CN1704405A - 一种分析与分离制备石杉碱甲和石杉碱乙的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种分析和分离制备石杉碱甲和石杉碱乙的方法。本发明的分析方法选用非烷基键合相硅胶介质为色谱柱填料，用高效液相色谱法测定样品中石杉碱甲和石杉碱乙的含量，具有简单快速、分辨率好、灵敏度高等特点，可用于分离制备石杉碱甲和石杉碱乙时中间产物的含量分析和成品的质量控制。本发明分离制备的方法包括采用非烷基键合相硅胶介质作为色谱柱填料进行柱层析分离石杉碱甲和石杉碱乙的步骤，工艺实施方法为：原料粉碎浸泡→大孔吸附树脂富集浓缩→反相柱层析→非烷基键合相硅胶介质柱层析→浓缩结晶→成品，最后可获得纯度＞98％的石杉碱甲和石杉碱乙，本发明工艺简单，效率高，所用资源可再生利用，大大降低了生产成本和社会成本。

Description

一种分析与分离制备石杉碱甲和石杉碱乙的方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域以及一种中药提取方法，具体涉及分析与分离制备石杉碱甲和石杉碱乙的方法。

背景技术

石杉碱甲是从中药石杉属植物千层塔中分离出的新生物碱，它是一种强效、可逆和高选择性乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂，属第二代AChE抑制剂，也是目前国内开发最为成功的治疗阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD，又被称为老年性痴呆症)的药物，在国内已作为治疗AD的药物应用于临床，在美国被FDA批准作为食品添加剂或营养保健品用于改善记忆力。另外，千层塔中尚含有其它具较强AChE抑制活性的生物碱，其中以石杉碱乙最具代表性，且其含量仅次于石杉碱甲。由于石杉碱乙和石杉碱甲结构相似，因此成为石杉碱甲生产中最难分离的物质，石杉碱乙的AChE抑制活性虽为石杉碱甲的十分之一，但由于它具有更长的活性持续时间，因此能表现出更高的治疗指数。

已报道的相关分析方法主要集中于用高效液相色谱法测定石杉碱甲，色谱柱的填料均采用十八烷基键合相硅胶，由于石杉碱甲分子中的基团与固定相中未全封闭的硅羟基的吸附，因此导致峰拖尾严重、灵敏度低、重复性差等问题。利用在流动相中添加有机胺、离子对试剂及采用梯度洗脱、提高柱温等方法能在一定程度上解决上述问题，但增加了分析的复杂性，同时也使分析方法受到了仪器条件的限制。另外目前的高效液相色谱分析方法很少涉及石杉碱乙的定量分析。

目前对分离制备石杉碱甲的方法主要是传统的溶剂萃取结晶法，或者同时结合以硅胶为填料的正相柱层析及正相高效液相色谱法，这些方法需要消耗大量如氯仿、***、丙酮等有毒有害溶剂，而且繁琐费时、收率低，均在万分之一以下。同时，生产中石杉碱乙被作为杂质除去，使石杉碱乙得不到有效回收利用，造成资源的浪费。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便而准确的分析石杉碱甲和石杉碱乙含量的方法，并克服现有分离制备石杉碱甲工艺中存在的大量消耗有毒有害有机溶剂，工艺周期长，收率低，有效成分如石杉碱乙被抛弃等缺陷，从而提供一种利用层析集成技术，使用低毒的有机溶剂，高效分离提纯石杉碱甲和石杉碱乙的方法，以获得高纯度和高回收率的石杉碱甲和石杉碱乙纯品。

本发明的目的是通过以下的技术方案实现的：

本发明提供的制备石杉碱甲和石杉碱乙的方法，其特征在于包括采用非烷基键合相硅胶介质作为色谱柱填料进行柱层析分离石杉碱甲和石杉碱乙的步骤。

所述的非烷基键合相硅胶介质指以硅胶为基质的表面键合非烷基基团的介质；所述的非烷基基团包括苯基、五氟苯基、腈基和酚基。

本发明提供的制备石杉碱甲和石杉碱乙的方法，其特征在于：将非烷基键合相硅胶介质装柱，千层塔原料经浸泡提取、富集浓缩、提纯后进料，用一定浓度的有机溶剂水溶液洗脱，分别收集石杉碱甲和石杉碱乙所在洗脱峰的洗脱液，两种洗脱液分别结晶、干燥后得到石杉碱甲和石杉碱乙成品。所述有机溶剂的水溶液为浓度20～100％(v/v)的甲醇、乙醇或丙酮的水溶液。

