CN107922885A - 含游离多元不饱和脂肪酸组合物及其制造方法 - Google Patents

含游离多元不饱和脂肪酸组合物及其制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种含游离多元不饱和脂肪酸组合物，其包含含量为组合物中的脂肪酸的80.0％以上的至少一种碳原子数为20以上的游离多元不饱和脂肪酸，且金属的总含量为0.1ppm以下；和一种含游离多元不饱和脂肪酸组合物的制造方法，其包括以下步骤：准备包含至少一种碳原子数为20以上的多元不饱和脂肪酸的原料组合物；对于将所准备的原料组合物、低级醇、金属的总含量为0.01ppm以下的水、及碱催化剂组合而制备的反应液，进行水解处理；将水解处理后的反应组合物与金属的接触按照每1g的组合物和金属的接触表面积[cm2]与接触时间[天]的积T[cm2×天]成为100以下的方式限制。

Description

含游离多元不饱和脂肪酸组合物及其制造方法
技术领域
本发明涉及含游离多元不饱和脂肪酸组合物及其制造方法。
背景技术
已知二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸(DGLA)、二十碳四烯酸、花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸及二十二碳六烯酸(DHA)等碳原子数为20以上的长链的多元不饱和脂肪酸在生物体中发挥各种功能性。因此，对于多元不饱和脂肪酸，研究了作为医药品、健康食品、化妆品等制品中的功能性成分的利用。伴随于此，要求以高浓度且大量地生产多元不饱和脂肪酸。
多元不饱和脂肪酸由于在天然中大多情况下，作为三酰基甘油(三甘油酯)的构成脂肪酸存在于油中，所以为了得到游离型的多元不饱和脂肪酸，通常进行将三酰基甘油中的构成脂肪酸或其脂肪酸烷基酯水解。
例如，在国际公开第2013/172346号中，公开了通过对将精馏、柱色谱法组合而得到的高度不饱和脂肪酸的酯进行水解，得到(游离)高度不饱和脂肪酸。
在国际公开第2015/083843号中，公开了关于DGLA的游离脂肪酸，通过制造微生物油的低级烷基酯后，将进行精制而提高了纯度的DGLA低级烷基酯用碱催化剂进行水解，得到DGLA的游离脂肪酸。
发明内容
发明所要解决的课题
为了充分地发挥游离多元不饱和脂肪酸的功能，要求以高浓度包含游离多元不饱和脂肪酸的组合物，通过浓缩处理等来提高游离多元不饱和脂肪酸的浓度。另一方面，即使在以相同的多元不饱和脂肪酸作为构成成分的情况下，游离脂肪酸有时也具有与以三酰基甘油等甘油酯作为主要成分的油脂不同的物理或化学性质。在游离脂肪酸中，有时根据链长、双键的数目等其结构而物理或化学性状大大改变。
其结果是，有时高浓度的游离多元不饱和脂肪酸与组合物中的其他成分反应而显示出预料之外的行为。因此，有时将这样的含游离多元不饱和脂肪酸组合物作为含有其他多种成分的组合物、例如化妆品组合物或功能性食品组合物的一添加成分使用时的处理变得复杂。
因此，例如，在作为添加成分使用的情况下，有对于处理良好的含游离多元不饱和脂肪酸组合物、及其制造方法的要求。
用于解决课题的方案
本发明所述的方式包含以下。
[1]一种含游离多元不饱和脂肪酸组合物，其包含含量为组合物中的脂肪酸的80.0％以上的至少一种碳原子数为20以上的游离多元不饱和脂肪酸，且所述含游离多元不饱和脂肪酸组合物中金属的含量为0.1ppm以下。
[2]根据[1]所述的含游离多元不饱和脂肪酸组合物，其中，过氧化物值为5.0meq/kg以下。
[3]根据[1]或[2]所述的含游离多元不饱和脂肪酸组合物，其中，共轭不饱和脂肪酸的含量为组合物中的脂肪酸的1.2％以下。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的含游离多元不饱和脂肪酸组合物，其中，茴香胺值为5.0以下。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的含游离多元不饱和脂肪酸组合物，其中，共轭不饱和脂肪酸的含量为组合物中的脂肪酸的0.001％～1.2％。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的含游离多元不饱和脂肪酸组合物，其中，多元不饱和脂肪酸为选自由二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸、米德酸、二十碳四烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸及二十二碳六烯酸组成的组中的至少一个。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的含游离多元不饱和脂肪酸组合物，其中，在使用含游离多元不饱和脂肪酸组合物而实施以下的膜评价试验的情况下，在将使用基准液而形成的膜损坏为止的时间(秒)设为1时，使用由含游离多元不饱和脂肪酸组合物制备的试验液而形成的膜损坏为止的时间成为1.4以上：
<膜评价试验>
在温度25℃、1个大气压、相对湿度55％的条件下，将具有多个内框的试验用圆形框浸在脂肪酸试验液(基准液液或试验液)中后，拿起到液面上而在通过多个内框形成的分区内形成膜，测定所形成的至少一个膜破裂为止所需要的时间(秒)。
<试验液的制备>
基准液
将硫酸铁(II)·7水合物的水溶液按照铁浓度成为100ppm的方式添加到游离多元不饱和脂肪酸组合物中，接着在添加乙醇而均匀化后将溶剂通过抽真空而除去，制备组合物中含有100ppm的铁的游离多元不饱和脂肪酸组合物。将含有100ppm的铁的含游离多元不饱和脂肪酸组合物0.5g、48重量％氢氧化钠0.15g、及精制水9.35g混合，制备水溶液中包含约5重量％的游离多元不饱和脂肪酸钠的水溶液，以所得到的水溶液作为基准液。
试验液
将含游离多元不饱和脂肪酸组合物0.5g、48重量％氢氧化钠0.15g、及精制水9.35g混合，制备水溶液中包含约5重量％的游离多元不饱和脂肪酸钠的水溶液，以所得到的水溶液作为试验液。
<试验用圆形框的准备>
以塑料制的用具作为试验用圆形框，其中，所述用具在直径为64mm、内径为52mm、厚度为3mm的外框内通过厚度为2mm的内框而具有5个分区。
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的含游离多元不饱和脂肪酸组合物，其中，金属为铁。
[9]一种含游离多元不饱和脂肪酸组合物的制造方法，其包括以下步骤：
准备包含至少一种碳原子数为20以上的多元不饱和脂肪酸的原料组合物；
对于将所准备的原料组合物、低级醇、金属的总含量为0.01ppm以下的水、及碱催化剂组合而制备的反应液，进行水解处理；
将水解处理后的反应组合物与金属的接触按照每1g的组合物和金属的接触表面积[cm2]与接触时间[天]的积T[cm2×天]成为100以下的方式限制。
[10]根据[9]所述的制造方法，其中，每1g的组合物和金属的接触表面积[cm2]与接触时间[天]的积T[cm2×天]为80以下。
[11]根据[9]或[10]所述的制造方法，其中，原料组合物中的碳原子数为20以上的游离多元不饱和脂肪酸的含量为组合物中的脂肪酸的80.0％以上。
[12]根据[9]～[11]中任一项所述的制造方法，其中，在10℃以下的温度条件下进行水解处理。
[13]根据[9]～[12]中任一项所述的制造方法，其中，水解处理中使用的水的铁含量为0.01ppm以下。
[14]根据[9]～[13]中任一项所述的制造方法，其中，原料组合物中的多元不饱和脂肪酸为多元不饱和脂肪酸烷基酯。
[15]根据[9]～[14]中任一项所述的制造方法，其中，原料组合物来源于微生物原料。
[16]一种含游离多元不饱和脂肪酸组合物的保存方法，其中，将包含含量为组合物中的脂肪酸的80.0％以上的至少一种碳原子数为20以上的游离多元不饱和脂肪酸的含游离多元不饱和脂肪酸组合物，在按照每1g的组合物和金属的接触表面积[cm2]与接触时间[天]的积T[cm2×天]成为100以下的方式限制与金属的接触的条件下保持。
[17]根据[1]～[8]中任一项所述的含游离多元不饱和脂肪酸组合物，其中，脂肪酸烷基酯的含量为组合物中的脂肪酸的0.2％以下。
[18]根据[1]～[8]及[17]中任一项所述的含游离多元不饱和脂肪酸组合物，其中，组合物中的残留有机溶剂的总含量为5000ppm以下。
[19]根据[1]～[8]、[17]及[18]中任一项所述的含游离多元不饱和脂肪酸组合物，其中，组合物中的碳原子数为18的二元以上的多元不饱和脂肪酸的含量为组合物的脂肪酸的2.0％以下。
[20]一种食品、增补剂、医药品、化妆品、或饲料，其含有[1]～[8]、[17]～[19]中任一项所述的含有不饱和脂肪酸组合物。
[21][1]～[8]、[17]～[19]中任一项所述的含有不饱和脂肪酸组合物在食品、增补剂、医药品、化妆品、或饲料的制造方法中的用途。
发明效果
根据本发明的一方式，可提供作为添加成分的处理良好的含游离多元不饱和脂肪酸组合物、及其制造方法。
附图说明
图1是表示膜形成试验中能够使用的试验用圆形框的一个例子的平面图。
具体实施方式
本发明的一方式所述的含游离多元不饱和脂肪酸组合物为如下所述的含游离多元不饱和脂肪酸组合物，其包含含量为组合物中的脂肪酸的80.0％以上的至少一种碳原子数为20以上的游离多元不饱和脂肪酸，且金属的总含量为0.1ppm以下。
本发明的一方式所述的含游离多元不饱和脂肪酸组合物的制造方法为如下所述的含游离多元不饱和脂肪酸组合物的制造方法，其包括以下步骤：准备包含至少一种碳原子数为20以上的多元不饱和脂肪酸的原料组合物；对于将所准备的原料组合物、低级醇、金属的总含量为0.01ppm以下的水、及碱催化剂组合而制备的反应液，进行水解处理；将水解处理后的反应组合物与金属的接触按照每1g的组合物和金属的接触表面积[cm2]与接触时间[天]的积T[cm2×天]成为100以下的方式限制。
在含有碳原子数为20以上的游离长链多元不饱和脂肪酸的组合物中，与烷基酯形态或甘油酯形态的长链多元不饱和脂肪酸相比极性高，有时显示出与烷基酯形态或甘油酯形态的长链多元不饱和脂肪酸不同的行为。特别是在以组合物中的脂肪酸的80.0％以上的含量包含碳原子数为20以上的游离长链多元不饱和脂肪酸的组合物中，有时产生在以相同程度的含量包含碳原子数为18以下的饱和脂肪酸或游离不饱和脂肪酸的组合物中无法确认到的物性的变动。本发明人们发现在这样的物性的变动与金属的总含量之间有一定的关联性。
若对其进一步进行说明，则如以下那样推定。发现含有高浓度的游离长链多元不饱和脂肪酸的组合物与碳原子数为18以下的脂肪酸相比能够溶出更多量的金属。此外，发现在含高浓度的游离多元不饱和脂肪酸组合物中，若金属存在规定的含量以上，则组合物的物理性质、或化学性质产生变动。
