CN108048367A - 白葡萄球菌粉及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，公开了一种白葡萄球菌粉，其由白葡萄菌种子液接种到麦麸培养基发酵培养制得。本发明白葡萄球菌粉采用特殊的发酵工艺制备而得，成本低廉，可应用于制备镇咳药物。

Description

白葡萄球菌粉及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，特别涉及白葡萄球菌粉及其应用。
背景技术
白葡萄球菌粉为一种非致病性的口服细菌制剂，系由非致病性白葡萄球菌液体培养而得的灭活干燥菌体制成。实验表明，其具有近似可待因的镇咳强度，直接作用于延脑咳嗽中枢，对急性咳嗽镇咳作用明显，剂量越大，镇咳作用越强，并有调节自主神经***功能，能使痰量明显减少。发酵法制备获得白葡萄球菌粉是制药企业生产白葡萄球菌粉的唯一途径，但是培养基的成本制约着企业的发展，目前较多企业采用葡萄糖蛋白胨培养基，原料成本高，菌体密度地，企业的利润大大降低。“用液体发酵法生产气管炎菌苗片的最佳工艺条件研究，山东医药工业1999年”，公开了一种白葡萄球菌培养基，包括蛋白胨0.5%，尿素2%，玉米浆1%，葡萄糖1%，柠檬酸钠0.3%，硫酸镁0.05%以及氯化钠0.5%，该培养基成本较高，并且获得的菌体浓度仅达到109CFU/mL级别。开发一种低成本的白葡萄球菌粉制备工艺是我们需要解决的技术问题。
小麦麸皮（麦麸）是面粉加工的主要副产品，过去，麸皮主要是用作动物饲料，经济价值不高，也有很多厂家将小麦麦麸随意丢弃。小麦麸皮含有丰富的碳水化合物、蛋白质、维生素E、酚类化合物以及无机矿物质等（麦麸的功能成分及其应用研究进展，贾天广，食品研究与开发2014年），已经逐渐应用到其他领域，包括保健品、食品添加剂、提取膳食纤维和膳食蛋白等，具备广泛的应用前景和开发价值。但由于小麦麸皮成分复杂，其处理工艺难以掌握。在细菌培养领域，现有研究大多采用小麦麸皮进行简单处理，作为细菌培养基的碳源的部分补充物，用于降低培养基的成本；迄今还没有出现以小麦麸皮为主要原料的白葡萄球菌培养基。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术白葡萄球菌发酵成本高的缺陷，提供了利用新的发酵工艺制备的白葡萄球菌粉及其应用。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种白葡萄球菌粉，其由白葡萄菌种子液接种到麦麸培养基发酵培养制得。
进一步地，
所述麦麸培养基按照如下工艺制备而得：
（1）将麦麸研磨粉碎，过100目筛，然后以1：15的料水质量比混合，再加入中性淀粉酶，添加量为0.6U/g麦麸，在70℃温度条件下处理15min，然后离心，收集沉淀和上层液体，将上层液体置于90℃的条件下，保温10min灭酶，冷却至室温，得到组分A；
（2）将沉淀加入到5倍重量的浓度为3M的盐酸，在80℃搅拌水解9小时，搅拌速度为100rpm，过滤收集滤液，然后用氨水中和残余盐酸，调整溶液pH为7.5，得到组分B；
（3）将组分A和组分B混匀得到麦麸培养基。
进一步地，
所述白葡萄球菌粉按照如下工艺制备而得：
1）取白葡萄球菌液，按照2-3%的接种量接种到种子培养基中，30-32℃、100rpm摇床培养18-24h，获得种子液；
2）将种子液按照3-5%的接种量接种于装有麦麸培养基的发酵罐中进行发酵培养，培养温度30-32℃，通气量保持溶氧水平为20％，并通过添加葡萄糖控制含糖量不低于0.5wt%，发酵培养48-60h，得白葡萄球菌发酵液；
3）往白葡萄球菌发酵液中添加甲醛进行灭活，再通过高速碟片机以5000rpm的速度离心6-8min，收集菌体沉淀，真空冷冻干燥，即得。
优选地，
所述种子培养基的组分为：葡萄糖12g/L，琼脂7g/L，蛋白胨3g/L，KH2PO4 0.5g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4 0.1g/L， FeSO4 0.1g/L，pH7.5；
优选地，
所述灭活参数为：控制甲醛终浓度为0.5wt%，25℃灭活48h。
本发明还要求保护一种制备白葡萄球菌粉的工艺。
本发明还要求保护上述制备的白葡萄球菌粉在制备镇咳药物中的应用。
本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：
