KR20210028140A - 삼중특이성 항원 결합 단백질 - Google Patents

삼중특이성 항원 결합 단백질 Download PDF

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레오나르도 보라스
도미닉 에셔
크리스티안 발데마르 빈지 레이스너
파비안 셰이펠레
토마스 셰이에르
필립 로버트 리히레
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Abstract

종양 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인; 상기 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인; 및 면역 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제3 결합 도메인을 포함하는 삼중 특이성 항원 결합 단백질이 제공된다. 삼중 특이성 항원 결합 단백질을 제조하는 방법이 제공된다.

Description

삼중특이성 항원 결합 단백질
본 개시내용은 삼중 특이성 항원 결합 단백질을 제조하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
이중 특이성 T 세포 관여항체(bispecific T cell engager)는 CD3을 통해 T 세포를 활성화시키고, 이들을 면역 시냅스 형성 및 종양 세포 용균을 유도하는 종양 발현 항원에 가교 결합시킨다. 이중 특이성 T 세포 관여항체는 액형 종양을 갖는 환자에서 치료 효능을 나타내지만, 이들이 모든 환자에서 도움이 되는 것은 아니다. 항종양 면역력은 PD-1/PD-L1 경로 매개 면역 억제에 의해 제한되며, 기존의 이중 특이성 T 세포 관여항체가 도움이 되지 않은 환자는 이들 T 세포가 PD-1/PD-L1 경로를 통해 반응하지 않기 때문에 비반응체일 수 있다. PD-L1과 같은 면역 관문 분자를 차단하는 단일클론성 항체의 사용은 면역 시스템을 종양에 대항하도록 하는 기준선 T-세포 특이적 면역 반응을 증가시키는 역할을 할 수 있다. 그러나, 면역 관문 분자의 기능이 붕괴되면 환자에서 억제되지 않는 면역 반응 및 독성을 초래하는 면역 관용에서의 불균형이 야기될 수 있다.
종양 연관 항원(TAA) 및 암세포 표면 면역 관문의 이중 표적화는 치료 효능을 향상시키고, 주요 회피 기작(escape mechanism)을 제한하고, 종양 표적화 선택성을 증가시켜, 전신성 독성의 감소 및 치료 지수의 개선을 초래하는 것으로 여겨진다. 그럼에도 불구하고, 이들 전략은 전형적으로 면역 관문에 대한 감소된 친화도 및 종양 연관 항원에 대한 높은 친화도에 의존한다. 이들 전략에서는 치료용 항체가 생체 내(in vivo)에서 대상이 되는 종양 세포 표적에 도달하는 것을 막는 "항원 싱크(antigen sink)"를 야기할 수 있는, 정상 조직 상에서의 TAA의 발현 및 세포 표면 항원의 배출(shedding)에 관한 문제가 제기된 바 없다(예를 들어, 문헌[Piccione et al. mAbs, 7(5): 946~956, 2015]; 문헌[Herrmann et al. Blood, 132(23): 2484~2494, 2018] 참조).
종양에 대해 면역 관문 분자를 선택적으로 억제하면서 종양에 대해 면역 세포를 보다 효율적으로 동원하는 능력을 가지면서 환자에서 면역 관용 및 독성에서의 불균형을 최소화하는 다중 특이성 항체가 요구되고 있다.
본 발명은 종양 항원 및 면역 세포 동원용 항원에 대해 특이성을 갖는 삼중 특이성 항원 결합 단백질을 제공한다.
본 발명은 CD3을 통해 T 세포와 결합하여 활성화하고, 종양 특이적 항원과 결합하고, 면역 관문 경로를 억제하는 삼중 특이성 T 세포 관여항체에 관한 것이다. 면역 시스템이 세포를 무차별적으로 공격하는 것을 막기 위해, 삼중 특이성 항원 결합 단백질은 PD-L1과 같은 세포 표면 면역 관문 단백질로부터 빠른 해리를 허용하는 낮은 친화도로 면역 관문과 결합한다. 종양 연관 항원 및 면역 관문 단백질인 PD-L1에 동시에 결합하면 종양 세포 상에 존재하는 항원에 대한 결합을 야기하는 친화력(avidity)이 부여된다. 이로 인해 종양 세포에서 우세한 항원 존재 세포와 항원 부재 세포 사이에서 구별이 보다 양호하다.
또한, 본 발명에서는 PD-L1의 다수의 친화도 변경 변이체와 쌍을 이룬 낮은 친화도의 항종양 연관 항원 모이어티로 구성된 삼중 특이성 항원 결합 단백질이 생리학적 조건 하에 선택적 종양 표적화를 조장하는 능력에서의 친화도 및 친화력의 복합 역할이 평가된다.
또한, 본 발명에서는 본 발명의 삼중 특이성 항원 결합 단백질의 효율적인 생성 및 개발을 가능하게 하는 다중 기능성 재조합 항원 결합 단백질 포맷이 기술되어 있다. 이들 다중 기능성 항원 결합 단백질 포맷은 스캐폴드를 형성하기 위해 Fab 단편의 중쇄(Fd 단편) 및 경쇄(L)의 효율적인 이형 이량체화 특성을 이용하며, 이때 추가적인 기능이 scFv 및 단일 도메인 항원 결합 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 추가적인 결합제에 의해 혼입된다.
본 발명의 하나의 양태에서, a) 종양 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인; b) 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인; 및 c) 면역 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제3 결합 도메인을 포함하는 삼중 특이성 항원 결합 단백질이 제공되며, 이때 제1 결합 도메인은 비종양 세포 또는 세포 표면 단백질의 가용성 형태에 대한 결합을 억제하도록 감소된 친화도로 종양 세포의 세포 표면 단백질에 결합한다.
본 발명의 하나의 양태에서, a) 종양 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인; b) 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인; 및 c) 면역 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제3 결합 도메인을 포함하는 삼중 특이성 항원 결합 단백질이 제공되며, 이때 제1 및 제2 결합 도메인은 비종양 세포에 대한 결합을 억제하도록 감소된 친화도로 표적 항원과 결합한다.
특정 실시형태에서, 종양 세포의 세포 표면 단백질은 BCMA, CD19, CD20, CD33, CD123, CEA, LMP1, LMP2, PSMA, FAP 및 HER2로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 제1 결합 도메인은 종양 세포 상의 BCMA와 결합한다.
특정 실시형태에서, 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질은 CD40, CD47, CD80, CD86, GAL9, PD-L1 및 PD-L2로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 제2 결합 도메인은 종양 세포 상의 PD-L1과 결합한다.
특정 실시형태에서, 제3 결합 도메인은 면역 세포 상의 CD3, TCRα, TCRβ, CD16, NKG2D, CD89, CD64 또는 CD32a와 결합한다.
특정 실시형태에서, 제3 결합 도메인은 면역 세포 상의 CD3과 결합한다.
특정 실시형태에서, 제1 결합 도메인의 친화도는 약 1 nM과 약 100 nM 사이이다.
특정 실시형태에서, 제2 결합 도메인의 친화도는 약 1 nM과 약 100 nM 사이이다.
특정 실시형태에서, 제1 결합 도메인의 친화도는 약 10 nM과 약 80 nM 사이이다.
특정 실시형태에서, 제2 결합 도메인의 친화도는 약 10 nM과 약 80 nM 사이이다.
특정 실시형태에서, 제1 및 제2 결합 도메인은 결합 친화력(binding avidity)을 증가시키기 위해 동일한 세포 상의 표적 항원과 결합한다.
특정 실시형태에서, 제1 결합 도메인은 건강한 세포 또는 세포 표면 단백질의 가용성 형태에 대한 가교 결합을 감소시키기 위해 종양 세포의 세포 표면 단백질에 대한 낮은 친화도를 포함한다.
특정 실시형태에서, 제2 결합 도메인은 건강한 세포에 대한 가교 결합을 감소시키기 위해 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질에 대한 낮은 친화도를 포함한다.
특정 실시형태에서, 제1 및 제2 결합 도메인 각각은 종양 세포의 표적 항원에 대한 낮은 친화도를 포함하며, 이때 삼중 특이성 항원 결합 단백질은 건강한 세포에 대한 가교 결합 대비 종양 세포에 대한 향상된 가교 결합을 포함한다.
특정 실시형태에서, 제1 및 제2 결합 도메인은 건강한 조직에 대한 비표적 결합(off-target binding)을 감소시키기 위해 동일한 세포 상의 표적 항원과 결합한다.
특정 실시형태에서, 제1, 제2 및 제3 결합 도메인은 감소된 비표적 결합을 갖는다.
특정 실시형태에서, 종양 세포의 세포 표면 단백질은 존재하지 않거나, 종양 세포 대비 건강한 세포 상에서의 제한적인 발현을 나타낸다.
특정 실시형태에서, 제2 결합 도메인은 건강한 세포 상에서의 관문 억제를 감소시키기 위해 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질에 대한 낮은 친화도를 갖는다.
특정 실시형태에서, 제1, 제2 및 제3 결합 도메인은 항체를 포함한다.
특정 실시형태에서, 제1, 제2 및 제3 결합 도메인은 scFv, sdAb 또는 Fab 단편을 포함한다.
특정 실시형태에서, 제2 결합 도메인은 1가이다.
특정 실시형태에서, 제3 결합 도메인은 1가이다.
특정 실시형태에서, 제1, 제2 및 제3 결합 도메인은 하나 이상의 링커에 의해 함께 연결된다.
특정 실시형태에서, 삼중 특이성 항원 결합 단백질은 약 75 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량을 갖는다.
특정 실시형태에서, 삼중 특이성 항원 결합 단백질은 약 60 kDa 이하의 분자량을 갖는 항원 결합 단백질 대비 증가된 혈청 반감기를 갖는다.
본 발명의 하나의 양태에서, a) 종양 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인; b) 종양 세포의 표면 상의 PD-L1에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인; 및 c) T 세포의 표면 상의 CD3에 결합할 수 있는 제3 결합 도메인을 포함하는 삼중 특이성 항원 결합 단백질이 제공되며, 이때 제1 및 제2 결합 도메인은 종양 세포의 세포 표면 단백질에 결합하고, 비종양 세포에 대한 결합을 억제하도록 감소된 친화도로 PD-L1에 결합한다.
특정 실시형태에서, 종양 세포의 세포 표면 단백질은 BCMA, CD19, CD20, CD33, CD123, CEA, LMP1, LMP2, PSMA, FAP 및 HER2로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 제1 결합 도메인은 종양 세포 상의 BCMA와 결합한다.
특정 실시형태에서, 제1 결합 도메인의 친화도는 약 1 nM과 약 100 nM 사이이다.
특정 실시형태에서, 제2 결합 도메인의 친화도는 약 1 nM과 약 100 nM 사이이다.
특정 실시형태에서, 제1 결합 도메인의 친화도는 약 10 nM과 약 80 nM 사이이다.
특정 실시형태에서, 제2 결합 도메인의 친화도는 약 1 nM과 약 80 nM 사이이다.
특정 실시형태에서, 제1 및 제2 결합 도메인은 결합 친화력을 증가시키기 위해 동일한 세포 상의 표적 항원과 결합한다.
