CN107929795A

CN107929795A - 一种抗菌止血材料的制备及其应用

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Publication number: CN107929795A
Application number: CN201711137277.9A
Authority: CN
Inventors: 闫瑞国; 富勇
Original assignee: BEIJING HOTWIRE MEDICAL TECH DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: BEIJING HOTWIRE MEDICAL TECH DEVELOPMENT Co Ltd
Priority date: 2017-11-16
Filing date: 2017-11-16
Publication date: 2018-04-20

Abstract

本发明涉及一种抗菌止血材料的制备及其应用，属于生物材料和医疗卫生领域。本发明具体公开了一种抗菌止血材料的制备及其应用，材料以胶原蛋白，有机硅季铵盐和壳聚糖为基础，经以下步骤：胶原蛋白的提取，三种溶液的制备，溶液的冻干，交联和灭菌等过程制得。所得抗菌止血材料具有三维网状结构，机械性能高，吸液能力强，吸液速率快，生物相容性好，降解可控等优点，此外由于有机硅季铵盐和壳聚糖的存在，本发明产品还具有良好的抑菌抗菌性，抗菌谱广，是一种优良的抗菌止血，组织填充材料。

Description

一种抗菌止血材料的制备及其应用

技术领域

本发明属于生物材料及医疗卫生领域，具体的涉及一种抗菌止血材料的制备及其应用。

背景技术

伤口出血是人类生活中难以避免的问题，比如手术过程，战争中受伤，交通事故，自然灾害及其他人为或意外事件均可导致出血情况的出现，无法快速有效止血是死亡的主要影响因素，因此有效止血显得尤为关键。止血过程本身是一个复杂的过程，除血液自身血小板聚集自身凝固外，其他因素也可起到关键作用，比如压迫止血，手术电刀及止血材料等。止血材料不仅需要具备通常的止血时间短，止血效果明显，具有促进伤口愈合和治疗的作用，材料本身还应具有良好的生物相容性，与机体无不良反应，与伤口组织黏附性好，特别是不应再产生二次创伤，无端给病人增加痛苦和医疗成本。目前临床上常用的止血材料种类繁多，功能各异，质量参差不齐，比如纱布，海绵类，止血粉及凝胶等。上述止血材料基本能满足临床应用，但是在手术过程中，特别是战争中，或者不能立即就医者，容易发生伤口感染，严重者甚至危及生命。因此亟待开发一种生物相容性好，止血速度快，促进伤口愈合同时兼具抑菌抗菌的多功能复合型医用止血材料。

胶原蛋白是生物高分子材料，是有三条肽链拧成的螺旋形纤维状蛋白质，三条相互独立的胶原蛋白肽链依靠甘氨酸之间形成的氢键维系三股螺旋相互缠绕的结构，胶原这种特殊的三股螺旋结构保证了它的机械强度。胶原蛋白是动物***重要的蛋白质，约占其20%~30%，是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白。胶原蛋白种类较多，常见类型为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型。胶原蛋白因其广泛的来源，良好的生物相容性、可降解性及生物活性，在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛应用和关注。

有机硅季铵盐是一类新型阳离子表面活性剂，它具有耐高温、耐水洗、持久的效果、抑菌范围广、能有效地抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌和真菌。有机硅季铵盐的优良抗菌抑菌性能是经过实践证明的。有研究表明,将其用于纯棉织物整理,发现对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠球菌24 h 后的抑菌率分别达到98.12 %、96.86 %、95.14% ,显示出广谱抗菌效果和较高抗菌率且安全无毒、无致酶反应。其杀菌机理是：以有机硅作为媒介,将具有杀菌性能的铵阳离子基团强有力地吸附于物体的表面，带正电荷的季铵盐离子牢牢吸附具有负电荷的细菌、真菌等微生物,通过改变细菌细胞壁的通透性,使菌体内的酶、辅酶和代谢中间产物溢出,致使微生物停止呼吸功能而致死，从而达到杀菌、抑菌的作用。另外有机硅季铵盐为水溶性，能与多种溶剂和溶质混合，且稳定性良好。

