CN108018325A - 提高谷胱甘肽产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提高谷胱甘肽产量的方法，包括以下步骤：将巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)JQ在种子培养基中培养至OD600达到1.0‑40.0，得到活化后的种子液，其中种子培养基的pH为3.0‑7.0；将活化后的种子液按1‑15％接种量接种至发酵培养基中进行发酵培养，其中发酵培养基的初始pH值为4.0‑7.0，发酵培养温度为25‑35℃；当发酵培养至OD600达到40‑80时，开始补加葡萄糖；继续发酵培养，当OD600达到100‑300时，补加氨基酸和/或氨基酸盐，其中氨基酸在发酵培养基中的终浓度为1‑50mmol/L。本发明还提供了上述方法在制备含谷胱甘肽的产品中的应用。采用本发明的方法可使谷胱甘肽产量达3369mg/L，与对照菌株相比，谷胱甘肽产量提高了15倍，说明利用此方法可以大大提高谷胱甘肽产量，为其工业化生产提供基础。

Description

提高谷胱甘肽产量的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，尤其涉及一种提高谷胱甘肽产量的方法。
背景技术
谷胱甘肽(GSH)，即γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的一种同时具有γ-谷氨酰基和巯基的生物活性三肽化合物。谷胱甘肽在生物体内有着多种重要的生理功能，被称为长寿因子和抗衰老因子，特别是对于维持生物体内适宜的氧化还原环境起着至关重要的作用。GSH作为一种多功能的生物活性添加剂在食品加工业中的应用将会愈来愈广，其需求量正日益增大。
发酵法是利用廉价的糖类原料，通过微生物体内物质的代谢途径来进行GSH生物合成的方法。该法具有菌种易于培养、原料来源方便廉价、反应步骤简单、成本低、转化效率高、生产速率快等优点，该法已成为当前生产GSH的主要方法。目前，利用发酵法生产GSH，最常用的菌种是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和产朊假丝酵母(Candida utilis)。但由于反馈抑制效应以及γ-谷氨酰转肽酶的存在对细胞内合成的GSH的降解作用，因而不利于胞内GSH的积累，使得胞内GSH不能获得大量有效积累，因此很多菌株还无法达到工业化生产的要求。
GSH的产量不仅与菌株的遗传特性有关，还与其所处的环境有着密切的关系。微生物的生长代谢是非常复杂的生化过程，需要大量的营养物质作为底物或诱导物，同时也有一些物质会对微生物的生长代谢产生抑制，即使是同一种物质也有可能随着浓度的变化而对GSH发酵产生不同影响的现象。随着发酵制品的商业化生产和应用的迅速增加，工业发酵的目标转为以最低的生产成本获得最大的产值和利润，而实现这一目标的工程手段是针对每个特定过程建立相应的高效发酵模式。高密度发酵技术就是满足这一需要而发展起来的一门新兴技术。它不仅是生产高质量的浓缩型菌体和代谢产物的重要环节，更是菌体和代谢产物工业化生产过程中必须达到的重要指标。GSH作为一种胞内产物，为了增加其产量，进一步降低生产成本，通过提高细胞密度实现其高密度发酵，对GSH的工业化生产具有重要意义。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种提高谷胱甘肽产量的方法，利用本发明的方法可以大大提高谷胱甘肽产量，为其工业化生产提供基础。
在一方面，本发明提供了一种提高谷胱甘肽产量的方法，包括以下步骤：
(1)将保藏编号为CCTCC No：M 2016664的巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)JQ在种子培养基中培养至OD600达到1.0-40.0，得到活化后的种子液，其中发酵过程中种子培养基的 pH为3.0-7.0；
(2)将步骤(1)得到的所述活化后的种子液按1-15％接种量接种至发酵培养基中进行发酵培养，其中所述发酵培养基的初始pH值为4.0-7.0，发酵培养温度为25-35℃；
