CN104845896A - 生产威兰胶的菌株及方法 - Google Patents
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Abstract
一株生产威兰胶的海洋菌株，属于鞘氨醇单胞菌（Sphingomonassp.WG），保藏号为CCTCC No: M2013161。在液体培养基中培养本发明菌株，可获得威兰胶，生产效率较高。本发明的菌株对碳源和氮源要求较低。发酵工艺步骤为：（1）培养种子液；（2）发酵生产威兰胶。提取纯化步骤为：（1）发酵液预处理；（2）粗品析出；（3）除杂质；（4）干燥得到威兰胶产品。利用本发明的海洋菌株发酵生产威兰胶产量最高可达33g/L，提取纯化收率最高可达95%。利用本发明能够实现威兰胶的低成本、高效率、高品质的生产。
Description
技术领域
本发明涉及一株高产威兰胶的海洋菌株鞘氨醇单胞菌（Sphingomonassp. WG）及利用该菌株进行威兰胶高产发酵和提取纯化的工艺方法，属于工业微生物技术领域。
背景技术
威兰胶（Welan gum）是一种由微生物合成的杂多糖，是一种高分子聚合物，它的骨架结构由D-葡萄糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖的单元组成。侧链由单链的L-甘露糖或单链的L-鼠李糖构成。
威兰胶具有良好的热稳定性、悬浮性、乳化性和增稠性，可作为增稠剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、润滑剂、成膜剂和粘合剂应用于工农业的各个方面，特别是在食品、混凝土、石油和油墨等工业中具有广泛的应用前景。
目前，威兰胶主要是通过微生物发酵法生产，美国kelco公司现已成为全球最大的威兰胶生产和供应商，国内对威兰胶的研究尚处于起步阶段，南京工业大学、南昌大学、江南大学和河北鑫合化工有限公司从事这方面的研究，但生产菌株和发酵工艺各不相同，此外还未见其他相关报道。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种鞘氨醇单胞菌，其可以在低成本的液体培养基中合成威兰胶。
本发明的另一个目的在于提供一种威兰胶的发酵生产工艺。
本发明的最后一个目的在于提供一种威兰胶的提取纯化工艺。
本发明所述的一种产威兰胶的菌株，其特征在于所述的菌株为鞘氨醇单胞菌WG（Sphingomonassp. WG），于2013年4月26日保藏于中国典型培养物保藏中心（武汉大学），保藏号为：CCTCC No: M2013161；本发明提供的鞘氨醇单胞菌WG（Sphingomonassp. WG）由青岛胶州湾海泥中分离得到，其单菌落呈黄色，圆形，中央凸起，粘稠，不透明，边缘整齐，表面光滑；本发明提供的鞘氨醇单胞菌WG（Sphingomonassp. WG）菌株形态特征：革兰氏染色阴性，菌体呈短杆状，有鞭毛，无芽孢；本发明提供的鞘氨醇单胞菌WG（Sphingomonas sp.WG）生理生化特征：生长温度为20~40℃，生长pH为4~9，NaCl耐受性为3%；氧化酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、脲酶、β-半乳糖苷酶以及柠檬酸利用实验为阳性，VP、吲哚产生、明胶水解实验、H2S产生实验为阴性。
本发明提供的鞘氨醇单胞菌WG（Sphingomonassp.WG）的16S rRNA基因序列特征：将鞘氨醇单胞菌WG接种于LB培养基，30℃ 180 rpm 培养 16~18 h，利用细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取其基因组DNA，采用上游引物5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’和下游引物5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’进行PCR扩增，得到其16S rRNA基因片段。PCR条件如下：94℃ 5 min； 94℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72℃ 10 min。将PCR扩增得到的16S rRNA基因片段纯化后，用快连试剂盒连接至pMD18-T载体，连接产物转化E. coli DH5α，在含100 μg /mL氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，经PCR鉴定获得阳性克隆，将单克隆送去上海生工生物工程有限公司，利用pMD18-T载体通用测序引物进行测序。测序结果表明，该菌株16S rRNA基因序列长度为1434 bp。
一种威兰胶的发酵生产工艺，包括如下步骤：
