-DM1,an Antibody-Cytotoxic DrugConjugate.(2008)Cancer Res.68:9280-90)，所述文献通过引用并入本文。使用Fo5模型测试抗-Her2抗体-药物缀合物，所述Fo5模型是一种人HER2基因在鼠乳腺肿瘤病毒启动子(MMTV-HER2)的转录调节下在***上皮中过表达的转基因小鼠模型。HER2过表达导致***肿瘤的自发发展。通过连续移植肿瘤片段(大小

)，在FVB小鼠后代中繁殖这些创始动物之一(5号成员[Fo5])的乳腺肿瘤。所有研究均按照实验动物护理和使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)进行。在研究开始时和在移植后14天向9只动物静脉内给药每种抗体-药物缀合物(单次剂量)。最初的肿瘤大小约为200mm³体积。

如(Chen等人(2007)Cancer Res 67：4924-4932)所述可以使用另一种***脂肪垫移植功效模型，评估单次静脉内剂量后的肿瘤体积并使用从携带腹膜内肿瘤的小鼠切除的肿瘤，然后连续传代到受体小鼠的***脂肪垫中。

可以这种方式测试的细胞系包括AU565、HCC1954、HCC1008、HCC2157、HCC202、HCC1419、HCC2218和HCC1569。

实施例5-Thio Hu抗-Ly6E LC K149C-p-硝基-PDS-加利车霉素抗体-药物缀合物 的功效

乳腺癌细胞系HCC1569(CRL-2330)获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)。HCC1569X2细胞系是针对体内生长优化的亲本HCC1569细胞系(ATCC，CRL-2330)的衍生物。将亲本HCC1569细胞皮下注射到雌性NCR裸鼠右侧侧腹，收获一个肿瘤，切碎并在体外生长，产生HCC1569XI细胞系。在雌性NCR裸鼠的右侧侧腹中再次皮下注射HCC1569XI细胞系以改进细胞系的生长。收集来自该研究的肿瘤并再次适于体外生长以产生HCC1569X2细胞系。该细胞系和来自该系的肿瘤表达Ly6E。

将SCID Beige小鼠在右侧2/3***脂肪垫中用悬浮于Hank平衡盐溶液(HBSS)和基质胶中的500万个细胞来接种。当肿瘤体积达到大约163-282mm³(第0天)时，将动物随机分成每组5只小鼠的多个组，并且以下列剂量施用媒介物对照或抗体-药物缀合物的单次静脉内(IV)注射：0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、6mg/kg和10mg/kg。给一组动物施用3mg/kg的ThioHu抗-CD22LC K149C-p-硝基-PDS-加利车霉素。每周两次测量肿瘤体积直至研究在第21天结束。测量肿瘤体积且基于使用卡尺测量的两个尺寸来计算，并且根据式：V＝0.5a×b²，用mm³为单位来表示，其中a及b分别为肿瘤的长直径及短直径。为分析相同动物随时间的肿瘤体积重复测量结果，使用混合模型化方法(参见例如Pinheiro J等人nlme:linear andnonlinear mixed effects models.2009；R package,版本3.1-96)。此方法可解决重复测量结果与归因于在研究结束之前非治疗相关移除动物的适度丢包率两者。使用三次回归样条来拟合在各剂量水平下log 2肿瘤体积的时程的非线性型态。然后使这些非线性型态与混合模式内的剂量相关联。所有动物方案皆由实验动物管理和使用委员会(InstitutionalAnimal Care and Use Committee，IACUC)批准。

实验结果如图1所示，并且表明在整个研究过程中1、3、6和10mg/kg剂量的Thio Hu抗-Ly6E LC K149C-p-硝基-PDS-加利车霉素抗体-药物缀合物减小肿瘤体积。

实施例6-Thio Hu抗-CD22 10F4v3 LC K149C-p-硝基-PDS-加利车霉素的功效

检测Thio Hu抗-CD22 10F4v3LC K149C-p-硝基-PDS-加利车霉素缀合物在WSU-DLCL2肿瘤(弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系)的小鼠异种移植模型中的抗肿瘤功效。