基于这些见解，在一实施方式中，金属的总含量为规定以下的含高浓度游离长链多元不饱和脂肪酸组合物可抑制起因于组合物中的金属的物性的变动的影响，可提供稳定性优异的组合物。
在一实施方式所述的含游离多元不饱和脂肪酸组合物中，由于金属的总含量为0.1ppm以下，所以以高浓度含有游离长链多元不饱和脂肪酸的组合物能够显示出稳定的物性。其结果是，在以一实施方式所述的含游离多元不饱和脂肪酸组合物作为一成分而与多种成分组合而构成制品的情况下，也能够抑制制品整体的物性或稳定性的变动。
在一实施方式所述的含游离多元不饱和脂肪酸组合物的制造方法中，由于将水解处理后的反应物与金属的接触按照每1g的组合物与金属的接触表面积[cm2]与接触时间[天]的积T[cm2×天]成为100以内的方式限制，所以能够高效地得到金属的总含量少、且物性稳定的以高浓度包含碳原子数为20以上的游离多元不饱和脂肪酸的组合物。另外，在本说明书中，有时将每1g的组合物与金属的接触表面积[cm2]与接触时间[天]的积T[cm2×天]简称为“积T”。
在一实施方式所述的含游离多元不饱和脂肪酸组合物的保存方法中，由于将以高浓度含有游离长链多元不饱和脂肪酸的组合物在按照每1g的组合物与金属的接触表面积[cm2]与接触时间[天]的积T[cm2×天]成为100以下的方式限制与金属的接触的条件下保持，所以能够将保存中的高浓度的含游离多元不饱和脂肪酸组合物以物性稳定的组合物的状态维持。
所谓“油”或“油脂”，在本说明书中，也包含仅含有三甘油酯的油、和以三甘油酯作为主要成分且包含二甘油酯、单甘油酯、磷脂质、胆甾醇、游离脂肪酸等其他脂质的粗油。“油”或“油脂”是指包含这些脂质的组合物。
对于用语“脂肪酸”，不仅包含游离的饱和或者不饱和脂肪酸它们自身，而且还包含游离的饱和或者不饱和脂肪酸、饱和或者不饱和脂肪酸烷基酯、三甘油酯、二甘油酯、单甘油酯、磷脂质、甾醇酯等中包含的作为构成单元的脂肪酸，也可换言之为构成脂肪酸。在本说明书中，只要没有特别说明，或只要没有特别表示，在言及关于存在或者使用的脂肪酸时，也包含任何形态的含脂肪酸化合物的存在或使用。作为包含脂肪酸的化合物的形态，可列举出游离脂肪酸形态、脂肪酸烷基酯形态、甘油酯形态、磷脂质的形态、甾醇酯形态等。某脂肪酸被特定的情况下，可以以一种形态存在，也可以作为2种以上的形态的混合物存在。
经验上判明脂肪酸的水解的反应效率高，在水解后，得到主要包含游离脂肪酸形态的脂肪酸的组合物。因此，对于加工工序后的脂肪酸，只要没有特别说明，则有时将为组合物、及脂肪酸为游离脂肪酸形态的脂肪酸省略而记载。但是，没有将包含除游离脂肪酸形态以外的形态的脂肪酸完全排除。
经验上判明油脂或脂肪酸酯的醇分解的反应效率高，在醇分解后，得到主要包含脂肪酸烷基酯形态的脂肪酸的组合物。因此，对于加工工序后的脂肪酸，只要没有特别说明，则有时将为组合物、及脂肪酸为烷基酯形态的脂肪酸省略而记载。但是，没有将包含除烷基酯形态以外的形态的脂肪酸完全排除。
在记载脂肪酸时，有时使用将碳原子数、双键的数目及双键的部位分别使用数字和字母简略地表示的数值表达。例如碳原子数为20的饱和脂肪酸被记载为“C20：0”，碳原子数为18的一元不饱和脂肪酸被记载为“C18：1”等，二高-γ-亚麻酸被记载为“C20：3，n-6”等。其中，“n-6”也作为ω-6被记载，但其表示从最后的碳(ω)向着羧基计数时的最初的双键的键合位置为第6个。该方法对于本领域技术人员是众所周知的，对于按照该方法记载的脂肪酸，只要是本领域技术人员则能够容易地特定。
在本说明书中“粗油”是指上述的脂质的混合物、且由生物提取的状态的油。在本说明书中“精制油”是指对于粗油进行选自由脱胶工序、脱酸工序、脱色工序、及脱臭工序组成的组中的至少一个油脂的精制工序，进行了将除磷脂质及甾醇等目标物以外的物质除去的精制处理而得到的油。
在本说明书中“工序”的用语不仅包含独立的工序，在无法与其他工序明确区别的情况下也只要可达成该工序的所期望的目的，则也包含于本用语中。
本说明书中使用“～”所表示的数值范围表示包含其前后记载的数值分别作为最小值及最大值的范围。在本说明书中，关于百分率的“以下”或“低于”的用语只要没有特别记载下限值，则意味着包含0％、即“不含有”的情况、或包含通过现状的手段无法检测的值的范围。
在本说明书中，组合物中的各成分的量在组合物中存在多个符合各成分的物质的情况下，只要没有特别说明，则是指组合物中存在的该多个物质的总计的量。在本说明书中，组合物中的各成分的含量(％)在组合物中存在多个符合各成分的物质的情况下，只要没有特别说明，则是指组合物中存在的该多个物质的总含量。
在本说明书中，在记载了仅规定对于同一对象言及的1个或者多个上限值的数值范围和仅规定1个或者多个下限值的数值范围的情况下，只要没有特别说明，则将从1个或多个上限值任意选择的上限值与从1个或多个下限值任意选择的下限值组合而成立的数值范围也包含于本发明的一实施方式中。
本说明书中的组合物中的脂肪酸的含量只要没有特别说明，则基于脂肪酸组成而决定。脂肪酸组成可以按照常规方法而求出。具体而言，在成为测定对象的组合物中的脂肪酸为脂肪酸低级烷基酯以外的情况下，使用将成为测定对象的脂肪酸使用低级醇和催化剂进行酯化而得到的脂肪酸低级烷基酯。在成为测定对象的组合物中的脂肪酸为脂肪酸低级烷基酯的情况下，直接使用测定对象的脂肪酸。接着，以所得到的脂肪酸低级烷基酯作为试样，使用气相色谱法进行分析。在所得到的气相色谱法的图表中鉴定与各脂肪酸相当的峰，使用Agilent ChemStation积分算法(修订版C.01.03[37]、Agilent Technologies)，求出各脂肪酸的峰面积。所谓峰面积是将以各种脂肪酸作为构成成分的油脂使用气相色谱法、薄层色谱法/氢焰离子化检测器(TLC/FID)等进行分析而得到的图表的各个成分的峰面积相对于总峰面积的比例(面积％)，表示该峰的成分的含有比率。基于通过上述的测定方法得到的面积％的值与基于各脂肪酸相对于试样中的脂肪酸的总重量的重量％的值设定为相同而可以互换使用。参照日本油化学会(JOCS)制定基准油脂分析试验法2013版2.4.2.1-2013脂肪酸组成(FID恒温气相色谱法)及该2.4.2.2-2013脂肪酸组成(FID升温气相色谱法)。
对于脂肪酸组成，通过利用实施例中示出的方法的气相色谱法来确认。详细的条件示于实施例中。
<含游离多元不饱和脂肪酸组合物>
一实施方式中的含游离多元不饱和脂肪酸组合物为以下所述的含游离多元不饱和脂肪酸组合物，其包含含量为组合物中的脂肪酸的80.0％以上的至少一种碳原子数为20以上的游离多元不饱和脂肪酸，且金属的总含量为0.1ppm以下。
本实施方式所述的含游离多元不饱和脂肪酸组合物由于金属的总含量低至0.1ppm，所以能够使含有脂肪酸的80.0％以上的碳原子数为20以上的游离多元不饱和脂肪酸的组合物中的物性稳定，且在作为其他组合物中的添加成分使用的情况下，也能够显示出良好的处理性。
本说明书中，只要没有特别说明，则有时将碳原子数为20以上的游离多元不饱和脂肪酸称为“游离LC-PUFA”。本说明书中，有时将本发明的实施方式所述的含游离多元不饱和脂肪酸组合物简称为“含游离LC-PUFA组合物”。
在本说明书中，作为含游离LC-PUFA组合物所显示的稳定的物性，可列举出例如对结晶的形成温度的影响、膜、泡及表面张力的稳定性、对于氧化的稳定性等。
组合物的结晶的形成温度可以是本技术领域中众所周知的测定方法中的任一者，可列举出例如测定组合物由固相相变成液相的温度的方法、或测定组合物由液相相变成固相的温度的方法等。在组合物的结晶的形成温度与金属的总含量为0ppm的含游离LC-PUFA组合物的固体化温度相比上升1℃以上的情况下，可以判断有可能组合物的粘性发生变动。在一实施方式所述的含游离LC-PUFA组合物中，在与金属的总含量为0ppm的含游离LC-PUFA组合物的固体化温度比较时，能够显示出低于+1℃、或低于+0.5℃的固体化温度的上升幅度。
组合物的膜的稳定性可以通过采用使用含游离LC-PUFA组合物制备的测定用肥皂水(脂肪酸的碱水溶液)而形成薄膜，测定所形成的薄膜的保持时间来决定。具体而言，可以适用以下的评价方法。
<膜评价试验>
在温度25℃、1个大气压、相对湿度55％的条件下，将具有多个内框的试验用圆形框浸在脂肪酸试验液(基准液或试验液)中后，慢慢地拿起到液面上，使通过多个内框形成的分区(空间)中形成膜，测定所形成的至少一个膜破裂为止所需要的时间(秒)。作为其中使用的脂肪酸试验液，使用以下的基准液或试验液。对于测定中使用的试验用圆形框，使用以下的试验用圆形框。
<试验液的制备>
基准液
将硫酸铁(II)·7水合物的水溶液按照铁浓度成为100ppm的方式添加到游离多元不饱和脂肪酸组合物中，接着在添加乙醇而均匀化后将溶剂通过抽真空而除去，制备组合物中含有100ppm的铁的游离多元不饱和脂肪酸组合物。将含有100ppm的铁的含游离多元不饱和脂肪酸组合物0.5g、48重量％氢氧化钠0.15g、及精制水9.35g混合，制备水溶液中包含约5重量％的游离多元不饱和脂肪酸钠的水溶液，以所得到的水溶液作为“基准液”。基准液中的“约5重量％”是指4.5重量％～5.5重量％的范围。
试验液
将含游离多元不饱和脂肪酸组合物0.5g、48重量％氢氧化钠0.15g、及精制水9.35g混合，制备水溶液中包含约5重量％的游离多元不饱和脂肪酸钠的水溶液，以所得到的水溶液作为评价对象的“试验液”。为了制备试验液而使用的含游离多元不饱和脂肪酸组合物设定为通过蒸发器及抽真空而除去了溶剂的组合物。试验液中的“约5重量％”是指4.5重量％～5.5重量％的范围。
<试验用圆形框的准备>
准备在直径为64mm、内径为52mm、厚度为3mm的外框内通过厚度为2mm的内框而具有5个分区的塑料制的用具作为试验用圆形框。通过内框确定的分区的大小可以均匀，也可以不同。图1中示出一实施方式所述的试验用圆形框10。
试验用圆形框10具备圆形的外框12和与外框12连结的多个内框14。外框12成为外径为64mm、内径为52mm、厚度为3mm。在圆形的外框12的内部，设置有由多个内框14包围的大分区16和由内框14和外框10包围的4个小分区18。试验用圆形框10具有总计5个分区。
适用上述膜评价试验的情况下，在将使用基准液形成的膜损坏为止的时间(保持时间(秒))设为1时，优选使用试验液形成的膜损坏为止的时间(保持时间(秒))的相对值成为1.2以上、1.3以上、1.4以上、1.5以上、或1.6以上。若为该范围的相对时间，则可以评价为金属的含量充分低、且物性稳定的含游离LC-PUFA组合物。对于该相对值的上限值没有特别限制，例如可以设定为3.0以下。