本发明白葡萄球菌粉采用特殊的发酵工艺制备而得，成本低廉，工业附加值高；小麦麸皮含有丰富的碳水化合物、蛋白质、维生素E以及无机矿物质，本发明对麦麸进行了特殊工艺处理，使麦麸的营养物质最大限度地释放出来，其处理物中含有丰富的碳源、氮源、游离氨基酸、短肽、维生素以及无机矿物质，完全符合白葡萄球菌的生长需求，培养效果优于常规的培养基，并且成本低廉，给制药企业节省了原料成本，提高了工业附加值；本发明麦麸处理工艺中首先采用粉碎过筛，浸泡酶解处理，获得了还原糖作为碳源，而且不会破坏维生素以及其他活性物质，同时避免了酸碱对糖类物质的破坏；沉淀物中含有蛋白质，本发明采用采用酸水解方式，蛋白水解率得到50%以上，然后采用碱中和，在平衡pH度的同时，同时增加了氯化铵氮源的供应量，一举两得；本发明发酵培养基只采用麦麸，成本低廉，可完全取代市场常用培养基，发酵效率也相应提高。
附图说明
图1：温度对还原糖浓度的影响；
图2：酶添加量对还原糖浓度的影响。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
一种白葡萄球菌粉，其由白葡萄菌种子液接种到麦麸培养基发酵培养制得；
具体地，所述白葡萄球菌粉按照如下工艺制备而得：
1）取白葡萄球菌液（5×107CFU/mL），按照3%的接种量接种到种子培养基中，30℃、100rpm摇床培养18h，获得种子液；所述种子培养基的组分为：葡萄糖12g/L，琼脂7g/L，蛋白胨3g/L，KH2PO4 0.5g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4 0.1g/L， FeSO4 0.1g/L，pH7.5；
2）将种子液按照5%的接种量接种于装有50L麦麸培养基的发酵罐中进行发酵培养，培养温度30℃，通气量保持溶氧水平为20％，并通过添加葡萄糖控制含糖量不低于0.2wt%，发酵培养54h，得白葡萄球菌发酵液；
所述麦麸培养基按照如下工艺制备而得：
（1）将麦麸研磨粉碎，过100目筛，然后以1：15的料水质量比混合，再加入中性淀粉酶，添加量为0.6U/g麦麸，在70℃温度条件下处理15min，然后离心，收集沉淀和上层液体，将上层液体置于90℃的条件下，保温10min灭酶，冷却至室温，得到组分A；
（2）将沉淀加入到5倍重量的浓度为3M的盐酸，在80℃搅拌水解9小时，搅拌速度为100rpm，过滤收集滤液，然后用氨水中和残余盐酸，调整溶液pH为7.5，得到组分B；
（3）将组分A和组分B混匀得到麦麸培养基；
3）往白葡萄球菌发酵液中添加甲醛，控制终浓度为0.5wt%，25℃灭活48h，再通过高速碟片机以5000rpm的速度离心8min，收集菌体沉淀，真空冷冻干燥，即得。
实施例2
一种白葡萄球菌粉，其由白葡萄菌种子液接种到麦麸培养基发酵培养制得；
具体地，所述白葡萄球菌粉按照如下工艺制备而得：
1）取白葡萄球菌液（7×107CFU/mL），按照2%的接种量接种到种子培养基中，32℃、100rpm摇床培养24h，获得种子液；所述种子培养基的组分为：葡萄糖12g/L，琼脂7g/L，蛋白胨3g/L，KH2PO4 0.5g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4 0.1g/L， FeSO4 0.1g/L，pH7.5；
2）将种子液按照3%的接种量接种于装有50L麦麸培养基的发酵罐中进行发酵培养，培养温度32℃，通气量保持溶氧水平为20％，并通过添加葡萄糖控制含糖量不低于0.2wt%，发酵培养48h，得白葡萄球菌发酵液；
所述麦麸培养基按照如下工艺制备而得：
（1）将麦麸研磨粉碎，过100目筛，然后以1：15的料水质量比混合，再加入中性淀粉酶，添加量为0.6U/g麦麸，在70℃温度条件下处理15min，然后离心，收集沉淀和上层液体，将上层液体置于90℃的条件下，保温10min灭酶，冷却至室温，得到组分A；
（2）将沉淀加入到5倍重量的浓度为3M的盐酸，在80℃搅拌水解9小时，搅拌速度为100rpm，过滤收集滤液，然后用氨水中和残余盐酸，调整溶液pH为7.5，得到组分B；
（3）将组分A和组分B混匀得到麦麸培养基；
3）往白葡萄球菌发酵液中添加甲醛，控制终浓度为0.5wt%，25℃灭活48h，再通过高速碟片机以5000rpm的速度离心6min，收集菌体沉淀，真空冷冻干燥，即得。
实施例3
硝基水杨酸比色法检测组分A中还原糖的含量：
