CN110241021B - 一种免仪器核酸现场快速检测试剂盒 - Google Patents

一种免仪器核酸现场快速检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种免仪器核酸现场快速检测试剂盒。其中的检测卡包括进样口，样本处理模块，穿刺管，反应液腔，反应液流路，主反应区，n个第二反应区及对应n个驱动组件、n≥0，温控区，结果区，结果驱动组件，废液区，外壳等。该检测卡无需预先提取纯化核酸样本，实现了从原始样本到结果的现场检测，且操作简便、快速、不易出错，仅需非专业人士两步操作，大幅降低了不同操作者所带来的错误与误差，也避免了气溶胶污染的风险，对样品处理、检测环境和人员素质要求都不高，污染风险小、假阳性率极低，不依赖大型或昂贵仪器、成本较低，可直接运用于现场复杂多样的各类型样本核酸检测，同时也适用于多种类似步骤复杂的检测反应，适用范围广，应用前景好。

Description

一种免仪器核酸现场快速检测试剂盒
技术领域
本发明属于检测技术领域。更具体地，涉及一种免仪器核酸现场快速检测试剂盒。
背景技术
核酸检测技术，在经历了数十年的发展与近几年的快速成熟后，目前已广泛运用于传染病病原检测(包括细菌、支原体、病毒等)、肿瘤突变检测、遗传病检测、个体基因型检测等各个方面。在多个应用领域，如传染病诊断，核酸检测技术的灵敏度与特异性均大幅优于胶体金/免疫荧光法，是多种诊断的金标准。然而，目前的核酸检测技术几乎全部需要依赖于仪器，且对样品处理、检测环境和人员素质要求都很高。一次常规的核酸检测，从获取样本到核酸纯化、检测体系配置、反应到结果判读，往往需要数小时至更长的时间。这些因素都限制了核酸检测技术在现场即时快速检测的实现。有一些报道，通过微流控等技术，实现了从原始样本到结果的完整流程，不依赖于特定环境及检测技术人员，但这类检测必须要基于复杂昂贵的仪器，提高了成本，仍无法广泛的实现现场快速检测。
目前也有少量研究，报道了对于免仪器的核酸现场检测方法的探索，但这些方法要真正应用于现场检测，还普遍存在一些待解决的问题：一类报道是基于试纸扩增-微球/胶体金/膜杂交等方法显色的检测。该种技术手段虽然能实现免仪器的核酸扩增和核酸检测结果显示，但往往需要预先提取纯化好的核酸样本，而没有提供核酸纯化的现场快速解决方案；这类报道无法直接运用于现场复杂多样的各类型样本核酸检测中。另一类报道是提供了简易的核酸提取装置，这类技术可以是基于手持式滤膜法提取，或磁珠法提取，再对接后续的裂解、反应、检测等步骤(以纸基反应，冻干试剂复溶反应为多)。这类技术可以实现免仪器的提取-扩增-检测流程，但操作繁琐，步骤多而容易出错，同时污染风险大，也很难广泛应用。
另外，除了检测装置方面，用于核酸扩增-检测的核心蛋白/技术原理同样很大程度上限制了核酸现场快速检测的实现。由于现场检测往往不依赖于大仪器，核酸现场快速检测以核酸等温扩增技术为主。常见的等温扩增检测技术有：(1)环介导等温扩增技术(LAMP)：该技术可以在60-65℃左右的条件下实现快速扩增，但该方法假阳性问题比较严重，且仍需要仪器或其他方式控温，并且引物设计要求比较高，对于很多检测位点的覆盖能力有限；(2)滚环扩增技术(RCA)：该技术利用DNA连接酶和DNA聚合酶，以滚环复制的方式，进行环形模板的链置换合成，从而实现部分环状基因组的扩增。但是该方法反应时间过长(大于4小时)，难以很好的契合现场快速检测需求。(3)重组聚合酶扩增技术(RPA)：该技术核心蛋白是单链DNA结合蛋白，单链核酸重组酶和链置换DNA聚合酶，该技术扩增能力强，速度快(10-30分钟)，温度范围广(25-42℃)，是一种很有潜力的等温扩增技术，但也会遇到假阳性问题。