（1）菌种活化：将鞘氨醇单胞菌在YPD固体培养基中于20~40℃恒温培养2~6天；（2）种子液制备：将步骤（1）中活化好的单菌落接种于新鲜无菌的YPD液体培养基中培养，之后采用逐级放大扩培的方式进行，培养温度为20~40℃，培养时间为10~26小时；（3）发酵生产威兰胶：将步骤（2）中逐级扩培得到的种子液以1%~15%的接种比例接种于发酵培养基中，通过对发酵过程的调控实现威兰胶的发酵生产，可获得较高产量的威兰胶，最高可达33 g/L。
步骤（3）所述的发酵培养基的组成，以重量体积百分比计，碳源1~15%，氮源0.2~5.0%，硫酸镁0.02~0.2%，磷酸氢二钾0.02~0.4%，磷酸氢二钠0.3~1.0%，磷酸二氢钠0.1~0.5%，pH值为4.5~8.5。
所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、糖蜜、甘油、淀粉和糊精之中的一种或几种。
所述的氮源为蛋白胨、酵母提取物、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、玉米蛋白粉、花生饼粉、生物氮素、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、硫酸铵和硝酸盐之中的一种或几种。
步骤（3）所述的发酵过程的调控分为三个阶段：第一阶段：0~24小时，此阶段为菌体生长阶段，逐步提高发酵罐内的溶氧水平，控制在20%以上；第二阶段：24~48小时，此阶段为前体补加阶段，控制发酵罐内溶氧水平在30%以上，并补加前体物质；第三阶段，48~90小时，此阶段为补料阶段，控制发酵罐内溶氧水平在30%以上，并补加一定比例的碳源和氮源维持威兰胶的生产。
所述的前体物质为甘露糖、鼠李糖、甘露醇和乙酸盐中的一种或几种。
一种威兰胶的提取纯化工艺，包括如下步骤：
（1）发酵液预处理：采用除菌方法以破坏或去除菌体细胞，并抑制威兰胶被降解；（2）粗品析出：将步骤（1）中预处理好的发酵液与pH调节剂调节后的酸性醇溶剂混合，体积比为1:1~1:5，混合液最终pH为2~7，反应时间大于10分钟，威兰胶逐渐析出，采用离心、过滤等方法获得威兰胶粗品；（3）除杂质：将步骤（2）中的威兰胶粗品用洗涤溶剂进行洗涤除杂，获得威兰胶半成品；（4）干燥：将步骤（3）中获得的威兰胶半成品采用干燥方法进行脱水干燥，获得威兰胶成品，总收率最高可达95%。
步骤（1）中所述的除菌方法包括加热、添加杀菌剂、离心和过滤中的一种或几种。
步骤（2）中所述的醇溶剂为甲醇、乙醇和异丙醇中的一种或几种。
步骤（2）中所述的pH调节剂为盐酸、硫酸、硝酸、醋酸、磷酸、草酸、柠檬酸、氢氧化钠、氢氧化钾和氨水中的一种或几种。
步骤（3）中所述的洗涤溶剂为水、甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮中的一种或几种。
步骤（4）中所述的干燥方法包括真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥中的一种或几种。
本发明的优点：
1. 本发明提供的鞘氨醇单胞菌从青岛胶州湾海泥中分离得到，对高盐环境具有良好的耐受性，可利用多种廉价的碳源和氮源发酵生产威兰胶。
2. 采用有效的发酵调控手段，将威兰胶发酵过程分为三阶段控制，为菌体生长和威兰胶的合成提供适宜的溶氧、碳源、氮源和前体物质，最终发酵产量高达33 g/L，超过其他文献报道的20 g/L左右的产量，实现了威兰胶的高效生产。
3. 采用了发酵液预处理、粗品析出、除杂和干燥4步工艺从发酵液中提取纯化威兰胶，在整个提取过程初始添加杀菌剂，进一步有效抑制威兰胶被降解，总收率可达95%，工艺简单，适合工业化生产。
附图说明
图1是LB培养基上30℃培养24 h时菌株WG的单菌落形态。
图2是威兰胶发酵过程曲线。
具体实施方式
实施例1 本发明提供的鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.WG菌株的形态和生理生化鉴定
本发明提供的鞘氨醇单胞菌WG（Sphingomonassp.WG）由青岛胶州湾海泥中分离得到，经过连续多次稀释涂平板得到纯培养物。通过革兰氏染色、形态观察、博检革兰氏阴性细菌鉴定***对其菌株形态和生理生化反应进行鉴定。
鞘氨醇单胞菌WG（Sphingomonassp.WG）在LB平板上30℃培养24 h即可长出单菌落，其单菌落呈黄色，圆形，中央凸起，粘稠，不透明，边缘整齐，表面光滑（见附图1）；该菌株革兰氏染色阴性，菌体呈短杆状，有鞭毛，无芽孢；其生长温度为20~40℃，生长pH为4~9，NaCl耐受性为3%；氧化酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、脲酶、β-半乳糖苷酶以及柠檬酸利用实验为阳性，VP、吲哚产生、明胶水解实验、H2S产生实验为阴性。
