CN107469145A - 一种硬膜修补材料的制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种硬膜修补材料的制备及其应用,属于生物材料和医疗卫生领域。本发明具体公开了一种硬膜修补材料的制备及其应用,具体步骤包括胶原蛋白的提取,浆液的制备,硬膜的冻干,交联和灭菌等过程。所得硬膜修补材料具有完整的三股螺旋结构,机械性能高,生物相容性好,降解可控等优点,可作为硬脑膜和脊柱膜的替代物。
Description
技术领域
本发明属于生物材料及医疗卫生领域,具体的涉及一种硬膜修补材料的制备及其应用。
背景技术
硬脑膜是一种较为坚固的***薄膜,天然硬脑膜结构的主要由成纤维细胞和胶原纤维组成,位于脑和脊髓膜结构的最外层,是保护脑组织的一道重要屏障,对于维护神经***的结构及功能活动意义重大。硬脊膜由致密***构成,厚而坚韧,形成一长筒状的硬脊膜囊。上方附于枕骨大孔边缘,与硬脑膜相续,向下在平第2骶椎高度形成一盲端,并借终丝附于 尾骨。硬脊膜囊内有脑脊液,脊髓和31对脊神经根,每对脊神经根穿硬脊膜囊时被包被形成神经外膜,并与椎间孔周围的***紧密相连,起固定作用。
现代科学的不断进步和医疗水平的快速发展,一些越来越多的高难度,高风险手术和治疗手段正被普及,比如脑部手术,脊柱外科手术等。脑脊缺损是脊柱外科与神经外科手术中经常遇到的临床问题,交通事故、工矿意外及战争等都会造成开放性颅骨损伤和脊柱受损,还有一些先天性脑膜缺损、肿瘤转移以及其他原因都会造成硬脑膜缺损,当出现上述缺损,如不进行手术修补,会导致脑脊液的渗漏,轻者引起神经损伤,伤口延迟愈合,并出现皮下积液、颅内感染等并发症;重者头皮或肌层的渗血可弥散到蛛网膜下隙刺激脑组织,引起发热、 头痛、无菌性炎症或脑膜刺激征;脑组织与头皮直接粘连愈合,增加了癫痫发生机会,甚至威胁患者生命。由此可见硬脊膜的缺损修复显得无比重要和关键,手术修补硬脊膜,可防止上述症状,但硬脊膜的修复材料种类繁多,质量和效果同样层次不齐。
目前临床上常用的修补材料一般分以下几类:自体组织修补材料、同种异体材料、异种生物材料和人工合成材料(如聚乳酸类材料)。自体组织修补材料虽然生物相容性好,免疫反应低,但是来源有限,价格昂贵。同种异体材料和异种生物材料获取方便,但是存在免疫排斥反应风险。人工合成材料,亲水性不够理想,降解产品多成酸性,生物相容性相对较差,存留时间较长后易形成包裹反应、可引起局部液体积聚或无菌性炎症等并发症。因此亟待开发一种生物相容性好,来源广泛,成本低的硬膜修补材料。理想的硬膜修补材料应该能够保护脑组织生物相容性好,无排斥反应; 能够在新生组织生成后被完全吸收;容易消毒保存,术前准备简单方便;材料来源方便,价格相对适中。
胶原蛋白是生物高分子材料,又称胶原,是有三条肽链拧成的螺旋形纤维状蛋白质,三条相互独立的胶原蛋白肽链依靠甘氨酸之间形成的氢键维系三股螺旋相互缠绕的结构,胶原这种特殊的三股螺旋结构保证了它的机械强度。胶原蛋白是动物***重要的蛋白质,约占其20%~30%,是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白。胶原蛋白种类较多,常见类型为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型。