CN107961366A - 葵花小分子肽在降尿酸溶解痛风石修复肾功能中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种葵花小分子肽在制备降尿酸溶解痛风石修复肾功能药物中的应用。本发明葵花小分子肽在制备降尿酸溶解痛风石修复肾功能药物中的应用，葵花小分子肽可以起到抗炎，消肿，止痛及降低血尿酸，溶解尿酸钠的作用，同时对肾脏受损细胞有良好的修复效果，对高尿酸症标本兼治，从根本治疗高尿酸症。

Description

葵花小分子肽在降尿酸溶解痛风石修复肾功能中的应用

技术领域

本发明涉及药物技术领域，特别涉及一种葵花小分子肽在制备降尿酸溶解痛风石修复肾功能药物中的应用。

背景技术

痛风是嘌呤代谢紊乱所致的一种代谢疾病，血尿酸浓度升高，尿酸钠晶体沉积于下肢骨关节、动脉、脊椎骨间隙组织而引起，表现为关节红、肿、热、痛，关节活动不利，严重者呈关节畸形及功能障碍，且具有反复发作的特点。痛风的存在还可导致冠心病、糖尿病、高血压等疾病的恶化。在治疗方面，西医药治疗痛风，尚无根治的方法，秋水仙碱、非甾体类抗炎药、别嘌呤醇等药物虽可减轻症状，降低血尿酸，但其作用较单一，很难从根本上治疗痛风，且长期服用此类西药对身体造成的伤害远比治疗效果多。

高尿酸血症目前国内外发病人数呈上升趋势，其发病机制上以尿酸生成增多和肾脏尿酸***减少为主，且该疾病用药常常对肾脏造成损伤以及加重肾脏负担。

向日葵花盘为菊科植物向日葵(Helianthus annuuss L.)的花盘，亦称向日葵花托、向日葵饼和葵房，其性平、味甘淡、无毒、归肝经，主要功能有清热平肝、止痛、止血，用于治疗关节炎、乳腺炎、头晕、耳鸣、脘腹痛等。向日葵盘水煎液具有***作用，向日葵花盘乙醇提取物有一定的降压作用，民间也用其作为调治萎缩性胃炎药膳。我国是向日葵的种植大国，葵花盘的资源丰富。但是，在传统应用中，通常是将除葵花子后葵花盘作为牲畜饲料喂养牲畜或作为烧材取暖做饭，没有发挥出其更大的经济效益和医疗作用，造成资源浪费。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种葵花小分子肽在制备降尿酸溶解痛风石修复肾功能药物中的应用。所述技术方案如下：

一方面，一种葵花小分子肽在制备降尿酸溶解痛风石修复肾功能药物中的应用。

进一步的，所述葵花小分子肽中粗蛋白质＞93％，80％肽段的相对分子质量分布/u＜1000；肽含量为85.6％，水分含量为3.5％，灰分含量为7.4％。

进一步的，所述葵花小分子肽通过以下方法制备得到：

1)将葵花盘粉碎至100-200目，加入6-10倍质量的去离子水，充分搅拌，用氢氧化钠调节pH值为8-9，在45-50℃搅拌120-240分钟，得到葵花盘分离蛋白液；

2)将葵花盘分离蛋白液加热至85-90℃，搅拌1-3h，冷却至45-55℃，加入占葵花盘分离蛋白液总体积0.1％-0.3％的复合蛋白酶，酶解3-5h，反应终止时，5分钟内升温至85-90℃，保持5-10分钟，使复合蛋白酶失去活性，所得酶解液备用；

3)将步骤2)的酶解液在5000转/分钟的转速下离心8-12分钟，收集上清液，得葵花蛋白小分子肽粗液；

4)将步骤3)的葵花蛋白小分子肽粗液经截流分子量为5000-20000的中空纤维膜超滤，除去大分子蛋白，得到葵花盘小分子肽液；

5)将步骤4)的葵花盘小分子肽液浓缩，使其体积浓缩至原来的四分之一到二分之一，喷雾干燥，即得葵花小分子肽。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明葵花小分子肽在制备降尿酸溶解痛风石修复肾功能药物中的应用，葵花小分子肽可以起到抗炎，消肿，止痛及降低血尿酸，溶解尿酸钠的作用，同时对肾脏受损细胞有良好的修复效果，对高尿酸症标本兼治，从根本治疗高尿酸症。

附图说明

为了更清楚地说明本发明施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1是本发明实施例2中空白组肾脏细胞图，其中A为400倍放大图，B为200倍放大图；