在含游离LC-PUFA组合物中的碳原子数为20以上的多元不饱和脂肪酸中，包含二元以上、优选三元以上的不饱和脂肪酸。多元不饱和脂肪酸的碳原子数是指构成脂肪酸的碳原子数。作为碳原子数为20以上的多元不饱和脂肪酸，可列举出例如碳原子数为20以上且22以下的多元不饱和脂肪酸，具体而言，可列举出二十碳二烯酸(C20：2，n-9、EDA)、二高-γ-亚麻酸(C20：3，n-6、DGLA)、米德酸(C20：3，n-9、MA)、二十碳四烯酸(C20：4，n-3、ETA)、花生四烯酸(C20：4，n-6、ARA)、二十碳五烯酸(C20：5，n-3、EPA)、二十二碳四烯酸(C22：4，n-6、ETA)、二十二碳五烯酸(C22：5，n-3、n-3DPA)、二十二碳五烯酸(C22：5，n-6、n-6DPA)及二十二碳六烯酸(C22：6，n-3、DHA)等。含游离LC-PUFA组合物只要包含至少一种这些多元不饱和脂肪酸即可，可以将2个以上组合包含。作为2个以上的组合的LC-PUFA，可列举出例如DGLA与EPA的组合、DGLA与n-3DPA的组合、DGLA与DHA的组合、ARA与EPA的组合、ARA与n-3DPA的组合、ARA与DHA的组合、EPA与n-3DPA的组合、DHA与n-3DPA的组合、DHA与EPA的组合、EPA与DHA与n- 3DPA的组合等。
在含游离LC-PUFA组合物中，可以包含选自上述的多元不饱和脂肪酸中的一个、且不包含其他多元不饱和脂肪酸；或者，只要作为LC-PUFA含有上述的碳原子数为20以上且22以下的多元不饱和脂肪酸中的至少一个，则也可以不包含其他特定的一个或2个以上。例如，含游离LC-PUFA组合物可以不包含选自由二十碳二烯酸(C20：2，n-9)、二高-γ-亚麻酸(C20：3，n-6)、米德酸(C20：3，n-9)、二十碳四烯酸(C20：4，n-3)、花生四烯酸(C20：4，n-6)、二十碳五烯酸(C20：5，n-3)、二十二碳四烯酸(C22：4，n-6)、二十二碳五烯酸(C22：5，n-3)、二十二碳五烯酸(C22：5，n-6)及二十二碳六烯酸(C22：6，n-3)组成的组中的至少一个。另外，这里不包含多元不饱和脂肪酸是指成为对象的多元不饱和脂肪酸的含量为低于组合物中的脂肪酸的5％、或为0％。
含游离LC-PUFA组合物中的LC-PUFA的含量为组合物中的脂肪酸的80.0％以上。含游离LC-PUFA组合物由于包含80.0％以上的LC-PUFA，所以能够更高地发挥LC-PUFA的功能。含游离LC-PUFA组合物中的靶LC-PUFA的含量的下限值可以设定为组合物中的脂肪酸的85.0％、90.0％、95.0％、97.0％、98.0％、99.0％、或99.5％。在LC-PUFA的含量更高的情况下，能够更高地发挥LC-PUFA的功能。LC-PUFA的含量的上限值没有特别限制，例如可以设定为99.9％、或98.0％。在本组合物中，LC-PUFA的含量可以设定为将上述的上限值的任意的值与下限值的任意的值组合的范围，例如也可以为组合物中的脂肪酸的80.0％～99.9％、90.0％～99.9％、90.0％～98％、95.0％～99.9％、97.0％～99.9％、或97.0％～98.0％。
含游离LC-PUFA组合物中的金属的总含量为0.1ppm以下。通过含游离LC-PUFA组合物中的金属的总含量为0.1ppm以下，能够使由游离LC-PUFA引起的组合物的物性的变动降低。含游离LC-PUFA组合物中的铁的含量可以设定为0.08ppm以下、0.05ppm以下、0.03ppm以下、0.01ppm以下、或0.00ppm。
基于上述的膜评价试验的稳定性优异的含游离LC-PUFA组合物也可以为0.05ppm以上、或0.1ppm以上的金属的总含量、代表性的是铁的含量，在该情况下，也可以为1.2ppm以下、或1.0ppm以下的金属的总含量、代表性的是铁的含量。这样的基于膜评价试验的稳定性优异的含游离LC-PUFA组合物的上述的膜评价试验的相对值也可以为1.8以上、1.9以上、2.0以上、2.2以上。对于该相对值的上限值没有特别限制，例如可以设定为3.0以下。
对于本说明书中的“金属”，可列举出铁、铜、铬、铝、镍、锡、锌、锰、钼等，代表性的是可列举出铁。这些金属可以是单独1种，也可以是2种以上。本说明书中的“金属的总含量”有时在组合物中可存在1种金属的情况下，是指组合物中可存在的1种的含量，在组合物中可存在2种以上的金属的情况下，是指它们的总含量。作为含游离LC-PUFA组合物中可存在的金属，由于很多情况下铁可符合，所以可以将铁的含量设定为“金属的总含量”。
本说明书中的铁是指通过原子吸光分析法(石墨炉法)测定的铁。在本说明书中，铁的含量根据基于以下的条件的分子吸光分析法进行测定。
称量1g的对象试样，在添加硝酸0.15mL(有害金属测定用)后通过甲基异丁基酮定容成10mL而制成试样液。
标准试样设定为Conostan S-21(10ppm(Wt.))，将该标准试剂在甲基异丁基酮中稀释，制备标准曲线试样(0μg/L、10μg/L、20μg/L)。
对于使用试样液、及标准试样的分析装置的利用石墨炉法的铁定量在最佳的条件、例如以下的分析条件下进行原子吸光分析，通过利用装置附带的软件的自动计算对试样液的铁含量进行定量。
装置Z-2000“塞曼原子吸光光度计”((株)日立制作所)
注入量20μL
测定模式石墨雾化器/自动进样器
测定元素Fe
石墨管Pyro tube HR
测定波长(nm)248.3
测定信号BKG修正
狭缝宽度(nm)0.2
时间常数(s)0.1
灯电流(mA)12.5
加热控制方法光温度控制
温度程序
1干燥80℃到140℃升温时间40秒保持时间0秒气体流量200mL/分钟
2灰化1000℃升温时间20秒保持时间0秒气体流量200mL/分钟
3原子化2400℃升温时间0秒保持时间5秒气体流量30mL/分钟
4清洁2700℃升温时间0秒保持时间4秒气体流量200mL/分钟
5冷却0℃升温时间0秒保持时间10秒气体流量200mL/分钟
具体的试样液中的铁含量基于以下的式(I)算出。
试样中的铁含量(ppm)＝C/(W×100)…(I)
(其中，C是指通过原子吸分光得到的试样液的铁含量(μg/升)，W是指试样液的采集量(g)。)
在一实施方式中的含游离LC-PUFA组合物中，除了上述的金属的总含量以外，还可以满足选自以下的(1)～(3)的条件中的至少一个。
(1)过氧化物值
在一实施方式中的含游离LC-PUFA组合物中，过氧化物值也可以为5.0meq/kg以下。过氧化物值为5.0meq/kd以下的含游离LC-PUFA组合物能够显示出优异的保存稳定性。含游离LC-PUFA组合物中的过氧化物值可以设定为5.0meq/kg以下、4.0meq/kg、3.5meq/kg以下、或3.0meq/kg以下。过氧化物值按照硫氰酸铁法来决定。
(2)共轭不饱和脂肪酸
在含游离LC-PUFA组合物中，共轭不饱和脂肪酸的含量也可以为组合物中的脂肪酸的1.2％以下。作为共轭不饱和脂肪酸，根据水解处理中适用的原料组合物中的脂肪酸的种类及LC-PUFA的种类而不同，但可列举出共轭二烯酸、共轭三烯酸、共轭四烯酸等。共轭不饱和脂肪酸可以基于成为对象的共轭不饱和脂肪酸的吸光度进行定量。含游离LC-PUFA组合物中的共轭不饱和脂肪酸的含量设定为测定试样的紫外光谱，并由规定的计算式算出的共轭不饱和脂肪酸的含量，设定为按照日本油化学会(JOCS)制定基准油脂分析试验法2013版参1.14中规定的共轭不饱和脂肪酸(光谱法)测定的值。在试样中的组合物包含除脂肪酸以外的成分的情况下，基于组合物中的脂肪酸的量，可以求出共轭不饱和脂肪酸的量。
含游离LC-PUFA组合物的共轭不饱和脂肪酸的含量可以设定为组合物中的脂肪酸的1.0％以下、0.8％以下、0.7％以下、0.6％以下、0.5％以下、0.4％以下、或0.3％以下。存在共轭不饱和脂肪酸的含量越少，则组合物的氧化稳定性越优异的倾向。共轭不饱和脂肪酸的含量的下限值也可以为0.1％、0.2％、0.01％、或0.001％。例如，含游离LC-PUFA组合物的共轭不饱和脂肪酸的含量可以设定为组合物中的脂肪酸的0.001％～1.2％、0.001％～1.0％、0.01％～0.8％、0.1％～0.7％、或0.2％～0.7％。
(3)茴香胺值
在一实施方式所述的含游离LC-PUFA组合物中，茴香胺值(AnV)可以设定为5.0以下、4.5以下、4.0以下、3.5以下、3.0以下、或2.5以下。茴香胺值是基于含游离LC-PUFA组合物中存在的氧化物质的含量而变动的指标。显示更低的茴香胺值的含游离LC-PUFA组合物中氧化物质的含量更少。茴香胺值按照日本油化学会(JOCS)制定基准油脂分析试验法2013版2.5.3来决定。
含游离LC-PUFA组合物为例如包含以下的组合物：
(a)铁的含量为0.1ppm以下、过氧化物值为5.0meq/kg以下、共轭不饱和脂肪酸的含量为组合物中的脂肪酸的1.2％以下的含游离LC-PUFA组合物：
(b)铁的含量为0.1ppm以下、过氧化物值为4.0meq/kg以下、共轭不饱和脂肪酸的含量为组合物中的脂肪酸的1.0％以下的含游离LC-PUFA组合物：
(c)铁的含量为0.1ppm以下、共轭不饱和脂肪酸的含量为组合物中的脂肪酸的1.2％以下、且茴香胺值为3.5以下的含游离LC-PUFA组合物；
(d)铁的含量为0.1ppm以下、过氧化物值为4.5meq/kg以下、茴香胺值为5.0以下的含游离LC-PUFA组合物；
(e)铁的含量为0.1ppm以下、过氧化物值为5.0meq/kg以下、共轭不饱和脂肪酸的含量为组合物中的脂肪酸的1.2％以下、且茴香胺值为4.0以下的含游离LC-PUFA组合物。
在上述(a)、(c)或(d)的含游离LC-PUFA组合物中，过氧化物值也可以为3.5meq/kg以下、或2.5meq/kg。在上述(a)、(b)或(d)的含游离LC-PUFA组合物中，共轭不饱和脂肪酸的含量也可以为0.8％以下、0.7％以下、0.6％以下、0.4％以下、或0.3％以下。在上述(b)、(c)或(d)的含游离LC-PUFA组合物中，茴香胺值也可以为4.5以下、4.0以下、3.5以下、3.0以下、或2.5以下。
在含游离LC-PUFA组合物中，脂肪酸烷基酯的含量可以设定为低。脂肪酸烷基酯在制造游离脂肪酸的工序中，可以为碱水解的原料物质、或可通过逆反应而由游离脂肪酸生成的产物。脂肪酸烷基酯的含量更少的含游离LC-PUFA组合物可以使游离LC-PUFA的含量更高，此外，存在组合物的生物体吸收性、特别是肠道吸收性更高的倾向。含游离LC-PUFA组合物的脂肪酸烷基酯含量可以设定为组合物中的脂肪酸的0.2％以下、0.1％以下、0.05％以下、0.04％以下、0.03％以下、0.02％以下、或0.01％以下。作为脂肪酸烷基酯的含量的下限值，没有特别限制，例如可以设定为0.0005％。脂肪酸烷基酯的含量为0.0005％以上的情况下，存在组合物难以结晶化、流动性提高的倾向。