壳聚糖作为自然界唯一的带正电的碱性多糖，其可以吸附红细胞上的负电荷，使红细胞大量聚集，产生凝血，加快止血；另外壳聚糖还具有优良的抗菌性能，其抗菌机理分以下几种：（1）分子量小于5000道尔顿的壳聚糖可以穿透细胞膜，小分子量的壳聚糖进入微生物细胞内，因壳聚糖带正电荷其与细胞内带负电的物质（主要是蛋白质和核酸）结合，使细胞的正常生理功能受到影响，导致微生物死亡；（2）大分子量的壳聚糖吸附在微生物细胞表面，形成一层高分子膜，阻止了营养物质向细胞内运输，从而起到杀菌和抑菌作用；（3）壳聚糖的正电荷与微生物细胞膜表面的负电荷之间的相互作用，改变了微生物细胞膜的通透性，引起微生物细胞死亡；（4）壳聚糖作为一种螯合剂，选择性地对螯合对微生物生长起关键作用的金属离子，从而抑制微生物的生长，产生毒性死亡。

有鉴于此，本发明提供了以胶原蛋白，有机硅季铵盐和壳聚糖为基础材料的复合止血材料的制备方法及其应用。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种抗菌止血材料的制备及其应用，具体技术方案如下。

1 胶原蛋白的制备

（1）选取富含胶原蛋白的组织，去除多余残留物后将其在-20℃的环境下冷冻至少6小时以上；然后冻结后的组织进行切片处理。富含胶原蛋白的组织为牛跟腱，牛蹄，牛皮，猪蹄和猪皮等。

（2）将切割好的组织，放入水中浸泡冲洗5~30min，沥去多余的水；配制磷酸盐缓冲液，完成后称取一定量的酶加入其中，酶的浓度为0.001%~5%，充分混匀。在本发明中所述的磷酸盐缓冲液由NaCl、Na₂HPO₄和NaH₂PO₄组成或NaCl，Na₂HPO₄和KH₂PO₄组成，磷酸盐缓冲液的浓度为0.01-0.1mol/L；pH值为5~7。所述的酶为胃蛋白酶，无花果蛋白酶，半胱胺酸蛋白酶及其他酸性蛋白酶的一种或几种。

（3）将冲洗完成的组织加入上述酶溶液中，放入摇床内，在10~50℃下保持0.5~24h；其中组织与酶溶液的比例为0.01:100~20:100（按质量分数计）。

（4）酶灭活：从摇床内取出反应物，用水冲洗几次，沥去多余水分，加入到预先配制好的盐溶液中，开启摇床，在10~50℃下保持0.5~5h；本发明中所述的盐溶液为硝酸钠，硝酸铵，硝酸钾，次氯酸钠，氢氧化钠，氢氧化钾中的一种或几种；浓度为0.01%~20%；反应物与盐溶液比例为0.1:100~30:100。

（5）病毒灭活：从摇床内取出反应物，用水冲洗几次，沥去多余水分，再将固体加入到配制好的盐溶液中，开启摇床，设定温度15~40℃，培养20~60h。本步骤中所述的盐溶液为亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠，硫酸铵，硫酸钠，氢氧化钠和氢氧化钾中的一种或几种，浓度为0.01%~20%；反应物与盐溶液比例为0.1:100~30:100。

（6）从摇床内取出培养物，调节ph为4~8，收集产物，用水清洗，榨干，即得到胶原蛋白。

2 浆液的制备

（1）称取一定数量的步骤1所制得胶原蛋白，加入到纯化水，搅拌使其均匀分散，用酸溶液调节pH至4~7，快速搅拌使其完全混匀，备用；胶原蛋白与纯化水的比例为0.01:100~10:100，酸溶液为醋酸，盐酸，硫酸或乳酸中的至少一种。

（2）量取一定数量的市售有机硅季铵盐，加入到纯化水，快速搅拌使混合均匀，备用；有机硅季铵盐与纯化水的比例为0.01:100~50:100。

（3）称取一定数量的市售壳聚糖，加入到纯化水，快速搅拌使混合均匀，用酸溶液调pH至4~7，备用；壳聚糖与纯化水的比例为0.01:100~50:100；本发明所述的壳聚糖为羧甲基壳聚糖，壳聚糖，羟丁基壳聚糖及其它改性壳聚糖中的至少一种；所用的酸为醋酸，盐酸，硫酸或乳酸中的至少一种。

（4）将步骤（1）所得胶原蛋白浆液，步骤（2）所得有机硅季铵盐溶液与步骤（3）所得壳聚糖溶液按一定比例混合，快速搅拌混匀，经减压脱泡，静置，得到混合浆液，备用；本发明中胶原蛋白浆液，有机硅季铵盐溶液，壳聚糖溶液的比例为（1~10）：（1~10）:（1~10）(V/V/V)。

