CN107904195A - 一株产果胶酶的海洋细菌及应用 - Google Patents

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Abstract

一株产果胶酶的海洋细菌及应用，涉及果胶酶。所述产果胶酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28。产果胶酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28在制备果胶酶的应用。将菌株从保种管中涂布于2216E平板上，纯化后，接入RO种子培养基中培养至对数生长期，得种子液；将种子液转接发酵培养基，培养后得发酵液；发酵液离心后，得上清液，即为果胶酶液。筛选的具有果胶酶生产能力的细菌，其在培养48h后，发酵液的果胶酶的酶活力可以达到120～160U/ml，具有良好的应用前景。

Description

一株产果胶酶的海洋细菌及应用
技术领域
本发明涉及果胶酶，尤其是涉及一株产果胶酶的海洋细菌及应用。
背景技术
果胶主要是直链α-1,4糖苷键连接的D-半乳糖醛酸残基组成的复合多糖，一般带有***糖、鼠李糖、木糖、海藻糖、乳糖等组成的侧链，游离的羧基部分或全部与钙、钾、钠离子，特别是与硼化物结合在一起，含有20种不同的糖苷键，是植物细胞壁和中胶层的重要组成部分。果胶酶是一类分解果胶质的酶的总称，是含有多种组分的复合酶。果胶酶广泛分布在高等植物和微生物中。该海洋细菌所能产生的果胶酶在食品等工艺上用途广泛，并对研究开发海洋生物资源具有重大意义。
本申请人在中国专利CN104388361A中公开一株产果胶酶的海洋细菌及其应用，涉及果胶酶。产果胶酶的海洋细菌(Gramella flavus)JLT2011，保藏中心登记入册编号为：CGMCC No.1.12375。产果胶酶的海洋细菌(Gramella flavus)JLT2011可在制备果胶酶中应用。果胶酶的制备方法如下：1)将菌株涂布于2216E培养基平板上，纯化后，接入种子培养基RO中，摇床培养至对数生长期，得种子液；2)将种子液转接发酵培养基，再摇床培养，得发酵液；3)将发酵液离心得上清液，即为果胶酶液。经试验，在培养48h后，发酵液的果胶酶的酶活力可以达到130～154U/ml，具有良好的应用前景。
发明内容
本发明的第一目的是提供产果胶酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28。
本发明的第二目的是提供产果胶酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28在制备果胶酶的应用。
本发明的第三目的在是提供果胶酶的制备方法。
所述产果胶酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28，已于2017年06月22日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏号为：CGMCC 1.15788。所述产果胶酶的海洋细菌Maribacter sp.T28为革兰氏阴性、好氧、杆状的海洋细菌。其基因组中编码的一个果胶裂解酶PL9，隶属碳水化合物活性酶(CAZyme)家族，起着将果胶裂解为寡聚糖的作用；降解蛋白 KdgF更是在随后的一系列转化到关键代谢物KDG的过程中起着重要作用。
所述产果胶酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28在制备果胶酶的应用。
所述果胶酶的制备方法包括以下步骤：
1)将菌株从保种管中涂布于2216E平板上，纯化后，接入RO种子培养基中培养至对数生长期，得种子液；
在步骤1)中，所述菌株为产果胶酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28；将菌株从保种管中取100μl涂布于2216E平板上，所述纯化可为2～3次；所述接入种子培养基RO中培养至对数生长期可在28℃，160rpm摇床培养24h至对数生长期；所述2216E培养基的配方可为：蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，柠檬酸铁0.1g，氯化钠19.45g，氯化镁5.98g，硫酸钠3.24g，氯化钙1.8g，氯化钾0.55g，碳酸钠0.16g，溴化钾0.08g，氯化锶34.0mg，硼酸22.0mg，硅酸钠4.0mg，氟化钠2.40mg，硝酸铵1.60mg，磷酸氢二钠8.0mg，蒸馏水1000g，pH7.6；所述 RO种子培养基的配方可为：蛋白胨1.0g，酵母膏1.0g，乙酸钠1.0g，氯化钠20.0g，氯化钾 0.3g，七水合硫酸镁0.5g，氯化铵0.3g，磷酸氢二钾0.3g，二水合氯化钙38.0mg，蒸馏水1000g，pH8.0。