含游离LC-PUFA组合物可以设定为除LC-PUFA以外的脂肪酸的含量少。在组合物中的LC-PUFA以外的脂肪酸的含量低的情况下，能够以与LC-PUFA的含量相应的程度期待功能的发挥，此外，能够抑制由除LC-PUFA以外的其他脂肪酸带来的影响。作为在含游离LC-PUFA组合物中含量能够降低的其他脂肪酸，可列举出碳原子数低于20的饱和或者不饱和脂肪酸、碳原子数为22以上的饱和脂肪酸等。具体而言，作为碳原子数低于20的饱和或不饱和脂肪酸，可列举出碳原子数为18的饱和脂肪酸、碳原子数为18的一元不饱和脂肪酸、碳原子数为18的二元不饱和脂肪酸、碳原子数为18的三元不饱和脂肪酸及碳原子数为18的四元不饱和脂肪酸，作为碳原子数为22以上的饱和脂肪酸，可列举出碳原子数为22的饱和脂肪酸及碳原子数为24的饱和脂肪酸。
在含游离LC-PUFA组合物中，这些除LC-PUFA以外的脂肪酸中的碳原子数为18的二元以上的多元不饱和脂肪酸的含量可以设定为低。例如，碳原子数为18的二元以上的多元不饱和脂肪酸的含量可以设定为组合物的脂肪酸的2.0％以下、1.5％以下、1.0％以下、或0.8％以下。作为除LC-PUFA以外的脂肪酸的含量的下限值，例如也可以为0.001％以上、0.005％以上、或0.01％。碳原子数为18的二元以上的多元不饱和脂肪酸的含量例如可以设定为0.001％～2.0％、0.005％～1.5％、0.01％～1.5％、或0.01％～1.0％。
含游离LC-PUFA组合物也可以含有除上述的脂肪酸以外的形态的脂肪酸。作为其他形态的脂肪酸，可列举出三甘油酯、二甘油酯、单甘油酯、磷脂质、甾醇酯等。这些其他形态的脂肪酸的含量只要是相当于含游离LC-PUFA组合物的除LC-PUFA以外的剩余部分的量即可，可以设定为低于组合物中的脂肪酸的20.0％、低于10.0％、低于5.0％、低于2.0％、低于1.0％、或低于0.5％。
含游离LC-PUFA组合物中的脂肪酸的含量可以设定为组合物的总重量的97.0重量％以上、98.0重量％以上、99.0重量％以上、99.5重量％以上、或99.9重量％以上。含游离LC-PUFA组合物中的脂肪酸的含量可以通过TLC/FID等公知的方法来确认。在含游离LC-PUFA组合物中，可以包含除脂肪酸以外的成分。作为可包含于含游离LC-PUFA组合物中的其他成分，可列举出生育酚、维生素C、维生素C衍生物等抗氧化剂、乙醇等溶剂等。
含游离LC-PUFA组合物只要可以具有本说明书中记载的特征，则可以是以任何制造方法制造的组合物，可以优选为通过后述的制造方法制造的组合物。
<制造方法>
本发明的一方式中的含游离LC-PUFA组合物的制造方法包括以下步骤：准备包含至少一种碳原子数为20以上的多元不饱和脂肪酸的原料组合物；对于将所准备的原料组合物、低级醇、金属的总含量为0.01ppm以下的水、及碱催化剂组合而制备的反应液，进行水解处理；将水解处理后的反应组合物与金属的接触按照每1g的组合物和金属的接触表面积[cm2]与接触时间[天]的积T[cm2×天]成为100以下的方式限制，根据需要也包含其他工序。根据本实施方式的制造方法，可以更高效地得到金属的总含量、代表性的是铁的含量为0.1ppm以下的含游离LC-PUFA组合物。
在准备原料组合物的工序中，只要是包含至少一个LC-PUFA的原料组合物，则可以准备已获得的原料组合物，也可以准备另外制造的原料组合物。原料组合物可以是来源于水产物原料的组合物、来源于微生物原料的组合物、来源于植物原料的组合物、来源于动物原料的组合物等来源于生物的组合物。原料组合物可以是包含三甘油酯形态的LC-PUFA的组合物，也可以是含有LC-PUFA烷基酯的组合物。含LC-PUFA烷基酯组合物优选为将含有三甘油酯形态的LC-PUFA的生物油进行烷基酯化而得到的组合物。
作为含有LC-PUFA的生物油，可以是鱼类等水产物原料油、来源于微生物的微生物油、来源于植物的植物油等生物油，例如，可以是微生物油。生物油是指以生物量作为起源而得到的油，微生物油是指以微生物生物量作为起源而得到的油。生物油也可以是来源于基因重组体的生物油。所谓“生物量”的用语是指在规定的区域或生态***中生长的规定的时刻的细胞的集合物或块。
作为水产物原料油，可例示出包含鱼类、甲壳类、或海产动物中包含的油脂、磷脂质、蜡酯等的脂质。作为水产原料油，为鲱鱼(herring)、沙丁鱼(sardine)、凤尾鱼(anchovy)、步鱼(menhaden)、皮尔彻德鱼(pilchard)、秋刀鱼(saury)、金枪鱼(tuna)、鲣鱼(bonito)、无须鳕(hake)、鲶鱼(catfish)、毛鳞鱼(capelin)、红鱼(red fish)、白鱼(whitefish)、鲭鱼(mackerel)、竹荚鱼(jack mackerel)、黄尾鱼(yellowtail)、玉筋鱼(sandeel)、大头鱼(pout)、鲑鱼(salmon)、狭鳕(pollock)、鳕鱼(cod)、大比目鱼(halibut)、鳟鱼(trout)、blue whitening、西鲱(sprat)、鲨鱼(shark)、狗鲨(dogfish)等鱼类来源的油、乌贼(squid)、双壳贝(clam)、鲍鱼(abalone)等软体动物来源的油、磷虾(krill)等甲壳类来源的油、及海豹(seal)、海狮(sealion)、海狗(seabear)、海象(warlus)等动物来源的油、以及这些油的混合物。
作为微生物，只要是脂质生产微生物或脂质生产可能微生物即可，可列举出藻类(algae)、真菌、细菌类(bacteria)、菌类(fungi)及原生藻菌(stramenopile)类。
作为藻类，可列举出粘菌门(Labyrinthulamycota)属等。
作为真菌，可列举出亚罗酵母属、假丝酵母属、酵母属、裂殖酵母属、毕赤酵母属等。
作为细菌类，可列举出农杆菌(Agrobacterium)、芽孢杆菌(Bacillus)、大肠杆菌(Escherichia)、假单胞菌(Pseudomonas)、放线菌(Actinomyces)等。
作为菌类，可列举出选自由被孢霉(Mortierella)属、耳霉(Conidiobolus)属、腐霉(Pythium)属、疫霉(Phytophthora)属、青霉(Penicillium)属、枝孢菌(Cladosporium)属、毛霉(Mucor)属、镰刀菌(Fusarium)属、曲霉(Aspergillus)属、红酵母(Rhodotorula)属、虫霉(Entomophthora)属、刺孢囊霉(Echinosporangium)属、及水霉(Saprolegnia)属组成的组中的至少1种。其中，进一步优选属于被孢霉(Mortierella)属的微生物。作为属于被孢霉属的微生物，可列举出例如长孢被孢霉(Mortierella elongata)、微小被孢霉(Mortierella exigua)、喜湿被孢霉(Mortierella hygrophila)、高山被孢霉(Mortierella alpina)等属于被孢霉亚属的微生物。
作为植物，除了芸薹属(Brassica)、向日葵属(Helianthus)、棉花属(Gossypium)、亚麻属(Linum)、烟草属(Nicotiana)、柑橘属(Citrus)、葱属(Allium)、小麦属(Triticum)、大麦属(Hordeum)、燕麦属(Avena)、黑麦属(Secale)、稻属(Oryza)、甘蔗属(Saccharum)、玉蜀黍属(Zea)、高粱属(Sorghum)的植物以外，还可列举出大豆(soybean)、番茄(tomato)、马铃薯(potato)、豌豆(pea)、豇豆(frijol)、花生(peanut)、苜蓿(Medicago)、芹菜(celery)、荷兰芹(pase1ey)、紫苜蓿(clover)、胡萝卜(carrot)、萝卜(radish)、甜菜(sugar beet)、黄瓜(cucumber)、菠菜(spinach)、木薯(cassava)、橄榄(olive)、苹果(apple)、香蕉(banana)、甜瓜(melon)、葡萄(grape)、草莓(strawberry)、椰子(coconut plant)、咖啡树(coffeeplant)、胡椒(pepper)等。
成为烷基酯化处理的对象的原料油可以是粗油，也可以是精制油。粗油可以是由水产物原料得到的油，也可以是由微生物原料得到的油。精制油可以是对粗油进行脱胶工序、脱酸工序、使用了活性白土或活性炭的脱色工序、水洗工序、利用水蒸气蒸馏等的脱臭工序等，经由将除磷脂质及甾醇等目标物以外的物质除去的粗油精制工序而得到。
在进行烷基酯化的工序中，将原料油通过使用了低级醇的醇分解，分解成低级烷基酯。作为低级醇，可列举出脂肪酸的烷基酯化中一般使用的醇、例如碳原子数为1～3的低级醇。醇分解是在原料油中添加低级醇例如乙醇和催化剂或酶并使其反应，由键合于甘油上的脂肪酸生成乙酯的反应。作为催化剂，使用碱催化剂、酸催化剂等。作为酶，使用脂酶。
在粗油或者精制油、或通过烷基酯化处理得到的含脂肪酸烷基酯组合物中，有时除了作为目标的LC-PUFA以外，还包含1个或2个以上的其他脂肪酸。为了由粗油或者精制油或含脂肪酸烷基酯组合物将特定的LC-PUFA浓缩或离析，可以将蒸馏、精馏、柱色谱法、低温结晶化法、尿素包合法、液-液逆流分配色谱法等单独使用1种、或将2种以上组合使用。优选蒸馏或精馏与柱色谱法或液-液逆流分配色谱法的组合。在经由将特定的LC-PUFA浓缩或离析的工序的情况下，能够提高本含LC-PUFA组合物中最终可包含的作为目标的LC-PUFA的脂肪酸中的含量，并且降低除作为目标的LC-PUFA以外的其他脂肪酸的脂肪酸中的含量。
例如，使用精馏的情况下，作为精馏工序，在将蒸馏塔的塔顶部的压力设定为10mmHg(1333Pa)以下的减压、将塔底温度设定为165℃～210℃、优选170℃～195℃的条件下进行蒸馏在抑制由热引起的脂肪酸的改性、提高精馏效率的方面优选。蒸馏塔的塔顶部的压力越低越好，更优选为0.1mmHg(13.33Pa)以下。对于塔顶部的温度没有特别限制，例如可以设定为160℃以下。通过精馏工序，可以得到包含更高的含量的LC-PUFA、例如LC-PUFA烷基酯的原料组合物。
作为柱色谱法，优选反相分配系的柱色谱法。作为反相柱色谱法，可列举出本技术领域中公知的反相柱色谱法，特别是优选可列举出以被十八烷基甲硅烷基(ODS)修饰过的基材作为固定相的高效液相色谱法(HPLC)。
通过浓缩或离析工序得到的组合物为作为目标的LC-PUFA的含量高的组合物，例如，作为目标的LC-PUFA的含量也可以为脂肪酸的80.0％以上、85.0％以上、90.0％以上、95.0％以上、97.0％以上、98.0％以上、99.0％以上、或99.5％以上。可以使用该含有高浓度的LC-PUFA的组合物作为原料组合物。