특정 실시형태에서, 제1 결합 도메인은 건강한 세포 또는 세포 표면 단백질의 가용성 형태에 대한 가교 결합을 감소시키기 위해 종양 세포의 세포 표면 단백질에 대한 낮은 친화도를 포함한다.
특정 실시형태에서, 제2 결합 도메인은 건강한 세포에 대한 가교 결합을 감소시키기 위해 종양 세포의 표면 상의 PD-L1에 대한 낮은 친화도를 포함한다.
특정 실시형태에서, 제1 및 제2 결합 도메인 각각은 종양 세포의 표적 항원에 대한 낮은 친화도를 포함하며, 이때 삼중 특이성 항원 결합 단백질은 건강한 세포에 대한 가교 결합 대비 종양 세포에 대한 향상된 가교 결합을 포함한다.
특정 실시형태에서, 제1 및 제2 결합 도메인은 건강한 조직에 대한 비표적 결합을 감소시키기 위해 동일한 세포 상의 표적 항원과 결합한다.
특정 실시형태에서, 제1, 제2 및 제3 결합 도메인은 감소된 비표적 결합을 갖는다.
특정 실시형태에서, 종양 세포의 세포 표면 단백질은 존재하지 않거나, 종양 세포 대비 건강한 세포 상에서의 제한적인 발현을 나타낸다.
특정 실시형태에서, 제2 결합 도메인은 건강한 세포 상에서의 관문 억제를 감소시키기 위해 종양 세포의 표면 상의 PD-L1에 대한 낮은 친화도를 갖는다.
특정 실시형태에서, 제1, 제2 및 제3 결합 도메인은 항체를 포함한다.
특정 실시형태에서, 제1, 제2 및 제3 결합 도메인은 scFv, sdAb 또는 Fab 단편을 포함한다.
특정 실시형태에서, 제2 결합 도메인은 1가이다.
특정 실시형태에서, 제3 결합 도메인은 1가이다.
특정 실시형태에서, 제1, 제2 및 제3 결합 도메인은 하나 이상의 링커에 의해 함께 연결된다.
특정 실시형태에서, 삼중 특이성 항원 결합 단백질은 약 75 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량을 갖는다.
특정 실시형태에서, 삼중 특이성 항원 결합 단백질은 약 60 kDa 이하의 분자량을 갖는 항원 결합 단백질 대비 증가된 혈청 반감기를 갖는다.
본 발명의 하나의 양태에서, a) 종양 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제1 항체 결합 도메인; b) 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질에 결합할 수 있는 제2 항체 결합 도메인; 및 c) 면역 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제3 항체 결합 도메인을 포함하는 삼중 특이성 항원 결합 단백질이 제공된다.
본 발명의 하나의 양태에서, 2개의 상이한 사슬을 포함하는 삼중 특이성 항원 결합 단백질이 제공되며, 이때 a) 하나의 사슬은 적어도 하나의 추가적인 결합 도메인에 연결된 Fab 단편의 적어도 하나의 중쇄(Fd 단편)를 포함하고; b) 다른 사슬은 적어도 하나의 추가적인 결합 도메인에 연결된 Fab 단편의 적어도 하나의 경쇄(L)를 포함하며, 이때 Fab 도메인은 선택적으로 추가적인 결합 도메인이 선택적으로 연결되어 있는 특정 이형 이량체화 스캐폴드로서 작용하고, 결합 도메인은 상이한 특이성을 갖는다.
특정 실시형태에서, 추가적인 결합 도메인은 scFv 또는 sdAb이다.
특정 실시형태에서, 삼중 특이성 결합 단백질은 i) 종양 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인; ii) 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인; 및 iii) 면역 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제3 결합 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 추가적인 결합 도메인은 Fab 단편의 중쇄 또는 경쇄의 N 말단 또는 C 말단에 연결되어 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 개체에 치료적 유효량의 삼중 특이성 항원 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법이 제공되며, 이때 삼중 특이성 항원 결합 단백질은 a) 종양 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인; b) 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인; 및 c) 면역 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제3 결합 도메인을 포함하고, 제1 및 제2 결합 도메인은 비종양 세포에 대한 결합을 억제하도록 감소된 친화도로 표적 항원과 결합한다.
특정 실시형태에서, 종양 세포의 세포 표면 단백질은 BCMA, CD19, CD20, CD33, CD123, CEA, LMP1, LMP2, PSMA, FAP 및 HER2로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 제1 결합 도메인은 종양 세포 상의 BCMA와 결합한다.
특정 실시형태에서, 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질은 CD40, CD47, CD80, CD86, GAL9, PD-L1 및 PD-L2로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 제2 결합 도메인은 종양 세포 상의 PD-L1과 결합한다.
특정 실시형태에서, 제3 결합 도메인은 면역 세포 상의 CD3, TCRα, TCRβ, CD16, NKG2D, CD89, CD64 또는 CD32a와 결합한다.
특정 실시형태에서, 제3 결합 도메인은 면역 세포 상의 CD3과 결합한다.
특정 실시형태에서, 암은 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 흑색종, EBV 연관 암, 및 B 세포 림프종 및 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 하나의 양태에서, 종양 세포의 세포 표면 단백질 및/또는 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 식별하는 생체 외 방법(ex vivo method)이 제공되며, 이때 상기 방법은 a) 암을 앓고 있는 환자로부터 종양 세포를 단리하는 단계; b) 종양 세포를 일군의 항원 결합 도메인과 접촉시키는 단계; c) 항원 결합 도메인의 이들의 표적 항원에 대한 결합 친화도를 결정하는 단계; 및 d) 대조군 항원 결합 도메인 대비 보다 약한 친화도를 갖는 항원 결합 도메인을 선별하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 생체 외 방법은 선별된 항원 결합 도메인을 삼중 특이성 항원 결합 단백질 내로 혼입하는 단계 e)를 추가로 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 종양 세포의 세포 표면 단백질 및 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질에 대한 결합 중 하나 또는 둘 모두를 할 수 있는 항원 결합 도메인을 식별하는 생체 외 방법이 제공되며, 이때 상기 방법은 a) 암을 앓고 있는 환자로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 골수 혈장 세포(PC) 및 자가 골수 침윤성 T 세포를 단리하는 단계; b) PBMC 또는 PC를 일군의 삼중 특이성 항원 결합 단백질과 접촉시키는 단계로서, 삼중 특이성 항원 결합 단백질의 제1 도메인은 T 세포 상의 CD3에 결합하고, 삼중 특이성 항원 결합 단백질의 제2 도메인은 종양 세포의 세포 표면 단백질 및/또는 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질에 결합하는 단계; c) 면역 매개 암세포 살해에 미치는 하나 이상의 삼중 특이성 항원 결합 단백질의 효과를 측정함으로써 암세포의 약물 살해를 결정하는 단계; 및 d) 삼중 특이성 항원 결합 단백질을 면역 매개 암세포 살해를 유도하는 이들의 능력에 기초하여 선별하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 면역 매개 암세포 살해에 미치는 삼중 특이성 항원 결합 단백질의 효과는 락테이트 데하이드로게나아제(lactate dehydrogenase; LDH) 방출을 포함한다.
특정 실시형태에서, 면역 매개 암세포 살해에 미치는 삼중 특이성 항원 결합 단백질의 효과는 표적 암세포 개수의 감소를 포함한다.
본 발명의 상기 및 기타 특징 및 이점은 첨부된 도면과 함께 고려되는 예시적인 실시형태에 대한 하기 상세한 설명으로부터 보다 충분히 이해될 것이다. 특허 및 출원 파일에는 컬러로 나타낸 하나 이상의 도면이 함유되어 있다. 컬러 도면(들)이 있는 특허 또는 특허 출원 공개공보의 사본은 필요한 수수료의 요구 및 지불 시에 특허청에 의해 제공될 것이다.
도 1은 본 발명의 삼중 특이성 항원 결합 단백질의 상호 교환 가능한 특성을 개략적으로 보여준다.
도 2는 세포 배양액에서 발현된 8개의 상이한 다중 특이성 항원 결합 구조체에 대한 분자량(kDa), 농도(㎎/㎖), 순도(% 단량체), 및 수율(㎎/ℓ 발현 배양액)을 보여준다.
도 3은 분석용 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정할 때 세포 배양액에서 발현된 4개의 상이한 다중 특이성 항원 결합 구조체의 순도를 보여준다.
도 4a 내지 도 4c는 CD3(도 4a), BCMA(도 4b) 및 PD-L1(도 4c)에 대한 BCMA-PD-L1-CD3 삼중 특이성 항원 결합 단백질의 ELISA 결합 데이터를 보여준다.
도 5는 BCMA-CD3에 대한 삼중 특이성 및 이중 특이성 항체의 동시 결합에 대한 ELISA 데이터를 보여준다.
도 6은 T 세포 활성화를 유도하는 CDR1-005의 CD3 결합암(binding arm)의 능력을 보여준다. T 세포 증식은 (플레이트 표면 상에) 고정된 항-CD3과 함께 48시간 배양된 CD3+ 저캇 T 세포(Jurkat T cell)에 대해 정량화되었다. 이러한 배양 기간 이후, WST-1 시약을 첨가하고, 형성된 포르마잔 염료를 최대 5시간까지 정량화하였다.
도 7은 CDR1-007이 H929 골수종 세포가 관여하지만 암세포(저캇 T 세포 + HEK293 세포)의 부재 시에 CD3+ 저캇 T 세포의 투여량 의존성 활성화를 유도하였다는 것을 보여준다. T 세포 활성화는 IL-2 사이토카인의 생성에 의해 측정되었으며, 파이토헤마글루티닌(phytohemagglutinin; PHA)은 T 세포 활성화의 일반적인 양성 대조군으로서 사용되었다.
도 8은 이중 특이성 CDR1-008 탠덤 scFv BCMA/CD3과 비교하여 삼중 특이성 CDR1-007에 의한 처리 시에 H929 골수종 세포와의 동시 배양 이후에 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 단리된 T 세포의 증가된 활성화를 보여준다. T 세포 활성화는 IL-2 사이토카인 생성에 의해 측정되었다.
도 9a 및 도 9b는 삼중 특이성 CDR1-007 및 이중 특이성 CDR1-008 탠덤 scFv BCMA/CD3(도 9a) 및 삼중 특이성 CDR1-007 및 이중 특이성 CDR1-020 PD-L1/CD3(도 9b)에 의해 매개되는 H929 골수종 세포의 리디렉팅(redirecting)된 T 세포 살해의 일대일 비교를 보여준다. H929 골수종 세포의 리디렉팅된 T-세포 살해는 락토오스 데하이드로게나아제(LDH) 방출 검정에 의해 결정되었다.
도 10a 및 도 10b는 각각의 결합 부위가 상이한 위치에서 평가되는 삼중 특이성 Fab-scFv 분자의 BCMA-PD-L1(도 10a) 또는 BCMA-CD3(도 10b) 중 하나에 대한 동시 결합에 대한 ELISA 데이터를 보여준다.
도 11a 및 도 11b는 대안적인 삼중 특이성 포맷 및 대안적인 결합 서열의 BCMA-PD-L1(도 11a) 또는 BCMA-CD3(도 11b) 중 하나에 대한 동시 결합에 대한 ELISA 데이터를 보여준다.