实施例2 本发明提供的鞘氨醇单胞菌WG（Sphingomonassp.WG）的16S rRNA基因的克隆和序列测定
本发明提供的鞘氨醇单胞菌WG（Sphingomonassp.WG）的16S rRNA基因序列特征：将WG菌株接种于LB培养基，30℃ 180 rpm培养16~18 h，利用细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取其基因组DNA，采用上游引物5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’和下游引物5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’ 进行PCR扩增，得到其16S rRNA基因片段。PCR条件如下：94℃ 5 min； 94℃ 50 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72℃ 10 min。将PCR扩增得到的16S rRNA基因片段纯化后，用快连试剂盒连接至pMD18-T载体，连接产物转化E. coli DH5α，在含100 μg /mL氨苄青霉素的LB 平板上进行筛选，经PCR鉴定获得阳性克隆，将单克隆送去上海生工生物工程有限公司，利用pMD18-T载体通用测序引物进行测序。测序结果表明，该菌株16S rRNA基因序列长度为1434 bp。
实施例3 种子液的制备
固体培养基：酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，pH7.5。
液体培养基：酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，pH7.5。
将鞘氨醇单胞菌WG的菌种在YPD固体培养基划线于30℃恒温培养4天进行活化，待长出黄色菌落，于2~4℃下短期保藏待用。将活化好单菌落接入装有YPD液体培养基的250 ml三角瓶中，三角瓶装液量为50 ml，在30℃、摇床转速为230 rpm下恒温培养18 h，获得一级种子液。将一级种子液以1.5%接种量接种于含有100 ml液体YPD培养基的500 ml三角瓶中，在30℃、摇床转速为230 rpm下恒温培养15 h，获得二级种子液。
实施例4 发酵罐（20 L）中发酵生产威兰胶
液体发酵培养基：麦芽糖5%，酵母膏0.4%，玉米浆0.2%，生物氮素1.5%，硫酸镁0.8%，磷酸氢二钾0.2%，磷酸氢二钠0.75%，磷酸二氢钠0.25%。121℃实罐灭菌20分钟。
将实施例3中所获得的鞘氨醇单胞菌二级种子液以10%接种量接种于含有15 L液体发酵培养基的20 L发酵罐中，初始条件：pH为7.5，转速为300 rpm，通气量为7.2 L/min，温度为30℃。
对威兰胶发酵进行三个阶段的调控。第一阶段：0~24小时，通过提高转速、增加罐压、添加氧载体等方式逐步提高发酵罐内的溶氧水平，始终控制溶氧大于20%；第二阶段：24~48小时，控制发酵罐内溶氧水平在30%以上，并补加前体物质甘露糖和鼠李糖，二者比例为1:1，最终补加量均为1.2 g/L；第三阶段，48~90小时，控制发酵罐内溶氧水平在30%以上，并补加葡萄糖和酵母膏来维持威兰胶的生产，二者比例为10:1，最终补加量分别为40 g/L和4 g/L。威兰胶产量达33.3 g/L，发酵液体积达17 L，总产量为566 g。发酵过程曲线见附图2。
实施例5 威兰胶的提取纯化
将实施例4中获得的威兰胶发酵液中添加异噻唑啉酮使其终浓度为0.2 g/L，以杀死发酵液中鞘氨醇单胞菌，并破坏蛋白质的键，从而抑制细胞液中的多种酶类的活性，保证威兰胶不被降解。
将预处理好的发酵液与草酸调节的酸性乙醇混合，体积比为1:1，混合液最终pH为5.2，反应时间20分钟，威兰胶逐渐析出，采用板框过滤的方法获得威兰胶粗品。
将威兰胶粗品依次用丙酮和纯水进行洗涤3次，威兰胶：丙酮为1:1（质量体积比），威兰胶：水为1:2（质量体积比），以除去多余的杂蛋白、细胞碎片和盐，采用板框过滤的方法获得威兰胶半成品，丙酮加以回收利用。
将威兰胶半成品至于低温连续真空干燥机中进行干燥，干燥温度为80℃，干燥时间大于1小时，至含水量低于10%，取出后经粉碎最终获得威兰胶成品，总收率为95.4%。
Claims (15)
1.一种生产威兰胶的鞘氨醇单胞菌WG菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO: M2013161。
2.根据权利要求1所述的生产威兰胶的菌株，其特征在于：
本发明提供的鞘氨醇单胞菌WG（Sphingomonassp.WG）由青岛胶州湾海泥中分离得到，其单菌落呈黄色，圆形，中央凸起，粘稠，不透明，边缘整齐，表面光滑；
