CN108065411A - 一种从沙棘中提取的活性多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从沙棘中提取的活性多肽，活性多肽的分子量介于3‑10KD之间，活性多肽的提取方法包括：原料预处理、种子粉脱脂、初次酶解、二次酶解、纯化，强沙棘籽脱脂后以碱性蛋白酶初步酶解，然后在双频率超声波与微波辐射交替间隔辅助酶解的条件下以胃蛋白酶二次酶解，将酶解液经超滤膜提纯即得活性多肽。有益效果为：在酶解反应中程添加的（S）‑1‑氨基‑2‑羟甲基二氢吲哚在较强酸性环境下可以发生二聚合、三聚合反应，聚合产物可以与胃蛋白酶产生亲电作用，防止胃蛋白酶蛋白质结构发生变化，从而防止其活性的减低，加快酶解反应的进行。
Description
技术领域
本发明涉及活性多肽的制备领域，尤其是涉及一种从沙棘中提取的活性多肽。
技术背景
沙棘是一种落叶性灌木，其特性是耐旱、抗风沙，可以在盐碱化土地上生存，因此被广泛用于水土保持。中国西北部大量种植沙棘，用于沙漠绿化。沙棘果实中维生素C含量高，素有维生素C之王的美称，沙棘是植物和其果实的统称，植物沙棘为胡颓子科沙棘属，是一种落叶性灌木。国内分布于华北、西北、西南等地，沙棘为药食同源植物。沙棘的根、茎、叶、花、果，特别是沙棘果实含有丰富的营养物质和生物活性物质，可以广泛应用于食品、医药、轻工、航天、农牧鱼业等国民经济的许多领域。沙棘果实入药具有止咳化痰、健胃消食、活血散瘀之功效。现代医学研究，沙棘可降低胆固醇，缓解心绞痛发作，还有防治冠状动脉粥样硬化性心脏病的作用。沙棘果和油具有很高的药用价值，可降低胆固醇，治愈心绞痛等作用，还有防治冠状动脉粥样硬化性心脏病的作用；有祛痰、止咳、平喘和治疗慢性气管炎的作用；能治疗胃和十二指肠溃疡以及消化不良等，对慢性浅表性胃炎、萎缩性胃炎、结肠炎等病症疗效显著；对烧伤、烫伤、刀烧、冻伤有很好的治疗作用；对妇女***有良好的治疗效果。
关于沙棘肽的提取技术有很多方法，现有技术如授权公众号为CN 103421873 B的中国发明专利，公开了一种具有抑菌作用的沙棘籽多肽的制备方法，该发明方法首先将沙棘籽渣经过浸泡处理，然后先后以单宁酶与植酸酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶分步水解，将多肽水解液低温静置过夜，然后通过低温高速离心去除大分子杂质，离心上清液浓缩、干燥后得到沙棘籽抑菌多肽，该发明制备沙棘籽抑菌多肽的方法过于繁琐，制备时间太长，大大提高了时间成本，抑菌多肽的效率较低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从沙棘中提取的活性多肽，活性多肽具有较强的抗氧化活性，活性多肽的提取方法简单易行，提取效率很高，适合规模化生产。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种从沙棘中提取的活性多肽，该活性多肽的分子量介于3-10KD之间，该活性多肽具有较强的抗氧化能力，可以用于抗氧化活性成分。
作为优选，一种从沙棘中提取的活性多肽，提取方法包括：原料预处理、种子粉脱脂、初次酶解、二次酶解、纯化，具体包括以下步骤：
原料预处理：挑选去壳无变质、无病虫、干净健康的沙棘籽，破碎后置于烘箱中，在55-60℃下干燥24-36小时，用粉碎机粉碎后过筛，筛网目数为200-300目，得沙棘籽粉；挑选健康沙棘籽以防止霉变产物污染活性物质，粉碎过筛可以除去种子中的杂质成分；