本发明提供的从原料中浸泡提取石杉碱甲和石杉碱乙的方法为：将原料千层塔粉碎后，用0.1％～2％(v/v)硫酸或硝酸的水溶液浸泡提取，得到千层塔浸出液。

本发明提供的石杉碱甲和石杉碱乙的富集浓缩的方法为：将千层塔浸出液用氨水、氢氧化钠或氢氧化钾调pH值为8～14后通过大孔吸附树脂柱进行吸附洗脱，洗脱液减压浓缩得到初分离产物。

本发明提供的石杉碱甲和石杉碱乙的提纯方法为：采用反相层析的方法，将以硅胶为基质的反相介质或以聚合物为基质的反相介质装柱，将初分离产物进料后，用5％～80％(v/v)甲醇、乙醇或丙酮的水溶液洗脱，收集石杉碱甲和石杉碱乙所在洗脱峰的洗脱液。其中以硅胶为基质的反相介质为市售的C8和C18反相介质，以聚合物为基质的反相介质包括以聚苯乙烯等为基质的反相介质。

本发明提供的分析石杉碱甲和石杉碱乙的方法，其特征在于包括采用非烷基键合相硅胶介质为色谱柱填料进行色谱分析的步骤。

本发明提供的分析石杉碱甲和石杉碱乙的方法，其特征在于所述的非烷基键合相硅胶指以硅胶为基质的表面键合非烷基基团如苯基、五氟苯基、腈基和酚基的介质。

本发明提供的分析石杉碱甲和石杉碱乙的方法，其特征是样品配制成与分离体系相匹配的分析样品溶液，然后用高效液相色谱法(HPLC法)测定石杉碱甲和石杉碱乙的浓度，换算成样品中石杉碱甲和石杉碱乙的含量。

本发明提供的分析石杉碱甲和石杉碱乙的方法，色谱分析条件为柱温20～35℃，流动相为甲醇和水的体积比＝50∶50～90∶10，流速为0.5～2.0ml/min。待测试样品得以分离后，采用液相色谱紫外检测器测定石杉碱甲和石杉碱乙的峰面积，用标准曲线校正方程计算石杉碱甲和石杉碱乙的浓度，换算成样品中石杉碱甲和石杉碱乙的含量。

本发明与已有技术相比具有以下的优点：

1.CN1430059A公开了希普林及石杉碱甲血药浓度分析方法，在此方法中石杉碱乙作为内标物加入到样品中，用LC/MS/MS***进行分析，从专利附图3中可以看出石杉碱甲和石杉碱乙分离度低，峰扩展严重，且应用昂贵的LC/MS/MS***，不易在大多数分析实验室中实施；本发明分析石杉碱甲和石杉碱乙含量的方法利用了非烷基键合相硅胶为色谱柱填料的高效液相色谱法，具有简单快速、呈现性好、分辨率高、灵敏度高等特点，能排除其他物质对石杉碱甲及石杉碱乙的干扰，线性范围广，石杉碱甲和石杉碱乙的最小检出量分别为0.5和0.6ng。本发明对样品中石杉碱甲和石杉碱乙的回收率95％以上，RSD小于1.00％。

2.现有石杉碱甲的分离制备工艺如US5177082、CN1306960A、CN1448390A均采用传统的生物碱提取方法从浸出液中富集浓缩石杉碱甲，有机溶剂耗量大，过程繁琐费时，同时液液萃取方法由于易产生乳化现象，产物的损失非常严重，从而导致收率下降；本发明利用大孔吸附树脂吸附浸出液中的石杉碱甲和石杉碱乙，而大部分杂质由于不被吸附而在吸附和水洗过程中被除去，从而一步达到富集浓缩石杉碱甲和石杉碱乙的目的，效果与溶剂萃取相似，但耗时短，所用溶剂毒性小、用量少且产物收率高。

3.CN1448390A将萃取液干燥后得到浸膏，拌入硅胶并湿法装柱，用氯仿-甲醇进行梯度洗脱，过程的检测用薄层层析法，此工艺与CN1035503A、US5177082层析工艺相似，均为正相层析法，具有检测方法自动化程度低、洗脱液毒性大等缺点；本工艺采用中低压反相层析，可以用紫外在线检测，经大孔吸附树脂的初分离产物经此一步层析可将绝大部分杂质除去，得到石杉碱甲和石杉碱乙的混合物，洗脱液用甲醇、乙醇等毒性较小的溶剂的水溶液。

4.由于石杉碱乙和石杉碱甲的结构相似，采用常规的方法较难将两者分离，本发明采用制备色谱法，石杉碱甲和石杉碱乙的混合物在非烷基键合相硅胶介质上得到完全的分离并回收制得各自的产品，设备投资低，处理量大。