在进行水解处理的工序中，使用将所准备的原料组合物、低级醇、金属的总含量为0.01ppm以下的水、及碱催化剂组合而制备的反应液，对于该反应液，进行水解处理。在本说明书中，有时将使用了碱催化剂的本水解处理称为碱水解处理。
对于碱水解处理中使用的反应液，将原料组合物、低级醇、金属的总含量为0.01ppm以下的水及碱催化剂与根据需要的其他成分组合而制备的反应液是符合的。
作为原料组合物，可以为生物油，也可以为含LC-PUFA烷基酯组合物。反应液中的原料组合物的浓度(w/w)从反应效率的观点出发，可以设定为10.0重量％～70.0重量％、20.0重量％～60.0重量％、或40重量％～50重量％。
作为低级醇，可列举出为了将生物油或脂肪酸烷基酯分解而得到游离脂肪酸而一般使用的低级醇、例如碳原子数为1～3的低级醇。反应液中的低级醇的量只要是为了将原料组合物中的脂肪酸分解成游离型而有效的量即可，例如，相对于原料组合物中的脂肪酸，可以设定为0.9当量～32.0当量、0.92当量～20.0当量、0.95当量～14当量、2.0当量～10.0当量、3.0当量～7.0当量、或4.5当量～5.5当量。原料组合物中的低级醇相对于脂肪酸的比为0.9当量或大于其的情况下，存在反应以更良好的速度进行的倾向，此外，存在更容易抑制着色物质的产生的倾向。另一方面，为32.0当量或小于其的情况下，存在能够使反应停止后的状态稳定化、且有效地抑制可生成脂肪酸烷基酯的逆反应的进行的倾向。对于反应液中的低级醇的量，包含在反应液的制备时添加的低级醇的量和在反应中反应液中副产的低级醇的量这两者。本说明书中的“当量”是指“摩尔当量”。以下相同。
反应液中的低级醇的量相对于水以重量比计可以设定为0.20～8.20、0.23～4.50、0.25～3.50、0.60～2.50、或1.20～1.50。若水与低级醇的重量比为该范围，则碱水解更良好地进行，此外，存在能够使反应停止后的状态稳定化、且有效地抑制可生成脂肪酸烷基酯的逆反应的进行的倾向。对于反应液中的低级醇的量，包含在反应液的制备时添加的低级醇的量和在反应中反应液中副产的低级醇的量这两者。
为了制备反应液而使用的水为金属的总含量为0.01ppm以下的水。作为金属，若以铁作为代表进行说明，则一般由于自来水包含0.3ppm的铁，所以不符合本实施方式中的制造方法中的“水”。
其他实施方式所述的水的铁的含量为0.01ppm以下、0.005ppm以下、或0、即不包含铁的水。一般自来水的日本的自来水标准值以铁量计为0.3ppm，在欧盟(EU)、美国及世界卫生组织(WHO)也大多为0.2～0.3ppm。认为若在反应中使用该水准的铁浓度的水，则在水解后的含多元不饱和脂肪酸组合物中残存一部分铁，得不到充分低的铁浓度的多元不饱和脂肪酸。此外，在含多元不饱和脂肪酸组合物的实际的制造厂或工厂设备中一般使用金属配管，有可能混入配管来源的铁等金属。因此，将反应中使用的水中包含的金属的总含量、代表性的是铁的含量抑制在0.01ppm以下可具有重要的意义。
作为具有这样的铁的含量的水，一般可列举出精制水、例如离子交换水、蒸馏水、RO(反渗透膜)水、纯水、超纯水等。本说明书中“精制水”是指这些被精制的水。使用金属的总含量为0.01ppm以下的水、即精制水时，能够高效地得到物性的变动少的含游离LC-PUFA组合物。
水在反应液中的量相对于原料组合物中的脂肪酸，可以设定为6.0当量～13.0当量、7.0当量～12.0当量、8.0当量～11.0当量、或9.0当量～10.0当量。若水相对于原料组合物的重量比为该范围时，则能够使碱水解更良好地进行。
作为碱水解处理中使用的碱催化剂，可以设定为碱金属氢氧化物，为氢氧化钠、氢氧化钾等，可以为选自由氢氧化钠及氢氧化钾组成的组中的至少一个，更优选为氢氧化钠。碱水解处理中使用的碱催化剂的量只要为可由原料组合物生成游离脂肪酸的范围即可，例如，相对于原料组合物中的脂肪酸可以设定为1.0当量～2.3当量、1.0当量～2.0当量、或1.0当量～1.5当量，碱催化剂相对于原料组合物的比为该范围内时，能够高效地使反应进行而得到游离LC-PUFA。
在反应液中，在不妨碍碱水解反应的进行的范围内，可以包含除上述的物质以外的成分。作为这样的成分，可列举出生育酚、维生素C、维生素C衍生物等抗氧化剂、丙酮等非醇溶剂等。
本制造方法中的水解处理只要是作为目标的水解处理能够进行的温度即可，例如可以在100℃以下、80℃以下、50℃以下、或10℃以下的温度条件下进行。一实施方式所述的水解处理可以在10℃以下的温度条件下实施。通过设定为10℃以下的水解处理，能够抑制共轭不饱和脂肪酸等杂质在水解工序中的产生或增加。水解处理的温度条件从抑制共轭不饱和脂肪酸等杂质的产生或增加的观点出发，水解处理温度例如可以设定为-20℃以上、-10℃以上、-5℃以上、-4℃以上、-2℃以上、0℃以上、或2℃以上。作为水解处理的温度范围，可以设定为基于上述的上限值中的任一者和下限值中的任一者的数值范围，例如可以设定为-20℃～100℃、-10℃～80℃、-5℃～70℃、-4℃～50℃、0℃～10℃、0℃～8℃、或2℃～7℃。在10℃以下那样的温度条件下进行水解处理的情况下，由于能够更加抑制上述的杂质的产生或增加，所以特别优选。
作为碱水解处理的反应时间，根据所设定的温度范围而不同，但例如可以设定为30分钟～600小时、1小时～100小时、8小时～80小时、或19小时～25小时。随着碱水解处理进行而反应液中的脂肪酸烷基酯的量减少。因此，可以根据反应液中的脂肪酸烷基酯的残存量而使碱水解处理停止。反应液中的脂肪酸烷基酯的量可以通过薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)等进行确认。
碱水解处理可以通过向反应液中添加酸而停止。通过添加酸，反应液的pH成为酸性侧，水解反应的进行停止，通过碱催化剂的添加而生成的皂化物分解，得到游离脂肪酸。此时，通过使反应液中存在己烷等有机溶剂，可以将通过反应停止处理而得到的游离脂肪酸萃取。对于反应停止及萃取处理的温度条件没有特别限制，例如可以设定为0℃～40℃、5℃～35℃、或15℃～30℃的范围内。对于反应停止及萃取处理的时间，没有特别限制，可以进行至通过搅拌等而混合的反应液发生层分离、且稳定。
为了将碱水解反应停止而使用的酸在本技术领域中众所周知，可列举出例如盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸等无机酸、或醋酸、柠檬酸、草酸等有机酸。作为酸，从水中的溶解度高且通过水洗容易除去的方面出发优选无机酸，其中从添加量为少量即可、所生成的盐及残存的酸的除去的方面出发，更优选盐酸等。酸的添加量只要是为了将碱水解处理停止而有效的量即可，相对于添加的碱催化剂可以设定为1.1当量左右。
酸添加后的反应液的pH只要是能够将碱水解停止的pH即可，可以以pH0.1、pH1.0、pH1.5、或pH2.0作为下限值，另一方面，可以以pH6.0、pH5.0、pH4.5、或pH4.0作为上限值。酸添加后的反应液的pH例如可以设定为pH0.1～pH6.0、pH1.0～pH6.0、pH1.5～pH4.5、pH2.0～pH5.0、pH2.0～pH4.0。
水解处理后的反应组合物中包含游离LC-PUFA。发明人们初次发现游离LC-PUFA与链长短的不饱和脂肪酸、或链长同等的饱和脂肪酸或者不饱和度少的一元单不饱和脂肪酸相比，容易使金属溶出。进而本发明人们发现，通过将水解处理后的反应组合物与金属的接触限制在一定以下，能够抑制含游离多元不饱和脂肪酸组合物中可包含的铁等金属的含量的增加，能够抑制由金属带来的对含多元不饱和脂肪酸组合物的物理性质、化学性质、稳定性的影响。
在本实施方式中，该水解处理后的反应物与金属的接触按照每1g的组合物和金属的接触表面积[cm2]与接触时间[天]的积T[cm2×天]成为100以下的方式限制。由此，将含游离LC-PUFA组合物中的金属的总含量高效地抑制在规定范围内、例如0.1ppm以下，能够提供物性稳定的含游离LC-PUFA组合物。
可以认为与水解处理后的反应组合物有关的每1g的组合物和金属的接触表面积[cm2]与接触时间[天]的积T[cm2×天]是将组合物中的金属的总含量相当于0.1ppm的金属溶出所需要的接触量，通过以下叙述的使用了不锈钢(SUS)球的铁的溶出试验而求出。
将不锈钢球SUS304-1/5(直径1/8英寸、SUS304制)投入50个到10mL容量的玻璃小瓶中，进而，添加5g试验组合物而使SUS球完全地浸渍，在氮气氛下40℃下保管。保管开始后，经时地进行组合物1g的取样，调查铁含量的变化。
铁含量的测定通过原子吸光分析(石墨炉法)求出。由试样液的铁含量求出试验组合物中的铁含量，计算与SUS的接触面积每1cm2的铁溶出速度(ng/cm2/天)，求出1g的组合物和金属的接触表面积[cm2]与接触时间[天]的积T[cm2×天]。
所得到的积T根据含游离LC-PUFA组合物中的LC-PUFA的种类、含量等而不同。只要使含游离LC-PUFA组合物与金属的接触为积T以内即可。由于“积T”为组合物1g中的组合物及金属表面间的接触时间与面积的积，所以为了按照成为积T以内的方式限制，可以通过调整接触的金属表面的大小和接触时间中的至少一者来达成。
例如，可以通过将水解处理中使用的设备及装置的材质变更为玻璃等非金属；在水解处理、根据情况之后的处理的期间、或保存时与金属表面接触的情况下，减小金属表面的大小；或缩短与接触的金属面的接触时间；或者减小金属表面的大小、且缩短接触时间等来达成。通过将含游离LC-PUFA组合物与金属表面的接触限制在积T以内，能够提供例如在水解处理的前后显示出稳定的物性的含游离LC-PUFA组合物。此外，在例如作为添加成分使用的情况下，能够提供显示出稳定的物性的含游离LC-PUFA组合物。
作为积T的值，根据含游离LC-PUFA组合物中的LC-PUFA的种类而不同，但可以设定为100以下、90以下、80以下、75以下、70以下、65以下、60以下、55以下、50以下、45以下、40以下。通过以该范围内的积T作为基准，在含有碳原子数成为20以上的游离的LC-PUFA的组合物中，能够将可混入组合物中的金属的量有效地抑制在规定范围内。
作为相对于含游离LC-PUFA组合物接触被限制在积T以内的金属表面，可列举出通过与LC-PUFA的接触能够溶出的金属，例如铁、不锈钢、钢、马口铁、以磷酸锌等涂布的钢等符合，特别是可列举出钢、不锈钢等。
组合物与金属表面的接触被限制在积T以内的范围可以设定为从开始水解处理到被容纳于最终的制品容器的期间，特别是可列举出到使水解处理的反应停止，将含游离多元不饱和脂肪酸组合物回收并水洗，进一步进行脱溶剂而保管，被容纳于制品容器为止的范围。