种子粉脱脂：将沙棘籽粉置于超临界CO2萃取釜中，在萃取温度为48-52℃、萃取压力为28-32MPa、CO2流量为25-30L/h的条件下萃取2.5-3.0小时，萃取结束后从釜中出粕，经粉碎、筛分、干燥，即获得沙棘籽脱脂粉；萃取过程中可以回收沙棘籽油，实现沙棘籽的完全综合利用，提升了产业的科技含量，增加了经济效益；
初次酶解：按照料液比1:12-14将沙棘籽脱脂粉溶于蒸馏水中，调节温度为36-37℃、pH为8.4-8.7，加入3000-4000U/g碱性蛋白酶，水解1.5-2.0小时后水浴灭酶；加入酶解液0.8-0.9倍的蒸馏水，调节温度为48-50℃、pH7.0-7.2，加入5000-6000U/g木瓜蛋白酶，水解2.0-3.0小时后水浴灭酶；
二次酶解：将初次酶解液降温至36-37℃，调节pH为2.5-2.8，加入2000-2800U/g胃蛋白酶水解15-20分钟，加入胃蛋白酶重量10-28‰的（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，继续反应15-20分钟，酶解过程中以酶解过程中以双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解，酶解完成后沸水浴灭活20-25分钟，静置15-30分钟，经2000-3500 r/min、0-4℃离心15-25分钟，取上清液；过长的微波辐射时长会影响胃蛋白酶蛋白质的空间结构，进而降低酶的活性，随着反应的进行与微波辐射时长的增加，在酶解反应的中程添加（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚在较强酸性环境下可以发生二聚合、三聚合反应，聚合产物可以与胃蛋白酶产生亲电作用，防止胃蛋白酶蛋白质结构发生变化，从而防止其活性的减低；
纯化：然后用超滤装置让酶解液依次通过3KD、10KD的超滤膜，收集3-10KD分子段的酶解液，低温干燥后以-80~-100℃冷冻保藏；超滤可以将酶解产物中大蛋白与小分子氨基酸滤除，操作简单，成本较低，不尽提高了地龙蛋白多肽的纯度，而且有利于更加精细化的考察蛋白多肽的分子量、氨基酸序列、功能等指标。
作为优选，双频率复合超声与微波辐射交错间隔辅助酶解的步骤为：开启双频率超声波50-55秒，关闭超声波，开启微波辐射5-10秒，关闭微波辐射；开启双频率超声波50-55秒，关闭超声波，开启微波辐射5-10秒，关闭微波辐射；在酶解过程中持续地以双频率超声与微波辐射交错间隔辅助酶解；以双频率超声与微波辐射交错间隔辅助酶解，不仅可以为酶解体系提供能量，维持酶解所需温度，而且双频率超声与微波辐射的交替间隔辅助还可以大大提高酶解效率，降低酶解时间，同时保证了酶解的彻底性与准确性，节约了成本；
作为优选，双频率超声波的超声频率与超声密度分别为34-35kHz、0.34-0.35W/cm2与64-65kHz、0.64-0.65W/cm2，微波辐射的功率为130-135W；双频率复合超声波的双空化效应可以产生叠加作用与协同作用，所产生的空化效应较之单频甚至双频交替要强的多，其所产生的空化崩溃次数也较多，更加高效的打散团聚的蛋白质分子与酶分子，使酶与底物的接触几率与接触面积大大增大，从而提高酶解效率；微波频率的共振使蛋白质大分子能象偶极子分子一样在微波的作用下产生振荡，这种振荡使蛋白质分子在微波触发下产生相干、有序的振动，从而加快蛋白的酶解。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）在对沙棘籽脱脂过程中可以回收沙棘籽油，实现沙棘籽的完全综合利用，提升了产业的科技含量，增加了经济效益；2）以双频率超声与微波辐射交错间隔辅助酶解，不仅可以为酶解体系提供能量，维持酶解所需温度，而且双频率超声与微波辐射的交替间隔辅助还可以大大提高酶解效率，降低酶解时间，同时保证了酶解的彻底性与准确性，节约了成本；3）在酶解反应中程添加的（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚在较强酸性环境下可以发生二聚合、三聚合反应，聚合产物可以与胃蛋白酶产生亲电作用，防止胃蛋白酶蛋白质结构发生变化，从而防止其活性的减低，加快酶解反应的进行。