도 12a 및 도 12b는 각각의 결합 부위가 상이한 위치에서 평가되는 삼중 특이성 Fab-scFv 분자(도 12a) 및 대안적인 삼중 특이성 포맷 및 대안적인 결합 서열(도 12b)에 의해 매개되는 H929 골수종 세포의 리디렉팅된 T 세포 살해의 비교를 보여준다. H929 골수종 세포의 리디렉팅된 T-세포 살해는 락토오스 데하이드로게나아제(LDH) 방출 검정에 의해 결정되었다.
도 13은 일련의 항체 희석액을 이용하여 ELISA에 의해 측정할 때 고정된 인간 PD-L1에 대한 광범위한 결합 프로파일을 갖는 삼중 특이성 항체들의 모음을 보여준다.
도 14a 및 도 14b는 삼중 특이성 CDR1-007 및 CDR1-011(도 14a) 및 삼중 특이성 CDR1-007 및 CDR1-017(도 14b)에 의해 매개되는 H929 골수종 세포의 농도 의존적 살해의 일대일 비교를 보여준다. 사용된 효과기(effector) 대 표적 세포 비율은 5:1(T 세포:H929 세포)이었다. 세포 배양 배지 내로 방출된 LDH는 세포를 화합물과 함께 24시간 동안 배양한 이후에 측정되었다.
도 15는 삼중 특이성 항체에 대한 이미지 기반의 생체 외 시험을 위해 사용되는 상이한 다발성 골수종 환자의 골수 샘플에서의 상이한 세포 군집의 비율(%)을 보여준다.
도 16a 내지 도 16c는 다발성 골수종 환자에서 유래한 골수 조직에서 생체 외에서 평가할 때 PD-L1에 대한 친화도가 상이한 삼중 특이성 항체가 T 세포 및 정상 세포의 가교 결합을 피하는 능력을 보여준다. 새로 진단된 다발성 골수종 환자(도 16a), 재발된 다발성 골수종 환자(도 16b) 및 여러 번 재발된 다발성 골수종 환자(도 16c)에서 유래한 샘플을 사용하였다.
도 17a 내지 도 17c는 이중 특이성 대조군 및 이중 특이성 대조군과 항-PD-L1 항체의 조합과 비교하여 삼중 특이성 CDR1-017이 새로 진단된(도 17a), 재발된(도 17b) 및 여러 번 재발된(도 17c) 다발성 골수종 환자에서 유래한 T 세포를 활성화하는 능력을 보여준다.
도 18은 시차 주사 형광측정법(DSF)에 의해 결정된 삼중 특이성 분자의 열적 안정성을 보여준다.
도 19a 내지 도 19c는 37℃에서 고농도의 CDR1-007(도 19a), CDR1-011(도 19b) 및 CDR1-017(도 19c)에 대한 안정성 데이터를 보여준다.
도 20a 내지 도 20c는 삼중 특이성 및 이중 특이성 항체가 인간 CD3+ T 세포 및 암 세포주인 H929 세포(도 20a), Raji 세포(도 20b) 및 HCT116 세포(도 20c)에 대한 결합 시에 IL-2 사이토카인의 생성을 유도하는 능력을 보여준다.
도 21a 및 도 21b는 다양한 삼중 특이성 및 이중 특이성 항체(도 21a) 및 상응하는 범례도(도 21b)를 개략적으로 보여준다.
도 22는 삼중 특이성 CDR1-017이 CD3+ T 세포를 CD138, CD269 또는 CD319에 대해 염색하는 표적 세포 군집으로 리디렉팅하는 능력을 보여준다. CDR1-017은 채워진 박스로 나타나 있고, 이중 특이성 대조군인 CDR1-008은 빈 박스로 나타나 있다.
i) 종양 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인; ii) 상기 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인; 및 iii) 면역 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제3 결합 도메인을 갖는 삼중 특이성 항원 결합 단백질이 제공된다. 삼중 특이성 항원 결합 단백질을 생성 및 스크리닝하기 위한 방법이 또한 제공된다. 암을 치료하기 위한 방법 또는 삼중 특이성 항원 결합 단백질을 이용한 표적 종양 세포 살해 방법이 또한 제공된다.
특정 양태에서, 본원에 기술되어 있는 삼중 특이성 항원 결합 단백질은 제1 결합 도메인에 의해 표적화된 종양 세포 표면 단백질에 대해 낮은 친화도를 갖고, 제2 결합 도메인에 의해 표적화된 종양 세포 표면 면역 관문 단백질에 대해 낮은 친화도를 갖는다. 낮은 친화도 상호작용은 종양 세포 또는 조직 대비 삼중 특이성 항원 결합 단백질의 건강한 조직에 대한 비표적 결합을 감소시킨다.
특정 양태에서, 본원에 기술되어 있는 삼중 특이성 항원 결합 단백질은 제1 결합 도메인에 의해 표적화된 종양 세포 표면 단백질 및 제2 결합 도메인에 의해 표적화된 종양 세포 표면 면역 관문 단백질에 대해 증가된 친화력을 갖는다. 증가된 친화력은 세포 표면 단백질 둘 모두가 동일한 세포 상에 존재하는 경우에 발생한다. 증가된 친화력 상호작용은 삼중 특이성 항원 결합 단백질의 건강한 조직에 대한 비표적 결합을 감소시키고, 표적 종양 세포에 대한 우선적인 결합을 보장한다(예를 들어, 문헌[Piccione et al. mAbs, 7(5): 946~956, 2015]; 문헌[Kloss et al. Nature Biotechnology, 31(1): 71~75, 2013] 참조).
본원에 기술되어 있는 삼중 특이성 항원 결합 단백질은 본질적으로 모듈식이 되도록 설계되어 있다. 삼중 특이성 항원 결합 단백질은 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인 및 면역 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제3 결합 도메인을 포함하는 불변의 코어 영역을 포함할 수 있다. 이러한 코어 이중 특이성 항원 결합 단백질은 종양 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 추가적인 제1 결합 도메인을 가질 수 있다. 코어 영역이 변하지 않은 채로 남아 있는 동안에 제1 결합 도메인은 치료될 암 유형 또는 표적화될 종양 세포에 따라 변할 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 코어 영역은 종양 세포의 표면 상의 PD-L1에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인 및 T 세포의 표면 상의 CD3과 결합할 수 있는 제3 결합 도메인을 갖는다. 예시적인 실시형태에서, 모듈식 제1 결합 도메인은 종양 세포의 표면 상의 BCMA와 결합할 수 있다.
일반적으로, 본원에 기술되어 있는 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학, 및 혼성화와 관련하여 사용된 명명법은 당해 기술분야에 널리 알려져 있으며, 흔히 사용된다. 본원에 제공되어 있는 방법 및 기법은 일반적으로 당해 기술분야에 널리 알려져 있는 통상적인 방법에 따라 수행되며, 달리 나타내지 않는 한 본 명세서의 전반에 인용되고 토의되어 있는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 인용문헌에 기술되어 있는 바와 같이 수행된다. 효소 반응 및 정제 기법은 당해 기술분야에서 흔히 구현되거나 본원에 기술되어 있는 바와 같이 제조사의 설명서에 따라 수행된다. 본원에 기술되어 있는 분석용 화학, 합성 유기 화학 및 의료 및 제약 화학과 관련하여 사용되는 명명법 및 이들의 실험 절차 및 기법은 당해 기술분야에 널리 알려져 있으며, 흔히 사용된다. 표준 기법은 화학적 합성, 화학적 분석, 약학 제제, 제형 및 전달 및 환자 치료에 사용된다.
본원에서 달리 한정하지 않는 한, 본원에서 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자에 의해 흔히 이해되는 의미를 갖는다. 잠재적 모호성(latent ambiguity)이 있는 경우, 본원에 제공되어 있는 정의가 임의의 사전적 또는 비본질적 정의보다 우선한다. 문맥 상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 달리 언급하지 않는 한, "또는"의 사용은 " 및/또는"을 의미한다. "포함하는"이란 용어뿐만 아니라 "포함한다" 및 "포함된다"과 같은 기타 용어의 사용은 제한적인 의미가 아니다.
본 발명이 보다 용이하게 이해될 수 있도록 특정 용어를 먼저 정의한다.
항원 결합 단백질
본원에서 사용되는 바와 같이, "항체" 또는 "항원 결합 단백질"이란 용어는 항원 또는 에피토프와 특이적으로 결합하거나 항원 또는 에피토프와 면역학적으로 반응성이며, 다클론성 및 단일클론성 항체 둘 모두 뿐만 아니라 기능성 항체 단편(단편 항원 결합 (Fab) 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, 재조합 IgG(rIgG) 단편, 단쇄 가변 단편(scFv) 및 단일 도메인 항체(예를 들어, sdAb, sdFv, 나노바디(nanobody)) 단편을 들 수 있지만 이에 제한되지 않음)을 포함하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. "항체"란 용어는 인트라바디(intrabody), 펩티바디(peptibody), 키메라 항체, 완전 인간 항체, 인간화 항체, 이종 접합 항체(예를 들어, 이중 특이성 항체, 다이바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 탠덤 디-scFv, 탠덤 트리-scFv) 등과 같은 유전적으로 조작되거나 또는 그 밖의 변형된 형태의 면역글로불린을 포함한다. 달리 언급하지 않는 한, "항체"란 용어는 이의 기능성 항체 단편을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, Fab 단편은 경쇄의 가변 경쇄 도메인(VL) 및 불변 도메인(CL)을 포함하는 경쇄 단편 및 중쇄의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 제1 불변 도메인(CH1)을 포함하는 항체 단편이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"이란 용어는 항원 특이성 및 결합 친화도를 부여하는 항체 가변 영역 내의 아미노산의 비연속 서열을 지칭한다. 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역 내에는 3개의 CDR(CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3)이 존재하고, 각각의 경쇄 가변 영역 내에는 3개의 CDR(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3)이 존재한다. "골격 영역" 또는 "FR"은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 비-CDR 부분을 지칭하는 것으로 당해 기술분야에 알려져 있다. 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역 내에는 4개의 FR(FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4)이 존재하고, 각각의 경쇄 가변 영역 내에는 4개의 FR(FR-L1, FR-L2, FR-L3 및 FR-L4)이 존재한다.
주어진 CDR 또는 FR의 정확한 아미노산 서열 경계는 문헌[Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.]("카바트(Kabat)" 넘버링 체계), 문헌[Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927~948]("초티아(Chothia)" 넘버링 체계), 문헌[MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732~745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography," J. Mol. Biol. 262, 732-745]("접촉" 넘버링 체계), 문헌[Lefranc M P et al., "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev Comp Immunol, 2003 January; 27(1):55~77]("IMGT" 넘버링 체계) 및 문헌[Honegger A and Pluckthun A, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool," J Mol Biol, 2001 Jun. 8; 309(3): 657~70](AHo 넘버링 체계)에 기술되어 있는 것을 비롯한 다수의 널리 알려져 있는 체계들 중 임의의 것을 이용하여 용이하게 결정될 수 있다.