3 抗菌止血材料的制备

（1）将上述制得混合液缓慢倒入不锈钢冻干模具中，浆液厚度1mm~50mm，设定好冻干参数进行冷冻干燥。

（2）冻干完成后，取出产品，采用物理和/或化学方法交联，裁剪包装，灭菌，即获得本发明所述的抗菌止血材料。本发明中产品物理交联方法为热交联；化学交联方法为甲醛，戊二醛，京尼平和EDC等；所采用的灭菌方式包括环氧乙烷灭菌，射线灭菌及高温灭菌，其中射线灭菌又分钴-60和电子束，灭菌剂量为5KGy~40KGy。

由以上步骤所得抗菌止血材料具有以下明显的优点：

一、本发明所提供的抗菌止血材料，具有三维孔径结构，机械强度高，低免疫原性和纯度高等优点；

二、本发明所提供的抗菌止血材料，具有优良的抗菌性能，抗菌谱广，抗菌抑菌率高；

三、本发明所提供的抗菌止血材料，生物相容性好，可完全降解，通过调节交联度可实现降解可控；

四、本发明所提供的抗菌止血材料，与人体组织粘附性强，促进组织修复，超强的吸液能力，加速止血，促进伤口愈合，用于伤口敷料时刻明显减少疤痕的生成。

具体实施方式

为使本发明的技术方案更加清楚，下面对本发明实施方式作进一步地详细描述。

实施例一

胶原蛋白的获得

1、选取富含胶原蛋白的牛跟腱，剔除筋膜，在-20℃的环境下冷冻20小时。将冻结后的组织进行切片处理；

2、称取牛跟腱切片5000g，放入水中浸泡冲洗15min，沥去多余的水；配制0.06mol/L的磷酸盐缓冲液40L，调节ph为7，完成后称取60g胃蛋白酶酶加入其中，充分混匀；

3、将冲洗完成的组织加入上述酶溶液中，放入摇床内，在30℃下保持10h；其中牛跟腱切片与酶溶液的比例为8:100；

4、酶灭活：从摇床内取出反应物，用水冲洗几次，沥去多余水分，加入到3%硝酸钠和0.4%氢氧化钠溶液中，溶液体积为40L，开启摇床，在30℃下保持2h；

5、病毒灭活：从摇床内取出反应物，用水冲洗几次，沥去多余水分，加入到2%硫酸铵溶液中，溶液体积为35L，开启摇床，在25℃下保持10h；

6、从摇床内取出培养物，调节ph为5.5，收集产物，用水清洗，榨干，即得到胶原蛋白。

实施例二

胶原蛋白原料获得

1、选取富含胶原蛋白的猪皮，除去杂质，在-20℃的环境下冷冻20小时。然后冻结后的猪皮进行切片处理；

2、称取猪皮切片1000g，放入水中浸泡冲洗25min，沥去多余的水；配制0.08mol/L的磷酸盐缓冲液15L，调节ph为6，完成后称取4g无花果蛋白酶加入其中，充分混匀；