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种从沙棘中提取的活性多肽，该活性多肽的分子量介于3-10KD之间，该活性多肽具有较强的抗氧化能力，可以用于抗氧化活性成分。
从沙棘中提取活性多肽的方法包括以下步骤：
1）挑选沙棘籽，破碎后置于55℃下干燥24小时，用粉碎机粉碎后过筛，筛网目数为200-目，得沙棘籽粉；2）将沙棘籽粉置于超临界CO2萃取釜中，在萃取温度为48℃、萃取压力为28MPa、CO2流量为25L/h的条件下萃取2.5小时，萃取结束后从釜中出粕，经粉碎、筛分、干燥，即获得沙棘籽脱脂粉；3）按照料液比1:12将沙棘籽脱脂粉溶于蒸馏水中，调节温度为36℃、pH为8.4，加入3000U/g碱性蛋白酶，水解1.5小时后水浴灭酶；加入酶解液0.8倍的蒸馏水，调节温度为48℃、pH7.0，加入5000U/g木瓜蛋白酶，水解时间2.0小时后水浴灭酶；4）将初次酶解液降温至36℃，调节pH为2.5，加入2000U/g胃蛋白酶水解15分钟，加入胃蛋白酶重量10‰的（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，继续反应15分钟，酶解过程中以酶解过程中以双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解，酶解完成后沸水浴灭活20分钟，静置15分钟，经2000 r/min、1℃离心15分钟，取上清液；将酶解液的上清液用超滤装置让酶解液依次通过3KD、10KD的超滤膜，收集3-10KD分子段的酶解液，低温干燥后以-80℃冷冻保藏。
实施2：
一种从沙棘中提取的活性多肽，提取方法包括以下步骤：
1）原料预处理：挑选去壳无变质、无病虫、干净健康的沙棘籽，破碎后置于烘箱中，在60℃下干燥36小时，用粉碎机粉碎后过筛，筛网目数为300目，得沙棘籽粉；挑选健康沙棘籽以防止霉变产物污染活性物质，粉碎过筛可以除去种子中的杂质成分；
2）种子粉脱脂：将沙棘籽粉置于超临界CO2萃取釜中，在萃取温度为52℃、萃取压力为32MPa、CO2流量为30L/h的条件下萃取3.0小时，萃取结束后从釜中出粕，经粉碎、筛分、干燥，即获得沙棘籽脱脂粉；萃取过程中可以回收沙棘籽油，实现沙棘籽的完全综合利用，提升了产业的科技含量，增加了经济效益；
3）初次酶解：按照料液比1:14将沙棘籽脱脂粉溶于蒸馏水中，调节温度为37℃、pH为8.7，加入4000U/g碱性蛋白酶，水解2.0小时后水浴灭酶；加入酶解液0.9倍的蒸馏水，调节温度为50℃、pH7.2，加入6000U/g木瓜蛋白酶，水解时间3.0小时后水浴灭酶；
4）二次酶解：将初次酶解液降温至37℃，调节pH为2.8，加入2800U/g胃蛋白酶水解20分钟，加入胃蛋白酶重量28‰的（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，继续反应20分钟，酶解过程中以酶解过程中以双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解，双频率超声波的超声频率与超声密度分别为35kHz、0.35W/cm2与64kHz、0.64W/cm2，微波辐射的功率为130W，以开启双频率超声波55秒、开启微波辐射5秒的方式交替开启双频率超声波与微波辐射辅助酶解，酶解完成后沸水浴灭活25分钟，静置30分钟，经3500 r/min、0-4℃离心25分钟，取上清液；