(3)当发酵培养至OD600达到40-80时，开始补加葡萄糖；
(4)继续发酵培养，当OD600达到100-300时，补加氨基酸或其盐，其中氨基酸在发酵培养基中的终浓度为1-50mmol/L。
在步骤(1)之前，还包括以下步骤：
将巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)JQ菌液接种至斜面培养基，在25-35℃下培养12-36h，得到高活性菌种，然后将其在种子培养基中培养。
进一步地，在步骤(1)中，在转速150-250r/min，25-35℃温度下进行培养。
进一步地，在步骤(1)中，种子培养基包括以下含量的各组分：葡萄糖5-50g/L，酵母提取物1-25g/L，蛋白胨5-50g/L，余量为水。
进一步地，在步骤(2)中，发酵培养基包括以下含量的各组分：葡萄糖10-150g/L，酵母提取物1-15g/L，硫酸铵1-30g/L，K2HPO4·3H2O1-10g/L，镁盐0.1-100mmol/L，钙盐0.1-10.0mmol/L，钾盐1-20.0mmol/L。其中，镁盐为MgCl2、MgSO4等；钙盐为CaCl2等钙盐；钾盐为KCl、K2SO4等。
进一步地，在步骤(3)中，基于残糖量补加所述葡萄糖，保证残糖量低于1.0g/L。
进一步地，在步骤(3)中，当溶氧水平(DO)为10-60时，开始补加葡萄糖。在具体实施时，可以设定10-60范围内任一数值，当DO大于该数值时，补加葡萄糖。
进一步地，在步骤(3)中，葡萄糖的补加方式包括：一次性流加、恒速流加和指数流加方式中的一种或几种。
进一步地，在步骤(3)中，葡萄糖的补加方式为恒速流加，恒速流加时，按1.0-50g/(L·h) 的流速恒速补加葡萄糖。
进一步地，在步骤(3)中，葡萄糖的补加方式为指数流加，指数流加时，按菌体比生长速率为0.05-0.3指数补加葡萄糖。
进一步地，在步骤(3)中，葡萄糖的补加方式为指数流加与恒速流加的混合方式，首先按菌体比生长速率为0.05-0.3指数补加葡萄糖，待流速达到10-20mL/h时，改为恒速流加。
进一步地，葡萄糖的纯度为10-80％。
进一步地，在步骤(4)中，氨基酸为谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸；谷氨酸盐为谷氨酸钠，半胱胺酸盐为半胱氨酸盐酸盐。
进一步地，谷氨酸/谷氨酸钠、半胱氨酸/半胱氨酸盐酸盐和甘氨酸的摩尔比为0.1-1.0: 0.1-1.0:0.1-1.0。
进一步地，在步骤(1)和步骤(2)中，采用pH计实时监测pH值，并补加5-50％的氨水控制pH值。
本发明使用的巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)JQ，已于2016年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M2016664。
本发明以CCTCC No：M 2016664为发酵菌株，采用了合适的种子培养基、发酵培养基及种子活化方法，提供了一种应用该菌株提高谷胱甘肽产量的方法，借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
葡萄糖的浓度对于控制细胞密度和促进GSH的合成至关重要。本发明，在发酵过程中，通过补加葡萄糖，可以提高菌体浓度，进一步提高GSH的产量；通过控制葡萄糖的补给速率与方式，消除细胞受底物而产生的对生长的抑制效果，从而将细胞密度控制在较高的水平，促进了GSH合成。在发酵过程中，适当地添加前体氨基酸对于提高GSH的产量有显著的效果。本发明，在发酵过程中，同时添加三种氨基酸或氨基酸盐对GSH的合成提高影响最大。本发明的方法可使谷胱甘肽产量达3369mg/L，与对照菌株相比谷胱甘肽产量提高了15倍；利用本发明的方法可以大大提高谷胱甘肽产量，为其工业化生产提供了基础。
附图说明
图1图示了分批发酵生产谷胱甘肽的产量结果；
图2图示了一次性补加补加葡萄糖对谷胱甘肽产量的影响；
图3图示了按流速为14mL/(L·h)补加葡萄糖对谷胱甘肽产量的影响；