3、将冲洗完成的组织加入上述酶溶液中，放入摇床内，在40℃下保持18h；其中猪皮切片与酶溶液的比例为1:30；

4、酶灭活：从摇床内取出反应物，用水冲洗几次，沥去多余水分，加入到5%硝酸铵溶液中，溶液体积为10L，开启摇床，在20℃下保持4h；

5、病毒灭活：从摇床内取出反应物，用水冲洗几次，沥去多余水分，加入到6%硫酸铵和1%氢氧化钠溶液中，溶液体积为15L，开启摇床，在20℃下保持50h；

6、从摇床内取出培养物，调节ph为5，收集产物，用水清洗，榨干，即得到胶原蛋白。

实施例三

1 称取50g的实施例一所制得胶原蛋白，加入到1L纯化水，搅拌使其均匀分散，用盐酸溶液调节pH至5.5，快速搅拌使其完全混匀，备用；

2 量取一定500mL有机硅季铵盐，加入到2L纯化水，快速搅拌使混合均匀，备用；

3 称取100g壳聚糖，加入到1L纯化水，快速搅拌使混合均匀，用醋酸溶液调pH至6.0，备用；

4 分别量取上述500mL胶原蛋白溶液，800mL有机硅季铵盐溶液与800mL壳聚糖溶液于一洁净的反应釜内，快速搅拌混匀，开启真空泵进行减压脱泡，静置，备用；

5 将上述制得混合液缓慢倒入不锈钢冻干模具中，浆液厚度4mm，设定好冻干参数进行冷冻干燥；

6 冻干结束，取出产品，用甲醛溶液进行交联；将交联后的样品进行裁剪包装，送辐照中心进行钴-60灭菌，灭菌剂量15KGy，得到本发明所述抗菌止血材料。

实施例四

1 称取400g的实施例一所制得胶原蛋白，加入到2L纯化水，搅拌使其均匀分散，用硫酸溶液调节pH至5.9，快速搅拌使其完全混匀，备用；

2 量取一定500mL有机硅季铵盐，加入到1L纯化水，快速搅拌使混合均匀，备用；

3 称取200g壳聚糖，加入到1L纯化水，快速搅拌使混合均匀，用乳酸溶液调pH至6.0，备用；

4 分别量取上述1000mL胶原蛋白溶液，500mL有机硅季铵盐溶液与200mL壳聚糖溶液于一洁净的反应釜内，快速搅拌混匀，开启真空泵进行减压脱泡，静置，备用；

5 将上述制得混合液缓慢倒入不锈钢冻干模具中，浆液厚度5mm，设定好冻干参数进行冷冻干燥；

6 冻干结束，取出产品，用戊二醛进行交联；将交联后的样品进行裁剪包装，送环氧乙烷灭菌站进行灭菌，解析结束后，得到本发明所述抗菌止血材料。

实施例五

1 称取200g的实施例二所制得胶原蛋白，加入到2L纯化水，搅拌使其均匀分散，用盐酸溶液调节pH至5.5，快速搅拌使其完全混匀，备用；

2 量取一定100mL有机硅季铵盐，加入到1L纯化水，快速搅拌使混合均匀，备用；

3 称取30g羟丁基壳聚糖，加入到1L纯化水，快速搅拌使混合均匀，用盐酸溶液调pH至6.0，备用；

4 分别量取上述800mL胶原蛋白溶液，500mL有机硅季铵盐溶液与1000mL壳聚糖溶液于一洁净的反应釜内，快速搅拌混匀，开启真空泵进行减压脱泡，静置，备用；

5 将上述制得混合液缓慢倒入不锈钢冻干模具中，浆液厚度3mm，设定好冻干参数进行冷冻干燥；

6 冻干结束，取出产品，用EDC进行交联；将交联后的样品进行裁剪包装，送辐照中心进行电子束灭菌，灭菌剂量35KGy。，得到本发明所述抗菌止血材料。

实施例六

将实施例三，实施例四，实施例五中所制得抗菌止血材料进行吸水性能检测，每一实施例取三个样品作为平行样品，检测如下：

检测过程：随机抽取每一实施例中样品三片，分别称重并记录，记为m₁。将样品分别浸入盛有20℃注射用水的烧杯中，用不锈钢镊子轻柔直至完全浸湿饱和，且所有空气被除去，注意不使破损，待吸足水分后，用镊子轻轻夹住一角将其从水中取出，轻持镊子在水面上排水1min 后，再次称量记录，记为m₂。根据公式计算吸液量（倍）=(m₂-m₁)/m₁；同时记录完全浸湿饱和所需时间（秒）；

计算结果见表1

表1

单位：吸液量（倍），饱和时间（秒）

通过上表可以看出，本发明所制得抗菌止血材料具有极强的吸液能力，其吸液量都达到自身重量的60倍以上，吸液速度快，平均饱和时间为5秒左右，因此本发明产品是一种优良的止血材料，能满足各种出血情况的需要。

以上所述仅是为了便于本领域的技术人员理解本发明的技术方案，并不用以限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种抗菌止血材料的制备及其应用，其特征在于制备过程包括一下步骤：