Jennifer Doudna等将Cas12a的附属切割单链DNA活性的特性与RPA技术结合，建立了快速检测DNA的方法，能在1小时内检测到人***瘤病毒(HPV)并准确区分亚型。但该方法同样依托于样本粗提取实验操作，加热仪器，检测仪器等配合，没有真正实现现场快速检测。再如发明人团队前期研究成果201811519861.5，公开了ScCas12a蛋白在切割DNA方面以及核酸检测方面的应用，可在25℃37℃的室温下实现高灵敏、高精度的分子检测，检测特异性好、灵敏度高，成本低廉、应用范围广。但是在其他方面仍有一定的不足，同样也需要经过样本粗提取、扩增、切割、显色等多个步骤，面临着操作者水平参差不齐及污染风险等问题，不适合现场快速检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，目的是提供一种操作简便、不依赖专业操作人员、不易污染、成本较低的免仪器核酸现场快速检测卡，构建了免仪器核酸现场快速检测试剂盒。该技术同时将核酸提取、扩增、结果显示等全部流程整合进入一张检测卡中，提供了核酸纯化的现场快速解决方案，无需预先提取纯化核酸样本，可直接运用于现场复杂多样的各类型样本核酸检测，实现了从原始样本到结果的简便现场快速检测。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种免仪器现场快速检测卡，包括按照样本流向依次设置的进样口1、样本处理模块2、反应液流路5、主反应区6、结果区10，还设有与样本处理模块2联动的内部有空腔的穿刺管3，以及与穿刺管3相邻或接触的反应液腔4；样本处理模块2移动并引发穿刺管3发生位移，进而引发反应液腔4内部液体经由穿刺管3内部空腔流出，并流经样本处理模块2进入样本流路。
本发明的检测卡可实现原始样本到结果简便检测，使用时，将样本由加样口加入，经过样本处理模块2的处理后，控制样本处理模块2移动，从而使得穿刺管3发生位移，穿刺管3的位移会引发反应液腔4内部液体由穿刺管3内部空腔流出，并依次经过样本处理模块2、反应液流路5，进入到主反应区6进行反应，结果在结果区10呈现。
进一步地，样本处理模块2上设有样本处理孔22、第一导向面23、贯穿样本处理孔22的半开泄流槽21；样本处理模块2移动后，穿刺管3的空腔与样本处理孔22、反应液流路5连通。
同时，穿刺管2的端部设有与第一导向面23配合的第二导向面。半开泄流槽21作为穿刺管3在样本处理模块2上滑动的轨道，同时在样本处理模块2向穿刺管3滑动的过程中提供泄流作用，推动2的过程中，可使得3引发4中的液体经由3内部空腔最终都流回22，再由22流经5，随即直接流入6，同时4中的反应液不会泄露至检测卡其他地方。
优选地，半开泄流槽21有n道，n为大于等于1的整数。同时反应液腔4、样本处理孔22、反应区均可平行设置多个，对应地，反应液流路5可以是单管通道，也可为多通道，提供分流，液体平行进入多个反应区，从而多重检测。因此，本发明的检测卡对应可以用于单组检测，也可以用于多组作为多重检测。
另外优选地，所述检测卡还设有与样本处理模块2连通的废液区13。原始状态下，样本处理模块2(样本处理孔22)与废液区13连通，移动样本处理模块2后，样本处理模块2(样本处理孔22)分别与穿刺管3的空腔和反应液流路5连通。
优选地，检测卡内部设有样本处理模块2移动的轨道，可用于控制样本处理模块2移动方向和距离，防止移动偏向或移动过多。
另外，为了适应多反应步骤的检测，所述主反应区6和结果区10之间还可设有n个第二反应区8及对应的n个第二反应区驱动组件9、n≥0且为整数。例如：需两步反应的检测，则需要设置一个主反应区、一个第二反应区，对应设置一个第二反应区的驱动组件；主反应区中的反应完成后，通过第二反应区的驱动组件带动第二反应区与主反应区接触，完成样本由主反应区转移到第二反应区继续第二步反应。如需多步反应的检测，则以此类推，以串联的方式设计多个第二反应区及其驱动组件。