将雌性CB17Fox Chase SCID小鼠分别在右侧侧腹中用悬浮在Hank平衡盐溶液(HBSS)中的2000万个WSU-DLCL2细胞(DSMZ，德国微生物和细胞培养物保藏中心，Braunschweig，Germany)来接种。当异种移植肿瘤达到175-237mm³的平均肿瘤体积(第0天)时，将动物随机分组成每组5只小鼠的多个组，并且以下列剂量施用媒介物对照或抗体-药物缀合物的单次静脉内(IV)注射：0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、6mg/kg和10mg/kg。给一组动物施用3mg/kg的Thio Hu抗-LY6E 9B12.v12LC K149-p-硝基-PDS-加利车霉素。如本文别处所述，每周两次测量肿瘤体积，直到21天时研究结束。所有动物方案皆由实验动物管理和使用委员会(IACUC)批准。

实验结果如图2所示，并且表明在整个研究过程中1、3、6和10mg/kg剂量的Thio Hu抗-CD22 10F4v3LC K149C-p-硝基-PDS-加利车霉素减小体积。

实施例7-另外的功效研究

实施例7评估了相对于用Thio Hu抗-Ly6E 9B12.v12LC K149C加利车霉素缀合物的非靶向对照，用针对CD22阳性伯基特氏淋巴瘤细胞(“BJAB”)和针对CD22阳性人弥漫大B细胞淋巴瘤来源的细胞系(WSU-DLCL2)的Thio Hu抗-CD22 10F4v3LC K149C加利车霉素缀合物的靶向对照的功效。每种缀合物的平均药物与抗体比率(“DAR”)为1.7。还评估了每种缀合物针对Jurkat的非靶向对照的功效。

BJAB、WSU-DLCL2和Jurkat细胞的IC₅₀功效结果分别描述于图3A至3C中。结果显示用Thio Hu抗-CD22 10F4v3LC K149C-加利车霉素处理CD22阳性BJAB和WSU-DLCL2细胞系提供了双位数功效，与用Thio Hu抗-Ly6E 9B12.v12LC K149C-加利车霉素对于BJAB和WSU-DLCL2的非靶向对照的功效相比，所述功效分别>1500倍以上和>2000倍以上。结果进一步显示Thio Hu抗-CD22 10F4v3LC K149C-加利车霉素和Thio Hu抗-Ly6E 9B12.v12LC K149C-加利车霉素对于Jurkat细胞各自基本上是无效的。在下表中报道了IC₅₀结果，其中“ADC”是指抗体-药物缀合物，“Thio Hu抗-CD22”是指Thio Hu抗-CD22 10F4v3LC K149C加利车霉素，且“Thio Hu抗-Ly6E”是指Thio Hu Hu抗-Ly6E 9B12.v12LC K149C加利车霉素。

尽管上述本发明已出于清楚理解的目的通过说明和实例方式详细描述，但描述和实施例不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容皆以全文引用的方式明确并入本文。

当介绍本公开或其一个或多个优选实施方案的要素时，冠词“一个/种(a/an)”、“所述/该(the/said)”意图意指存在一个或多个要素。术语“包括”、“包含”和“具有”意在是包括性的，并且意指除所列出的要素之外可存在另外的要素。

本说明书使用实例来公开本发明，包括最佳模式，同时也让本领域的任何技术人员能够实践本发明，包括制造并使用任何装置或***，以及实施所涵盖的任何方法。本发明的保护范围由权利要求书限定，并可包含所属领域的技术人员想到的其他实例。如果其他此类实例的结构要素与权利要求书的字面意义相同，或如果此类实例包含的等效结构要素与权利要求书的字面意义无实质差别，则此类实例也应在权利要求书的范围内。

Claims (17)

1.一种式I或式II的药物中间体组合物：

其中R选自H、-C(O)R¹、-C(O)NR¹R²、-S(O)₂R¹和-S(O)₂NR²R¹；R¹和R²独立地选自C₁-C₆烷基和C_6-C₂₀芳基；R³选自NO₂、Cl、F、CN、CO₂H和Br；并且q是0、1或2。

2.根据权利要求1所述的药物中间体组合物，其中R是-C(O)CH₃。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的药物中间体组合物，其中R³是NO₂且q是1。