5）纯化：然后用超滤装置让酶解液依次通过3KD、10KD的超滤膜，收集3-10KD分子段的酶解液，低温干燥后以-100℃冷冻保藏；超滤可以将酶解产物中大蛋白与小分子氨基酸滤除，操作简单，成本较低，不尽提高了地龙蛋白多肽的纯度，而且有利于更加精细化的考察蛋白多肽的分子量、氨基酸序列、功能等指标。
实施3：
一种从沙棘中提取的活性多肽，该活性多肽的分子量介于3-10KD之间，该活性多肽具有较强的抗氧化能力，可以用于抗氧化活性成分。
从沙棘中提取的活性多肽的方法包括：原料预处理、种子粉脱脂、初次酶解、二次酶解、纯化，具体包括以下步骤：
原料预处理：挑选去壳无变质、无病虫、干净健康的沙棘籽，破碎后置于烘箱中，在58℃下干燥24小时，用粉碎机粉碎后过筛，筛网目数为240目，得沙棘籽粉；挑选健康沙棘籽以防止霉变产物污染活性物质，粉碎过筛可以除去种子中的杂质成分；
种子粉脱脂：将沙棘籽粉置于超临界CO2萃取釜中，在萃取温度为50℃、萃取压力为30MPa、CO2流量为26L/h的条件下萃取2.5小时，萃取结束后从釜中出粕，经粉碎、筛分、干燥，即获得沙棘籽脱脂粉；萃取过程中可以回收沙棘籽油，实现沙棘籽的完全综合利用，提升了产业的科技含量，增加了经济效益；
初次酶解：按照料液比1:12将沙棘籽脱脂粉溶于蒸馏水中，调节温度为36℃、pH为8.6，加入3500U/g碱性蛋白酶，水解1.5小时后水浴灭酶；加入酶解液0.9倍的蒸馏水，调节温度为48℃、pH7.2，加入5500U/g木瓜蛋白酶，水解时间2.5小时后水浴灭酶；
二次酶解：将初次酶解液降温至36℃，调节pH为2.6，加入2500U/g胃蛋白酶水解18分钟，加入胃蛋白酶重量18‰的（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，继续反应20分钟，酶解过程中以酶解过程中以双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解，酶解完成后沸水浴灭活25分钟，静置20分钟，经3000 r/min、2℃离心20分钟，取上清液；过长的微波辐射时长会影响胃蛋白酶蛋白质的空间结构，进而降低酶的活性，随着反应的进行与微波辐射时长的增加，在酶解反应的中程添加（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚在较强酸性环境下可以发生二聚合、三聚合反应，聚合产物可以与胃蛋白酶产生亲电作用，防止胃蛋白酶蛋白质结构发生变化，从而防止其活性的减低；
纯化：然后用超滤装置让酶解液依次通过3KD、10KD的超滤膜，收集3-10KD分子段的酶解液，低温干燥后以-90℃冷冻保藏；超滤可以将酶解产物中大蛋白与小分子氨基酸滤除，操作简单，成本较低，不尽提高了地龙蛋白多肽的纯度，而且有利于更加精细化的考察蛋白多肽的分子量、氨基酸序列、功能等指标。
双频率复合超声与微波辐射交错间隔辅助酶解的步骤为：开启双频率超声波50秒，关闭超声波，开启微波辐射10秒，关闭微波辐射；开启双频率超声波50秒，关闭超声波，开启微波辐射10秒，关闭微波辐射；在酶解过程中持续地以双频率超声与微波辐射交错间隔辅助酶解；以双频率超声与微波辐射交错间隔辅助酶解，不仅可以为酶解体系提供能量，维持酶解所需温度，而且双频率超声与微波辐射的交替间隔辅助还可以大大提高酶解效率，降低酶解时间，同时保证了酶解的彻底性与准确性，节约了成本；