图4图示了按流速为18mL/(L·h)补加葡萄糖对谷胱甘肽产量的影响；
图5图示了按μ＝0.1进行指数流加补加葡萄糖对谷胱甘肽产量的影响；
图6图示了指数流加与恒速流加共同补加葡萄糖对谷胱甘肽产量的影响；
图7图示了在补加葡萄糖的基础上，补加氨基酸对谷胱甘肽产量的影响；
图8图示了指数流加与恒速流加共同补加葡萄糖基础上，补加氨基酸对谷胱甘肽产量的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例采用的种子培养基包括以下含量的各组分：葡萄糖18g/L、酵母提取物9g/L、蛋白胨18g/L、pH＝5.5。
本实施例采用的发酵培养基包括以下含量的各组分：葡萄糖60g/L、酵母提取物6.5g/L、硫酸铵13g/L、K2HPO4·3H2O 6g/L、MgSO4 25mmol/L、CaCl2 4.1mmol/L、KCl 5mmol/L、 pH＝5.5。
将巴斯德毕赤酵母JQ在种子培养基中进行培养，然后接种至含上述发酵培养基的发酵罐中培养28h，结果如图1所示。其中5L发酵罐装液量为3L，通气量为1vvm，搅拌转速为600rpm，培养温度为30℃，采用20％浓度的氨水控制pH为5.5。从图1中可以看出，随着发酵时间的延长，菌浓逐渐增大，OD600最大可达61。谷胱甘肽产量在21h达到最大，最大产量为200mg/L。
实施例2
本实施例采用的种子培养基包括以下含量的各组分：葡萄糖25g/L、酵母提取物13g/L、蛋白胨30g/L、pH＝6.5。
本实施例采用的发酵培养基包括以下含量的各组分：葡萄糖60g/L、酵母提取物6.5g/L、硫酸铵13g/L、K2HPO4·3H2O6g/L、MgSO4 25mmol/L、CaCl2 4.1mmol/L、KCl 5mmol/L、pH＝5.5。
将巴斯德毕赤酵母JQ在种子培养基中进行培养，然后接种至含上述发酵培养基的发酵罐中培养28h。其中5L发酵罐装液量为3L，通气量为1vvm，搅拌转速为600rpm，培养温度为30℃，采用20％浓度的氨水控制pH为5.5。随着发酵时间的延长，菌浓逐渐增大，OD600最大可达55。谷胱甘肽产量在18h达到最大，最大产量为230mg/L。
实施例3
本实施例采用的种子培养基包括以下含量的各组分：葡萄糖25g/L、酵母提取物13g/L、蛋白胨30g/L、pH＝6.5。
本实施例采用的发酵培养基包括以下含量的各组分：葡萄糖90g/L、酵母提取物10g/L、硫酸铵15g/L、K2HPO4·3H2O 8g/L、MgSO4 35mmol/L、CaCl2 6mmol/L、KCl 10mmol/L、pH＝6.0。
将巴斯德毕赤酵母JQ在种子培养基中进行培养，然后接种至含上述发酵培养基的发酵罐中培养28h。其中5L发酵罐装液量为3L，通气量为1vvm，搅拌转速为600rpm，培养温度为30℃，采用20％浓度的氨水控制pH为6.0。随着发酵时间的延长，菌浓逐渐增大，OD600最大可达80。谷胱甘肽产量在24h达到最大，最大产量为210mg/L。
实施例4
本实施例采用的种子培养基包括以下含量的各组分：葡萄糖18g/L、酵母提取物9g/L、蛋白胨18g/L、pH＝5.5。
本实施例采用的发酵培养基包括以下含量的各组分：葡萄糖60g/L、酵母提取物6.5g/L、硫酸铵13g/L、K2HPO4·3H2O 6g/L、MgSO4 25mmol/L、CaCl2 4.1mmol/L、KCl 5mmol/L、 pH＝5.5。
将巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)JQ菌液接种至斜面培养基，在25℃下培养12h，得到高活性菌种，然后将巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)JQ在种子培养基中培养至OD600达到20，得到活化后的种子液。其中，在转速为200r/min，35℃温度下在种子培养基中进行培养。
将活化后的种子液按10％接种量接种至发酵培养基，其中发酵培养基的初始pH值为5.5，温度为30℃。当发酵培养至菌浓OD600达到60时，开始补加浓度为70％的葡萄糖。葡萄糖补加方式为：一次性补加。测定发酵后的谷胱甘肽含量，结果如图2所示。从图2中可看出，当发酵至42h时，谷胱甘肽产量可达670mg/L，为不补加葡萄糖情况下最高产量的3.35倍。