4.根据权利要求3所述的药物中间体组合物，其具有式Ia：

5.根据权利要求1或权利要求2所述的药物中间体组合物，其具有式IIa：

6.一种具有式III的抗体-药物缀合物化合物：

或其药学上可接受的盐，其中

R选自H、-C(O)R¹、-C(O)NR¹R²、-S(O)₂R¹和-S(O)₂NR²R¹；

R¹和R²独立地选自C₁-C₆烷基和C₆-C₂₀芳基；

p为1至8的整数；

Ab是与选自(1)-(53)的一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体结合的半胱氨酸工程化抗体：

(1)BMPR1B(骨形成蛋白受体IB型)；

(2)E16(LAT1，SLC7A5)；

(3)STEAP1(***的六跨膜上皮抗原)；

(4)MUC16(0772P，CA125)；

(5)MPF(MPF，MSLN，巨核细胞强化因子，间皮素)；

(6)Napi2b(NAPI-3B；NPTIIb；SLC34A2；溶质载体家族34(磷酸钠)，成员2；II型钠依赖性磷酸盐转运蛋白3b)；

(7)Sema 5b(FLJ10372，KIAA1445，Mm.42015，SEMA5B，SEMAG，脑信号蛋白5b Hlog，sema结构域，七凝血栓蛋白重复序列(1型和1型样的)，跨膜结构域(TM)和短胞质结构域，(脑信号蛋白)5B)；

(8)PSCA hlg(2700050C12Rik，C530008O16Rik，RIKEN cDNA 2700050C12，RIKEN cDNA2700050C12基因)；

(9)ETBR(内皮素B型受体)；

(10)MSG783(RNF124，假定蛋白FLJ20315)；

(11)STEAP2(IPCA-1，PCANAP1，STAMP1，STEAP2，STMP，***癌相关基因1，***癌相关蛋白1，***的六跨膜上皮抗原2，六跨膜***蛋白)；