作为一种具体可选择的案例，反应区均由试纸条组成，驱动组件用于驱动第二反应区的试纸条移动与主反应区的试纸条接触，试纸条互相接触后，液体就会层析过去。
另外优选地，所述检测卡还设有外壳12，外壳12上设有控制样本处理模块2移动的控制钮。优选地，外壳12上还设有控制第二反应区驱动组件9的控制钮。
优选地，所述检测卡还设有用于控制结果区10与主反应区6接触的结果驱动组件11。
当检测卡为核酸检测卡时，所述结果区10的显示方法可以有不同方法，如胶体金法、荧光法、变色反应、杂交法或微球法等。
优选地，外壳12上还设有控制结果驱动组件11的控制钮和对应结果区10的结果显示区。
优选地，所述检测卡还设有与主反应区6连接的温控区7。温控区7可以是发热材料(如铁粉、生石灰、及多种发热材料混合物等)或各类型电加热装置。
优选地，反应液腔4由可刺破的材料封装而成，移动2可推动3上移刺破4。或反应液腔4上设有控制液体流出的阀门，移动2可推动3上移推动打开阀门。
更优选地，与反应液腔4相邻处还设有与样本处理模块2联动的辅助挤压组件24，用于辅助反应液腔，4中的液体流出。辅助挤压组件24与样本处理模块2机械联动的设计可实现在移动2使得3和4对接液体流出的同时，使得24挤压4，帮助4中的液体挤出。
具体作为一种可选择的案例：辅助挤压组件24的结构设计如下：
辅助挤压组件24位于反应液腔4附近，且与样本处理模块2的控制钮连接(如一体式固定连接)，推动样本处理模块2的控制钮时带动辅助挤压组件24向靠近反应液腔4方向移位从而起到辅助挤压反应液腔4帮助其中液体挤出的作用。
作为一种可选择案例，当检测卡为核酸检测卡时，样本处理孔22内设有滤膜，所述滤膜为核酸提取滤膜、硅胶膜、核酸吸附膜、硝酸纤维素膜、滤纸或玻璃纤维纸等。
另外，进样口1的形状不限定，可以是任何形状。外壳12的形状不限定，可以是任何形状。
本发明的检测卡的原理和使用方法流程如下：
第一步：液体样本或预处理好的液体样本从进样口1加入检测卡，样本中液体会经过样本处理模块2流入废液区13，样本中的待提取物质(如核酸)将留存在样本处理模块2的样本处理孔22内。
第二步：推动2向前移动与3之间发生相对位移，3经由第一导向面和第二导向面的配合第一导向面促使3上移，3上移后会刺破由可刺破材料封装的反应液腔4或打开反应液腔4的阀门，4中的反应液体从3中间空腔流出并随着推动2的过程经由半开泄流槽21最终都流回22，再由22流经5，随即直接流入6。
第三步：样本和反应液体在反应区发生反应：在6中反应，7区可提供温控(如加热)。(如是两步反应的，则先在第一反应区内完成第一步反应，再移动9带动第二反应区与第一反应区接触，完成样本从第一反应区到第二反应区的转移。)，如有第三反应区，依次推理。
第四步：反应完成后，移动结果驱动组件11，使结果区10和反应区接触，从而完成反应区的样本进入结果区10，获得结果。
另外，以核酸检测为例，即当检测卡为核酸检测卡时：
优选地，所述反应液腔4中预装有反应试剂：双蒸水、无核酸酶水、Tris-HCL缓冲液、MgCl2溶液或乙酸镁溶液等液体。优选为100-300mM MgCl2溶液，更优选为280mM MgCl2溶液。
优选地，所述主反应区6中预装有扩增反应冻干试剂。如可以是环介导等温扩增技术(LAMP)所需试剂、可以是依赖于核酸序列的扩增法(NASBA)所需试剂、可以是滚环扩增技术(RCA)所需试剂、可以是依赖解旋酶DNA等温扩增法(HDA)所需试剂、可以是链替代扩增(SDA)所需试剂、可以是重组聚合酶扩增(RPA)所需试剂等。优选为RPA技术的所需试剂。
所述扩增反应试剂还可以同时增加逆转录步骤组分(Reverse Transcript)在内，优选组分为MLV逆转录酶。