2)将种子液转接发酵培养基，培养后得发酵液；
在步骤2)中，所述种子液的接种量可为0.2％；所述发酵培养基可为：果胶2.0g，酵母膏0.5g，氯化铵0.5g，海盐23.0g，Tris-HCl 50mM，蒸馏水1000g，pH 7.8；所述培养可在28℃，160rpm摇床培养48h。
3)发酵液离心后，得上清液，即为果胶酶液。
在步骤3)中，所述离心可为12000g×10min。
本发明筛选的具有果胶酶生产能力的细菌，其在培养48h后，发酵液的果胶酶的酶活力可以达到120～160U/ml，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是产果胶酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28的透射电子显微镜形态图。
图2为产果胶酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28基于16s rRNA序列，利用MEGA 6中的neighbour-joining,maximum-likelihood,即T28和其亲缘关系相近菌株之间的***发育树图。
图3为产果胶酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28的果胶降解实拍。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的详细描述。
1)目标菌的筛选
对来源于中国台湾龟山岛浅滩热液采集的表层海水样品进行微生物富集、初筛、复筛、筛选产果胶酶菌。
具体技术方案如下：
初筛：将中国台湾龟山岛浅滩热液采集的表层海水水样涂布于RO(蛋白胨1.0g，酵母膏1.0g，乙酸钠1.0g，氯化钠20.0g，氯化钾0.3g，七水合硫酸镁0.5g，氯化铵0.3g，磷酸氢二钾 0.3g，二水合氯化钙38.0mg，蒸馏水1000g，pH 8.0)。在30℃下培养14d，得到形态各异的单菌落，并纯化，用30％(v/v)甘油(1︰1；甘油：菌液)保存在-80℃。
复筛：将上述保种的细菌纯化接入30ml果胶液体培养基(果胶2.0g，酵母膏1.0g，乙酸钠1.0g，氯化铵0.5g，氯化钠20.0g，氯化钾0.3g，七水合硫酸镁0.5g，二水合氯化钙0.05g，蒸馏水1000g,pH 7.6)中,在28℃，160rpm摇床培养。分离能降解果胶的海洋细菌。
海洋细菌(Maribacter sp.)T28的筛选方法：从苹果果胶(Sigma)平板透明圈筛选，具体为配制0.2％的果胶固体培养基(果胶2.0g，酵母膏1.0g，乙酸钠1.0g，氯化铵0.5g，氯化钠 20.0g，氯化钾0.3g，七水合硫酸镁0.5g，二水合氯化钙0.05g，琼脂15.0g，蒸馏水1000g,pH 7.6)；添加10μl菌液，培养18～24h，得到菌落直径，再将1％的钌红原平板单菌落上，有透明光圈，比较透明光圈和原始菌落直径对比，确定有果胶降解酶活性的，最终确定菌株。
2)形态特征，生长条件以及***发育树分析研究表明，菌株T28具有以下特点：
菌株形态特征：革兰氏阴性菌，在2216E平板上培养3d后形成黄色、凸起、表面光滑、直径约为1～1.5mm的圆形菌落。在透射电子显微镜下观察，菌体呈杆状。
生长条件：严格好氧，最适生长温度为30℃，最适生长pH5～8，最适生长盐度0～5％。
***发育树分析：菌株T28的16s序列和全基因组已上传至NCBI，收录号分别为：KX022625和CP018760；根据16s***发育进化树分析T28与Maribacter arcticus的相似性最高，为97.7％。
3)产果胶酶细菌菌液的制备
将T28接种于液体培养基(果胶2.0g，酵母膏0.5g，氯化铵0.5g，海盐23.0g，Tris-HCl 50mM，蒸馏水1000g，pH 7.8)中，在28℃，160rpm摇床培养24h，获得种子培养液，将种子培养液按2％接种量接种于新鲜的液体培养基，于28℃，160rpm摇床培养48h，即可制得产果胶酶的细菌菌液。
4)果胶酶的制备
将上述的发酵菌液经高速离心获取上清液，此即为果胶酶酶液。
5)果胶酶活性的测定
果胶酶活单位：1g或1ml酶液在50℃、pH5.0的条件下，1h分解果胶产生的1mg半乳糖醛酸为一个酶活单位。
酶活测定采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法。酶反应体系为：1ml果胶酶液+1ml果胶底物(磷酸-柠檬酸缓冲液pH5.0)。酶活测定过程：将反应体系混合均匀立即在50℃水浴中准确反应30min；加入2ml DNS试剂混匀后立即放入沸水水浴5min,取出，立即用流动冷水冷却；以半乳糖醛酸的标准曲线为对照，于540nm处测定吸光值。经沸水浴预处理10min的失活酶液作为酶活测定的阴性对照。
结果表明，48h测得的酶活力为120～160U/ml。