5.本发明所用层析介质如大孔吸附树脂、反相层析介质及非烷基键合相硅胶介质均可再生后重复使用；所用有机溶剂均可蒸发回收，从而降低生产成本。

6.现有生产工艺未提到石杉碱甲和石杉碱乙回收率，而以得率来表示，而原料千层塔由于来源不同，其石杉碱甲和石杉碱乙的含量差别较大，因此用得率无法体现工艺的适用性；本发明由于采用了一种简单快速的高效液相色谱方法分析原料、中间产物和产品中的石杉碱甲和石杉碱乙，从而可对中间产物和终产物的纯度和回收率进行检测，同时本发明利用层析集成技术，可从含量相差非常大的不同的千层塔原料中提取石杉碱甲和石杉碱乙，工艺具有较高的适用性，石杉碱甲和石杉碱乙的回收率分别可达85％和80％以上，纯度均为98％以上。

7.本发明工艺简单，效率高，生产周期短(小于7天)，成本低且环境污染小。

附图说明

图1为采用本发明的方法得到的千层塔浸出液，利用本发明提供的分析方法检测的HPLC图谱；

图2为采用本发明的方法得到的初分离产物，利用本发明提供的分析方法检测的HPLC图谱；

图3为采用本发明的方法，将初分离产物纯化后得到的石杉碱甲和石杉碱乙混合物，利用本发明提供的分析方法检测的HPLC图谱；

图4为采用非烷基键合相硅胶介质作为色谱柱填料进行柱层析得到的石杉碱甲溶液，利用本发明提供的分析方法检测的HPLC图谱；

图5为采用非烷基键合相硅胶介质作为色谱柱填料进行柱层析得到的石杉碱乙溶液，利用本发明提供的分析方法检测的HPLC图谱。

具体实施方式

本发明结合以下实施例作进一步描述，但并不限制本发明。

本发明分离制备石杉碱甲和石杉碱乙的工艺流程为：原料粉碎浸泡→大孔吸附树脂富集浓缩→反相柱层析→非烷基键合相硅胶介质柱层析→浓缩结晶→成品。其中每个步骤得到的产物均用本发明提供的分析方法检测石杉碱甲和石杉碱乙的含量。

实施例1、以含石杉碱甲0.053％，石杉碱乙0.013％的千层塔为原料，分离提纯制备99.1％的石杉碱甲和98.4％的石杉碱乙，过程采用高效液相色谱法分析石杉碱甲和石杉碱乙的含量。

样品的HPLC分析条件为：Waters Alliance 2695高效液相色谱仪，2996紫外二极管阵列检测器，色谱柱填料为苯基键合相硅胶Inertsil Ph-3，流动相甲醇∶水＝90∶10，进样量为20μl，流速1ml/min。

1)1公斤含石杉碱甲0.053％，石杉碱乙0.013％的干燥千层塔粉碎后，用10升0.1％硝酸浸泡24小时；倾出上层清液后，向残余物再加入5升0.1％硝酸浸泡12小时；过滤，用同样的酸液洗涤滤渣数次；合并滤液及洗涤液，得到浸出液约20升。HPLC分析结果表明浸出液中含520mg石杉碱甲和129mg石杉碱乙，浸出率分别为98.1％和99.2％；

2)浸出液用氢氧化钠调pH值为8，过滤，滤液通过南开大学化工厂生产的X-5树脂进行吸附；吸附完毕后用蒸馏水洗涤树脂，1％盐酸洗脱，减压浓缩所收洗脱液，得到初分离产物17.5g。初分离产物精密称定，用80％甲醇溶解后进样，测定其中石杉碱甲含量为2.92％，回收率为98.3％；石杉碱乙含量为0.72％，回收率为97.7％。

3)将C18反相介质装柱，用20％乙醇水溶液平衡；将步骤2)得到的初分离产物20％乙醇水溶液充分溶解后进料；用25～40％乙醇水溶液梯度洗脱；紫外在线检测，收集洗脱峰HPLC检测；减压浓缩石杉碱甲和石杉碱乙所在的洗脱液并回收溶剂，得到石杉碱甲和石杉碱乙混合物716mg，经HPLC测定其中石杉碱甲含量为68.2％，回收率为95.5％；石杉碱乙含量为16.6％，回收率94.3％。

4)将五氟苯基键合硅胶介质装柱，用30％的甲醇水溶液平衡；用30％甲醇水溶液将步骤3)得到的混合物充分溶解后进料，30％甲醇洗脱，紫外在线检测，收集洗脱峰得到石杉碱甲溶液；70％甲醇洗脱，收集洗脱峰得到石杉碱乙溶液。HPLC分析表明石杉碱甲溶液中含480mg石杉碱甲，回收率98.2％；石杉碱乙溶液中含114mg石杉碱乙，回收率95.6％。