更优选地，作为一种可选择的实施案例，所述主反应区(6)中预装有冻干扩增反应试剂，包括：T4UvsX、T4UvsY、gp32、ATP、肌酸激酶、磷酸肌酸、Bsu聚合酶、醋酸钾、dNTPs、PEG20000、DTT、上下游引物。
例如具体试剂组成可为：T4UvsX 400ng/ul；T4UvsY 100ng/ul；gp32 312ng/ul；ATP 3mM；肌酸激酶0.4mg/ml；磷酸肌酸50mM；Bsu聚合酶0.5U/ul；醋酸钾100mM；dNTPs150nM；PEG20000，5％；DTT，2mM；上下游引物各400nM。
优选地，当检测卡为核酸检测卡时，可以搭配或不搭配第二反应区8使用。优选地，所述第二反应区8中预装有与主反应区6中等温扩增体系共同完成核酸检测步骤的检测体系冻干物。如可以是CRISPR/Cas12a检测体系，也可以是CRISPR/Cas13a检测体系等。
优选的，所述第二反应区8中预装有CRISPR/Cas12a的检测体系的冻干试剂，包括Cas12a、gRNA、ssDNA Reporter、Tris、NaCl、MgCl2。所述Cas12a如ScCas12a等。
例如具体试剂组成可为：Cas12a 45nM，gRNA 22.5nM，ssDNA Reporter(地高辛标记核酸探针)100nM，Tris 20mM，NaCl 60mM,MgCl2 10mM,pH 7.3。
当检测卡为核酸检测卡时，所述主反应区6和第二反应区8反应试剂可以冻干在基质上。所述基质，可以是纸片、纤维素膜、滤纸、玻璃纤维纸等；优选为玻璃纤维纸。
另外，基于上述检测卡可构建免仪器核酸现场快速检测试剂盒。试剂盒还可包括核酸样本预处理试剂，如核酸裂解液。
优选地，所述核酸裂解液的组成可以包括以下成分：5M异硫氰酸胍、20mM乙二酸四乙酸二钠，pH8.0的100mMTris-HCl和2％Triton-100。
本发明具有以下有益效果：
本发明的免仪器核酸现场快速检测卡，无需预先提取纯化核酸样本，可直接运用于现场复杂多样的各类型样本核酸检测，实现了从原始样本到结果的简便现场快速检测，且不依赖大型或昂贵仪器、成本较低。
本发明的检测卡操作简便、快速、不易出错，仅需非专业人士两步操作，大幅降低了不同操作者所带来的错误与误差，也避免了气溶胶污染的风险，对样品处理、检测环境和人员素质要求都不高，污染风险小、假阳性率极低。
本发明的检测卡不仅适用于核酸的现场快速检测，也适用于多种类似的传统步骤复杂的检测反应，适用范围广，应用前景好，对于核酸等现场快速检测具有很好的价值。
附图说明
图1为本发明检测卡的内部结构示意图。
图2为样本处理模块(核酸提取模块)2的局部放大图。
图3为检测卡中样本处理模块(核酸提取模块)2、穿刺管3和反应液腔4区域的局部放大图。
图4为检测卡中辅助挤压组件24的局部结构示意图。
图5为检测卡中辅助挤压组件24的局部结构示意图。
图中标号为：1进样口，2样本处理模块(核酸提取模块)，3穿刺管，4反应液腔，5反应液流路，6主反应区，7温控区，8第二反应区，9第二反应区驱动组件，10结果区，11结果驱动组件，12外壳，13废液区，21半开泄流槽，22样本处理孔，23第一导向面，24辅助挤压组件。
图6为本发明核酸检测卡的外观示意图。
图7为非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)检测卡及检测结果。
图8为甲型流感病毒(Influenza A)检测卡及检测结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1免仪器现场快速检测卡
1、一种免仪器现场快速检测卡，如图1-3所示，包括按照样本流向依次设置的进样口1、样本处理模块2、反应液流路5、主反应区6、一个第二反应区8及对应的一个第二反应区驱动组件9、结果区10；还设有内部有空腔的穿刺管3，以及与穿刺管3相邻或接触的反应液腔4；还包括结果驱动组件11，外壳12，废液区13。