图2是本发明实施例2中模型组肾脏细胞图，其中A为400倍放大图a，B为400倍放大图b，C为200倍放大图；

图3是本发明实施例2中葵花小分子肽组肾脏细胞图，其中A为400倍放大图，B为200倍放大图；

图4是本发明实施例2中别嘌呤组肾脏细胞图，其中A为400倍放大图a，B为400倍放大图b，C为200倍放大图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

实施例1葵花小分子肽的制备

1)将葵花盘5kg粉碎至100目，加入30kg的去离子水，充分搅拌，用氢氧化钠调节pH值为8，在45℃搅拌120分钟，得到葵花盘分离蛋白液。

2)将葵花盘分离蛋白液加热至85℃，搅拌1h，冷却至45℃，加入占葵花盘分离蛋白液总体积0.1％的复合蛋白酶(生姜蛋白酶、蜗牛蛋白酶、蝙蝠蛾幼虫蛋白消化酶按1:0.5:1的质量比例混合)，酶解3h，反应终止时，5分钟内升温至85℃，保持5分钟，使复合蛋白酶失去活性，所得酶解液备用。

3)将步骤2)的酶解液在5000转/分钟的转速下离心8分钟，收集上清液，得葵花蛋白小分子肽粗液。

4)将步骤3)的葵花蛋白小分子肽粗液经截流分子量为5000的中空纤维膜超滤，除去大分子蛋白，得到葵花盘小分子肽液。

5)将步骤4)的葵花盘小分子肽液浓缩，使其体积浓缩至原来的四分之一到，喷雾干燥，即得葵花小分子肽。

蝙蝠蛾幼虫蛋白消化酶的制备方法包括如下步骤：将蝙蝠蛾幼虫去头并剔除虫皮和脂肪，取消化道整体，加入10倍质量的磷酸缓冲液，匀浆，在4℃下组织浆液，然后以3000rpm/min的速度离心，取上清液加热到40℃并迅速冷却至5℃，过滤除去脂肪，透析除盐，冷冻干燥，即得。

制备得到的葵花小分子肽中粗蛋白质＞93％，80％肽段的相对分子质量分布/u＜1000；肽含量为85.6％，水分含量为3.5％，灰分含量为7.4％。

实施例2葵花小分子肽降尿酸修复受损肾脏细胞试验

(1)材料

小分子肽：实施例1制备的葵花小分子肽。

酵母膏：英国Oxiod公司。

氧嗪酸钾盐：美国Sigma公司，批号：101310713。

别嘌醇片：世贸天阶制药(江苏)有限责任公司，批号：201608301。

小鼠尿酸检测试剂盒：南京建成生物工程研究所。

SPF级KM小鼠：雄性，体质量(22～25)g，由吉林大学第一医院实验动物中心提供。

(2)造模给药

研究进行前对小鼠进行称重，其中12只作为空白对照组，其余小鼠为高尿酸血症模型造模组。实验期间每日早间称重。本次造模实验采取酵母膏灌胃的方法，通过给予大量嘌呤物质使其尿酸值增高，嘌呤代谢紊乱，从而达到短时间内暂时性升高血尿酸值的效果。将50只小鼠随机分为4组，每组约12只，分别为空白组，模型组，葵花盘小分子肽组，别嘌醇组。造模期间，除空白组(等体积水灌胃)外，其他各组每天按20g/kg酵母膏进行灌胃，1次/d，连续灌胃7天，第7日夜间断食，次日清晨取血测血UA值。第9天开始，空白组每日等体积水灌胃，根据血尿酸值测试结果随机选取12只作为模型组，余下均分为2组给药，上午持续酵母膏灌胃，给药组下午灌胃给药，连续给药7天，7日后晚间断食，次日清晨取血测血尿酸值。

按表1对各组小鼠进行给药。

表1造模给药灌胃各组给药药物

	空白组	模型组	葵花小分子肽组	别嘌醇组
					1-8天	水	酵母膏	酵母膏	酵母膏
9-15天	水	酵母膏	酵母膏+小分子肽	酵母膏+别嘌醇

(3)小鼠造模前、造模后和给药后，测定血尿酸值水平

于小鼠造模前、造模后和给药后分别测定各组小鼠的血尿酸水平(μmol/L)，结果见表2。

表2各组造模前、造模后和给药后血尿酸值(μmol/L)

	造模前	造模后	给药后
				空白组	230.99	235.59	298.32
模型组	252.89	364.38	336.38
				葵花小分子肽组	285.58	497.83	149.51
别嘌醇组	239.38	409.68	91.75