作为优选，双频率超声波的超声频率与超声密度分别为35kHz、0.35W/cm2与65kHz、0.65W/cm2，微波辐射的功率为135W；双频率复合超声波的双空化效应可以产生叠加作用与协同作用，所产生的空化效应较之单频甚至双频交替要强的多，其所产生的空化崩溃次数也较多，更加高效的打散团聚的蛋白质分子与酶分子，使酶与底物的接触几率与接触面积大大增大，从而提高酶解效率；微波频率的共振使蛋白质大分子能象偶极子分子一样在微波的作用下产生振荡，这种振荡使蛋白质分子在微波触发下产生相干、有序的振动，从而加快蛋白的酶解。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种从沙棘中提取的活性多肽，其特征在于：所述活性多肽的分子量介于3-10KD之间，所述活性多肽的提取方法包括：原料预处理、种子粉脱脂、初次酶解、二次酶解、纯化。
2.根据权利要求1所述的一种从沙棘中提取的活性多肽，其特征在于：所述原料预处理步骤为：挑选去壳无变质、无病虫、干净健康的沙棘籽，破碎后置于烘箱中，在55-60℃下干燥24-36小时，用粉碎机粉碎后过筛，筛网目数为200-300目，得沙棘籽粉。
3.根据权利要求1所述的一种从沙棘中提取的活性多肽，其特征在于：所述种子粉脱脂步骤为：将沙棘籽粉置于超临界CO2萃取釜中，在萃取温度为48-52℃、萃取压力为28-32MPa、CO2流量为25-30L/h的条件下萃取2.5-3.0小时，萃取结束后从釜中出粕，经粉碎、筛分、干燥，即获得沙棘籽脱脂粉。
4.根据权利要求1所述的一种从沙棘中提取的活性多肽，其特征在于：所述初次酶解步骤为：按照料液比1:12-14将沙棘籽脱脂粉溶于蒸馏水中，调节温度为36-37℃、pH为8.4-8.7，加入3000-4000U/g碱性蛋白酶，水解1.5-2.0小时后水浴灭酶；加入酶解液0.8-0.9倍的蒸馏水，调节温度为48-50℃、pH7.0-7.2，加入5000-6000U/g木瓜蛋白酶，水解2.0-3.0小时后水浴灭酶。
5. 根据权利要求1所述的一种从沙棘中提取的活性多肽，其特征在于：所述二次酶解步骤为：将初次酶解液降温至36-37℃，调节pH为2.5-2.8，加入2000-2800U/g胃蛋白酶水解15-20分钟，加入胃蛋白酶重量10-28‰的（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，继续反应15-20分钟，酶解过程中以酶解过程中以双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解，酶解完成后沸水浴灭活20-25分钟，静置15-30分钟，经2000-3500 r/min、0-4℃离心15-25分钟，取上清液。
6.根据权利要求5所述的一种从沙棘中提取的活性多肽，其特征在于：所述酶解步骤中的频率复合超声与微波辐射交错间隔辅助酶解的步骤为：开启双频率超声波50-55秒，关闭超声波，开启微波辐射5-10秒，关闭微波辐射；开启双频率超声波50-55秒，关闭超声波，开启微波辐射5-10秒，关闭微波辐射。
7.根据权利要求5所述的一种从沙棘中提取的活性多肽，其特征在于：所述酶解步骤中的双频率超声波的超声频率与超声密度分别为34-35kHz、0.34-0.35W/cm2与64-65kHz、0.64-0.65W/cm2，微波辐射的功率为130-135W。
8.根据权利要求1所述的一种从沙棘中提取的活性多肽，其特征在于：所述纯化：然后用超滤装置让酶解液依次通过3KD、10KD的超滤膜，收集3-10KD分子段的酶解液，低温干燥后以-80~-100℃冷冻保藏。
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