其中，进样口1与样本处理模块2连通；样本处理模块2可移动，样本处理模块2与穿刺管3接触且两者之间可滑动，推动样本处理模块2使得穿刺管3发生位移；穿刺管3与反应液腔4相邻，穿刺管3位移后与反应液腔4接触并引起反应液腔4内部液体流出。
具体地，所述样本处理模块2上设有样本处理孔22、第一导向面23和半开泄流槽21。反应液流路5连通样本处理孔22和主反应区6。
检测卡内部设有样本处理模块2移动的轨道，可用于控制样本处理模块2移动方向和距离，防止移动偏向或移动过多。
以核酸检测为例，所述样本处理孔22内设有核酸提取滤膜用于核酸样本的提取。
穿刺管3内部有空腔，与样本处理模块2接触的一端面为与第一导向面配合的第二导向面，两者之间可滑动。
半开泄流槽21提供了样本处理模块2向穿刺管3移动的滑轨；穿刺管3另一端与反应液腔4相邻。反应液腔4由可刺破的材料封装而成，移动2可推动3上移刺破4从而使其中的反应液体流出。
半开泄流槽21不仅是提供了样本处理模块2向穿刺管3移动的滑轨，同时在样本处理模块2向穿刺管3滑动的过程中提供泄流作用。推动2的过程中，可使得3引发4中的液体经由3内部空腔最终都流回22，再由22流经5，随即直接流入6。同时保证4中的反应液不会泄露至检测卡其他地方。
另外，结果区10与第二反应区8相邻，结果驱动组件11控制结果区10和第二反应区8的接触；废液区13与样本处理模块2连通。
主反应区6和第二反应区8均由试纸条(如玻璃纤维纸，SB08号，上海金标)组成，驱动组件用于驱动第二反应区的试纸条移动与主反应区的试纸条接触，试纸条互相接触后，液体就会层析过去。
所述结果区10的显示方法为胶体金法，结果区10为胶体金试纸。
外壳12上设有控制样本处理模块2移动的控制钮。
外壳12上还设有控制第二反应区驱动组件9的控制钮。
外壳12上还设有控制结果驱动组件11的控制钮。
外壳12上还设有对应结果区的显示区。
2、上述检测卡的原理和使用方法流程如下：
第一步：液体样本或预处理好的液体样本从1中加入检测卡，样本中液体会经过2流入13，样本中的待提取物质将留存在2的滤膜上。
第二步：推动2向前移动与3之间发生相对位移，3经由第一导向面23移入半开泄流槽21将促使3上移，3上移后会刺破反应液腔4，4中的反应液体从3中间空腔流出并随着推动2的过程经由半开泄流槽21最终都流回22，再由22流经5，随即直接流入6。
第三步：样本和反应液体在6中进行反应。反应区6内完成第一步反应后，移动9带动第二反应区8与主反应区6接触，完成样本从主反应区6到转移第二反应区8进行第二步反应。
第四步：第二反应区8内完成第二步反应后，移动模块11，使10和反应区8接触，从而完成反应区8的样本进入10，获得结果，并呈现在外壳12上的显示区。
实施例2免仪器现场快速检测卡
一种免仪器现场快速检测卡，如图1-5所示，结构同实施例，另外与反应液腔4相邻处还可设有辅助挤压组件24，以及温控区7，温控区7中为铁粉混合物，温控区7与主反应区6连接，可为反应区提供温控需求。
辅助挤压组件24与样本处理模块2机械联动，用于辅助反应液腔，4中的液体流出。可实现在移动2使得3上移刺破4使得其中液体流出的同时，使得24挤压4，帮助4中的液体挤出。
具体地，辅助挤压组件24的结构如图4-5所示：
辅助挤压组件24位于反应液腔4附近，且与样本处理模块2的控制钮连接(如一体式固定连接)，推动样本处理模块2的控制钮时带动辅助挤压组件24向靠近反应液腔4方向移位从而起到辅助挤压反应液腔4帮助其中液体挤出的作用。
实施例3免仪器核酸现场快速检测卡及试剂盒
1、应用到核酸检测时，本发明提供的是一种免仪器核酸现场快速检测卡，结构同实施例1。