本发明提供的鞘氨醇单胞菌WG（Sphingomonassp. WG）菌株形态特征：革兰氏染色阴性，菌体呈短杆状，有鞭毛，无芽孢；
本发明提供的鞘氨醇单胞菌WG（Sphingomonassp.WG）生理生化特征：生长温度为20~40℃，生长pH为4~9，NaCl耐受性为3%；氧化酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、脲酶、β-半乳糖苷酶以及柠檬酸利用实验为阳性，VP、吲哚产生、明胶水解实验、H2S产生实验为阴性。
3.一种发酵生产威兰胶的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：（1）菌种活化：将权利要求1所述的菌株在YPD固体培养基中于20~40℃恒温培养2~6天；（2）种子液制备：将步骤1）中活化好的单菌落接种于新鲜无菌的YPD液体培养基中培养，之后采用逐级放大扩培的方式进行，培养温度为20~40℃，培养时间为10~26小时；（3）发酵生产威兰胶：将步骤2）中逐级扩培得到的种子液以1%~15%的接种比例接种于发酵培养基中，通过对发酵过程的调控实现威兰胶的发酵生产，可获得较高产量的威兰胶。
4.根据权利要求4所述的发酵生产威兰胶的方法，其特征在于步骤3）所述的发酵培养基的组成，以重量体积百分比计，碳源1~15%，氮源0.2~5.0%，硫酸镁0.02~0.2%，磷酸氢二钾0.02~0.4%，磷酸氢二钠0.3~1.0%，磷酸二氢钠0.1~0.5%，pH值为4.5~8.5。
5.根据权利要求4所述的发酵生产威兰胶的方法，其特征在于所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、糖蜜、甘油、淀粉和糊精之中的一种或几种。
6.根据权利要求4所述的发酵生产威兰胶的方法，其特征在于所述的氮源为蛋白胨、酵母提取物、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、玉米蛋白粉、花生饼粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、硫酸铵和硝酸盐之中的一种或几种。
7.根据权利要求4所述的发酵生产威兰胶的方法，其特征在于所述的发酵过程的调控分为三个阶段：第一阶段：0~24小时，此阶段为菌体生长阶段，逐步提高发酵罐内的溶氧水平，控制在20%以上；第二阶段：24~48小时，此阶段为前体补加阶段，控制发酵罐内溶氧水平在30%以上，并补加前体物质；第三阶段，48~90小时，此阶段为补料阶段，控制发酵罐内溶氧水平在30%以上，并补加一定比例的碳源和氮源维持威兰胶的生产。
8.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述的前体物质为甘露糖、鼠李糖、甘露醇和乙酸盐中的一种或几种。
9.根据权利要求4所述的发酵生产威兰胶的方法，其特征在于所述的威兰胶的产量高达33 g/L。
10.一种提取纯化威兰胶的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
（1）发酵液预处理：采用除菌方法以破坏或去除菌体细胞，并抑制威兰胶被降解；（2）粗品析出：将步骤（1）中预处理好的发酵液与醇溶剂混合，体积比为1:1~1:5，以pH调节剂调节混合液pH，使其最终pH为2~7，反应时间大于10分钟，威兰胶逐渐析出，采用离心、过滤等方法获得威兰胶粗品；（3）除杂质：将步骤（2）中的威兰胶粗品用洗涤溶剂进行洗涤除杂，获得威兰胶半成品；（4）干燥：将步骤（3）中获得的威兰胶半成品采用干燥方法进行脱水干燥，获得威兰胶成品，总收率最高可达95%。
11.根据权利要求11所述的提取纯化威兰胶的方法，其特征在于步骤1）中所述的除菌方法包括加热、添加杀菌剂、离心和过滤中的一种或几种。
12.根据权利要求11所述的提取纯化威兰胶的方法，其特征在于步骤2）中所述的醇溶剂为甲醇、乙醇和异丙醇中的一种或几种。
13.根据权利要求11所述的提取纯化威兰胶的方法，其特征在于步骤2）中所述的pH调节剂为盐酸、硫酸、硝酸、醋酸、磷酸、草酸、柠檬酸、氢氧化钠、氢氧化钾和氨水中的一种或几种。
14.根据权利要求11所述的提取纯化威兰胶的方法，其特征在于步骤3）中所述的洗涤溶剂为水、甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮中的一种或几种。
15.根据权利要求11所述的提取纯化威兰胶的方法，其特征在于步骤4）中所述的干燥方法包括真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥中的一种或几种。
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