本制造方法可以包括从反应停止及萃取处理后得到的反应液除去水溶性成分的洗涤工序。在洗涤工序中，只要使用水等作为洗液添加到反应液中即可。可以进行至洗涤处理中使用的洗液的pH为中性附近、例如超过6。对于洗涤工序的温度没有特别限制，可以在25℃以下进行。本制造方法可以包括在洗涤工序后，用于由洗涤处理后的反应液的有机层回收作为目标的含游离LC-PUFA组合物的回收工序。回收处理只要应用为了该目的而通常使用的手段即可，例如可以使用蒸发器等。
在通过本制造方法得到的含游离LC-PUFA组合物中，金属的总含量为0.1ppm以下、0.05ppm以下、0.03ppm以下或0.01ppm以下，且LC-PUFA的含量例如可以为组合物中的脂肪酸的80.0％以上、85.0％以上、90.0％以上、95.0％以上、97.0％以上、98.0％以上、99.0％以上、或99.5％以上。
通过一实施方式所述的制造方法得到的含游离LC-PUFA组合物具备上述那样的金属的总含量、及LC-PUFA的含量，且共轭不饱和脂肪酸的含量可以设定为组合物中的脂肪酸的1.2％以下、1.0％以下、0.8％以下、0.7％以下、0.6％以下、0.5％以下、0.4％以下、或0.3％以下。
通过其他实施方式所述的制造方法得到的含游离LC-PUFA组合物可以为显示上述的规定的过氧化物值、茴香胺值等的组合物。
在含游离LC-PUFA组合物中，与通过水解酶得到的含游离LC-PUFA组合物相比，热失活处理后的酶的残留量少。在热失活处理后的酶的残留量少的组合物中，能够降低残留酶的影响。
含游离LC-PUFA组合物设定为来源于生物油的组合物，由于可以不经由化学合成的工序而得到，所以能够制成残留有机溶剂量低的组合物。本说明书中的有机溶剂是指为除脂肪酸以外的溶剂、且具有至少一个碳原子的疏水性或亲水性的溶剂，可列举出极性溶剂、非极性溶剂、水混合性溶剂、水不混合性溶剂、及它们2个以上的组合。作为有机溶剂，可列举出取代或未取代的、饱和或者不饱和脂肪族烃、芳香族烃、醇、醚、酮、醛、羧酸、酯、腈、酰胺等，它们可以是单独或也可以是2种以上的组合。
含游离LC-PUFA组合物中的残留有机溶剂的总含量可以设定为5000ppm以下、3000ppm以下、2000ppm以下、或1000ppm以下。
含游离LC-PUFA组合物也可以是残留有机溶剂中的选自由甲醇、乙醇、丙酮及己烷组成的组中的至少一个的含量低的组合物。这些有机溶剂可以分别独立地设定为500ppm以下、300ppm以下、或200ppm以下。例如，含游离LC-PUFA组合物中的甲醇、乙醇、丙酮及己烷的含量均可以设定为500ppm以下、300ppm以下、或200ppm以下。
在含游离LC-PUFA组合物中，由于以高浓度包含至少一个游离LC-PUFA、且物性稳定，所以能够以高的水平良好地发挥与所含有的LC-PUFA的种类相应的功能，处理性好，能够在各种用途中优选使用。
作为含游离LC-PUFA组合物的优选的用途，可列举出例如在食品、增补剂、医药品、化妆品、饲料等中的使用、在它们的制造方法中的使用，特别是可列举出包含含有LC-PUFA的组合物作为有效成分的医药品。例如，在本含游离LC-PUFA组合物为含有游离ARA、游离DGLA、游离EPA、游离DHA等的组合物的情况下，对于将这些功能性LC-PUFA以高的含有率且生产率好地应用于所要求的用途中极其有用。作为这样的用途，根据组合物中的LC-PUFA的种类而不同，但可列举出可期待动脉硬化、脑梗塞、心筋梗塞、血栓症、高脂血症等生活习惯病预防、代谢综合症改善、抗过敏、抗炎症、抗癌、脑功能改善等作用的食品、增补剂、医药品、化妆品、饲料等。作为医药品，可列举出皮肤外用剂、经口剂等。
使用含游离LC-PUFA组合物作为医药品时，医药品包含含游离LC-PUFA组合物及医药上能够允许的载体和根据需要的其他成分。投与形态只要基于组合物中的LC-PUFA的种类，正确进行经口投与或非经口投与，则可以是任何形态。作为投与形态，可列举出例如注射液、输液、散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、肠溶剂、糖锭、内用液剂、悬浮剂、乳剂、糖浆剂、外用液剂、湿布剂、滴鼻剂、滴耳剂、滴眼剂、吸入剂、软膏剂、洗涤剂、栓剂等，可以将它们根据症状而分别单独使用、或组合使用。
这些各种制剂可以按照常规方法根据目的而在主药中使用赋型剂、结合剂、防腐剂、稳定剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂等在医药的制剂技术领域中通常可使用的已知的辅助剂进行制剂化。此外其投与量根据投与的目的、组合物中的LC-PUFA的种类、投与对象者的状况(性别、年龄、体重等)而不同，但通常对于成人经口投与的情况下，以作为结构脂质的LC-PUFA的总量计，可以在每1天0.01mg～10g、优选0.1mg～2g、进一步优选1mg～200mg的范围内，此外非经口投与的情况下，以作为结构脂质的LC-PUFA的总量计，可以在每1天0.001mg～1g、优选0.01mg～200mg、进一步优选0.1mg～100mg的范围内适当调节而投与。
关于一实施方式所述的含游离LC-PUFA组合物的保存方法，在按照每1g的组合物和金属的接触表面积[cm2]与接触时间[天]的积T[cm2×天]成为100以下的方式限制与金属的接触的条件下保持。
在本实施方式所述的含游离LC-PUFA组合物的保存方法中，由于将含游离LC-PUFA组合物按照每1g的组合物和金属的接触表面积[cm2]与接触时间[天]的积T[cm2×天]成为100以内的方式限制与金属的接触，所以能够将含游离LC-PUFA组合物中的铁的含量高效地抑制在规定量以下、例如0.1ppm以下。其结果是，能够避免含游离LC-PUFA组合物的物性在保存中发生变动这样的不足的事态。此外，以本实施方式所述的保存方法保存的含游离LC-PUFA组合物在保存后可以作为处理性良好的添加成分在各种用途、例如作为食品、增补剂、医药品、化妆品、饲料等的一成分使用。
关于本实施方式所述的含游离LC-PUFA组合物的保存方法，对于金属的接触的限制条件，能够适用对于其他实施方式所述的含游离LC-PUFA组合物的制造方法记载的事项。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行详细说明。然而，本发明并不受它们的任何限定。
在以下的项中的实施例及比较例中，将LC-PUFA仅设定为特定种类，但对于LC-PUFA的种类没有特别限定。
推测作为本实施例中使用的原料组合物的含脂肪酸烷基酯组合物中包含的脂肪酸的大部分为脂肪酸烷基酯形态。因此，以下，试样中包含的脂肪酸全部作为烷基酯形态的脂肪酸记载。但是，没有将包含除烷基酯形态以外的形态的脂肪酸完全排除。
[实施例1]
将包含96.8％的EPA的鱼油来源的EPA乙酯1使用实质上不包含铁的精制水(铁含量为0.01ppm以下)，在比较高的温度下进行使用了碱催化剂的水解。
即，将5.0g的EPA乙酯1注入玻璃制的茄形烧瓶中，进一步添加3.5mL(相对于脂肪酸为4.0当量)的乙醇、2.0mL的精制水、1.5g的48重量％氢氧化钠水溶液(相对于脂肪酸为1.2当量的NaOH、乙醇·水的重量比为0.4)而制备试样液1。对于该茄形烧瓶中的试样液1，一边通过24小时70℃、油浴加热一边搅拌，进行水解处理。
精制水是将自来水通过下一代型纯水制造装置AUTO PURE WEX5型(YamatoScientific Co.,Ltd.)处理后，进一步通过纯水供给型超纯水装置Synergy UV(MilliporeCorporation)处理而得到。所得到的精制水的比电阻值为18.2MΩ·cm，铁的含量为0.1ppm以下。以下相同。
水解处理的反应的结束如以下那样操作来判断。
即，将试样液1的一部分取出，以试样液：1N盐酸水溶液：己烷＝1：2：5(v/v/v)组合而混合。以分离的己烷层作为确认用试样。
使用微量注射器将确认用试样0.5μL负载于TLC板上，在展开槽中立刻展开。展开后，将薄层板从展开槽取出，在通风机内使溶剂蒸发，通过浸渍方式涂布对茴香醛显色试剂。涂布后，在110℃～120℃左右，加热至呈色，得到斑点。通过目视确认原料乙酯的斑点的消失，作为反应终点。以下相同。
作为展开溶剂，使用己烷：二乙基醚：醋酸＝80：20：1(v/v/v)。作为TLC板，使用Silica gel 60G F254(Merck Millipore)。作为显色试剂，使用对茴香醛显色试剂。
对茴香醛显色试剂如以下那样操作而制备。即，将9.3mL的对茴香醛、3.8mL的醋酸、340mL的乙醇一边冰冷一边混合后，混合12.5mL的浓硫酸而制备。
将处理后的试样液1风冷，转移至玻璃制的分液漏斗中后，在该试样液1中添加6.3mL的己烷、5.0mL的精制水。进一步添加2.1g的盐酸并搅拌，接着静置。之后，试样液1分离成己烷层和水层这两层。水层的pH为0.4。
在由试样液1除去水层后的试样液1中，进一步添加7.5mL的精制水并搅拌。添加微量盐酸而将水层的pH调整为0.1后，将下层除去。之后，使用等量的精制水作为水洗用液进行水洗。在添加精制水后形成乳液而无法充分地分离的情况下，使用在精制水中少量添加食盐而得到的水洗用液，进行水洗。重复水洗至水洗后回收的水洗用液成为中性(pH3.5以上)。水洗后由试样液1回收己烷层到其他玻璃制的茄形烧瓶中，由回收的己烷层将己烷通过蒸发器及抽真空而除去，得到4.3g含有游离EPA的组合物、EPA1。
[实施例2]
将包含95.8％的DGLA的微生物来源的DGLA乙酯2使用实质上不包含铁的精制水(铁含量为0.01ppm以下)在比较高的温度下进行使用了碱催化剂的水解。
即，将3.0g的DGLA乙酯2注入玻璃制的茄形烧瓶中，进一步添加2.1mL(相对于脂肪酸为4.0当量)的乙醇、1.2mL的精制水、0.9g的48重量％氢氧化钠水溶液(相对于脂肪酸为1.2当量的NaOH、乙醇·水的重量比为0.4)而制备试样液2。对于该茄形烧瓶中的试样液2，一边通过24小时70℃、油浴加热一边搅拌，进行水解处理。
将处理后的试样液2风冷，转移至玻璃制的分液漏斗中后，在该试样液2中添加3.8mL的己烷、3.0mL的精制水。进一步添加1.3g的盐酸并搅拌，接着静置。之后，试样液2分离成己烷层和水层这两层。水层的pH为2.1。
在由试样液2除去水层后的试样液2中，进一步添加4.5mL的精制水并搅拌。添加微量盐酸而将水层的pH调整为1.4后，将下层除去。之后，使用等量的精制水作为水洗用液进行水洗。在添加精制水后形成乳液而无法充分地分离的情况下，使用在精制水中少量添加食盐而得到的水洗用液，进行水洗。重复水洗至水洗后回收的水洗用液成为中性pH(pH3.5以上)。水洗后由试样液2回收己烷层到其他玻璃制的茄形烧瓶中，由回收的己烷层将己烷通过蒸发器及抽真空而除去，得到2.5g含有游离DGLA的组合物、DGLA2。