（1）选取富含胶原蛋白的组织，去除多余残留物后将其在-20℃的环境下冷冻至少6小时以上；然后冻结后的组织进行切片处理；

（2）将切割好的组织，放入水中浸泡冲洗5~30min，沥去多余的水；同时配制磷酸盐缓冲液，完成后称取一定量的酶加入其中，酶的浓度为0.001%~5%，充分混匀；

（3）将冲洗完成的组织加入上述酶溶液中，放入摇床内，在10~50℃下保持0.5~24h；其中组织与酶溶液的比例为0.01:100~20:100（按质量分数计）；

（4）酶灭活：从摇床内取出反应物，用水冲洗几次，沥去多余水分，加入到预先配制好的盐溶液中，开启摇床，在10~50℃下保持0.5~5h；

（5）病毒灭活：从摇床内取出反应物，用水冲洗几次，沥去多余水分，再将固体加入到配制好的盐溶液中，开启摇床，设定温度15~40℃，培养20~60h；

（6）从摇床内取出培养物，调节ph为4~8，收集产物，用水清洗，榨干，即得到胶原蛋白；

（7）称取一定数量的步骤（6）中得胶原蛋白，加入到纯化水，搅拌使其均匀分散，用酸溶液调节pH至4~7，快速搅拌使其完全混匀，备用；胶原蛋白与纯化水的比例为0.01:100~10:100；

（8）量取一定数量的市售有机硅季铵盐，加入到纯化水，快速搅拌使混合均匀，备用；有机硅季铵盐与纯化水的比例为0.01:100~50:100；

（9）称取一定数量的市售壳聚糖，加入到纯化水，快速搅拌使混合均匀，用酸溶液调pH至4~7，备用；壳聚糖与纯化水的比例为0.01:100~50:100；

（10）将步骤（7）所得胶原蛋白浆液，步骤（8）所得有机硅季铵盐溶液与步骤（9）所得壳聚糖溶液按一定比例混合，快速搅拌混匀，经减压脱泡，静置，得到混合浆液，备用；

（11）将上述制得混合液缓慢倒入不锈钢冻干模具中，浆液厚度1mm~50mm，设定好冻干参数进行冷冻干燥；

（12）冻干完成后，取出产品，采用物理和/或化学方法交联，裁剪包装，灭菌，即获得本发明所述的抗菌止血材料。

2.根据权利要求1所述的制备过程步骤（1）中，其特征在于，所述的富含胶原蛋白的组织为牛跟腱，牛蹄，牛皮，猪蹄和猪皮等。

3.根据权利要求1所述的制备过程步骤（2）中，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液由NaCl、Na₂HPO₄和NaH₂PO₄组成或NaCl，Na₂HPO₄和KH₂PO₄组成，磷酸盐缓冲液的浓度为0.01-0.1mol/L；pH值为5~7；所述的酶为胃蛋白酶，无花果蛋白酶，半胱胺酸蛋白酶及其他酸性蛋白酶的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的制备过程步骤（4）中，其特征在于，所述的盐溶液为硝酸钠，硝酸铵，硝酸钾，次氯酸钠，氢氧化钠，氢氧化钾中的一种或几种；浓度为0.01%~20%；反应物与盐溶液比例为0.1:100~30:100。

5.根据权利要求1所述的制备过程步骤（5）中，其特征在于，所述的盐溶液为亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠，硫酸铵，硫酸钠，氢氧化钠和氢氧化钾中的一种或几种，浓度为0.01%~20%；反应物与盐溶液比例为0.1:100~30:100。

6.根据权利要求1所述的制备过程步骤（9）中，其特征在于，本发明所述的壳聚糖为羧甲基壳聚糖，壳聚糖，羟丁基壳聚糖及其它改性壳聚糖中的至少一种；制备过程步骤（7）和（9）中所用的酸均为醋酸，盐酸，硫酸或乳酸中的至少一种。

7.根据权利要求1所述的制备过程步骤（10）中，其特征在于，本发明中胶原蛋白浆液，有机硅季铵盐溶液，壳聚糖溶液的比例为（1~10）：（1~10）:（1~10）(按体积计，V：V：V)。

8.根据权利要求1所述的制备过程步骤（12）中，其特征在于，本发明中产品物理交联方法为热交联；化学交联方法为甲醛，戊二醛，京尼平和EDC等；所采用的灭菌方式包括环氧乙烷灭菌，射线灭菌及高温灭菌，其中射线灭菌又分钴-60和电子束，灭菌剂量为5KGy~40KGy。

9.根据权利要求1所述的一种抗菌止血材料，其特征在于，所述的抗菌止血材料具有三维网状结构，机械强度高，洗液速度快、能力强，且降解可控，生物相容性好，还具有良好的广谱抗菌抑菌性能。

10.根据权利要求1所述的一种抗菌止血材料，其特征在于，所述的抗菌止血材料，可用于手术切口止血，腔道填充，溃疡性创面修复再生。