5)分别减压浓缩步骤4)得到的石杉碱甲溶液和石杉碱乙溶液至有结晶析出，冷冻干燥，得475mg纯度为99.1％的石杉碱甲和110mg纯度为98.4％的石杉碱乙，回收率分别为98.1％和94.9％。

本工艺总回收率分别为石杉碱甲88.8％，石杉碱乙83.3％。

实施例2、以含石杉碱甲0.016％，石杉碱乙0.0033％的千层塔为原料，分离提纯制备98.5％的石杉碱甲和98.2％的石杉碱乙，过程采用高效液相色谱法分析石杉碱甲和石杉碱乙的含量。

样品的HPLC分析方法为：Beckman FL750高效液相色谱仪，紫外多波长检测器，色谱柱填料为五氟苯基键合相硅胶Curosil-PFP，流动相甲醇∶水＝70∶30，进样量为10μl，流速2ml/min。

1)将含石杉碱甲0.016％，石杉碱乙0.0033％的干燥千层塔粉碎后，用1％硫酸浸泡24小时；倾出上层清液后，向残余物再加入1％硫酸浸泡12小时；过滤，用同样的酸液洗涤滤渣数次；合并滤液及洗涤液，得到浸出液。

2)浸出液用氢氧化钠调pH值为10，过滤，滤液通过Romn Hass生产的XAD-4树脂进行吸附；吸附完毕后用蒸馏水洗涤树脂，50％丙酮洗脱，减压浓缩所收洗脱液，得到初分离产物。

3)将C8反相介质装柱，用10％乙醇水溶液平衡；将步骤2)得到的初分离产物10％乙醇水溶液充分溶解后进料；用50％乙醇水溶液洗脱；紫外在线检测，收集洗脱峰HPLC检测；减压浓缩石杉碱甲和石杉碱乙所在的洗脱液并回收溶剂，得到石杉碱甲和石杉碱乙混合物。

4)将腈基键合硅胶介质装柱，用40％的甲醇水溶液平衡；用40％甲醇水溶液将步骤3)得到的混合物充分溶解后进料，40％甲醇洗脱，紫外在线检测，收集洗脱峰得到石杉碱甲溶液；100％甲醇洗脱，收集洗脱峰得到石杉碱乙溶液。

5)分别减压浓缩步骤4)得到的石杉碱甲溶液和石杉碱乙溶液至有结晶析出，冷冻干燥，得纯度为98.5％的石杉碱甲和纯度为98.2％的石杉碱乙。

本工艺总回收率分别为石杉碱甲86.9％，石杉碱乙82.2％。

实施例3、以含石杉碱甲0.0035％，石杉碱乙0.0014％的千层塔为原料，分离提纯制备98.5％的石杉碱甲和98.1％的石杉碱乙，过程采用高效液相色谱法分析石杉碱甲和石杉碱乙的含量。

样品的HPLC分析方法为：Agilent 1100高效液相色谱仪，紫外多波长检测器，色谱柱填料为腈基键合相硅胶Lichrospher 100 CN，流动相甲醇∶水＝60∶40，进样量为20μl，流速0.5ml/min。

1)将含石杉碱甲0.053％，石杉碱乙0.013％的干燥千层塔粉碎后，用2％硫酸浸泡36小时；倾出上层清液后，向残余物再加入2％硫酸浸泡12小时；过滤，用同样的酸液洗涤滤渣数次；合并滤液及洗涤液，得到浸出液。

2)浸出液用氢氧化钠调pH值为14，过滤，滤液通过西安蓝深交换吸附材料有限公司生产的LSA-21树脂进行吸附；吸附完毕后用蒸馏水洗涤树脂，95％乙醇洗脱，减压浓缩所收洗脱液，得到初分离产物。

3)将Polyspher PST 10(MERCK，苯乙烯-二乙烯基苯共聚物)反相介质装柱，用30％甲醇水溶液平衡；将步骤2)得到的初分离产物30％乙醇水溶液充分溶解后进料；用80％甲醇水溶液洗脱；紫外在线检测，收集洗脱峰HPLC检测；减压浓缩石杉碱甲和石杉碱乙所在的洗脱液并回收溶剂，得到石杉碱甲和石杉碱乙混合物。