胶原蛋白因其良好的生物相容性、可降解性及生物活性,在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛应用和关注,用胶原蛋白作为原料经相关过程和工艺处理,可得到用于临床手术中组织修复的优良材料,有鉴于此,本发明提供了一种硬膜修补材料的制备方法及其应用。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供了一种硬脑膜修补材料的制备及应用,具体技术方案如下。
1、选取富含胶原蛋白的组织,去除多余残留物后将其在-20℃的环境下冷冻至少6小时以上。然后冻结后的组织进行切片处理。富含胶原蛋白的组织为牛跟腱,牛蹄,牛皮,鱼皮,猪蹄和猪皮等。
2、将切割好的组织,放入水中浸泡冲洗5~30min,沥去多余的水;配制磷酸盐缓冲液,完成后称取一定量的酶加入其中,酶的浓度为0.001%~5%,充分混匀。在本发明中所述的磷酸盐缓冲液由NaCl、Na2HPO4和NaH2PO4组成或NaCl,Na2HPO4和KH2PO4组成,磷酸盐缓冲液的浓度为0.01-0.1mol/L;pH值为5~7。所述的酶为胃蛋白酶,无花果蛋白酶,半胱胺酸蛋白酶及其他酸性蛋白酶的一种或几种。
3、将冲洗完成的组织加入上述酶溶液中,放入摇床内,在10~50℃下保持0.5~24h;其中组织与酶溶液的比例为0.01:100~20:100(按质量分数计)。
4、酶灭活:从摇床内取出反应物,用水冲洗几次,沥去多余水分,加入到预先配制好的盐溶液中,开启摇床,在10~50℃下保持0.5~5h;本发明中所述的盐溶液为硝酸钠,硝酸铵,硝酸钾,次氯酸钠,氢氧化钠,氢氧化钾中的一种或几种;浓度为0.01%~20%;反应物与盐溶液比例为0.1:100~30:100。
5、病毒灭活:从摇床内取出反应物,用水冲洗几次,沥去多余水分,再将固体加入到配制好的盐溶液中,开启摇床,设定温度15~40℃,培养20~60h。本步骤中所述的盐溶液为亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠,硫酸铵,硫酸钠,氢氧化钠和氢氧化钾中的一种或几种,浓度为0.01%~20%;反应物与盐溶液比例为0.1:100~30:100。
6、从摇床内取出培养物,调节ph为4~8,收集产物,用水清洗,榨干,即得到胶原蛋白。
7、称取一定数量的胶原蛋白,加入到纯化水,搅拌使其均匀分散,用碱溶液调节pH至8~12,快速搅拌使其完全混匀;胶原蛋白与纯化水的比例为0.01:100~10:100。
8、向上述溶液中加入酸溶液,使胶原均匀分散,得到浆液,浆液pH为4~8,将浆液进行真空脱泡,将浆液缓慢倒入不锈钢冻干模具中,浆液厚度1mm~50mm,设定好冻干参数进行冷冻干燥。
9、冻干完成后,取出产品,采用物理和/或化学方法交联,裁剪包装,灭菌,即获得本发明所述的硬膜修补材料。本发明中产品物理交联方法为热交联;化学交联方法为甲醛,戊二醛,京尼平和EDC等;所采用的灭菌方式包括环氧乙烷灭菌,射线灭菌及高温灭菌,其中射线灭菌又分钴-60和电子束,灭菌计量为5KGy~40KGy。
由以上步骤所得硬膜修补材料具有明显的优点:
一、本发明所提供的硬膜修补材料完整的保留胶原蛋白的三股螺旋结构,具有三维孔径结构,机械强度高,低免疫原性和纯度高等优点;
二、所得硬膜修补材料生物相容性好,可完全降解,通过调节交联度可实现降解可控;
