CN107917983B - 一种快速检测烟气体内代谢标志物的分析方法 - Google Patents
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Abstract
一种快速检测烟气体内代谢标志物的分析方法，包括烟气样品净化富集前处理和分析检测两部分，所述代谢物为4‑（甲基亚硝胺基）‑1‑（3‑吡啶基）‑1‑丁醇（NNAL），其特征在于：先将代谢物采用β‑葡萄糖醛酸酶反应器进行水解后，再使用纳升级液相色谱‑质谱进行分析检测。本发明的创新点在于：酶反应器在线制备，水解效果更好，且可简化实验步骤，提高分析速度与分析灵敏度。首次将纳升液相色谱串联质谱应用于烟气代谢物领域。实验所需样品量极少，纳升级流速条件下，仅需要微纳克级样品，可以实现高灵敏检测与高通量分析。
Description
技术领域
本发明涉及烟气体内代谢标志物的检测方法，属于分析检测技术领域，具体是一种快速检测烟气体内代谢标志物的分析方法，所述代谢物为4-（甲基亚硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁醇（NNAL）。
背景技术
4-(甲基亚硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）是一种具有较高致癌活性的烟草特有N-亚硝胺（TSNAs），被国际癌症研究机构（IARC）列为一级致癌物。是尼古丁亚硝基化或微量烟碱亚硝基化形成的一种烟气致癌物，其在细胞色素P450酶和谷胱甘肽转硫酶调控下的体内代谢产物4-（甲基亚硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁醇（NNAL）及其糖苷态衍生物NNAL-Glucs 是研究NNK在人体内代谢过程中致毒与解毒机制中非常有价值的生物标志物。4-（甲基亚硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁醇是4-(甲基亚硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮的主要代谢物，并且具有和4-(甲基亚硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮相似的致癌活性。
人体体液中烟气代谢标记物的分析方法主要包括样品净化富集前处理和检测两部分。随着样品前处理技术微型化发展，固相微萃取和液相微萃取技术常被用于净化和富集生物样品中的低浓度目标物，具有很高的富集倍数。目前采用多种前处理方法进行富集水解后经常规液质联用分离分析。烟气体内代谢物总NNAL的分析需要在富集净化步骤前首先将其糖苷衍生物进行去糖基化，从而得到游离态的NNAL。该过程通常由β-葡萄糖醛酸酶对其进行水解完成。但是传统的酶水解反应耗时较长（16-24h），水解效率较低，现有技术中代谢物的水解与富集过程依然需要离线操作，多步样品处理易造成样品损失污染，且操作繁琐、耗时较长，严重阻碍了烟气代谢物的高通量分析。
常检测方法主要有气相色谱热能分析仪法（GC-TEA）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）、高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）。气相色谱热能分析法具有选择性好和灵敏度高的优点，但它对N-亚硝基类化合物均有响应的局限性，因此对共流出的化合物无法区分；气相色谱-质谱联用技术是一种比较成熟的分离检测方法，它结合了气相色谱高分离效能和质谱选择性高、检测灵敏度高、提供丰富的结构信息的特点于一体逐渐成为微量痕量分析的重要检测手段之一，但该技术难以分析高沸点化合物。液相色谱串联质谱（HPLC-MS-MS）技术是20世纪80年代发展起来的一种分析检测技术。