Claims (10)

1.一株产果胶酶的海洋细菌，其特征在于所述产果胶酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28，已保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号分别为：CGMCC1.15788。
2.如权利要求1所述一株产果胶酶的海洋细菌，其特征在于所述产果胶酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28为革兰氏阴性、好氧、杆状的海洋细菌；其基因组中编码的一个果胶裂解酶PL9，隶属碳水化合物活性酶家族，将果胶裂解为寡聚糖的作用。
3.产果胶酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28在制备果胶酶的应用。
4.如权利要求1所述一株产果胶酶的海洋细菌，其特征在于所述果胶酶的制备方法包括以下步骤：
1)将菌株从保种管中涂布于2216E平板上，纯化后，接入RO种子培养基中培养至对数生长期，得种子液；
2)将种子液转接发酵培养基，培养后得发酵液；
3)发酵液离心后，得上清液，即为果胶酶液。
5.如权利要求4所述一株产果胶酶的海洋细菌，其特征在于在步骤1)中，所述菌株为产果胶酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28；将菌株从保种管中取100μl涂布于2216E平板上，所述纯化为2～3次。
6.如权利要求4所述一株产果胶酶的海洋细菌，其特征在于在步骤1)中，所述接入种子培养基RO中培养至对数生长期是在28℃，160rpm摇床培养24h至对数生长期；所述2216E培养基的配方为：蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，柠檬酸铁0.1g，氯化钠19.45g，氯化镁5.98g，硫酸钠3.24g，氯化钙1.8g，氯化钾0.55g，碳酸钠0.16g，溴化钾0.08g，氯化锶34.0mg，硼酸22.0mg，硅酸钠4.0mg，氟化钠2.40mg，硝酸铵1.60mg，磷酸氢二钠8.0mg，蒸馏水1000g，pH7.6。
7.如权利要求4所述一株产果胶酶的海洋细菌，其特征在于在步骤1)中，所述RO种子培养基的配方为：蛋白胨1.0g，酵母膏1.0g，乙酸钠1.0g，氯化钠20.0g，氯化钾0.3g，七水合硫酸镁0.5g，氯化铵0.3g，磷酸氢二钾0.3g，二水合氯化钙38.0mg，蒸馏水1000g，pH8.0。
8.如权利要求4所述一株产果胶酶的海洋细菌，其特征在于在步骤2)中，所述种子液的接种量为0.2％。
9.如权利要求4所述一株产果胶酶的海洋细菌，其特征在于在步骤2)中，所述发酵培养基为：果胶2.0g，酵母膏0.5g，氯化铵0.5g，海盐23.0g，Tris-HCl 50mM，蒸馏水1000g，pH7.8；所述培养可在28℃，160rpm摇床培养48h。
10.如权利要求4所述一株产果胶酶的海洋细菌，其特征在于在步骤3)中，所述离心为12000g×10min。
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