주어진 CDR 또는 FR의 경계는 식별에 사용되는 체계에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 카바트 체계는 구조적 정렬에 기반을 두고 있는 반면, 초티아 체계는 구조적 정보에 기반을 두고 있다. 카바트 및 초티아 체계 둘 모두에 있어서 넘버링은 가장 흔한 항체 영역 서열 길이에 기반을 두고 있는데, 삽입 문자, 예를 들어 "30a"에 의해 삽입이 수용되고, 일부 항체에서 결실이 나타난다. 2개의 체계에서는 상이한 위치에서 특정 삽입 및 결실("indel")이 위치하며, 그 결과 차등 넘버링이 야기된다. 접촉 체계는 복합 결정 구조의 분석에 기반을 두고 있으며, 많은 점에서 초티아 넘버링 체계와 유사하다.
따라서, 달리 명시하지 않는 한, 주어진 항체 또는 이의 영역(예를 들어, 이의 가변 영역)의 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역" 또는 개개의 명시된 CDR(예를 들어, "CDR-H1", "CDR-H2")은 알려져 있는 체계 중 임의의 것에 의해 정의된 바와 같이 하나(또는 특정)의 상보성 결정 영역을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 마찬가지로, 달리 명시하지 않는 한, 주어진 항체 또는 이의 영역(예를 들어, 이의 가변 영역)의 "FR" 또는 "골격 영역" 또는 개개의 명시된 FR(예를 들어, "FR-H1", "FR-H2")은 알려져 있는 체계 중 임의의 것에 의해 정의된 바와 같이 하나(또는 특정)의 골격 영역을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 일부 경우, 카바트, 초티아, 또는 접촉 방법에 의해 정의된 바와 같은 CDR와 같이 특정 CDR 또는 FR을 식별하기 위한 체계가 명시되어 있다. 기타 경우, CDR 또는 FR의 특정 아미노산 서열이 주어진다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "친화도"란 용어는 항체의 항원 결합 부위와 이것이 결합하는 에피토프 사이의 상호작용의 강도를 지칭한다. 당업자가 용이하게 이해하는 바와 같이, 항체 또는 항원 결합 단백질의 친화도는 해리 상수(KD)로서 몰농도(M)로 기재될 수 있다. 많은 항체는 10-6 M 내지 10-9 M 범위의 KD 값을 갖는다. 고친화도 항체는 10-9 M(1 나노몰(nM)) 이하의 KD 값을 갖는다. 예를 들어, 고친화도 항체는 약 1 nM 내지 약 0.01 nM 범위의 KD 값을 가질 수 있다. 고친화도 항체는 약 1 nM, 약 0.9 nM, 약 0.8 nM, 약 0.7 nM, 약 0.6 nM, 약 0.5 nM, 약 0.4 nM, 약 0.3 nM, 약 0.2 nM 또는 약 0.1 nM의 KD 값을 가질 수 있다. 친화도가 매우 높은 항체는 10-12 M(1 피코콜(pM)) 이하의 KD 값을 갖는다.
저친화도 내지 중간 친화도 항체는 약 10-9 M(1 나노몰(nM)) 초과의 KD 값을 갖는다. 예를 들어, 저친화도 내지 중간 친화도 항체는 약 1 nM 내지 약 100 nM 범위의 KD 값을 가질 수 있다. 저친화도 항체는 약 10 nM 내지 약 100 nM의 KD 값을 가질 수 있다. 저친화도 항체는 약 10 nM 내지 약 80 nM 범위의 KD 값을 가질 수 있다. 저친화도 항체는 약 10 nM, 약 15 nM, 약 20 nM, 약 25 nM, 약 30 nM, 약 35 nM, 약 40 nM, 약 45 nM, 약 50 nM, 약 55 nM, 약 60 nM, 약 65 nM, 약 70 nM, 약 75 nM, 약 80 nM, 약 85 nM, 약 90 nM, 약 95 nM, 약 100 nM 또는 100 nM 초과의 KD 값을 가질 수 있다.
본 발명의 항원 결합 도메인은 이들의 표적 항원에 대해 약 10-4 M 미만, 약 10-4 M, 약 10-5 M, 약 10-6 M, 약 10-7 M, 약 10-8 M, 약 10-9 M, 약 10-10 M, 약 10-11 M, 약 10-12 M 또는 약 10-13 M의 결합 친화도를 가질 수 있다.
항원 결합 도메인이 특정 항원 결정인자에 결합하는 능력은 효소 결합 면역 흡착 검정(ELISA) 또는 당업자에게 익숙한 기타 기법, 예를 들어 표면 플라스몬 공명(SPR) 기법(비아코어(BIAcore) 기기 상에서 분석됨)(문헌[Liljeblad et al., Glyco J 17, 323~329 (2000)]) 및 통상의 결합 검정(문헌[Heeley, Endocr Res 28, 217~229 (2002)]) 중 하나를 통해 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "친화력"이란 용어는 항체-항원 상호작용의 전체 강도를 지칭한다. 친화력은 개개의 비공유 결합 상호작용의 다수의 친화도의 강도가 축적된 것이다. 동시 결합 상호작용의 개수가 증가함에 따라 총 결합 친화력은 증가하고, 따라서 상호작용이 보다 안정적이게 된다.
본 발명의 삼중 특이성 항원 결합 단백질은 삼중 특이성 항원 결합 단백질의 도메인을 연결하기 위한 하나 이상의 링커를 포함할 수 있다. 삼중 특이성 항원 결합 단백질은 Fab 사슬을 2개의 scFv에 공유 결합적으로 연결시키는 2개의 가요성 펩티드 링커를 포함할 수 있다. Fab 사슬과 scFv를 연결시키는 링커는 비면역원성으로 간주되는 글리신-세린(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)으로 구성될 수 있다.
링커의 예시적인 예로는 글리신 폴리머(Gly)n; 글리신-세린 폴리머(GlynSer)n(여기서, n은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8의 정수임); 글리신-알라닌 폴리머; 알라닌-세린 폴리머; 및 당해 기술분야에 알려져 있는 기타 가요성 링커를 들 수 있다.
글리신 및 글리신-세린 폴리머는 비교적 비구조적이며, 따라서 본원에 기술되어 있는 삼중 특이성 항원 결합 단백질과 같은 융합 단백질의 도메인 사이에서 중성 테더(neutral tether)로서 작용할 수 있다. 글리신은 기타 소형 측쇄 아미노산보다 현저히 많은 파이-프사이(phi-psi) 공간에 접근하고, 보다 긴 측쇄를 갖는 잔기보다 훨씬 덜 제한된다(문헌[Scheraga, Rev. Computational Chem. 1: 1173~142 (1992)]). 당업자라면 특정 실시형태에서 삼중 특이성 항원 결합 단백질의 설계가 완전 또는 부분 가요성인 링커를 포함할 수 있어서, 링커가 목적하는 구조를 제공하기 위해 가요성을 덜 부여하는 하나 이상의 연장부(stretch)뿐만 아니라 가요성 링커 연장부를 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
그러나, 링커 서열은, 예를 들어 인간 CH1 및 Cκ 서열의 시작부분에 상응하는 아미노산 연장부 또는 인간 IgG의 힌지 영역의 하부 부분에 상응하는 아미노산 연장부를 이용하여 천연 링커 서열과 유사하도록 선택될 수 있다.
scFv 모이어티 내의 VL 및 VH 도메인을 연결하는 펩티드 링커의 설계는 일반적으로 소형의 비극성 또는 극성 잔기, 예를 들어 Gly, Ser 및 Thr으로 구성된 가요성 링커이다. scFv 모이어티의 가변 도메인을 연결하는 특히 예시적인 링커는 (Gly4Ser)4 링커(여기서 4는 모티프의 반복서열(repeat)의 예시적인 개수임)이다.
기타 예시적인 링커로는 하기 아미노산 서열을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다: GGG; DGGGS; TGEKP(문헌[Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci.94: 5525~5530 (1997)]); GGRR; (GGGGS)n(여기서 n은 1, 2, 3, 4 또는 5임)(문헌[Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci.93: 1156~1160 (1996)]); EGKSSGSGSESKVD(문헌[Chaudhary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 1066~1070 (1990)]); KESGSVSSEQLAQFRSLD(문헌[Bird et al., Science 242: 423~426 (1988)]); GGRRGGGS; LRQRDGERP; LRQKDGGGSERP; 및 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(문헌[Cooper et al., Blood, 101(4): 1637~1644 (2003)]). 대안적으로, 가요성 링커는 단백질 및 펩티드의 3D 구조를 모델링할 수 있는 컴퓨터 프로그램을 이용하거나 파지 디스플레이(phage display) 방법에 의해 합리적으로 설계될 수 있다.
다중 특이성 항원 결합 포맷
본 발명의 실시형태에서, 삼중 특이성 항원 결합 단백질은 적어도 하나의 Fab 도메인을 포함한다. Fab 도메인은 추가적인 결합 도메인이 연결되는 특정 이형 이량체화 스캐폴드로서 역할을 할 수 있다. Fab 단편의 중쇄(Fd 단편) 및 경쇄(L)의 자연적이고 효율적인 이형 이량체화 특성으로 인해 Fab 단편이 이상적인 스캐폴드가 된다. 추가적인 결합 도메인은 다른 Fab 도메인, scFv 또는 sdAb를 포함하지만 이에 제한되지 않는 몇몇 상이한 포맷 내에 있을 수 있다.
Fab 단편의 각각의 사슬은 추가적인 결합 도메인을 갖는 N-말단 또는 C-말단에서 확장될 수 있다. 상기 사슬은 숙주 세포 결합 면역글로불린 단백질(BiP) 샤페론(chaperone)이 중쇄-경쇄 이형 이량체(Fd:L)의 형성을 유도하는 포유동물 세포에서 동시 발현될 수 있다. 이들 이형 이량체는 안정적이며, 이때 결합제 각각은 이들의 특이적 친화도를 보유한다. 이 같은 삼중 특이성 항원 결합 단백질의 생성을 위한 예시적인 실시형태에서, 상술한 결합 부위들 중 적어도 하나는 Fab 단편이며, 이는 또한 특정 이형 이량체화 스캐폴드로서 역할을 한다. 게다가, 2개의 나머지 결합 부위는 scFv 또는 sdAb로서 특유의 Fab 사슬에 융합되며, 여기서 각각의 사슬은, 예를 들어 추가적인 scFv 또는 sdAb 도메인을 갖는 C-말단에서 확장될 수 있다(예를 들어, 문헌[Schoonjans et al., J. Immunology, 165(12): 7050~7057, 2000]; 문헌[Schoonjans et al., Biomolecular Engineering, 17: 193~202, 2001] 참조).
종양 항원 및 T 세포 동원용 항원(예를 들어, CD3)에 대해 결합 특이성을 갖는 2개의 Fab 도메인을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 단백질이 기술되어 있다(예를 들어, U.S. 20150274845 A1 참조).