它将液相色谱的高分离度与质谱的高选择性、高灵敏度相结合，可以同时得到分析物在色谱柱上的保留时间、分子量及结构碎片等信息，是对复杂样品、未知样品及痕量物质定性定量有效的研究手段，现已广泛应用于代谢组学、脂质组学、蛋白组学等多组学以及代谢物鉴定、药代动力学、多残留分析、违禁添加物等有机化合物的精确定性定量分析。但常规液质分析方法，灵敏度仍有限，这也是限制烟气代谢物高灵敏分析的重要因素之一。纳升级液相色谱串联质谱技术具有无分流进样、样品损失小、精确稳定的流速控制、灵敏度高等优点，已将液质分析拓展应用至微量代谢靶分子、致病蛋白分子的检测分析。但目前为止，采用纳升液相色谱串联质谱分析技术烟气体内代谢物尚未见报道。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的提供一种用于烟气体内代谢物快速高灵敏检测的分析方法，通过该方法可简化实验步骤，提高分析速度与分析灵敏度。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
首先将代谢物采用β-葡萄糖醛酸酶反应器进行水解后，使用纳升级液相色谱-质谱进行分析检测。
本发明通过以下技术方案实现：一种快速检测烟气体内代谢标志物的分析方法，包括烟气样品净化富集前处理和分析检测两部分，所述代谢物为4-（甲基亚硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁醇（NNAL），其特征在于：先将代谢物采用在线制备的β-葡萄糖醛酸酶反应器进行水解后，再使用纳升级液相色谱-质谱进行分析检测，具体步骤如下：
1、首先制备β-葡萄糖醛酸酶反应器，具体方法如下：
（1）整体柱基质的制备：
A、将300 μL甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）、100 μL三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸脂（TRIM）涡旋混合均匀；将850μL环己醇与150μL十二醇混合均匀；取250 μL上述GMA-TRIM混合液加入750μL的环己醇-十二醇混合液中；
B、称取10 mg的偶氮二异丁腈（AIBN）溶于上述溶液，超声脱气20min，涡旋10min至澄清透明，将其注入管壁活化后的毛细管柱中，用硅胶塞封住两端，50℃恒温水浴锅中反应24h；
C、用甲醇冲洗柱中未反应完的溶剂后采用超纯水冲洗，使用5mM醋酸铵缓冲溶液冲洗；
（2） β-葡萄糖醛酸酶的修饰：将100 U/mL-25000 U/mL β-葡萄糖醛酸酶溶液通入上述（1）所制备的有机聚合物整体柱中，使整体柱基质上的环氧基与β-葡萄糖醛酸酶的氨基一步反应完成酶的固定化；
2、烟气代谢物的水解
将浓度为0.05-1.0mg.mL-1的底物4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇-β-O-葡萄糖醛酸钠盐（NNAL-O-Gluc）以0.1-1.0 μL/min的流速流穿过步骤1制备的有机聚合物整体柱酶反应器，收集酶解液；
3、分析检测
将酶解液经过除盐、浓缩、复溶、超声、离心后，进行纳升级液相色谱质谱分析；
色谱条件如下：流动相A: 98%水:2%乙腈，0.1%甲酸； 流动相B: 98%乙腈-2%水，0.1%甲酸；色谱柱型号：3C18-CL-120 (3 μm particle，120 Å, 0.075×150 mm）；柱温：21°C；流速：300 nL/min；进样体积：8μL；梯度洗脱；梯度洗脱条件如下表所示：
质谱条件如下：离子源电压为2300V；离子源温度为110℃；雾化气为6psi，辅助加热气为0psi，气帘气为30psi；去簇电压为80V，碰撞电压为10V；4-（甲基亚硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁醇（NNAL）的去簇电压：70V；碰撞电压：45V；碰撞电压差：5V；其糖苷衍生物4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇-β-O-葡萄糖醛酸钠盐的去簇电压为70V；碰撞电压：60V；碰撞电压差：10V。