(12)TrpM4(BR22450；FLJ20041；TRPM4；TRPM4B；瞬时受体电位阳离子通道，亚家族M，成员4)；

(13)CRIPTO(CR，CR1，CRGF，CRIPTO，TDGF1，畸胎癌衍生的生长因子)；

(14)CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/埃-巴二氏病毒受体)或Hs 73792)；

(15)CD79b(CD79B，CD79β，IGb(免疫球蛋白相关β)，B29)；

(16)FcRH2(IFGP4，IRTA4，SPAP1A(含SH2结构域的磷酸酶锚定蛋白1a)，SPAP1B，SPAP1C)；

(17)HER2；

(18)NCA；

(19)MDP；

(20)IL20Rα；

(21)短蛋白聚糖；

(22)EphB2R；

(23)ASLG659；

(24)PSCA；

(25)GEDA；

(26)BAFF-R(B细胞活化因子受体，BLyS受体3，BR3)；

(27)CD22(B细胞受体CD22-B同种型)；

(28)CD79a(CD79A，CD79α，免疫球蛋白相关α)；

(29)CXCR5(伯基特淋巴瘤受体1)；

(30)HLA-DOB(MHC II类分子的β亚基(Ia抗原))；

(31)P2X5(嘌呤能受体P2X配体门控离子通道5)；

(32)CD72(B细胞分化抗原CD72，Lyb-2)；

(33)LY64(淋巴细胞抗原64(RP105)，富含亮氨酸重复序列(LRR)家族的I型膜蛋白)；

(34)FcRH1(Fc受体样蛋白1)；

(35)FcRH5(IRTA2，免疫球蛋白超家族受体易位相关2)；

(36)TENB2(推定的跨膜蛋白聚糖)；

(37)PMEL17(银同系物；SILV；D12S53E；PMEL17；SI；SIL)；

(38)TMEFF1(具有EGF样和两个卵泡抑素样结构域的跨膜蛋白1；Tomoregulin-1)；

(39)GDNF-Ra1(GDNF家族受体α1；GFRA1；GDNFR；GDNFRA；RETL1；TRNR1；RET1L；GDNFR-α1；GFR-α-1)；

(40)Ly6E(淋巴细胞抗原6复合物，基因座E；Ly67，RIG-E，SCA-2，TSA-1)；

(41)TMEM46(shisa同系物2(非洲爪蛙)；SHISA2)；

(42)Ly6G6D(淋巴细胞抗原6复合物，基因座G6D；Ly6-D，MEGT1)；

(43)LGR5(含有富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5；GPR49，GPR67)；

(44)RET(ret原癌基因；MEN2A；HSCR1；MEN2B；MTC1；PTC；CDHF12；Hs.168114；RET51；RET-ELE1)；

(45)LY6K(淋巴细胞抗原6复合物，基因座K；LY6K；HSJ001348；FLJ35226)；

(46)GPR19(G蛋白偶联受体19；Mm.4787)；

(47)GPR54(KISS1受体；KISS1R；GPR54；HOT7T175；AXOR12)；

(48)ASPHD1(含有天冬氨酸β-羟化酶结构域的多肽1；LOC253982)；

(49)酪氨酸酶(TYR；OCAIA；OCA1A；酪氨酸酶；SHEP3)；

(50)TMEM118(环指蛋白，跨膜2；RNFT2；FLJ14627)；

(51)GPR172A(G蛋白偶联受体172A；GPCR41；FLJ11856；D15Ertd747e)；

(52)CD33；和

(53)CLL-1，并且

其中所述半胱氨酸工程化抗体是选自LC K149C、HC A140、HC A118C和HC L177C的突变体。

7.根据权利要求6所述的抗体-药物缀合物化合物或其药学上可接受的盐，其中Ab选自抗-HER2 4D5、抗-CD22、抗-CD33、抗-Ly6E、抗-Napi3b、抗-HER2 7C2和抗-CLL-1。

8.根据权利要求6或7所述的抗体-药物缀合物化合物或其药学上可接受的盐，其中p为1、2、3或4。

9.根据权利要求6或7所述的抗体-药物缀合物化合物或其药学上可接受的盐，其包含所述抗体-药物缀合物化合物的混合物，其中在抗体-药物缀合物化合物的所述混合物中每个抗体的平均载药量为2至5。

10.一种药物组合物，其包含根据权利要求6至9中任一项所述的抗体-药物缀合物化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。

11.根据权利要求10所述的药物组合物，其进一步包含治疗有效量的化疗剂。

12.根据权利要求6至9中任一项所述的抗体-药物缀合物化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗哺乳动物的癌症的药物中的用途。

13.根据权利要求10所述的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

14.根据权利要求13所述的用途，其中所述药物组合物与化疗剂组合使用。

15.一种制备根据权利要求6所述的抗体-药物缀合物化合物的方法，所述方法包括：

(a)使与选自(1)-(53)的一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体结合的半胱氨酸工程化抗体：

(1)BMPR1B(骨形成蛋白受体IB型)；

(2)E16(LAT1，SLC7A5)；

(3)STEAP1(***的六跨膜上皮抗原)；

(4)MUC16(0772P，CA125)；

(5)MPF(MPF，MSLN，巨核细胞强化因子，间皮素)；

(6)Napi2b(NAPI-3B；NPTIIb；SLC34A2；溶质载体家族34(磷酸钠)，成员2；II型钠依赖性磷酸盐转运蛋白3b)；

(7)Sema 5b(FLJ10372，KIAA1445，Mm.42015，SEMA5B，SEMAG，脑信号蛋白5b Hlog，sema结构域，七凝血栓蛋白重复序列(1型和1型样的)，跨膜结构域(TM)和短胞质结构域，(脑信号蛋白)5B)；

(8)PSCA hlg(2700050C12Rik，C530008O16Rik，RIKEN cDNA2700050C12，RIKEN cDNA2700050C12基因)；

(9)ETBR(内皮素B型受体)；

(10)MSG783(RNF124，假定蛋白FLJ20315)；

(11)STEAP2(IPCA-1，PCANAP1，STAMP1，STEAP2，STMP，***癌相关基因1，***癌相关蛋白1，***的六跨膜上皮抗原2，六跨膜***蛋白)；