三、所得硬膜修补材料与人体组织粘附性强,促进组织修复,超强的吸液能力,可促进止血,加快伤口愈合,是一种优良的硬膜组织修补材料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,明显地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1实施例1所制备的硬膜修补材料的拉伸性能图;
图2实施例1所制备的硬膜修补材料的扫描电镜图;
图3实施例3所制备的硬膜修补材料的电泳图;
图4实施例5所制备的硬膜修补材料的圆二色谱分析图。
具体实施方式
为使本发明的技术方案更加清楚,下面对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例一
1、选取富含胶原蛋白的牛跟腱,剔除筋膜,在-20℃的环境下冷冻6小时。然后冻结后的组织进行切片处理。
2、称取牛跟腱切片100g,放入水中浸泡冲洗10min,沥去多余的水;配制0.05mol/L的磷酸盐缓冲液2L,调节ph为7,完成后称取5g胃蛋白酶酶加入其中,充分混匀。
3、将冲洗完成的组织加入上述酶溶液中,放入摇床内,在20℃下保持8h;其中牛跟腱切片与酶溶液的比例为5:100。
4、酶灭活:从摇床内取出反应物,用水冲洗几次,沥去多余水分,加入到2%硝酸铵和0.5%氢氧化钠溶液中,溶液体积为5L,开启摇床,在30℃下保持1h。
5、病毒灭活:从摇床内取出反应物,用水冲洗几次,沥去多余水分,加入到3%硫酸铵溶液中,溶液体积为3L,开启摇床,在25℃下保持30h。
6、从摇床内取出培养物,调节ph为5,收集产物,用水清洗,榨干,即得到胶原蛋白。
7、称取50g胶原蛋白,加入到5L纯化水中,搅拌使其均匀分散,用碱溶液调节pH至9,快速搅拌使其完全混匀。
8、向上述溶液中加入酸溶液,使胶原均匀分散,得到浆液,浆液pH为6,将浆液进行真空脱泡,将浆液缓慢倒入不锈钢冻干模具中,浆液厚度5mm,设定好冻干参数进行冷冻干燥。
9、冻干完成后,取出产品,用甲醛气体进行交联后,裁剪包装,25KGy计量电子束进行灭菌,即获得本发明所述的硬膜修补材料。
相关检测:
将所得硬膜修补材料分别进行拉伸测试和电镜扫描,结果分别见图1,图2,可以看出本发明所得硬膜修补材料的具有良好的力学性能和孔隙结构。
实施例二
1、选取富含胶原蛋白的猪皮,除去杂质,在-20℃的环境下冷冻24小时。然后冻结后的组织进行切片处理。
2、称取猪皮切片500g,放入水中浸泡冲洗20min,沥去多余的水;配制0.05mol/L的磷酸盐缓冲液20L,调节ph为6,完成后称取1g无花果蛋白酶加入其中,充分混匀。
3、将冲洗完成的组织加入上述酶溶液中,放入摇床内,在30℃下保持20h;其中牛跟腱切片与酶溶液的比例为1:40。
4、酶灭活:从摇床内取出反应物,用水冲洗几次,沥去多余水分,加入到5%硝酸铵溶液中,溶液体积为10L,开启摇床,在20℃下保持2h。
5、病毒灭活:从摇床内取出反应物,用水冲洗几次,沥去多余水分,加入到6%硫酸钠和0.5%氢氧化钠溶液中,溶液体积为15L,开启摇床,在37℃下保持50h。
6、从摇床内取出培养物,调节ph为6,收集产物,用水清洗,榨干,即得到胶原蛋白。
7、称取200g胶原蛋白,加入到20L纯化水中,搅拌使其均匀分散,用碱溶液调节pH至10,快速搅拌使其完全混匀。