본 발명의 삼중 특이성 항원 결합 단백질 스캐폴드의 이점은 대략 75 kDa 내지 100 kDa의 중간 분자 크기이다. 이중 특이성 T 세포 관여항체(BiTE)인 블리나투모맙(blinatumomab)은 재발 또는 난치성 급성 림프아구성 백혈병 환자에서 우수한 결과를 나타냈다. 이의 크기(60 kDa)가 작기 때문에 블리나투모맙은 수 시간의 짧은 혈청 반감기를 특징으로 하며, 따라서 연속 주입이 요구된다(U.S. 7,112,324 B1 참조). 본 발명의 삼중 특이성 항원 결합 단백질은 BiTE(예를 들어, 블리나투모맙)와 같은 보다 작은 이중 특이성 항체와 비교하여 유의하게 더 긴 반감기를 갖는 것으로 예상되며, 따라서 이들의 바람직한 반감기로 인해 연속 주입이 요구되지 않는다. 중간 크기의 분자는 신장 제거(kidney clearance)를 피할 수 있으며, 개선된 종양 축적(tumor accumulation)에 충분한 반감기를 제공할 수 있다. 본 발명의 삼중 특이성 항원 결합 단백질은 기타 소형의 이중 특이성 포맷과 비교하여 증가된 혈장 반감기를 가지면서 여전히 종양 침투 능력을 보유하고 있다.
Fab를 이형 이량체화 유닛으로 사용하는 것의 추가적인 이점은, Fab 분자가 혈청에 풍부하게 존재하며, 따라서 개체에 투여될 때 비면역원성일 수 있다는 것이다.
예시적인 이중 특이성 및 삼중 특이성 항원 결합 단백질 서열이 표 1에 나열되어 있다. 서열은 도 2 및 도 21a 및 도 21b의 항원 결합 단백질에 상응한다.
Figure pct00001
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추가적인 예시적인 삼중 특이성 포맷이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 삼중 특이성 T 세포 활성화 구조체(TriTAC) 포맷이 이용될 수 있다. TriTAC 포맷은, scFv, sdAb 및 Fab 도메인 모두가 하나의 항체 분자에서 사용되지 않을 수 있긴 하지만, 이들 3개의 도메인의 혼합물을 포함한다. TriTAC 포맷 항체는 적어도 하나의 반감기 확장 도메인, 예를 들어 인간 혈청 알부민 결합 도메인을 포함할 수 있다. TriTAC 포맷 및 예시적인 TriTAC 항체의 예는 본원에 참고로 포함된 WO 2016187594 및 WO 2018071777 A1에 추가로 기술되어 있다.
종양 세포의 세포 표면 단백질에 대한 결합 도메인
종양 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인을 갖는 삼중 특이성 항원 결합 단백질이 제공된다. 삼중 특이성 항원 결합 단백질의 제1 결합 도메인은 세포 표면 단백질의 활성을 억제할 수 있으며, 면역 세포를 종양 세포에 특이적으로 동원시키는 수단으로서 역할을 한다. 표적화될 수 있는 종양 세포 상의 세포 표면 단백질의 예로는 BCMA, CD19, CD20, CD33, CD123, CEA, LMP1, LMP2, PSMA, FAP 및 HER2를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 종양 세포 단백질은 BCMA이다.
종양 세포 상의 세포 표면 단백질에 대해 결합 특이성을 갖는 이중 특이성 항원 결합 단백질의 예로는 U.S. 20130273055 A1, U.S. 9,150,664 B2, U.S. 20150368351 A1, U.S. 20170218077 A1, 문헌[Hipp et al., Leukemia, 31: 1743~1751 (2017)]) 및 문헌[Seckinger et al., Cancer Cell, 31(3): 396~410 (2017)]에 기술되어 있는 것을 들 수 있다.
삼중 특이성 항원 결합 단백질의 제1 결합 도메인의 결합 친화도는 비종양 또는 건강한 조직에 대한 삼중 특이성 항원 결합 단백질의 비표적 결합을 감소시키기 위해 낮을 수 있다. 제1 결합 도메인의 결합 친화도는 약 1 nM 내지 약 100 nM의 범위일 수 있다. 제1 결합 도메인의 결합 친화도는 약 1 nM 내지 약 80 nM의 범위일 수 있다. 제1 결합 도메인의 결합 친화도는 약 10 nM 내지 약 80 nM의 범위일 수 있다.
BCMA 항원 결합 도메인 서열은 종양 세포 상의 세포 표면 단백질과 결합할 수 있는 결합 도메인의 예로서 하기 표 2 및 WO 2016094304 및 WO 2010104949에 나열되어 있다. 상기 서열은 삼중 특이성 항원 결합 단백질의 일부로서 Fab, scFv 또는 sdAb 포맷 중 하나에서 사용될 수 있다.
Figure pct00015
종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질에 대한 결합 도메인
종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인을 갖는 삼중 특이성 항원 결합 단백질이 제공된다. 삼중 특이성 항원 결합 단백질의 제2 결합 도메인은 세포 표면 면역 관문 단백질의 활성을 억제하여 제거될 표적 종양 세포의 면역 억제 신호를 억제할 수 있다. 표적화될 수 있는 종양 세포 상의 세포 표면 면역 관문 단백질의 예로는 CD40, CD47, CD80, CD86, GAL9, PD-L1 및 PD-L2를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 면역 관문 단백질은 PD-L1이다.
예시적인 실시형태에서, 본 발명의 삼중 특이성 항원 결합 단백질은 종양 세포의 세포 표면 상의 PD-L1과 결합한다. 예정사 수용체 1(programmed death receptor 1)은 활성화된 T 세포 상에서 유도되고 고갈된 T 세포 상에서 발현되는 억제 수용체이다. PD1-PD-L1 상호작용은 적어도 부분적으로는 면역 기능 장애 상태의 원인이 될 수 있으며, 블리나투모맙 요법이 도움이 되지 않는 PD-L1의 수준이 증가된 급성 림프아구성 백혈병 환자에서 BiTE 효능의 감소에 또한 연관되어 있다(문헌[Krupka et al., Leukemia, 30(2): 484~491 (2016)]).
삼중 특이성 항원 결합 단백질의 제2 결합 도메인은 표적으로부터의 신속한 해리를 허용하도록 낮은 친화도로 세포 표면 면역 관문 단백질과 결합하도록 설계되어 있다. 이러한 방식으로, 삼중 특이성 항원 결합 단백질은 건강한 조직 상의 면역 관문 단백질과 결합하지 않을 수 있으며, 그 결과 비표적 효과(off-target effect)를 회피할 수 있다.
삼중 특이성 항원 결합 단백질의 제2 결합 도메인의 결합 친화도는 약 1 nM 내지 약 100 nM의 범위일 수 있다. 제1 결합 도메인의 결합 친화도는 약 1 nM 내지 약 80 nM의 범위일 수 있다. 제1 결합 도메인의 결합 친화도는 약 10 nM 내지 약 80 nM의 범위일 수 있다.
종양 세포 상의 세포 표면 면역 관문 단백질에 대해 결합 특이성을 갖는 이중 특이성 항원 결합 단백질의 예로는 WO 2017106453 A1, WO 2017201281 A1 및 문헌[Horn et al., Oncotarget, 8: 57964, 2017]에 기술되어 있는 것을 들 수 있다.
PD-L1 항원 결합 도메인 서열은 종양 세포 상의 세포 표면 면역 관문 단백질과 결합할 수 있는 결합 도메인의 예로서 하기 표 3 및 WO 2017147383 및 U.S. 20130122014 A1에 나열되어 있다. 서열은 삼중 특이성 항원 결합 단백질의 일부로서 Fab 또는 scFv 포맷 중 하나에서 사용될 수 있다.
Figure pct00016
면역 세포의 세포 표면 단백질에 대한 결합 도메인
면역 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제3 결합 도메인을 갖는 삼중 특이성 항원 결합 단백질이 제공된다. 삼중 특이성 항원 결합 단백질의 제3 결합 도메인은 면역 세포를 제거될 표적 종양 세포에 특이적으로 동원시킬 수 있다. 동원 가능한 면역 세포의 예로는 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 호중구 세포, 단핵구 및 대식세포를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 면역 세포를 동원하기 위해 사용될 수 있는 표면 단백질의 예로는 CD3, TCRα, TCRβ, CD16, NKG2D, CD89, CD64, 및 CD32a를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 면역 세포의 예시적인 세포 표면 단백질은 CD3이다.
예시적인 CD3 항원 결합 도메인은 하기 표 4 및 본원에 참고로 포함된 WO 2016086196 및 WO 2017201493에 나열되어 있다.
Figure pct00017
종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질 및 종양 세포의 세포 표면 단백질에 대한 감소된 결합 친화도
삼중 특이성 항원 결합 단백질은 표적 종양 세포의 세포 표면 단백질(예를 들어, BCMA)에 대한 감소된 결합 친화도 및 표적 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질(예를 들어, PD-L1)에 대한 감소된 결합 친화도를 갖는다. 각각의 결합 도메인의 개개의 결합 친화도는 삼중 특이성 항원 결합 단백질이 비종양 또는 건강한 조직에 대한 감소된 비표적 결합을 가질 수 있는 정도이다. 표적 내 결합(on-target binding)은 표적 종양 세포가 표적 면역 관문 단백질 및 표적 세포 표면 단백질 둘 모두를 발현하는 경우에 개선된다. 2개의 도메인의 조합된 결합 친화력은 삼중 특이성 항원 결합 단백질이 건강한 조직보다 더 특이적으로 항원 둘 모두를 발현하는 표적 종양에 결합하는 정도이다. 삼중 특이성 항원 결합 단백질은 표적 종양에 대한 생산적 결합을 구현하기 위해 표적 종양 세포의 세포 표면 단백질에 대한 고친화도 결합에 의존할 필요는 없다. 일례로, 결코 제한적이지 않지만 BCMA는 종양 세포의 표면 상에서 발견될 수 있으며 세포 표면 항원인 BCMA의 가용성 형태로 발견될 수 있다. BCMA는 막통과 영역에서 γ-세크레타아제(γ-secretase)에 의해 개열되어, BCMA 세포 외 도메인의 가용성 형태(sBCMA)를 초래한다. sBCMA는 리간드 APRIL에 대한 디코이(decoy)로서 작용할 수 있으며, 세포 표면 항원인 BCMA의 이러한 혈청 가용성 형태는 항체-항원 싱크를 초래할 수 있다. 따라서, 고친화도 항-BCMA 항체는 저친화도 항체보다 sBCMA 간섭에 더 민감할 수 있다(예를 들어, 문헌[Tai et al., Immunotherapy. 7(11): 1187~1199, 2015] 및 문헌[Sanchez et al., Br J Haematol. 158(6); 727738, 2012] 참조). 더 나아가, 표적 종양 세포 상의 기타 세포 표면 단백질은 또한 비종양 세포의 표면 상에서 발현될 수 있다. 비종양 세포 상의 세포 표면 단백질의 존재는 항체-항원 싱크로서 작용할 수 있어서, 종양 세포와 결합하는데 이용 가능한 항체의 양을 줄일 수 있다. 따라서, 본원에 개시되어 있는 삼중 특이성 항원 결합 단백질과 같은 치료용 항체가 세포 표면 단백질에 대한 낮은 결합 친화도 또는 중간 결합 친화도를 갖는 경우에 상기 항체는 항체-항원 싱크에 덜 민감할 수 있다. 이러한 동일한 원리가 표적 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질에 역시 적용될 수 있다.