上述过程中，采用25％浓度的氨水控制培养基的pH值。
实施例6
本实施例采用的种子培养基包括以下含量的各组分：葡萄糖18g/L、酵母提取物9g/L、蛋白胨18g/L、pH＝5.5。
本实施例采用的发酵培养基包括以下含量的各组分：葡萄糖60g/L、酵母提取物6.5g/L、硫酸铵13g/L、K2HPO4·3H2O 6g/L、MgSO4 25mmol/L、CaCl2 4.1mmol/L、KCl 5mmol/L、 pH＝5.5。
将巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)JQ菌液接种至斜面培养基，在35℃下培养36h，得到高活性菌种，然后将巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)JQ在种子培养基中培养至OD600达到20，得到活化后的种子液。其中，在转速为200r/min，30℃温度下在种子培养基中进行培养。
将活化后的种子液按15％接种量接种至发酵培养基，其中发酵培养基的初始pH值为5.5，温度为30℃。当发酵培养至菌浓OD600达到60时，开始补加浓度为70％的葡萄糖，且按流速为14mL/(L·h)补加葡萄糖。结果如图3所示，巴斯德毕赤酵母生产谷胱甘肽的产量达到最大，为 1255.9mg/L。
实施例7
本实施例采用的种子培养基包括以下含量的各组分：葡萄糖18g/L、酵母提取物9g/L、蛋白胨18g/L、pH＝5.5。
本实施例采用的发酵培养基包括以下含量的各组分：葡萄糖60g/L、酵母提取物6.5g/L、硫酸铵13g/L、K2HPO4·3H2O 6g/L、MgSO4 25mmol/L、CaCl2 4.1mmol/L、KCl 5mmol/L、 pH＝5.5。
将巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)JQ菌液接种至斜面培养基，在35℃下培养36h，得到高活性菌种，然后将巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)JQ在种子培养基中培养至OD600达到20，得到活化后的种子液。其中，在转速为200r/min，30℃温度下在种子培养基中进行培养。
将活化后的种子液按15％接种量接种至发酵培养基，其中发酵培养基的初始pH值为5.5，温度为30℃。当发酵培养至菌浓OD600达到60时，开始补加浓度为70％的葡萄糖，且按流速为 18mL/(L·h)补加葡萄糖。结果如图4所示，巴斯德毕赤酵母生产谷胱甘肽的产量达到最大，为 1286.2mg/L。
实施例8
本实施例采用的种子培养基包括以下含量的各组分：葡萄糖18g/L、酵母提取物9g/L、蛋白胨18g/L、pH＝5.5。
本实施例采用的发酵培养基包括以下含量的各组分：葡萄糖60g/L、酵母提取物6.5g/L、硫酸铵13g/L、K2HPO4·3H2O 6g/L、MgSO4 25mmol/L、CaCl2 4.1mmol/L、KCl 5mmol/L、 pH＝5.5。
将巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)JQ菌液接种至斜面培养基，在35℃下培养36h，得到高活性菌种，然后将巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)JQ在种子培养基中培养至OD600达到20，得到活化后的种子液。其中，在转速为200r/min，30℃温度下在种子培养基中进行培养。
将活化后的种子液按15％接种量接种至发酵培养基，其中发酵培养基的初始pH值为5.5，温度为30℃。当发酵培养至菌浓OD600达到60时，开始补加浓度为70％的葡萄糖，且按μ＝0.1 进行指数流加补加葡萄糖。结果如图5所示，巴斯德毕赤酵母生产谷胱甘肽的产量达到最大，为1595.5mg/L。
实施例9
本实施例采用的种子培养基包括以下含量的各组分：葡萄糖18g/L、酵母提取物9g/L、蛋白胨18g/L、pH＝5.5。