8、向上述溶液中加入酸溶液,使胶原均匀分散,得到浆液,浆液pH为7,将浆液进行真空脱泡,将浆液缓慢倒入不锈钢冻干模具中,浆液厚度10mm,设定好冻干参数进行冷冻干燥。
9、冻干完成后,取出产品,用戊二醛气体进行交联后,裁剪包装,环氧乙烷灭菌,即获得本发明所述的硬膜修补材料。
实施例三
1、选取富含胶原蛋白的牛皮,除去杂质,在-20℃的环境下冷冻16小时。然后冻结后的组织进行切片处理。
2、称取牛皮切片1000g,放入水中浸泡冲洗30min,沥去多余的水;配制0.05mol/L的磷酸盐缓冲液50L,调节ph为7,完成后称取35g半胱氨酸蛋白酶加入其中,充分混匀。
3、将冲洗完成的组织加入上述酶溶液中,放入摇床内,在40℃下保持8h;其中牛跟腱切片与酶溶液的比例为1:50。
4、酶灭活:从摇床内取出反应物,用水冲洗几次,沥去多余水分,加入到3%硝酸铵和0.2%次氯酸钠溶液中,溶液体积为20L,开启摇床,在30℃下保持5h。
5、病毒灭活:从摇床内取出反应物,用水冲洗几次,沥去多余水分,加入到3%硫酸钠和1%氢氧化钾溶液中,溶液体积为20L,开启摇床,在25℃下保持60h。
6、从摇床内取出培养物,调节ph为7,收集产物,用水清洗,榨干,即得到胶原蛋白。
7、称取500g胶原蛋白,加入到20L纯化水中,搅拌使其均匀分散,用碱溶液调节pH至12,快速搅拌使其完全混匀。
8、向上述溶液中加入酸溶液,使胶原均匀分散,得到浆液,浆液pH为6,将浆液进行真空脱泡,将浆液缓慢倒入不锈钢冻干模具中,浆液厚度20mm,设定好冻干参数进行冷冻干燥。
9、冻干完成后,取出产品,用热交联方法进行交联后,裁剪包装,用钴-60灭菌,灭菌剂量25KGy,即获得本发明所述的硬膜修补材料。
样品检测
将本发明所得硬膜修补材料进行SDS-PAGE电泳实验,结果见图3,胶原蛋白的分子量约为30万道尔顿。
实施例四
1、选取富含胶原蛋白的鱼皮,除去杂质,在-20℃的环境下冷冻30小时。然后冻结后的组织进行切片处理。
2、称取猪皮切片300g,放入水中浸泡冲洗15min,沥去多余的水;配制0.05mol/L的磷酸盐缓冲液10L,调节ph为7,完成后称取1g无花果蛋白酶加入其中,充分混匀。
3、将冲洗完成的组织加入上述酶溶液中,放入摇床内,在35℃下保持6h;其中牛跟腱切片与酶溶液的比例为3:100。
4、酶灭活:从摇床内取出反应物,用水冲洗几次,沥去多余水分,加入到0.3%硝酸钠和0.5%次氯酸钠溶液中,溶液体积为5L,开启摇床,在15℃下保持4h。
5、病毒灭活:从摇床内取出反应物,用水冲洗几次,沥去多余水分,加入到0.3%硫代硫酸钠和0.5%亚硫酸氢钠溶液中,溶液体积为10L,开启摇床,在30℃下保持50h。
6、从摇床内取出培养物,调节ph为6,收集产物,用水清洗,榨干,即得到胶原蛋白。
7、称取150g胶原蛋白,加入到10L纯化水中,搅拌使其均匀分散,用碱溶液调节pH至9,快速搅拌使其完全混匀。
8、向上述溶液中加入酸溶液,使胶原均匀分散,得到浆液,浆液pH为5,将浆液进行真空脱泡,将浆液缓慢倒入不锈钢冻干模具中,浆液厚度4mm,设定好冻干参数进行冷冻干燥。
9、冻干完成后,取出产品,用热交联方法进行交联后,裁剪包装,用钴-60灭菌,灭菌剂量30KGy,即获得本发明所述的硬膜修补材料。
实施例五