항원 결합 폴리펩티드의 발현
하나의 양태에서, 본원에 개시되어 있는 결합 폴리펩티드(예를 들어, 항원 결합 단백질)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 이들 폴리뉴클레오티드를 발현하는 단계를 포함하는, 결합 폴리펩티드를 제조하는 방법이 또한 제공된다.
본원에 개시되어 있는 결합 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 목적하는 양의 청구된 항체 또는 이의 단편을 생성하기 위해 사용될 수 있는 숙주 세포 내로의 도입을 위한 발현 벡터 내에 삽입된다. 따라서, 특정 양태에서 본 발명은 본원에 개시되어 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 이들 벡터 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
"벡터" 또는 "발현 벡터"란 용어는 목적하는 유전자를 세포에 도입하고 이를 발현하기 위한 비히클로서 본 발명에 따라 사용되는 벡터를 의미하도록 본원에서 사용된다. 당업자에게 알려져 있는 바와 같이, 이 같은 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스 및 레트로바이러스로 이루어진 군으로부터 용이하게 선택될 수 있다. 일반적으로, 본 발명과 양립 가능한 벡터는 선별 마커, 목적하는 유전자의 클로닝을 용이하게 하는 적절한 제한 부위, 및 원핵 또는 진핵 세포에 들어가고/가거나 상기 세포에서 복제하는 능력을 포함할 것이다.
다수의 발현 벡터 시스템이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어 하나의 부류의 벡터는 소 유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 우두 노바이러스, 배큘로바이러스, 레트로바이러스(예를 들어, RSV, MMTV, MOMLV 등) 또는 SV40 바이러스와 같은 동물 바이러스에서 유래하는 DNA 요소를 이용한다. 다른 것은 내부 리보솜 결합 부위를 갖는 폴리시스트론성 시스템의 사용을 수반한다. 추가적으로, DNA가 이들의 염색체 내로 통합되어 있는 세포는 형질 감염된 숙주 세포의 선별을 허용하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 선별될 수 있다. 마커는 영양 요구성 숙주에 대한 원영양성(prototrophy), 살생물제(biocide) 내성(예를 들어, 항생제) 또는 구리와 같은 중금속에 대한 내성을 제공할 수 있다. 선별 마커 유전자는 발현될 DNA 서열에 직접 연결될 수 있거나, 동시 형질 전환에 의해 동일한 세포 내로 도입될 수 있다. 또한 추가적인 요소는 mRNA의 최적의 합성을 위해 요구될 수 있다. 이들 요소는 전사 프로모터, 인핸서 및 종결 신호뿐만 아니라 신호 서열, 스플라이스 신호(splice signal)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 클로닝된 가변 영역 유전자는 상기에서 토의된 바와 같이 합성된 중쇄 및 경쇄 불변 영역 유전자(예를 들어, 인간 불변 영역 유전자)와 함께 발현 벡터 내로 삽입된다.
기타 실시형태에서, 결합 폴리펩티드는 폴리시스트론성 구조체를 이용하여 발현될 수 있다. 이 같은 발현 시스템에서, 항체의 중쇄 및 경쇄와 같은 다수의 관심 있는 유전자 생성물은 단일 폴리시스트론성 구조체로부터 생성될 수 있다. 이들 시스템은 유리하게는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하여 진핵 숙주 세포에서 비교적 높은 수준의 폴리펩티드를 제공한다. 양립 가능한 IRES 서열은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에서 참고로 포함되는 미국 특허 제6,193,980호에 개시되어 있다. 당업자라면 이 같은 발현 시스템이 본 출원에 개시되어 있는 모든 범위의 폴리펩티드를 효과적으로 생성하기 위해 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
보다 일반적으로, 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 벡터 또는 DNA 서열이 제조되면 발현 벡터는 적절한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 즉, 숙주 세포는 형질 전환될 수 있다. 숙주 세포 내로의 플라스미드의 도입은 당업자에게 널리 알려져 있는 다양한 기법에 의해 달성될 수 있다. 이들로는 형질 감염(전기영동 및 전기천공을 포함함), 원형질 융합, 인산칼륨 침전, 외피형 DNA와의 세포 융합, 미세주사 및 온전한 바이러스에 의한 감염을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다(문헌[Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2, pp. 470~472, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988)] 참조). 숙주 내로의 플라스미드의 도입은 전기천공에 의해 이루어질 수 있다. 형질 전환된 세포는 경쇄 및 중쇄의 생성에 적합한 조건하에 성장하고, 중쇄 및/또는 경쇄 단백질의 합성에 대해 검정할 수 있다. 예시적인 검정 기법으로는 효소 결합 면역 흡착 검정(ELISA), 방사성 면역 검정(RIA), 형광-활성화된 세포 분별기 분석(FACS), 면역 조직화학 등을 들 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "형질 전환"이란 용어는 유전자형을 변경하고, 결과적으로 수용 세포에서의 변화를 초래하는 수용 숙주 세포 내로의 DNA의 도입을 지칭하기 위해 광범위한 의미에서 사용될 것이다.
이들과 동일한 방식으로, "숙주 세포"는 재조합 DNA 기법을 이용하여 구축되고 적어도 하나의 이종성 유전자를 암호화하는 벡터로 형질 전환되어 있는 세포를 지칭한다. 재조합 숙주로부터 폴리펩티드를 단리하기 위한 과정의 설명에서, "세포" 및 "세포 배양액"이란 용어는 이를 달리 명확하게 규명하지 않는 한 항체의 공급원을 나타내기 위해 상호 교환 가능하게 사용된다. 다시 말해, "세포"로부터의 폴리펩티드의 회수는 스핀-다운된 전체 세포 또는 배지 및 현탁된 세포 둘 모두를 함유하는 세포 배양액 중 하나로부터의 회수를 의미할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 항체의 발현을 위해 사용되는 숙주 세포주는 포유동물 기원을 갖는다. 당업자라면 그 내부에서 발현될 목적하는 유전자 생성물에 가장 적합한 특정 숙주 세포주를 결정할 수 있다. 예시적인 숙주 세포주로는 DG44 및 DUXB11(중국 햄스터 난소 세포주, DHFR minus), HELA(인간 자궁경부 암종), CV-1(원숭이 신장 세포주), COS(SV40 T 항원을 갖는 CV-1의 유도체), R1610(중국 햄스터 섬유아세포) BALBC/3T3(마우스 섬유아세포), HAK(햄스터 신장 세포주), SP2/O(마우스 골수종), BFA-1c1BPT(소 내피세포), RAJI(인간 림프구), 293(인간 신장) 등을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 하나의 실시형태에서, 세포주는 이로부터 발현된 항체(예를 들어, PER.C6®(크루셀(Crucell)) 또는 FUT8-녹아웃 CHO 세포주(포텔리전트®(Potelligent®) 세포)(뉴저지주 프린스턴 소재의 바이오와(Biowa))의 변경된 글리코실화, 예를 들어 탈푸코실화(afucosylation)를 제공한다. 숙주 세포주는 전형적으로 상용 서비스, 예를 들어 미국 세포주 은행(American Tissue Culture Collection)으로부터 이용 가능하거나 공개된 문헌으로부터 이용 가능하다.
시험관 내(in vitro) 생성에서는 정률증가(scale-up)가 허용되어 다량의 목적하는 폴리펩티드가 얻어진다. 조직 배양 조건 하에서의 포유동물 세포의 배양 기법은 당해 기술분야에 알려져 있으며, 예를 들어 공기 부양 반응기 또는 연속 교반기 반응기 내의 균질한 현탁 배양액, 또는 예를 들어 아가로스 마이크로비드 또는 세라믹 카트리지 상의 중공 섬유, 마이크로캡슐 내에 고정 또는 포획된 세포 배양액을 포함한다. 필요하고/하거나 요구되는 경우, 폴리펩티드의 용액은 통상의 크로마토그래피 방법, 예를 들어 겔 투과, 이온 교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로오스 상의 크로마토그래피 및/또는 (면역-)친화도 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
본 발명에서 특징으로 하는 항원 결합 단백질을 암호화하는 유전자는 박테리아 또는 효모 또는 식물 세포와 같은 비포유동물 세포 상에서 발현될 수 있다. 이와 관련하여, 박테리아와 같은 다양한 단세포성 비포유동물 미생물, 즉 배양액 또는 발효액에서 성장할 수 있는 것이 또한 형질 전환될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 형질 전환에 민감한 박테리아는 에셔리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 살로넬라(Salmonella) 균주와 같은 장내세균과(Enterobacteriaceae); 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스과(Bacillaceae); 뉴모코쿠스(Pneumococcus); 스트렙토코쿠스(Streptococcus); 및 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae)의 멤버를 포함한다. 또한, 박테리아에서 발현되는 경우에 단백질은 봉입체(inclusion body)의 일부가 될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 단백질은 단리되고 정제된 후, 기능성 분자 내에 조립되어야 한다.
원핵생물 이외에도, 진핵 미생물이 또한 사용될 수 있다. 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 즉 흔한 제빵 효모는 다수의 기타 균주가 흔히 이용 가능할 지라도 진핵 미생물 중에서 가장 흔하게 사용된다. 사카로마이세스에서의 발현을 위해, 예를 들어 플라스미드 YRp7(문헌[Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)]; 문헌[Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979)]; 문헌[Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)])이 흔히 사용된다. 이러한 플라스미드는 트립토판에서 성장하는 능력이 없는 효모의 돌연변이 균주, 예를 들어 ATCC 제44076호 또는 PEP4-1(문헌[Jones, Genetics, 85:12 (1977)])에 대한 선별 마커를 제공하는 TRP1 유전자를 이미 함유하고 있다. 이어서, 효모 숙주 세포 게놈의 특징으로서의 trp1 병소의 존재는 트립토판의 부재 하의 성장에 의한 형질 전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다.
항원 결합 단백질을 투여하는 방법
항원 결합 단백질(예를 들어, 본원에 개시되어 있는 삼중 특이성 항원 결합 단백질)을 제조하고 개체에 투여하는 방법이 당업자에게 잘 알려져 있거나, 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 본 개시내용의 항원 결합 단백질의 투여 경로는 경구, 비경구이거나, 흡입에 의한 것이거나 국소일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 비경구란 용어는 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 피하, 직장 또는 질 내 투여를 포함한다. 이들 모든 투여 형태는 명백히 본 개시내용의 범주 내에 있는 것으로 고려될지라도 투여 형태는 주사용, 특히 정맥 내 또는 동맥 내 주사 또는 점적용 용액일 수 있다. 보통, 주사용으로 적합한 약학 조성물은 완충제(예를 들어, 아세트산, 인산 또는 시트르산 완충제), 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트), 선택적으로 안정화제(예를 들어, 인간 알부민) 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본원의 교시와 양립 가능 한 기타 방법에서, 개질된 항체는 부정적인 세포 군집의 부위에 직접 전달될 수 있어서, 치료제에 대한 병든 조직의 노출이 증가할 수 있다.