本发明的创新点在于：简化实验步骤，提高分析速度与分析灵敏度。首次将纳升液相色谱串联质谱应用于烟气代谢物领域。实验所需样品量极少，纳升级流速条件下，仅需要微纳克级样品，可以实现高灵敏检测与高通量分析。酶经过固定后，具有酶与底物的比例高，酶解后无需分离酶和底物、能够显著减少酶之间的接触、防止其自降解的优势，与传统的自由溶液相比，固定化酶反应器具有酶解快速，酶解效率高，酶活性高，简单易操作、能够与多种检测方式联用等优点。本发明采用共价键合法将β-葡萄糖醛酸酶一步键合在有机聚合物整体柱上，可以使酶的流失减小到最低，酶能够在极性溶剂中使用，不会因为底物和盐的存在而发生流失。酶固定后具有更高的稳定性。
附图说明
图1 有机聚合物整体柱扫描电镜图，
图2 有机聚合物整体柱及β-葡萄糖醛酸酶反应器的热重图，
图3 有机聚合物整体柱及β-葡萄糖醛酸酶反应器的差示扫描量热图，
图4 0.1mg.mL-1 NNAL-O-Gluc水解产物NNAL与未水解底物的提取离子流图，
图5 0.1mg.mL-1 NNAL-O-Gluc水解产物NNAL的一级质谱图，
图6 0.1mg.mL-1 NNAL-O-Gluc水解产物NNAL的二级质谱图，
图7 0.05mg.mL-1 NNAL-O-Gluc水解产物NNAL的二级质谱图，
图8 0.2mg.mL-1 NNAL-O-Gluc水解产物NNAL的二级质谱图，
图9 0.5mg.mL-1 NNAL-O-Gluc水解产物NNAL的二级质谱图，
图10 1.0mg.mL-1 NNAL-O-Gluc水解产物NNAL的二级质谱图，
图11 20ng.mL-1 NNAL标准品的二级质谱图。
具体实施方式
本发明结合一下实施例做进一步描述，但并不限制本发明。
具体实施例1 β-葡萄糖醛酸酶反应器的制备
（1）取300μL GMA、100μL TRIM 于1.5mL离心管中，涡旋5min；
（2）取 850μL环己醇、150μL十二醇于1.5mL 离心管中涡旋5min；
（3）取250μL的GMA-TRIM溶液与750μL的环己醇-十二醇溶液混合;
（4）加入0.0100g的AIBN 溶于上述溶液，超声脱气20min，涡旋10min至澄清透明溶液，灌入管壁活化后的毛细管柱中，封住两端，50℃恒温水浴锅中聚合反应24h；之后用甲醇冲洗；
（5）用18.25 MΩ超纯水冲洗制备的多孔有机聚合物整体柱30min，pH试纸检测其pH值为中性；5mM醋酸铵缓冲溶液润洗多孔有机聚合物整体柱；
（6）在4℃下用一次性注射器将20μL浓度为2.18 mg.mL-1β-葡萄糖醛酸酶醋酸铵溶液，（5mM）24h内通入所制备的有机聚合物整体柱中，使整体柱基质上的环氧基与β-葡萄糖醛酸酶的氨基反应，制得固定化酶反应器。
由图1可看出，GMA-TRIM有机聚合物整体柱基质内部分布均匀且较为密集，有相当数量的孔，孔径充分大。由热重图（图2）可以看出，有机聚合物整体柱键合β-葡萄糖醛酸酶后，与GMA-TRIM有机聚合物整体柱相比，质量变化更明显。由差示扫描量热图（图3）可以看出，有机聚合物整体柱键合β-葡萄糖醛酸酶后，分别在251.3℃和476.9℃开始吸收热量，发生分解；GMA-TRIM有机聚合物整体柱，分别是359.1℃和678.5℃开始质量变化,说明该整体柱热稳定性良好。
实施例2 酶解液的收集及前处理
取10 μL浓度为0.05mg.mL-1、0.1mg.mL-1、0.2mg.mL-1、0.5mg.mL-1、0.8mg.mL-1、1.0mg.mL-1的底物NNAL-O-Glu 以0.6μL/min的流速流穿过有机聚合物整体柱酶反应器，1.5mL的离心管收集酶解液。同时配制浓度为0.05mg.mL-1、0.1mg.mL-1、0.2mg.mL-1、0.5mg.mL-1、0.8mg.mL-1、1.0mg.mL-1的自由水解液于1.5mL离心管中，将其置于37℃水浴中。24小时后，取出水浴锅中的自由水解液。