通过对高尿酸血症模型小鼠灌胃给药的方法，连续给药7天后，发现别嘌醇组、小分子肽组具有一定的降尿酸能力，其P<0.05，具有显著性差异。

从表2可以看出，造模前各组小鼠血尿酸水平相近，造模后模型组、葵花小分子肽组和别嘌醇组小鼠血尿酸值显著上升，说明模型成功；给药后葵花小分子肽组和别嘌醇组小鼠血尿酸值均下降，甚至比造模前还要低。其中葵花小分子肽组小鼠给药后的血尿酸值较造模后下降了70％，别嘌醇组小鼠给药后的血尿酸值较造模后下降了78％，说明葵花小分子肽降低血尿酸能力与别嘌醇相近。这说明葵花盘粉小分子肽可以显著降低高尿酸血症模型小鼠的血尿酸值，可达到治疗高尿酸血症的目的。

(4)免疫组化免疫组化实验检验药物对肾脏影响

①组织浸入石蜡后，包埋前将组织移入包埋用石蜡杯内。从恒温箱取出置于三角架上，其下点燃酒精灯，以保持石蜡的溶解状态。

②准备好包埋框，将包埋用的镊子在酒精灯上加温(防止镊子粘蜡)后，左手持蜡杯，右手把加温的镊子放在蜡口(直立状)倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。

③迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内，切面朝下放正置入框底并轻轻压平，以保证不再有气泡。

④待石蜡表面凝固前将标签贴于其上，需注意勿使标签与标本混淆，当蜡块冷至蜡面有一层透明蜡膜时，浸入冷水中迅速使其冷却，否则蜡内常形成结晶。

⑤蜡块完全硬固后除去铜框，以保证蜡彻底凝固，立即修切。

⑥取出切片，采用免疫组化试剂盒染色，显微镜观察检验切片组织细胞状态并拍照。

实验结果见图1-4，空白组(图1)中肾小球正常，肾小管上皮细胞饱满、排列整齐，未见肾小管扩张，管腔清晰，没有炎症及纤维化。模型组(图2)中肾小球数目未见差异，肾小管管腔扩张，上皮细胞空化、萎缩、坏死，可见炎细胞浸润，管腔可见蛋白管型和细胞管型。葵花小分子肽组(图3)染色结果与空白组比较无明显差异，说明小分子肽给药组对肾脏受损细胞的修复效果最好。别嘌醇组(图4)可见肾皮质炎细胞浸润、明显肾小管管腔扩张，肾小管上皮细胞空化，说明虽然别嘌醇组降尿酸能力最好，但是其对肾脏细胞有较大损伤。

免疫组化实验表明，葵花小分子肽除了降低模型小鼠的血尿酸值，同时可以对受损的肾脏细胞具有一定的抗炎和修复作用，葵花小分子肽优于阳性药物别嘌呤醇，而阳性药物别嘌呤醇只能降低血尿酸值，对肾脏细胞具有一定的损伤。说明葵花小分子肽不仅能降低尿酸值，而且可以修复肾脏，对高尿酸症标本兼治，能够从根本上治疗高尿酸症。

本发明葵花小分子肽在制备降尿酸溶解痛风石修复肾功能药物中的应用，葵花小分子肽可以起到抗炎，消肿，止痛及降低血尿酸，溶解尿酸钠的作用，同时对肾脏受损细胞有良好的修复效果，对高尿酸症标本兼治，从根本治疗高尿酸症。

上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.葵花小分子肽在制备降尿酸溶解痛风石修复肾功能药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述葵花小分子肽中粗蛋白质＞93％，80％肽段的相对分子质量分布/u＜1000；肽含量为85.6％，水分含量为3.5％，灰分含量为7.4％。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述葵花小分子肽通过以下方法制备得到：

1)将葵花盘粉碎至100-200目，加入6-10倍质量的去离子水，充分搅拌，用氢氧化钠调节pH值为8-9，在45-50℃搅拌120-240分钟，得到葵花盘分离蛋白液；

2)将葵花盘分离蛋白液加热至85-90℃，搅拌1-3h，冷却至45-55℃，加入占葵花盘分离蛋白液总体积0.1％-0.3％的复合蛋白酶，酶解3-5h，反应终止时，5分钟内升温至85-90℃，保持5-10分钟，使复合蛋白酶失去活性，所得酶解液备用；

3)将步骤2)的酶解液在5000转/分钟的转速下离心8-12分钟，收集上清液，得葵花蛋白小分子肽粗液；

4)将步骤3)的葵花蛋白小分子肽粗液经截流分子量为5000-20000的中空纤维膜超滤，除去大分子蛋白，得到葵花盘小分子肽液；

5)将步骤4)的葵花盘小分子肽液浓缩，使其体积浓缩至原来的四分之一到二分之一，喷雾干燥，即得葵花小分子肽。