(12)TrpM4(BR22450；FLJ20041；TRPM4；TRPM4B；瞬时受体电位阳离子通道，亚家族M，成员4)；

(13)CRIPTO(CR，CR1，CRGF，CRIPTO，TDGF1，畸胎癌衍生的生长因子)；

(14)CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/埃-巴二氏病毒受体)或Hs 73792)；

(15)CD79b(CD79B，CD79β，IGb(免疫球蛋白相关β)，B29)；

(16)FcRH2(IFGP4，IRTA4，SPAP1A(含SH2结构域的磷酸酶锚定蛋白1a)，SPAP1B，SPAP1C)；

(17)HER2；

(18)NCA；

(19)MDP；

(20)IL20Rα；

(21)短蛋白聚糖；

(22)EphB2R；

(23)ASLG659；

(24)PSCA；

(25)GEDA；

(26)BAFF-R(B细胞活化因子受体，BLyS受体3，BR3)；

(27)CD22(B细胞受体CD22-B同种型)；

(28)CD79a(CD79A，CD79α，免疫球蛋白相关α)；

(29)CXCR5(伯基特淋巴瘤受体1)；

(30)HLA-DOB(MHC II类分子的β亚基(Ia抗原))；

(31)P2X5(嘌呤能受体P2X配体门控离子通道5)；

(32)CD72(B细胞分化抗原CD72，Lyb-2)；

(33)LY64(淋巴细胞抗原64(RP105)，富含亮氨酸重复序列(LRR)家族的I型膜蛋白)；

(34)FcRH1(Fc受体样蛋白1)；

(35)FcRH5(IRTA2，免疫球蛋白超家族受体易位相关2)；

(36)TENB2(推定的跨膜蛋白聚糖)；

(37)PMEL17(银同系物；SILV；D12S53E；PMEL17；SI；SIL)；

(38)TMEFF1(具有EGF样和两个卵泡抑素样结构域的跨膜蛋白1；Tomoregulin-1)；

(39)GDNF-Ra1(GDNF家族受体α1；GFRA1；GDNFR；GDNFRA；RETL1；TRNR1；RET1L；GDNFR-α1；GFR-α-1)；

(40)Ly6E(淋巴细胞抗原6复合物，基因座E；Ly67，RIG-E，SCA-2，TSA-1)；

(41)TMEM46(shisa同系物2(非洲爪蛙)；SHISA2)；

(42)Ly6G6D(淋巴细胞抗原6复合物，基因座G6D；Ly6-D，MEGT1)；

(43)LGR5(含有富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5；GPR49，GPR67)；

(44)RET(ret原癌基因；MEN2A；HSCR1；MEN2B；MTC1；PTC；CDHF12；Hs.168114；RET51；RET-ELE1)；

(45)LY6K(淋巴细胞抗原6复合物，基因座K；LY6K；HSJ001348；FLJ35226)；

(46)GPR19(G蛋白偶联受体19；Mm.4787)；

(47)GPR54(KISS1受体；KISS1R；GPR54；HOT7T175；AXOR12)；

(48)ASPHD1(含有天冬氨酸β-羟化酶结构域的多肽1；LOC253982)；

(49)酪氨酸酶(TYR；OCAIA；OCA1A；酪氨酸酶；SHEP3)；

(50)TMEM118(环指蛋白，跨膜2；RNFT2；FLJ14627)；

(51)GPR172A(G蛋白偶联受体172A；GPCR41；FLJ11856；D15Ertd747e)；

(52)CD33；和

(53)CLL-1

(b)与式I或式II的药物中间体反应

其中：R选自H、-C(O)R¹、-C(O)NR¹R²、-S(O)₂R¹和-S(O)₂NR²R¹；R¹和R²独立地选自C₁-C₆烷基和C₆-C₂₀芳基；R³选自NO₂、Cl、F、CN、CO₂H和Br；并且q是0、1或2，

其中所述半胱氨酸工程化抗体是选自LC K149C、HC A140、HC A118C和HC L177C的突变体，并且

其中式I或式II的药物中间体与抗体的当量为1.5:1至10:1。

16.根据权利要求15所述的方法，其中Ab选自抗-HER2 4D5、抗-CD22、抗-CD33、抗-Ly6E、抗-Napi3b、抗-HER2 7C2和抗-CLL-1。

17.一种制品，其包含根据权利要求10所述的药物组合物、容器和指示所述药物组合物可用于治疗癌症的包装说明书或标签。

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