其中，预先裂解后的样本从进样口1加入检测卡，并进入样本处理模块2，经核酸提取滤膜进行提取，废液流入废液区13，样本中的待提取物质留存在滤膜上。
所述裂解液包括以下成分：5M异硫氰酸胍、20mM乙二酸四乙酸二钠，pH8.0的100mMTris-HCl和2％Triton-100。
反应液腔4中预装有反应液：280mM MgCl2溶液。
主反应区6中预装有恒温扩增的冻干试剂，试剂组成为：T4UvsX 400ng/ul；T4UvsY100ng/ul；gp32 312ng/ul；ATP 3mM；肌酸激酶0.4mg/ml；磷酸肌酸50mM；Bsu聚合酶0.5U/ul；醋酸钾100mM；dNTPs 150nM；PEG20000，5％；DTT，2mM；上下游引物各400nM。
推动样本处理模块2使得穿刺管3发生位移并刺破反应液腔4，反应液流出并经穿刺管3内部空腔流出，继续流经样本处理模块2的滤膜，再流入反应液流路5，随即直接流入主反应区6，在主反应区6中进行第一次反应。
温控区7与主反应区6连接，使用铁粉混合物提供发热温控。
第二反应区8中预装的有CRISPR/Cas12a的检测体系的冻干试剂，试剂组成为：ScCas12a 45nM，gRNA 22.5nM，地高辛标记核酸探针100nM，Tris 20mM，NaCl 60mM,MgCl210mM,pH 7.3。
主反应区6和第二反应区8均由试纸条组成。当主反应区6，通过驱动组件9驱动第二反应区8的试纸条移动与主反应区6的试纸条接触，试纸条互相接触后，液体就会层析过去，在第二反应区继续第二次反应。
第二次反应完成后，通过结果驱动组件11控制结果区10和主反应区6接触，液体层析到结果区，获得结果，并通过外壳12的观察窗可观测到。
本核酸检测卡的外观示意图如图6所示，图中所示“开始”键即为控制样本处理模块2移动的控制钮，所示“结果”键即为控制结果驱动组件11的控制钮。
该检测卡优化了基于CRISPR-Cas12a及RPA的核酸检测技术，同时将核酸提取、扩增、结果显示等全部流程整合进入一张检测卡中，提供了核酸纯化的现场快速解决方案，无需预先提取纯化核酸样本，可直接运用于现场复杂多样的各类型样本核酸检测，真正实现了从原始样本到结果的简便现场快速检测。
2、组建成免仪器核酸现场快速检测试剂盒，其中包括上述检测卡，另外还包括取样瓶，瓶中装有裂解液，裂解液包括以下成分：5M异硫氰酸胍、20mM乙二酸四乙酸二钠，pH8.0的100mMTris-HCl和2％Triton-100。
实施例4免仪器核酸现场快速检测卡的使用案例---非洲猪瘟病毒(Africanswine fever virus，ASFV)检测卡
检测卡结构和组成同实施例3，具体地扩增引物及gRNA为针对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)设计。
本实验在有非洲猪瘟检测资质实验室内完成。具体步骤如下：
(1)样本裂解：用一次性注射器取猪耳静脉血5ml血液，收集血清，将制备的血清样本，加入含有裂解液的取样瓶中，震荡混匀。
(2)裂解步骤完成后，给取样瓶换上带有滤膜***中的盖帽，然后竖直***检测卡进样口1，通过挤压使取样瓶中液体进入检测卡进样口，并通过样本处理孔22中的滤膜，过滤裂解过程中的杂质及其他需过滤掉的物质。推动“开始”开关，切换滤膜通道(即样本处理模块2被推动使得穿刺管3上移刺破反应液腔4)，使滤膜与反应液腔4结构对接并同时自动触发反应液正压通过滤膜，进入到预装有恒温扩增冻干试剂的主反应区6(主反应区的试纸一，即恒温扩增反应模板)中。
主反应区6中的扩增引物为根据非洲猪瘟病毒特异性靶标序列设计用于恒温扩增引物，扩增片段大小为80-120nt，引物的变性温度可为54-67℃、Opt＝60，长度为30-35nt、Opt＝32，引物中GC含量为40-60％，根据设计序列合成DNA引物。