[实施例3]
将包含97.6％的DHA的鱼油来源的DHA乙酯3使用实质上不包含铁的精制水(铁含量为0.01ppm以下)在比较高的温度下进行使用了碱催化剂的水解。
即，将3.0g的DHA乙酯3注入玻璃制的茄形烧瓶中，进一步添加2.1mL(相对于脂肪酸为4.3当量)的乙醇、1.2mL的精制水、0.9g的48重量％氢氧化钠水溶液(相对于脂肪酸为1.3当量的NaOH、乙醇·水的重量比为0.4)而制备试样液3。对于该茄形烧瓶中的试样液3，一边通过24小时70℃、油浴加热一边搅拌，进行水解处理。
将处理后的试样液3风冷，转移至玻璃制的分液漏斗中后，在该试样液3中，添加3.8mL的己烷、3.0mL的精制水。进一步添加1.3g的盐酸并搅拌，接着静置。之后，试样液3分离成己烷层和水层这两层。水层的pH为1.1。
在由试样液3除去水层后的试样液3中，进一步添加4.5mL的精制水并搅拌。添加微量盐酸而将水层的pH调整为0.1后，将下层除去。之后，使用等量的精制水作为水洗用液进行水洗。在添加精制水后形成乳液而无法充分地分离的情况下，使用在精制水中少量添加食盐而得到的水洗用液，进行水洗。重复水洗至水洗后回收的水洗用液成为中性pH(pH3.5以上)。水洗后由试样液3回收己烷层到其他玻璃制的茄形烧瓶中，由回收的己烷层将己烷通过蒸发器及抽真空而除去，得到2.5g含有游离DHA的组合物、DHA3。
[实施例4]
将包含96.8％的EPA的鱼油来源的EPA乙酯4使用实质上不包含铁的精制水(铁含量为0.01ppm以下)，在低温下进行使用了碱催化剂的水解。
即，将3.0g的EPA乙酯4注入玻璃制的茄形烧瓶中，进一步添加2.1mL(相对于脂肪酸为4.0当量)的乙醇、1.2mL的精制水、0.9g的48重量％氢氧化钠水溶液(相对于脂肪酸为1.2当量的NaOH、乙醇·水的重量比为0.4)而制备试样液4。对于该茄形烧瓶中的试样液4，一边在6℃下冷却一边搅拌24小时，进行水解处理。
将处理后的试样液4转移至玻璃制的分液漏斗中后，在该试样液4中，添加3.8mL的己烷、3.0mL的精制水。进一步添加1.3g的盐酸并搅拌，接着静置。之后，试样液4分离成己烷层和水层这两层。水层的pH为0.9。
在由试样液4除去水层后的试样液4中，进一步添加4.5mL的精制水并搅拌。添加微量盐酸而将水层的pH调整为0.6后，将下层除去。之后，使用等量的精制水作为水洗用液进行水洗。在添加精制水后形成乳液而无法充分地分离的情况下，使用在精制水中少量添加食盐而得到的水洗用液，进行水洗。重复水洗至水洗后回收的水洗用液成为中性pH(pH3.5以上)。水洗后由试样液4回收己烷层到其他玻璃制的茄形烧瓶中，由回收的己烷层将己烷通过蒸发器及抽真空而除去，得到2.4g含有游离EPA的组合物、EPA4。
[评价1：铁含量的确认及积T的确认]
对于实施例1中得到的含EPA组合物及实施例2中得到的含DGLA组合物，如下所述，进行铁含量及接触允许值T的确认。
作为对象，使用了油酸(试剂：油酸68％含量、其他脂肪酸C14：0 3重量％、C16：0 3重量％、C16：1 5重量％、18：1，n-7 4重量％、C18：2，n-6 5重量％、和光1级、和光纯药工业(株))。另外如上所述，在实施例1及实施例2中，水解处理及己烷萃取及组合物的回收为止，使用玻璃制的用具，与金属表面的接触几乎没有。
在10mL容量玻璃小瓶(SV-10、日电理化硝子(株))中投入50个不锈钢球SUS304-1/5(直径1/8英寸、SUS304制、AS ONE Corporation)，进一步添加5g的试验组合物使SUS球完全地浸渍，在氮气氛下40℃下保管。在5天后、9天后经时地进行1g取样，调查铁含量的变化。
在实施例1及实施例2的含LC-PUFA组合物的情况下，使用在水解处理后进一步通过硅胶精制将微量的氧化产物除去了的组合物。
SUS球50个的总计表面积由下面的计算式算出为15.8cm2。
总计表面积[cm2]＝50×4×3.14×(1/8×2.54/2)2
试验组合物中的铁含量的变化通过基于以下的条件的原子吸光分析(石墨炉法)求出。
称量1g的试验组合物，在添加硝酸0.15mL(有害金属测定用、和光纯药工业(株))后，通过甲基异丁基酮(原子吸光分析用、和光纯药工业(株))定容成10mL而制成试样液。
标准试样设定为Conostan S-21(10ppm(Wt.))。将该标准试剂在甲基异丁基酮中稀释，制备标准曲线试样(0μg/L、10μg/L、20μg/L)。
对于使用试样液、及标准试样的分析装置的利用石墨炉法的铁定量，在以下的分析条件下进行原子吸光分析，通过利用装置附带的软件的自动计算对试样液的铁含量进行定量。
装置Z-2000“塞曼原子吸光光度计”((株)日立制作所)
注入量20μL
测定模式石墨雾化器/自动进样器
测定元素Fe
石墨管Pyro tube HR
测定波长(nm)248.3
测定信号BKG修正
狭缝宽度(nm)0.2
时间常数(s)0.1
灯电流(mA)12.5
加热控制方法光温度控制
温度程序
1干燥80℃-140℃升温时间40秒保持时间0秒气体流量200mL/分钟
2灰化1000℃升温时间20秒保持时间0秒气体流量200mL/分钟
3原子化2400℃升温时间0秒保持时间5秒气体流量30mL/分钟
4清洁2700℃升温时间0秒保持时间4秒气体流量200mL/分钟
5冷却0℃升温时间0秒保持时间10秒气体流量200mL/分钟
由所定量的试样液的铁含量通过以下的式(3)算出EPA1的铁含量。
EPA1的铁含量[ppm]＝C/(W×100)…(3)
(式中，C是指通过原子吸光分析得到的试样液的铁含量(μg/L)，W是指EPA1的采集量(g)。)
由所得到的铁的量算出使1g的组合物与1cm2的SUS接触时的铁的溶出速度(ng/cm2/天)。将结果示于表1中。
[表1]
如表1中所示的那样，实施例1的含游离EPA组合物、及实施例2的含游离DGLA组合物的铁含量均为0.1ppm以下。因此，获知实施例1及实施例2中使用的水解处理及测定均适合使用玻璃制的器具进行，将组合物中的铁的含量限制在0.1ppm以下。
此外，获知使1g的组合物与接触面积1cm2的SUS接触时的铁的溶出速度在实施例1所述的含游离EPA组合物中成为2.6ng/cm2/天，在实施例2所述的含游离DGLA组合物中成为1.4ng/cm2/天，快于油酸的0.9ng/cm2/天。其结果是，积T关于实施例1的含EPA组合物成为38(cm2×天)，关于实施例2的含DGLA组合物成为72(cm2×天)，远远小于油酸的108(cm2×天)。
由此获知，实施例1及实施例2中分别所述的含EPA组合物及含DGLA组合物显示出与碳原子数为18的不饱和脂肪酸即油酸不同的行为。
[评价2：组合物的特性]
对于实施例1～实施例3的各原料组合物(原料EPA乙酯1、原料DGLA乙酯2、原料DHA乙酯3、及原料EPA乙酯4)和上述中得到的含游离LC-PUFA组合物(EPA1、DGLA2、DHA3及EPA4)，按照以下所示的方法，调查过氧化物值、共轭二烯含量、过氧化物值、茴香胺值、铁含量、脂肪酸组成。将评价结果示于表2中。将原料组合物的脂肪酸组成、共轭二烯含量、茴香胺值、过氧化物值及铁含量示于表3中。没有检测到除共轭二烯酸以外的共轭不饱和脂肪酸。
另外，对于共轭不饱和脂肪酸，仅共轭二烯酸示于表2中。
(1)过氧化物值
通过硫氰酸铁法来测定原料组合物以及含游离LC-PUFA组合物的过氧化物值。
即，将氯仿(试剂特级、和光纯药工业(株))与甲醇(试剂特级、和光纯药工业(株))以2：1(vol/vol)混合而制备氯仿/甲醇溶液。30％硫氰酸铵水溶液是量取1.5g的硫氰酸铵(试剂特级、和光纯药工业(株))，按照总计成为5.0g的方式添加精制水而制备。0.02N硫酸铁(II)/3.5％盐酸是量取27.8mg的硫酸铁(II)(试剂特级、Nacalai Tesque Inc.)到10mL容量瓶中，添加盐酸(试剂特级、和光纯药工业(株))1mL，按照以整体计成为10mL的方式添加精制水混合而制备。
将试样100mg量取到带共塞的玻璃试管中，添加4mL的氯仿/甲醇溶液，剧烈搅拌混合而制成试样液。将空白液制成氯仿/甲醇溶液。在其他的带共塞的玻璃试管中注入氯仿/甲醇溶液4.55mL，添加0.25mL的试样液或空白液，进一步添加0.1mL的30％硫氰酸铵水溶液和0.1mL的0.02N硫酸铁(II)/3.5％盐酸并快速地搅拌混合，3分钟后正确地测定500nm的吸光度，得到试样反应液的吸光度或空白反应液的吸光度。使用以下的式(2)，由所得到的吸光度算出过氧化物值。
过氧化物值(meq/kg)＝30.70×(A1-A0)+0.1578…(2)
式中，A1表示试样反应液的吸光度，A0表示空白反应液的吸光度。
式(2)由对于氧化后的大豆油测定过氧化物值(基准油脂分析试验法2.5.2.1-2013)的结果与通过上述的硫氰酸铁法得到的吸光度(A1-A0)的相关求出。
另外，吸光度测定中使用了紫外可见分光光度计V-560型(日本分光(株))。使用光路长为10mm的石英池，以氯仿/甲醇溶液作为对照。
(2)共轭二烯酸
按照日本油化学会(JOCS)制定基准油脂分析试验法2013版参1.14测定。
(3)茴香胺值
按照日本油化学会(JOCS)制定基准油脂分析试验法2013版2.5.3来决定。
(4)铁含量分析
原料组合物及含游离LC-PUFA组合物的铁含量通过基于以下的条件的原子吸光分析(石墨炉法)求出。
称量1g的原料组合物或含游离LC-PUFA组合物，添加硝酸0.15mL(有害金属测定用、和光纯药工业(株))后，通过甲基异丁基酮(原子吸光分析用、和光纯药工业(株))定容成10mL而制成试样液。
标准试样设定为Conostan S-21(10ppm(Wt.))。将该标准试剂在甲基异丁基酮中稀释，调整标准曲线试样(0μg/L、10μg/L、20μg/L)。
对于使用试样液、及标准试样的分析装置的利用石墨炉法的铁定量，在以下的分析条件下进行原子吸光分析，通过利用装置附带的软件的自动计算对试样液的铁含量进行定量。
装置Z-2000“塞曼原子吸光光度计”((株)日立制作所)
注入量20μL
测定模式石墨雾化器/自动进样器
测定元素Fe
石墨管Pyro tube HR
测定波长(nm)248.3
测定信号BKG修正
狭缝宽度(nm)0.2
时间常数(s)0.1
灯电流(mA)12.5
加热控制方法光温度控制
温度程序
1干燥80℃―140℃升温时间40秒保持时间0秒气体流量200mL/分钟
2灰化1000℃升温时间20秒保持时间0秒气体流量200mL/分钟
3原子化2400℃升温时间0秒保持时间5秒气体流量30mL/分钟