1、选取富含胶原蛋白的牛跟腱,除去杂质,在-20℃的环境下冷冻15小时。然后冻结后的组织进行切片处理。
2、称取猪皮切片600g,放入水中浸泡冲洗30min,沥去多余的水;配制0.02mol/L的磷酸盐缓冲液10L,调节ph为7,完成后称取2g无花果蛋白酶加入其中,充分混匀。
3、将冲洗完成的组织加入上述酶溶液中,放入摇床内,在20℃下保持4h;其中牛跟腱切片与酶溶液的比例为6:100。
4、酶灭活:从摇床内取出反应物,用水冲洗几次,沥去多余水分,加入到4%硝酸钠和0.5%氢氧化钾溶液中,溶液体积为10L,开启摇床,在30℃下保持2h。
5、病毒灭活:从摇床内取出反应物,用水冲洗几次,沥去多余水分,加入到0.1%硫酸钠和0.01%氢氧化钠溶液中,溶液体积为10L,开启摇床,在20℃下保持48h。
6、从摇床内取出培养物,调节ph为7,收集产物,用水清洗,榨干,即得到胶原蛋白。
7、称取20g胶原蛋白,加入到10L纯化水中,搅拌使其均匀分散,用碱溶液调节pH至10,快速搅拌使其完全混匀。
8、向上述溶液中加入酸溶液,使胶原均匀分散,得到浆液,浆液pH为6,将浆液进行真空脱泡,将浆液缓慢倒入不锈钢冻干模具中,浆液厚度2mm,设定好冻干参数进行冷冻干燥。
9、冻干完成后,取出产品,用热交联方法进行交联后,裁剪包装,用环氧乙烷灭菌,即获得本发明所述的硬膜修补材料。
圆二色谱检测
将所得硬膜修补材料进行圆二色谱检测,见图4,由圆二色谱谱图可知,在198nm左右有一个负吸收峰,在226nm左右有一个弱的正吸收峰,属于典型的三股螺旋构像特征。说明经环氧乙烷灭菌后的硬膜修补材料仍保持其完整的三螺旋结构,具有生物活性。
实施例六
1、选取富含胶原蛋白的猪蹄,除去杂质,将富含胶原蛋白部位切割,在-20℃的环境下冷冻20小时。然后冻结后的组织进行切片处理。
2、称取猪蹄切片300g,放入水中浸泡冲洗30min,沥去多余的水;配制0.03mol/L的磷酸盐缓冲液10L,调节ph为7,完成后称取1g胃蛋白酶加入其中,充分混匀。
3、将冲洗完成的组织加入上述酶溶液中,放入摇床内,在20℃下保持2h;其中牛跟腱切片与酶溶液的比例为3:100。
4、酶灭活:从摇床内取出反应物,用水冲洗几次,沥去多余水分,加入到4%硝酸铵和0.4%次氯酸钠溶液中,溶液体积为8L,开启摇床,在25℃下保持1h。
5、病毒灭活:从摇床内取出反应物,用水冲洗几次,沥去多余水分,加入到1%硫酸钠和0.01%氢氧化钠溶液中,溶液体积为8L,开启摇床,在20℃下保持36h。
6、从摇床内取出培养物,调节ph为8,收集产物,用水清洗,榨干,即得到胶原蛋白。
7、称取100g胶原蛋白,加入到10L纯化水中,搅拌使其均匀分散,用碱溶液调节pH至11,快速搅拌使其完全混匀。
8、向上述溶液中加入酸溶液,使胶原均匀分散,得到浆液,浆液pH为6,将浆液进行真空脱泡,将浆液缓慢倒入不锈钢冻干模具中,浆液厚度8mm,设定好冻干参数进行冷冻干燥。
9、冻干完成后,取出产品,用甲醛进行交联后,裁剪包装,用电子束灭菌,灭菌剂量20KGy,即获得本发明所述的硬膜修补材料。
以上所述仅是为了便于本领域的技术人员理解本发明的技术方案,并不用以限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种硬膜修补材料的制备及其应用,其特征在于制备过程包括一下步骤:
(1)选取富含胶原蛋白的组织,去除多余残留物后将其在-20℃的环境下冷冻至少6小时以上,然后冻结后的组织进行切片处理;
(2)将切割好的组织,放入水中浸泡冲洗5~30min,沥去多余的水;配制磷酸盐缓冲液,完成后称取一定量的酶加入其中,酶的浓度为0.001%~5%,充分混匀;
(3)将冲洗完成的组织加入上述酶溶液中,放入摇床内,在10~50℃下保持0.5~24h;其中组织与酶溶液的比例为0.01:100~20:100(按质量分数计);
(4)酶灭活:从摇床内取出反应物,用水冲洗几次,沥去多余水分,加入到预先配制好的盐溶液中,开启摇床,在10~50℃下保持0.5~5h;
(5)病毒灭活:从摇床内取出反应物,用水冲洗几次,沥去多余水分,再将固体加入到配制好的盐溶液中,开启摇床,设定温度15~40℃,培养20~60h;(6)从摇床内取出培养物,调节ph为4~8,收集产物,用水清洗,榨干,即得到胶原蛋白;
(7)称取一定数量的胶原蛋白,加入到纯化水,搅拌使其均匀分散,用碱溶液调节pH至8~12,快速搅拌使其完全混匀;胶原蛋白与纯化水的比例为0.01:100~10:100;
(8)向上述溶液中加入酸溶液,使胶原均匀分散,得到浆液,浆液pH为4~8,将浆液进行真空脱泡,将浆液缓慢倒入不锈钢冻干模具中,浆液厚度1mm~50mm,设定好冻干参数进行冷冻干燥;
(9)冻干完成后,取出产品,采用物理和/或化学方法交联,裁剪包装,灭菌,即获得本发明所述的硬膜修补材料。
2.根据权利要1所述的制备过程步骤(1)中,其特征在于,所述的富含胶原蛋白的组织为牛跟腱,牛蹄,牛皮,鱼皮,猪蹄和猪皮等。
3.根据权利要1所述的制备过程步骤(2)中,其特征在于,所述的磷酸盐缓冲液由NaCl、Na2HPO4和NaH2PO4组成或NaCl,Na2HPO4和KH2PO4组成,磷酸盐缓冲液的浓度为0.01-0.1mol/L;pH值为5~7;所述的酶为胃蛋白酶,无花果蛋白酶,半胱胺酸蛋白酶及其他酸性蛋白酶的一种或几种。
4.根据权利要1所述的制备过程步骤(4)中,其特征在于,所述的盐溶液为硝酸钠,硝酸铵,硝酸钾,次氯酸钠,氢氧化钠,氢氧化钾中的一种或几种;浓度为0.01%~20%;反应物与盐溶液比例为0.1:100~30:100。
5.根据权利要1所述的制备过程步骤(5)中,其特征在于,所述的盐溶液为亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠,硫酸铵,硫酸钠,氢氧化钠和氢氧化钾中的一种或几种,浓度为0.01%~20%;反应物与盐溶液比例为0.1:100~30:100。
6.根据权利要1所述的制备过程步骤(9)中,其特征在于,本发明中产品物理交联方法为热交联;化学交联方法为甲醛,戊二醛,京尼平和EDC等;所采用的灭菌方式包括环氧乙烷灭菌,射线灭菌及高温灭菌,其中射线灭菌又分钴-60和电子束,灭菌计量为5KGy~40KGy。
7.根据权利要1所述的硬膜修补材料,其特征在于,所述的硬膜修补材料保留了胶原蛋白特有的完整三股螺旋结构,具有生物活性;另外产品具有三维孔径结构,机械强度高,降解可控,生物相容性好。
8.根据权利要1所述的硬膜修补材料,其特征在于,所述的硬膜修补材料,其可作为硬脑膜和脊柱膜等的替代品。
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