举例设计的引物如下：
ASFV-F1：TACTCTGCTAAACCARGCCTTGGCCTCRAC
ASFV-R1：CTCTTGTTTACTCGYTTTAATATAGTTAAY
(3)反应10分钟后，推动“第二滑块”(即第二反应区驱动组件9的控制钮)使第二反应区8的试纸二(即基因剪切反应模块)与主反应区试纸一(恒温扩增反应模板)对接，恒温扩增反应产物和水分通过层析的作用进入到预装有CRISPR/Cas12a检测体系冻干试剂的第二反应区(即基因剪切反应模块)。
使用的gRNA是针对靶标序列设计的特异性gRNA。gRNA引物序列设计原则：选取靶向序列时，靶向序列5’端应具有5’-TTTN-3’序列；且靶向序列本身、靶向序列和其余序列间不形成稳定二级结构。gRNA引物结构为：5’--“TAATTTCTACTAAGTGTAGAT”-靶向序列-3’
(4)反应10分钟后，推动“结果”按键，将结果区的试纸三(及胶体金免疫层析试纸条)与试纸二(基因剪切反应模块)对接，试纸二中的地高辛标记的核酸探针和水分通过层析的作用进入试剂条三，待层析结束后判读结果。
使用的免疫层析试纸制备如下：胶体金颗粒标记鼠源地高辛抗体；检测线标记链霉亲和素，控制线标记羊抗鼠抗体。结果分析，若血液样本中含有非洲猪瘟病毒，则检测卡T线不显色为阳性，若不携带非洲猪瘟病毒，试纸T线显色为阴性。
2、检测结果显示如图7所示，阴性标本的检测线与对照线均出现，对应为检测阴性；阳性标本的对照线出现但检测线消失，对应为检测阳性。结果说明通过该检测卡可以准确检测非洲猪瘟样本中的病毒核酸。
实施例5免仪器核酸现场快速检测卡的使用案例---甲型流感病毒(Influenza A)检测卡
检测卡结构和组成同实施例3，具体地扩增引物及gRNA为针对甲型流感病毒(Influenza A)设计。
检测步骤如下：
(1)取样及样本裂解：取咽拭子，嘱患者头后仰张大嘴巴发出“啊”声，刮去扁桃体腺两侧和咽后壁的分泌物。将取样的拭子放入装有裂解液的取样瓶中，震荡混匀。
(2)裂解步骤完成后，给取样瓶换上带有滤膜***中的盖帽，然后竖直***检测卡进样口，通过挤压使取样瓶中液体进入检测卡进样口，并通过滤膜过滤裂解过程中使用的玻璃微珠。推动“开始”的开关，切换滤膜通道，使滤膜与反应液腔结构对接并同时自动触发反应液正压通过滤膜，进入到预装有恒温扩增冻干试剂的主反应区中。
根据甲型流感病毒特异性靶标序列设计用于恒温扩增引物，扩增片段大小为200nt，引物的变性温度可为54-67℃、Opt＝60，长度为30-35nt、Opt＝32，引物中GC含量为40-60％，根据设计序列合成DNA引物。
举例设计的引物如下：
InA-F1:AGTCACAAGAGAACCCTATGTTTCATGCGA
InA-R1:TACTTGACCACCCAATGCATTCCACCCTGC
(3)反应20分钟后，推动“第二滑块”(即第二反应区驱动组件9的控制钮)使试纸二(基因剪切反应模块)与试纸一(恒温扩增反应模板』对接，恒温扩增反应产物和水分通过层析的作用进入到预装有CRISPR/Cas12a检测体系冻干试剂的第二反应区(即基因剪切反应模块)。
本专利中使用的gRNA是针对靶标序列设计的特异性gRNA。gRNA引物序列设计原则：选取靶向序列时，靶向序列5’端应具有5’-TTTN-3’序列；且靶向序列本身、靶向序列和其余序列间不形成稳定二级结构。gRNA引物结构为：5’--“TAATTTCTACTAAGTGTAGAT”-靶向序列-3’
(4)反应10分钟后，推动“结果”的按键，将试纸三(及胶体金试剂条)与试纸二(基因剪切反应模块』对接，基因剪切反应模块中的地高辛标记的核酸探针和水分通过层析的作用进行试剂条，待层析结束后判读结果。