4清洁2700℃升温时间0秒保持时间4秒气体流量200mL/分钟
5冷却0℃升温时间0秒保持时间10秒气体流量200mL/分钟
由所定量的试样液的铁含量通过以下的式(3)算出原料组合物或含游离LC-PUFA组合物的铁含量。
铁含量[ppm]＝C/(W×100)…(3)
(式中，C是指通过原子吸光分析得到的试样液的铁含量(μg/L)，W是指原料组合物或含游离LC-PUFA组合物的采集量(g)。)
(5)脂肪酸组成
原料组合物及含游离LC-PUFA组合物的脂肪酸组成通过利用基于以下的条件的气相色谱法得到的各脂肪酸峰求出。另外，对于含游离LC-PUFA组合物，在气相色谱法测定前进行甲基酯化。甲基酯化依据American Oil Chemists’Society(AOCS)Official Method Ce1b-89进行。
-气相色谱法分析条件-
机种Agilent7890GC system(Agilent社)
柱DB-WAX(Agilent Technologies、30m×0.25mm ID、0.25μm film thickness)J&W122-7032
柱烘箱180℃-3℃/min-230℃(25min)
注入温度250℃
注入方法分流
分流比30：1
检测器温度270℃
检测器FID
载气氦(1.0mL/min、恒定流量)
[表2]
[表3]
[评价3：固体化温度评价]
使用实施例2的DGLA2(DGLA95.8％、铁含量0.00ppm)作为基准游离DGLA组合物，如以下那样，评价将铁的含量变更时的固体化温度的变动。
(1)对含DGLA组合物的固体化温度的影响
相对于基准游离DGLA组合物，添加硫酸铁(II)·7水合物(Guaranteed，NacalaiTesque Inc.)的水溶液，制备铁的含量为10ppm的试样，进一步添加适量乙醇而均匀化后，通过抽真空将溶剂除去。对于所得到的铁含量10ppm的试样以基准含游离DGLA组合物稀释，分别制作0.05ppm、0.1ppm、1ppm的各浓度的游离DGLA试样。
对于各浓度试样，参考熔点(透明熔点、基准油脂分析试验法3.2.2.1-2013)的实验装置、器具，测定固定化温度。即，通过与熔点测定同样的装置在毛细管中加入1cm左右液油，每分钟每0.5℃使冷却温度降低，以毛细管的液油发生白浊的温度作为固体化的温度。将结果示于表4中。
(2)对肥皂水的固体化温度的影响
使用上述(1)的评价中使用的基准游离DGLA组合物，制备游离DGLA的5％肥皂水及10％肥皂水而测定结晶化或固体化而白浊的温度。5％肥皂水是添加0.5g的基准游离DGLA组合物、0.15g的48％氢氧化钠水溶液、9.35g的精制水而混合至变得均匀而制备。10％肥皂水是添加1.0g的基准游离DGLA组合物、0.30g的48％氢氧化钠水溶液、8.70g的精制水而混合至变得均匀。任一肥皂水全部为pH12以上的强碱性。
固体化的温度的测定通过与上述(1)相同的方法测定。将结果示于表4中。
[表4]
如表4中所示的那样，暗示了在游离DGLA试样、各浓度肥皂水的任一者中，通过所包含的铁的含量的增加而固体化温度上升，变得容易凝固。认为特别是在肥皂水中，与游离DGLA试样相比，伴随着铁的含量而固体化温度大大上升。由此暗示了，通过固体化温度的上升，对配管堵塞、或各制品处方中的加工时的处理有影响。
[评价4：膜评价]
使用实施例2的DGLA2(DGLA为95.7重量％、铁含量为0.00ppm)作为基准游离DGLA组合物，如以下那样进行膜评价试验。将其结果示于表5中。
<试验方法>
在温度25℃、1个大气压、相对湿度55％的条件下，将后述的试验用圆形框(参照图1)浸在脂肪酸试验液(基准液或试验液)中后，慢慢地拿起到液面上而使通过多个内框形成的分区内形成膜，使用秒表测定所形成的至少一个膜破裂为止所需要的时间(保持时间)。将结果示于表5中。作为其中使用的脂肪酸试验液，使用了以下的基准液或试验液。对于测定中使用的试验用圆形框，准备以下的试验用圆形框。
<试验液的制备>
基准液
将硫酸铁(II)·7水合物(Guaranteed、Nacalai Tesque Inc.)的水溶液按照铁含量成为100ppm的方式添加到实施例2的DGLA2中，进一步添加适量的乙醇而均匀化，通过抽真空将溶剂除去，制备含有100ppm的铁的DGLA2。将0.5g的该含有100ppm的铁的DGLA2、0.15g的48重量％氢氧化钠与9.35g的精制水混合，得到来源于实施例2的DGLA2、且水溶液中包含5.1重量％的DGLA钠的水溶液。以所得到的水溶液作为“基准液”。
试验液
将上述得到的相对于DGLA2含有100ppm的铁的基准液分别按照铁含量成为0.05ppm、0.1ppm、及1.0ppm的方式使用实施例2的DGLA2稀释，制备以各种含量包含铁的DGLA2。将0.5g的所得到的各DGLA2、0.15g的48重量％氢氧化钠与9.35g的精制水混合而制备包含5.1重量％的DGLA钠的试验用的水溶液，作为成为评价用试样的“试验液”。
<试验用圆形框的准备>
准备在直径为64mm、内径为52mm、厚度为3mm的外框内通过厚度为2mm的4个内框而具有一个大分区和4个小分区的塑料制的试验用圆形框(参照图1)。
[表5]
如表5中所示的那样，获知根据测定试样中的铁的含量而保持时间发生变动，组合物中的铁含量对膜的保持造成影响。
2015年8月31日申请的日本专利申请第2015-170856号的公开其整体通过参照纳入本说明书中。
本说明书中记载的全部文献、专利申请、及技术标准与具体且分别记载各个文献、专利申请、及技术标准通过参照纳入的情况相同程度地援引而纳入本说明书中。

Claims (16)

1.一种含游离多元不饱和脂肪酸组合物，其包含含量为组合物中的脂肪酸的80.0％以上的至少一种碳原子数为20以上的游离多元不饱和脂肪酸，且所述含游离多元不饱和脂肪酸组合物中金属的总含量为0.1ppm以下。
2.根据权利要求1所述的含游离多元不饱和脂肪酸组合物，其中，
过氧化物值为5.0meq/kg以下。
3.根据权利要求1或2所述的含游离多元不饱和脂肪酸组合物，其中，
共轭不饱和脂肪酸的含量为组合物中的脂肪酸的1.2％以下。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的含游离多元不饱和脂肪酸组合物，其中，
茴香胺值为5.0以下。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的含游离多元不饱和脂肪酸组合物，其中，
共轭不饱和脂肪酸的含量为组合物中的脂肪酸的0.001％～1.2％。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的含游离多元不饱和脂肪酸组合物，其中，
多元不饱和脂肪酸为选自由二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸、米德酸、二十碳四烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸及二十二碳六烯酸组成的组中的至少一个。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的含游离多元不饱和脂肪酸组合物，其中，
在使用含游离多元不饱和脂肪酸组合物而实施以下的膜评价试验的情况下，在将使用基准液而形成的膜损坏为止的时间(秒)设为1时，使用由含游离多元不饱和脂肪酸组合物制备的试验液而形成的膜损坏为止的时间成为1.4以上：
<膜评价试验>
在温度25℃、1个大气压、相对湿度55％的条件下，将具有多个内框的试验用圆形框浸在脂肪酸试验液(基准液液或试验液)中后，拿起到液面上而在通过多个内框形成的分区内形成膜，测定所形成的至少一个膜破裂为止所需要的时间(秒)，
<试验液的制备>
基准液
将硫酸铁(II)·7水合物的水溶液按照铁浓度成为100ppm的方式添加到游离多元不饱和脂肪酸组合物中，接着在添加乙醇而均匀化后将溶剂通过抽真空而除去，制备组合物中含有100ppm的铁的游离多元不饱和脂肪酸组合物；将含有100ppm的铁的含游离多元不饱和脂肪酸组合物0.5g、48重量％氢氧化钠0.15g、及精制水9.35g混合，制备水溶液中包含约5重量％的游离多元不饱和脂肪酸钠的水溶液，以所得到的水溶液作为基准液，
试验液
将含游离多元不饱和脂肪酸组合物0.5g、48重量％氢氧化钠0.15g、及精制水9.35g混合，制备水溶液中包含约5重量％的游离多元不饱和脂肪酸钠的水溶液，以所得到的水溶液作为试验液，
<试验用圆形框的准备>
以塑料制的用具作为试验用圆形框，所述用具在直径为64mm、内径为52mm、厚度为3mm的外框内通过厚度为2mm的内框而具有5个分区。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的含游离多元不饱和脂肪酸组合物，其中，
金属为铁。
9.一种含游离多元不饱和脂肪酸组合物的制造方法，其包括以下步骤：
准备包含至少一种碳原子数为20以上的多元不饱和脂肪酸的原料组合物；
对于将所准备的原料组合物、低级醇、金属的总含量为0.01ppm以下的水、及碱催化剂组合而制备的反应液，进行水解处理；以及
将水解处理后的反应组合物与金属的接触按照每1g的组合物和金属的接触表面积[cm2]与接触时间[天]的积T[cm2×天]成为100以下的方式限制。
10.根据权利要求9所述的制造方法，其中，
每1g的组合物和金属的接触表面积[cm2]与接触时间[天]的积T[cm2×天]为80以下。
11.根据权利要求9或10所述的制造方法，其中，
原料组合物中的碳原子数为20以上的游离多元不饱和脂肪酸的含量为组合物中的脂肪酸的80.0％以上。
12.根据权利要求9～11中任一项所述的制造方法，其中，
在10℃以下的温度条件下进行水解处理。
13.根据权利要求9～12中任一项所述的制造方法，其中，
水解处理中使用的水的铁含量为0.01ppm以下。
14.根据权利要求9～13中任一项所述的制造方法，其中，
原料组合物中的多元不饱和脂肪酸为多元不饱和脂肪酸烷基酯。
15.根据权利要求9～14中任一项所述的制造方法，其中，
原料组合物为来源于微生物原料的组合物。
16.一种含游离多元不饱和脂肪酸组合物的保存方法，其中，
将包含含量为组合物中的脂肪酸的80.0％以上的至少一种碳原子数为20以上的游离多元不饱和脂肪酸的含游离多元不饱和脂肪酸组合物，在按照每1g的组合物和金属的接触表面积[cm2]与接触时间[天]的积T[cm2×天]成为100以下的方式限制与金属的接触的条件下保持。
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