비경구 투여용 제제는 멸균 수용액 또는 비수용액, 현탁액 및 유화제를 포함한다. 비수성 용매의 예로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 식물성 오일(예를 들어, 올리브 오일) 및 주사용 유기 에스테르(예를 들어, 에틸올리에이트)가 있다. 수성 담체는 물, 알코올성/수성 용액, 유화액 또는 현탁액(식염수 및 완충 매질을 포함함)을 포함한다. 본 개시내용의 조성물 및 방법에서, 약학적으로 허용 가능한 담체로는 0.01 M 내지 0.1 M 또는 0.05 M의 인산 완충제 또는 0.8%의 식염수를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 기타 흔한 비경구 비히클로는 인산나트륨 용액, 링거 덱스트로오스(Ringer's dextrose), 덱스트로오스 및 염화나트륨, 락테이티드 링거(lactated Ringer's), 고정유(fixed oil) 등을 들 수 있다. 정맥 내 비히클로는 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제(링거 덱스트로오스에 기반을 둔 것들) 등을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 기체 등과 같은 보존제 및 기타 첨가제가 또한 존재할 수 있다. 보다 구체적으로는, 주사용으로 적합한 약학 조성물은 멸균 수성 용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 이 같은 경우, 조성물은 멸균되어야 하며, 용이한 주사 가능성이 존재하는 정도로 유체일 것이다. 이는 제조 및 저장 조건 하에 안정적이고, 또한 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보존될 것이다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌글리콜 및 액체 폴리에틸렌글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동성이 유지될 수 있다.
미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살(thimerosal) 등에 의해 달성될 수 있다. 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알코올(예를 들어, 만니톨, 소르비톨) 또는 염화나트륨이 또한 조성물에 포함될 수 있다. 주사용 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 야기될 수 있다.
임의의 경우, 멸균 주사 용액은, 본원에서 나열된 성분들 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 적절한 용매에 활성 화합물(예를 들어, 개질된 결합 폴리펩티드 자체 또는 기타 활성제와 함께)을 요구되는 양으로 혼입시킨 후, 필요한 경우 여과 멸균(filtered sterilization)을 실시함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질 및 상기에 나열된 것을 제외한 요구되는 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 활성 화합물을 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 용액 제조용 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 전형적으로 진공 건조 및 냉동 건조를 포함하며, 이로 인해 활성 성분과 이전에 멸균 여과된 이의 용액으로부터의 임의의 추가적인 목적하는 성분의 분말이 수득된다. 주사용 제제를 가공하여 앰플, 백, 병, 주사기 또는 바이얼과 같은 용기에 채워 넣고, 당해 기술분야에 알려져 있는 방법에 따라 무균 조건에서 밀봉한다. 게다가, 제제는 공-계류 중인 U.S.S.N. 09/259,337 및 U.S.S.N. 09/259,338(각각은 본원에서 참고로 포함됨)에 기술된 것과 같은 키트의 형태로 포장되고 판매될 수 있다. 이 같은 제조 물품은 라벨 또는 포장 삽입물을 포함하며, 이는 연관된 조성물이 자가면역 또는 신생물 질환(neoplastic disorder)을 앓고 있거나 이들 질환에 취약한 개체를 치료하는데 유용하다는 것을 보여준다.
상술한 병태의 치료를 위한 본 개시내용의 조성물의 유효 투여량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리적 상태, 환자가 인간 또는 동물인지의 여부, 투여되는 기타 약물, 치료가 예방적 또는 치료적인지의 여부를 비롯한 많은 상이한 인자에 따라 달라진다. 보통, 환자는 인간이지만, 형질 전환 포유동물을 포함한 비인간 포유동물이 또한 치료될 수 있다. 치료 복용량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 당업자에게 알려져 있는 통상의 방법을 이용하여 적정될 수 있다.
항원 결합 단백질을 이용한 수동 면역화를 위해, 복용량은, 예를 들어 숙주 체중의 약 0.0001 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 및 보다 일반적으로는 0.01 ㎎/㎏ 내지 5 ㎎/㎏(예를 들어, 0.02 ㎎/㎏, 0.25 ㎎/㎏, 0.5 ㎎/㎏, 0.75 ㎎/㎏, l ㎎/㎏, 2 ㎎/㎏ 등)의 범위일 수 있다. 예를 들어, 복용량은 1 ㎎/㎏ 체중 또는 10 ㎎/㎏ 체중일 수 있거나, 1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏의 범위, 예를 들어 적어도 1 ㎎/㎏일 수 있다. 상기 범위의 중간에 있는 투여량은 또한 본 개시내용의 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 이 같은 투여량은 개체에 매일, 격일로, 매주 투여되거나, 경험적 분석에 의해 결정된 임의의 기타 스케줄에 따라 투여될 수 있다. 예시적인 치료는, 예를 들어 적어도 6개월의 장기간에 걸쳐 수회 나눠 투여하는 것을 수반한다. 추가적인 예시적인 치료 용법(treatment regimen)은 2주마다 1회 또는 월 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회의 투여를 수반한다. 예시적인 복용 스케줄은 연일로 1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏ 또는 15 ㎎/㎏, 격일로 30 ㎎/㎏ 또는 매주 60 ㎎/㎏을 포함한다. 일부 방법에서, 상이한 결합 특이성을 갖는 2개 이상의 항원 결합 단백질이 동시에 투여되며, 이 경우 투여되는 각각의 항원 결합 단백질의 복용량은 표시된 범위 내에 있다.
본원에 기술되어 있는 항원 결합 단백질은 수회 나눠 투여될 수 있다. 1회 복용량 사이의 간격은 1주, 1개월 또는 1년일 수 있다. 또한 간격은 환자에서 개질된 결합 폴리펩티드 또는 항원의 혈중 수준을 측정함으로써 표시된 바와 같이 불규칙적일 수 있다. 일부 방법에서, 복용량은 1 ㎍/㎖ 내지 1000 ㎍/㎖의 혈장 개질된 항원 결합 단백질 농도 및 일부 방법에서는 25 ㎍/㎖ 내지 300 ㎍/㎖의 혈장 개질된 항원 결합 단백질 농도를 달성하기 위해 조절된다. 대안적으로, 항원 결합 단백질은 서방형 제형으로서 투여될 수 있으며, 이 경우 보다 덜 빈번한 투여가 요구된다. 항원 결합 단백질에 있어서, 복용량 및 빈도는 환자에서의 항원 결합 단백질의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간화 항체는 가장 긴 반감기를 나타내고, 그 다음으로 키메라 항체 및 비인간 항체이다.
복용량 및 투여 빈도는 치료가 예방적 또는 치료적인지의 여부에 따라 달라질 수 있다. 예방적 응용에서, 본 발명의 항원 결합 단백질 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 환자의 내성을 향상시키기 위해 아직 질병 상태에 있지 않는 환자에게 투여된다. 이 같은 양은 "예방적 유효량"인 것으로 정의된다. 이러한 용도에서, 정확한 양은 이번에도 환자의 건강 상태 및 일반적인 면역력에 의존하지만, 일반적으로는 투여량 당 0.1 ㎎ 내지 25 ㎎, 특히 투여량 당 0.5 ㎎ 내지 2.5 ㎎의 범위이다. 비교적 낮은 복용량이 긴 기간에 걸쳐 비교적 빈번하지 않은 간격으로 투여된다. 일부 환자는 남은 평생 동안 치료를 계속 받는다. 치료적 응용에서, 비교적 짧은 간격 동안의 비교적 높은 복용량(예를 들어, 투여량 당 약 1 ㎎/㎏ 내지 400 ㎎/㎏의 항체; 5 ㎎ 내지 25 ㎎의 복용량이 방사성 면역 접합체용으로 보다 흔히 사용되고, 세포독소-약물 개질 항체의 경우에 보다 높은 복용량이 사용됨)은 종종 질병의 진행이 감소 또는 종료될 때까지, 또는 환자가 질병 증상의 부분 또는 완전한 개선을 나타낼 때까지 요구된다. 그 이후, 환자에는 예방적 용법이 투여될 수 있다.
본원에 기술되어 있는 항원 결합 단백질은 치료(예를 들어, 예방적 또는 치료적)가 필요한 질환 또는 병태를 치료하는데 효과적인 기타 약제와 함께 선택적으로 투여될 수 있다. 본 개시내용의 90Y-표지된 개질된 항체의 유효한 단일 치료 복용량(즉, 치료적 유효량)은 약 5 mCi와 약 75 mCi 사이, 예를 들어 약 10 mCi와 약 40 mCi 사이의 범위이다. 131I-개질된 항체의 유효한 단일 치료 비골수성 절제 투여량은 약 5 mCi와 약 70 mCi 사이, 예를 들어 약 5 mCi와 약 40 mCi 사이의 범위이다. 131I-표지된 항체의 유효한 단일 치료 절제 투여량(즉, 자가 골수 이식이 요구될 수 있음)은 약 30 mCi와 약 600 mCi 사이, 예를 들어 약 50 mCi와 약 500 mCi 미만 사이의 범위이다. 키메라 항체와 함께 쥐 항체와 비교하여 보다 긴 순환 반감기로 인해 131I-표지된 키메라 항체의 유효한 단일 치료 비골수성 절제 투여량은 약 5 mCi와 약 40 mCi 사이의 범위, 예를 들어 약 30 mCi 미만이다. 예를 들어, 111In 표지에 대한 이미지화 기준은 전형적으로 약 5 mCi 미만이다.
항원 결합 단백질이 바로 앞서 기술한 바와 같이 투여될 수 있을 지라도 기타 실시형태에서는 항원 결합 단백질이 일차 요법으로서 그 외의 건강한 환자에게 투여될 수 있다는 점이 강조되어야 한다. 이 같은 실시형태에서, 항원 결합 단백질은 정상 또는 평균 적색 골수 보유량을 갖는 환자 및/또는 하나 이상의 기타 요법을 경험하지 않았거나 현재 경험하지 않은 환자에게 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 보조 요법과 함께 또는 결합하여 개질된 항체 또는 이의 단편의 투여는 요법 및 개시된 항체의 연속적, 동시, 동연적(coextensive), 병용, 부수적 또는 공동 투여 또는 적용을 의미한다. 당업자라면 치료의 전반적인 효율성을 향상시키기 위해 복합 치료 용법의 다양한 성분의 투여 또는 적용의 타이밍을 맞출 수 있다는 것을 인지할 것이다. 당업자(예를 들어, 능숙한 종양학자)라면 선별된 보조 요법 및 본 명세서의 교시에 기초하여 과도한 실험 없이도 효과적인 복합 치료 용법을 용이하게 알아볼 수 있다.
앞서 토의된 바와 같이, 본 개시내용의 항원 결합 단백질, 이의 면역 반응성 단편 또는 재조합체는 포유동물 질환의 생체 내 치료를 위한 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 이와 관련하여, 개시된 항원 결합 단백질이 투여를 용이하게 하고 활성제의 안정성을 조장하기 위해 제형화된다는 것이 인지될 것이다.