本实施例采用的发酵培养基包括以下含量的各组分：葡萄糖60g/L、酵母提取物6.5g/L、硫酸铵13g/L、K2HPO4·3H2O 6g/L、MgSO4 25mmol/L、CaCl2 4.1mmol/L、KCl 5mmol/L、 pH＝5.5。
将巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)JQ菌液接种至斜面培养基，在35℃下培养36h，得到高活性菌种，然后将巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)JQ在种子培养基中培养至OD600达到20，得到活化后的种子液。其中，在转速为200r/min，30℃温度下在种子培养基中进行培养。
将活化后的种子液按15％接种量接种至发酵培养基，其中发酵培养基的初始pH值为5.5，温度为30℃。当发酵培养至菌浓OD600达到60时，开始补加浓度为70％的葡萄糖，且按μ＝0.1 进行指数流加补加葡萄糖，待流速达到16mL/h时，改为恒速流加。结果如图6所示，巴斯德毕赤酵母生产谷胱甘肽的产量达到最大，为1772.4mg/L。
实施例10
本实施例采用的种子培养基包括以下含量的各组分：葡萄糖18g/L、酵母提取物9g/L、蛋白胨18g/L、pH＝5.5。
本实施例采用的发酵培养基包括以下含量的各组分：葡萄糖60g/L、酵母提取物6.5g/L、硫酸铵13g/L、K2HPO4·3H2O 6g/L、MgSO4 25mmol/L、CaCl2 4.1mmol/L、KCl 5mmol/L、 pH＝5.5。
将巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)JQ菌液接种至斜面培养基，在35℃下培养36h，得到高活性菌种，然后将巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)JQ在种子培养基中培养至OD600达到20，得到活化后的种子液。其中，在转速为200r/min，30℃温度下在种子培养基中进行培养。
将活化后的种子液按15％接种量接种至发酵培养基，其中发酵培养基的初始pH值为5.5，温度为30℃。当发酵培养至菌浓OD600达到60时，开始补加浓度为70％的葡萄糖，且按流速为 10mL/(L·h)补加葡萄糖。继续培养至菌浓OD600增加至290时，补加14mmol/L的3种氨基酸(谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸，三者比例为1:1:1)。结果如图7所示，巴斯德毕赤酵母生产谷胱甘肽的产量达到最大，为3080mg/L，与对照相比谷胱甘肽产量提高了15倍。
实施例11
本实施例采用的种子培养基包括以下含量的各组分：葡萄糖18g/L、酵母提取物9g/L、蛋白胨18g/L、pH＝5.5。
本实施例采用的发酵培养基包括以下含量的各组分：葡萄糖60g/L、酵母提取物6.5g/L、硫酸铵13g/L、K2HPO4·3H2O 6g/L、MgSO4 25mmol/L、CaCl2 4.1mmol/L、KCl 5mmol/L、 pH＝5.5。
将巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)JQ菌液接种至斜面培养基，在35℃下培养36h，得到高活性菌种，然后将巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)JQ在种子培养基中培养至OD600达到20，得到活化后的种子液。其中，在转速为200r/min，30℃温度下在种子培养基中进行培养。