酶解液经过除盐、浓缩、1mL 0.1%甲酸-水复溶、超声15分钟，13300 rpm/min离心3次，10分钟/次。3000rmp/min涡旋5分钟，移液枪移取上清液，0.22μm有机相针式滤器过滤；采用发明内容中所述色谱与质谱条件进行Nano ESI -RPLC-Triple TOF -MS/MS 分析。根据产物液相色谱质谱结果的一级与二级谱图（图4-10），结合NNAL（图11）标准品进行对比，可以说明固定化酶反应器对底物溶液水解效果较好。不同浓度NNAL-O-Gluc经β-葡萄糖醛酸酶反应器水解后的液质结果如表1所示。
以上不同浓度NNAL-O-Gluc经过β-葡萄糖醛酸酶反应器水解、冻干等前处理后进纳升液质检测，其产物NNAL的峰强度及峰面积随着底物浓度的增大而减小。结果表明固定化β-葡萄糖醛酸酶反应器对低浓度的底物酶解效果较好。
Claims (1)
1.一种快速检测烟气体内代谢标志物的分析方法，包括烟气样品净化富集前处理和分析检测两部分，所述代谢标志物为4-（甲基亚硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁醇（NNAL），其特征在于：先将代谢标志物采用在线制备的β-葡萄糖醛酸酶反应器进行水解后，再使用纳升级液相色谱-质谱进行分析检测，具体步骤如下：
1）首先制备β-葡萄糖醛酸酶反应器，具体方法如下：
（1）整体柱基质的制备：
A、将300 μL甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）、100 μL三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸脂（TRIM）涡旋混合均匀；将850μL环己醇与150μL十二醇混合均匀；取250 μL 的GMA-TRIM混合液加入750μL的环己醇-十二醇混合液中；
B、称取10 mg的偶氮二异丁腈（AIBN）溶于上述混合液，超声脱气20min，涡旋10min至澄清透明，将其注入管壁活化后的毛细管柱中，用硅胶塞封住两端，50℃恒温水浴锅中反应24h；
C、用甲醇冲洗柱中未反应完的溶剂后采用超纯水冲洗，使用5mM醋酸铵缓冲溶液冲洗；
（2） β-葡萄糖醛酸酶的修饰：将100 U/mL-25000 U/mL β-葡萄糖醛酸酶溶液通入上述（1）所制备的有机聚合物整体柱中，使整体柱基质上的环氧基与β-葡萄糖醛酸酶的氨基一步反应完成酶的固定化；
2）烟气代谢物的水解
将浓度为0.05-1.0mg.mL-1的底物4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇-β-O-葡萄糖醛酸钠盐（NNAL-O-Gluc）以0.1-1.0 μL/min的流速流穿过步骤1）制备的有机聚合物整体柱酶反应器，收集酶解液；
3）分析检测
将酶解液经过除盐、浓缩、复溶、超声、离心后，进行纳升级液相色谱质谱分析；
色谱条件如下：流动相A: 98%水:2%乙腈，0.1%甲酸； 流动相B: 98%乙腈-2%水，0.1%甲酸；色谱柱型号：3C18-CL-120；柱温：21°C；流速：300 nL/min；进样体积：8μL；梯度洗脱条件：0-0.1min，95%A∶5%B；0.1-5.0min，85%A∶15%B；5.0-8.0min，10%A∶90%B；8.0-8.1min，10%A∶90%B；8.1-10min，95%A∶5%B；
质谱条件如下：离子源电压为2300V；离子源温度为110℃；雾化气为6psi，辅助加热气为0psi，气帘气为30psi；去簇电压为80V，碰撞电压为10V；4-（甲基亚硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁醇（NNAL）的去簇电压：70V；碰撞电压：45V；碰撞电压差：5V；其糖苷衍生物4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇-β-O-葡萄糖醛酸钠盐的去簇电压为70V；碰撞电压：60V；碰撞电压差：10V。
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