以实施例1为例，检测了温度以及加酶量对还原糖含量的影响，设置温度梯度为：40℃、50℃、60℃、70℃、80℃；设置加酶量梯度为：0.2U/g、0.4U/g、0.6U/g、0.8U/g、1.0U/g。如图1所示，当温度低于70℃时，随着温度的升高，还原糖的含量增加，在70℃左右时，水解得到的还原糖的含量最高，说明在70℃时中温淀粉酶的活力可以达到比较高的水平；而达到80℃的温度还原糖含量急剧降低，这可能是因为高温使中温淀粉酶的活性降低，同时也可能伴随着大量的还原糖的消耗。如图2所示，随着中温淀粉酶的添加量不断增大，麦麸中淀粉的水解程度不断增大，还原糖含量不断提高，当酶的添加量为0.6U/g时，还原糖含量最高；随着酶添加量的继续增加，还原糖的增加量并不明显，最终趋于平稳；考虑到成本，最终选择0.6U/g的添加量。
实施例4
本发明发酵工艺中使用的不同培养基对发酵液中菌浓度的影响：
以实施例1为例，实施例1发酵培养基为麦麸培养基；同时设置对照组：
对照组1：发酵培养基采用（质量百分比）：蛋白胨0.5%，尿素2%，玉米浆1%，葡萄糖1%，柠檬酸钠0.3%，硫酸镁0.05%以及氯化钠0.5%。其余工艺同实施例1。
对照组2：发酵培养基采用（质量百分比）：氯化铵1%，酵母粉1%，玉米浆2%，葡萄糖2%，氯化钠0.05%，硫酸亚铁0.01%，硫酸镁0.01%。其余工艺同实施例1。
对照组3：发酵培养基采用（质量百分比）：氯化铵0.5%，豆粕2%，麦麸1%，葡萄糖2%，氯化钠0.02%，硫酸亚铁0.01%，硫酸镁0.01%。其余工艺同实施例1。分别检测了实施例1以及对照组1-3制备的发酵液中的菌浓度，每组别设置三个平行组，求平均值，具体结果见表1：
表1
组别 实施例1 对照组1 对照组2 对照组3
菌浓度（CFU/mL） 1.2×1011 9.7×109 4.1×1010 1.9×1010
结论：本发明采用麦麸培养基作为发酵培养基，其采用麦麸为主要原料，其含有丰富的碳源、氮源、氨基酸、短肽、维生素以及无机矿物质，完全符合白葡萄球菌的生长需求，培养效果优于常规的培养基，并且成本低廉，节省了原料成本。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种白葡萄球菌粉，其由白葡萄菌种子液接种到麦麸培养基发酵培养制得。
2.根据权利要求1所述的白葡萄球菌粉，其特征在于，所述麦麸培养基按照如下工艺制备而得：
（1）将麦麸研磨粉碎，过100目筛，然后以1：15的料水质量比混合，再加入中性淀粉酶，添加量为0.6U/g麦麸，在70℃温度条件下处理15min，然后离心，收集沉淀和上层液体，将上层液体置于90℃的条件下，保温10min灭酶，冷却至室温，得到组分A；
（2）将沉淀加入到5倍重量的浓度为3M的盐酸，在80℃搅拌水解9小时，搅拌速度为100rpm，过滤收集滤液，然后用氨水中和残余盐酸，调整溶液pH为7.5，得到组分B；
（3）将组分A和组分B混匀得到麦麸培养基。
3.根据权利要求1或2所述的白葡萄球菌粉，其特征在于，所述白葡萄球菌粉按照如下工艺制备而得：
1）取白葡萄球菌液，按照2-3%的接种量接种到种子培养基中，30-32℃、100rpm摇床培养18-24h，获得种子液；
2）将种子液按照3-5%的接种量接种于装有麦麸培养基的发酵罐中进行发酵培养，培养温度30-32℃，通气保持溶氧水平为20％，并通过添加葡萄糖控制含糖量不低于0.5wt%，发酵培养48-60h，得白葡萄球菌发酵液；
3）往白葡萄球菌发酵液中添加甲醛进行灭活，再通过高速碟片机以5000rpm的速度离心6-8min，收集菌体沉淀，真空冷冻干燥，即得。
4.根据权利要求3所述的白葡萄球菌粉，其特征在于，
所述种子培养基的组分为：葡萄糖12g/L，琼脂7g/L，蛋白胨3g/L，KH2PO4 0.5g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4 0.1g/L， FeSO4 0.1g/L，pH7.5。
5.根据权利要求3所述的白葡萄球菌粉，其特征在于，所述灭活参数为：控制甲醛终浓度为0.5wt%，25℃灭活48h。
6.一种制备权利要求1-5所述的白葡萄球菌粉的工艺。
7.权利要求1-5任其一所述的白葡萄球菌粉在制备镇咳药物中的应用。
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