4)将苯基键合硅胶介质装柱，用60％的乙醇水溶液平衡；用60％乙醇水溶液将步骤3)得到的混合物充分溶解后进料，60％乙醇洗脱，紫外在线检测，收集洗脱峰得到石杉碱甲溶液；80％乙醇洗脱，收集洗脱峰得到石杉碱乙溶液。

5)分别减压浓缩步骤4)得到的石杉碱甲溶液和石杉碱乙溶液至有结晶析出，冷冻干燥，得纯度为98.5％的石杉碱甲和纯度为98.1％的石杉碱乙。

本工艺总回收率分别为石杉碱甲85.2％，石杉碱乙80.1％。

实施例4、以含石杉碱甲2.92％，石杉碱乙0.72％的大孔吸附树脂初分离产物为原料，用制备型高效液相色谱法分离制备石杉碱甲和石杉碱乙，样品的制备方法为：使用AKTA purifier 10层析***，紫外多波长检测器，色谱柱填料为酚基键合相硅胶，流动相甲醇∶水＝90∶10，流速5ml/min，将含石杉碱甲2.92％，石杉碱乙0.72％的大孔吸附树脂初分离产物进料后洗脱。收集石杉碱甲和石杉碱乙洗脱峰所在的洗脱液，洗脱液分别减压浓缩至有结晶析出，冷冻干燥，得到纯度为99.9％的石杉碱甲和99.8％的石杉碱乙。

本实施例中用到的有机溶剂都可以回收后再次循环使用。

Claims (12)

1.一种制备石杉碱甲和石杉碱乙的方法，其特征是包括采用非烷基键合相硅胶介质作为色谱柱填料进行柱层析分离石杉碱甲和石杉碱乙的步骤。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于：非烷基键合相硅胶指以硅胶为基质的表面键合非烷基基团如苯基、五氟苯基、腈基和酚基的介质。

3.权利要求1或2所述的方法，其特征在于：将非烷基键合相硅胶介质装柱，千层塔原料经浸泡提取、富集浓缩、提纯后进料，用一定浓度的有机溶剂水溶液洗脱，分别收集石杉碱甲和石杉碱乙所在洗脱峰的洗脱液，两种洗脱液分别结晶、干燥后得到石杉碱甲和石杉碱乙成品。

4.权利要求3所述的方法，其特征在于：所述有机溶剂的水溶液为浓度20～100％(v/v)的甲醇、乙醇或丙酮的水溶液。

5.权利要求3所述的方法，其特征是从原料中浸泡提取石杉碱甲和石杉碱乙的方法为：将原料千层塔粉碎后，用浓度为0.1％～2％(v/v)硫酸或硝酸的水溶液浸泡提取，得到千层塔浸出液。

6.权利要求3或5所述的方法，其特征是石杉碱甲和石杉碱乙的富集浓缩的方法为：将千层塔浸出液用氨水、氢氧化钠或氢氧化钾调pH值为8～14后通过大孔吸附树脂柱进行吸附洗脱，洗脱液减压浓缩得到初分离产物。

7.权利要求3或6的方法，其特征是石杉碱甲和石杉碱乙的提纯方法为：采用反相层析的方法，将以硅胶为基质的反相介质或以聚合物为基质的反相介质装柱，将初分离产物进料后，用5％～80％(v/v)甲醇、乙醇或丙酮的水溶液洗脱，收集石杉碱甲和石杉碱乙所在洗脱峰的洗脱液。

8.权利要求3或7所述的方法，其特征在于：所述的以硅胶为基质的反相介质为市售的C8和C18反相介质，以聚合物为基质的反相介质包括以聚苯乙烯等为基质的反相介质。

9.一种分析石杉碱甲和石杉碱乙的方法，其特征在于包括采用非烷基键合相硅胶介质为色谱柱填料进行色谱分析的步骤。

10.按权利要求9所述的方法，其特征在于：非烷基键合相硅胶指以硅胶为基质的表面键合非烷基基团如苯基、五氟苯基、腈基和酚基的介质。

11.权利要求9或10所述的方法，其特征是样品配制成与分离体系相匹配的分析样品溶液，然后用高效液相色谱法(HPLC法)测定石杉碱甲和石杉碱乙的浓度，换算成样品中石杉碱甲和石杉碱乙的含量。

12.按权利要求9、10或11所述的方法，其特征在于：色谱分析条件为柱温20～35℃，流动相为甲醇和水的体积比＝50∶50～90∶10(v/v)，流速为0.5～2.0ml/min，待测试样品得以分离后，采用高效液相色谱紫外检测器测定石杉碱甲和石杉碱乙的峰面积，用标准曲线校正方程计算石杉碱甲和石杉碱乙的浓度，换算成样品中石杉碱甲和石杉碱乙的含量。

Images