将活化后的种子液按15％接种量接种至发酵培养基，其中发酵培养基的初始pH值为5.5，温度为30℃。当发酵培养至菌浓OD600达到60时，开始补加浓度为70％的葡萄糖，且按μ＝0.1 进行指数流加补加葡萄糖，待流速达到16mL/h时，改为恒速流加，继续培养至菌浓OD600增加至290时，补加14mmol/L的3种氨基酸(谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸，三者比例为1:1:1)。结果如图8所示，巴斯德毕赤酵母生产谷胱甘肽的产量达到最大，为3369mg/L。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种提高谷胱甘肽产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将保藏编号为CCTCC No：M 2016664的巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)JQ在种子培养基中培养至OD600达到1.0-40.0，得到活化后的种子液，其中培养过程中所述种子培养基的pH为3.0-7.0；
(2)将步骤(1)得到的所述活化后的种子液按1-15％接种量接种至发酵培养基中进行发酵培养，其中所述发酵培养基的初始pH值为4.0-7.0，发酵培养温度为25-35℃；
(3)当发酵培养至OD600达到40-80时，开始补加葡萄糖；
(4)继续发酵培养，当OD600达到100-300时，补加氨基酸或其盐，其中氨基酸在发酵培养基中的终浓度为1-50mmol/L。
2.根据权利要求1所述的提高谷胱甘肽产量的方法，其特征在于，在步骤(1)之前，还包括以下步骤：
将巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)JQ菌液接种至斜面培养基，在25-35℃下培养12-36h，得到高活性菌种。
3.根据权利要求1所述的提高谷胱甘肽产量的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述种子培养基包括以下含量的各组分：葡萄糖5-50g/L，酵母提取物1-25g/L，蛋白胨5-50g/L。
4.根据权利要求1所述的提高谷胱甘肽产量的方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述发酵培养基包括以下含量的各组分：葡萄糖10-150g/L，酵母提取物1-15g/L，硫酸铵1-30g/L，K2HPO4·3H2O 1-10g/L，镁盐0.1-100mmol/L，钙盐0.1-10.0mmol/L，钾盐1-20.0mmol/L。
5.根据权利要求1所述的提高谷胱甘肽产量的方法，其特征在于：在步骤(3)中，基于残糖量补加所述葡萄糖，使得发酵培养基中所述残糖量浓度为0.5-1.5g/L。
6.根据权利要求1所述的提高谷胱甘肽产量的方法，其特征在于：在步骤(3)中，当溶氧水平为10-60时，开始补加所述葡萄糖。
7.根据权利要求1所述的提高谷胱甘肽产量的方法，其特征在于：在步骤(3)中，葡萄糖的补加方式包括：一次性流加、恒速流加和指数流加方式中的一种或几种。
8.根据权利要求7所述的提高谷胱甘肽产量的方法，其特征在于：在步骤(3)中，葡萄糖的补加方式为恒速流加，恒速流加时，按1.0-50g/(L·h)的流速恒速补加所述葡萄糖。
9.根据权利要求7所述的提高谷胱甘肽产量的方法，其特征在于：在步骤(3)中，葡萄糖的补加方式为指数流加，指数流加时，按菌体比生长速率为0.05-0.3指数补加所述葡萄糖。
10.根据权利要求7所述的提高谷胱甘肽产量的方法，其特征在于：在步骤(3)中，葡萄糖的补加方式为指数流加与恒速流加的混合方式，首先按菌体比生长速率为0.05-0.3指数补加所述葡萄糖，待流速达到10-20mL/h时，改为恒速流加。
11.根据权利要求1所述的提高谷胱甘肽产量的方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述氨基酸为谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸。
12.根据权利要求11所述的提高谷胱甘肽产量的方法，其特征在于：所述谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸的摩尔比为0.1-1.0:0.1-1.0:0.1-1.0。
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