使用的免疫层析试纸制备如下：胶体金颗粒标记鼠源地高辛抗体；检测线标记链霉亲和素，控制线标记羊抗鼠抗体。结果分析，若血液样本中含有甲型流感病毒，则检测卡T线不显色为阳性，若不携带甲型流感病毒，试纸T线显色为阴性。
2、检测结果显示如图8所示，阴性标本的检测线与对照线均出现，对应为检测阴性；阳性标本的对照线出现但检测线消失，对应为检测阳性。结果说明通过该检测卡可以准确检测流感病毒样本中的病毒核酸。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种免仪器现场快速检测卡，其特征在于，包括按照样本流向依次设置的进样口（1）、样本处理模块（2）、反应液流路（5）、主反应区（6）、结果区（10），还设有与样本处理模块（2）联动的内部有空腔的穿刺管（3），以及与穿刺管（3）相邻或接触的反应液腔（4）；样本处理模块（2）移动并引发穿刺管（3）发生位移，进而引发反应液腔（4）内部液体经由穿刺管（3）内部空腔流出，并流经样本处理模块（2）进入样本流路；还设有用于控制结果区（10）与主反应区（6）接触的结果驱动组件（11）；还设有外壳（12），外壳（12）上设有控制样本处理模块（2）移动的控制钮，外壳（12）上设有控制结果驱动组件（11）的控制钮和对应结果区（10）的结果显示区；所述主反应区（6）和结果区（10）之间还设有n个第二反应区（8）及对应的n个第二反应区驱动组件（9）、n≥0且为整数；外壳（12）上还设有控制第二反应区驱动组件（9）的控制钮；还设有与主反应区（6）连接的温控区（7）。
2.根据权利要求1所述检测卡，其特征在于，样本处理模块（2）上设有样本处理孔（22）、第一导向面（23）、贯穿样本处理孔（22）的半开泄流槽（21）；半开泄流槽（21）同时作为样本处理模块（2）向穿刺管（3）滑动的轨道；样本处理模块（2）移动后，穿刺管（3）的空腔与样本处理孔（22）、反应液流路（5）连通。
3.根据权利要求2所述检测卡，其特征在于，穿刺管（3）的端部设有与第一导向面（23）配合的第二导向面。
4.根据权利要求1所述检测卡，其特征在于，检测卡内部设有样本处理模块（2）移动的轨道；还设有与样本处理模块（2）连通的废液区（13）。
5.根据权利要求2所述检测卡，其特征在于，当检测卡为核酸检测卡时，样本处理孔（22）内设有滤膜，所述滤膜为核酸提取滤膜、硅胶膜、核酸吸附膜、硝酸纤维素膜、滤纸或玻璃纤维纸。
6.根据权利要求2所述检测卡，其特征在于，半开泄流槽（21）有n道，n为大于等于1的整数。
7.根据权利要求1所述检测卡，其特征在于，反应液腔（4）由可刺破的材料封装而成，反应液腔（4）上设有控制液体流出的阀门。
8.根据权利要求1所述检测卡，其特征在于，与反应液腔（4）相邻处还设有与样本处理模块（2）联动的辅助挤压组件（24）。
9.根据权利要求1-8任一所述检测卡，其特征在于，当检测卡为核酸检测卡时，所述反应液腔（4）中预装有反应试剂：双蒸水、无核酸酶水、Tris-HCL缓冲液、MgCl2溶液或乙酸镁溶液。
10.根据权利要求1-8任一所述检测卡，其特征在于，当检测卡为核酸检测卡时，所述主反应区（6）中预装有扩增反应试剂。
11.根据权利要求1所述检测卡，其特征在于，当检测卡为核酸检测卡时，所述第二反应区（8）中预装有与主反应区（6）中等温扩增体系共同完成核酸检测步骤的检测体系冻干物。
12.一种免仪器核酸现场快速检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-11任一所述检测卡。
13.根据权利要求12所述试剂盒，其特征在于，还包括核酸样本预处理试剂。
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