본 개시내용에 따른 약학 조성물은 전형적으로 생리 식염수, 비독성 완충제, 보존제 등과 같은 약학적으로 허용 가능한 비독성의 멸균 담체를 포함한다. 본 출원의 목적을 위해, 개질된 항원 결합 단백질, 이의 면역 반응성 단편 또는 재조합체(치료제에 접합되어 있거나 접합되어 있지 않음)의 약학적 유효량은 항원에 대한 효과적인 결합을 달성하고 하나의 이점을 달성하기에 충분한 양, 예를 들어 질병 또는 질환의 증상을 개선하거나 물질 또는 세포를 검출하기에 충분한 양을 의미하도록 유지되어야 한다. 종양 세포의 경우, 개질된 결합 폴리펩티드는 전형적으로 신생 또는 면역 반응성 세포 상의 선별된 면역 반응성 항원과 상호작용할 수 있을 것이며, 이들 세포의 사멸 증가를 제공할 것이다. 물론, 본 개시내용의 약학 조성물은 약학적 유효량의 개질된 결합 폴리펩티드를 제공하기 위해 단일 또는 다수의 투여량으로 투여될 수 있다.
본 개시내용의 범주에 따라서, 본 개시내용의 항원 결합 단백질은 상술한 치료 방법에 따라 인간 또는 기타 동물에 치료 또는 예방 효과를 발휘하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 본 개시내용의 항원 결합 단백질은 알려져 있는 기법에 따라 본 개시내용의 항체를 통상적인 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와 조합함으로써 제조되는 통상적인 투여 형태로 이 같은 인간 또는 기타 동물에 투여될 수 있다. 당업자라면 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제의 형태 및 특징이 이것이 조합되어야 하는 활성 성분의 양, 투여 경로 및 기타 잘 알려져 있는 변수에 의해 좌우된다는 것을 인지할 것이다. 당업자라면 본 개시내용에 기술되어 있는 하나 이상의 결합 폴리펩티드 종을 포함하는 칵테일이 특히 효과적인 것으로 입증될 수 있다는 것을 추가로 인지할 것이다.
본원에 정의된 약학 조성물의 생물학적 활성은, 예를 들어 하기 실시예 또는 WO 99/54440에 기술되어 있거나 슐레레스(Schlereth) 등(문헌[Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1~12])에 의해 기술되어 있는 바와 같이, 세포독성 검정에 의해 결정될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "효능" 또는 "생체 내 효능"은, 예를 들어 표준화된 NCI 반응 기준을 이용하여 본 발명의 약학 조성물의 요법에 대한 반응을 지칭한다. 본 발명의 약학 조성물을 이용한 요법의 성공 또는 생체 내 효능은 이의 의도된 목적을 위한 조성물의 유효성, 즉 이의 목적하는 효과, 즉 병적 세포, 예를 들어 종양 세포의 감소를 야기하는 조성물의 능력을 지칭한다. 생체 내 효능은 백혈구 계수, 감별분류(differential), 형광 활성화된 세포 분별, 골수 흡인을 포함하지만 이에 제한되지 않는 개개의 질병 단위(disease entity)에 대한 확립된 표준 방법에 의해 모니터링될 수 있다. 더욱이, 다양한 질병-특이적 임상적 화학 매개변수 및 기타 확립된 표준 방법이 사용될 수 있다. 또한, 컴퓨터 지원 단층 촬영법, X-선, 핵 자기 공명 단층 촬영법(예를 들어, 국립 암 연구소-기준 기반 반응 평가를 위해[Cheson B D, Horning S J, Coiffier B, Shipp M A, Fisher R I, Connors J M, Lister T A, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris N L, Armitage J O, Carter W, Hoppe R, Canellos G P. Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin's lymphomas. NCI Sponsored International Working Group. J Clin Oncol. 1999 April; 17(4):1244]), 양전자 방출 단층 촬영 스캐닝, 백혈구 계수, 감별분류, 형광 활성화된 세포 분별, 골수 흡인, 림프절 생검/조직분석 및 다양한 림프종-특이적 임상적 화학 매개변수(예를 들어, 락테이트 데하이드로게나아제) 및 기타 확립된 표준 방법이 사용될 수 있다.
암을 치료하는 방법
암을 앓고 있는 개체에서 본원에 기술되어 있는 삼중 특이성 항원 결합 단백질을 이용하여 암을 치료하는 방법이 제공된다. 본원에 기술되어 있는 삼중 특이성 항원 결합 단백질을 이용하여 종양 세포를 표적화 및 살해하는 방법이 또한 제공된다.
본 발명의 삼중 특이성 항원 결합 단백질의 제1 결합 도메인은 종양 세포와 연관이 있는 세포 표면 단백질과 특이적으로 결합한다. 예시적인 실시형태에서, 세포 표면 종양 단백질은 종양 세포에 비해 건강한 세포에서 존재하지 않거나 유의하게 덜 풍부하다. 본 발명의 삼중 특이성 항원 결합 단백질은 우선적으로 이 같은 종양 항원을 갖는 종양 세포에 부착한다. 특정 종양 세포에 연관된 세포 표면 단백질의 예로는 CD33(AML(급성 골수성 백혈병) 세포 상에서 고도로 발현되는 세포 표면 단백질), CD20(B 세포 림프종 및 백혈병에 대해 발현되는 세포 표면 단백질), BCMA(다발성 골수종 세포 상에서 발현되는 세포 표면 단백질), CD19(ALL(급성 림프아구성 백혈병)에 대해 발현되는 세포 표면 단백질) 등을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 개시되어 있는 실시형태의 범주 내에서 벗어나지 않고 적합한 등가물을 이용하여 본원에 기술되어 있는 방법에 대한 기타 적절한 변형 또는 조정이 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게는 매우 자명할 것이다. 이제, 특정 실시형태를 상세하게 설명하였고, 이는 하기 실시예를 참조하여 보다 명확하게 이해될 것이며, 이러한 실시예는 예시의 목적으로만 포함되고, 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1: 예시적인 삼중 특이성 항원 결합 단백질의 설계, 발현 및 정제
배경
삼중 특이성 항원 결합 단백질 치료제를 개발하는데 있어서 주요 과제는 개발 가능성에 대한 바람직한 특징을 유지하면서 매우 다양한 상이한 생물학적 및 약리학적 특성을 지지할 수 있는 구조적으로 다양한 대안으로부터 분자 포맷을 선별하는 것이다. 이 같은 특징으로는 높은 열적 안정성, 높은 용해성, 낮은 응집 성향, 낮은 점도, 화학적 안정성 및 높은 수준의 발현(1리터의 역가 당 그램(g))을 들 수 있다.
단일 숙주 세포에서의 다수(3개)의 경쇄 및 중쇄의 동시 발현에 의한 삼중 특이성 항원 결합 단백질의 생성은 목적하는 삼중 특이성 항원 결합 단백질의 낮은 수율 및 밀접하게 관련이 있는 쌍을 잘못 이룬 오염물질의 제거 시의 어려움으로 인해 매우 힘든 문제일 수 있다. IgG 기반 삼중 특이성 항원 결합 단백질에서, 중쇄는 목적하는 이형 이량체뿐만 아니라 동형 이량체를 형성한다. 추가적으로, 경쇄는 비동족 중쇄와 쌍을 잘못 이룰 수 있다. 그 결과, 다수의 사슬의 동시 발현으로 인해 (목적하는 삼중 특이성 항원 결합 단백질을 제외한) 많은 원치 않는 종이 얻어질 수 있고, 따라서 생성 수율이 낮아질 수 있다.
삼중 특이성 분자를 구축하기 위한 항체의 선별
SP34 및 OKT3에서 유래하는 2개의 상이한 항-CD3 항체는 이중 특이성 및 삼중 특이성 분자의 구축을 위한 CD3에 대한 결합암으로서 사용되었다. 항체 둘 모두는 T-세포를 활성화하는 능력을 특징으로 하고, 암의 치료 시에 사용될 수 있는 치료용 이중 특이성 항체의 생성 시에 사용되어 왔다.
주요 종양 면역 회피 기작인 PD-1/PD-L1 경로를 무력화하기 위해, 항-PD-L1 항체, 즉 KN035(문헌[Cell Discov. 2017; 3: 17004]) 및 특허 출원 WO 2017147383의 서열 번호 9를 이중 특이성 및 삼중 특이성 항체의 생성을 위해 선택되었다. 마우스 항체인 C11D5.3 및 단일 도메인 항체인 269A37346(WO 2018028647에 기술되어 있음)은 이중 특이성 및 삼중 특이성 분자의 구축 시에 BCMA를 표적화하는 엔티티로서 사용되었다. C11D5.3은 가용성 수용체뿐만 아니라 혈장 세포를 포함하는 하나 이상의 서브세트의 B 세포의 표면 상의 BCMA와 특이적으로 결합하고, 또한 다발성 골수종 및 형질세포종에 대해 발현되는 BCMA와 효율적으로 결합한다(WO 2016094304A2에 기술되어 있음). 종양 연관 항원(TAA)에 대한 추가적인 항체로는 HER2-양성 전이성 유방암의 치료를 위한 항-HER2 인간화 단일클론성 항체(문헌[Cho et al., Nature, 421(6924): 756~760 (2003)])인 트라스투즈맙(trastuzumab) 및 필라델피아 염색체(philadelphia chromosome)-음성의 재발 또는 난치성 B-세포 전구체 급성 림프아구성 백혈병(ALL)의 치료용으로 표시된 이중 특이성 T-세포 관여항체 단일클론성 항체인 블리나투모맙을 들 수 있다.
삼중 특이성 분자 및 이중 특이성 대조군의 조립
항-BCMA 항체인 C11D5.3, 특허 출원 WO 2017147383의 서열 번호 9의 항-PD-L1 항체 및 항-CD3 항체인 SP34는 1) 단일 단백질 사슬 상의 펩티드 링커에 의해 연결된 2개의 scFv 단편을 포함하는 탠덤 scFv 융합; 및 2) scFv가 Fab 부분의 경쇄 또는 중쇄 C-말단 융합체 중 하나로서 조립된 Fab의 C-말단 사슬에 대한 scFv 융합체와 같은 2개의 상이한 포맷으로 조립되어 있는 이중 특이성 및 삼중 특이성 항체의 구축용으로 선택되었다. 고도로 안정적이며, 효율적인 이형 이량체화 스캐폴드인 Fab 포맷은 재조합 이중 특이성 및 삼중 특이성 항체 유도체를 생성하기 위해 사용되었다(문헌[Schoonjans et al., J Immunol. 2000 Dec 15; 165(12): 7050~7]). 하기 표 5에는 상기 구조체, 및 탠덤 scFv 융합체 또는 Fab 분자의 C-말단에 연결된 scFv로서의 결합 모이어티의 위치가 나열되어 있다.
Figure pct00018
Fab-scFv 삼중 특이성 분자 내의 항원 결합 부위의 위치
항원 결합 부위의 위치가 결합 활성, 및/또는 면역 세포 살해를 종양 세포로 리디렉팅하는 효율에 영향을 줄 수 있는 지를 조사하기 위해, Fab-scFv 융합체를 구축하여 3개의 가능한 위치, 즉 1) Fab; 2) Fab 경쇄의 C-말단에 연결된 scFv; 및 3) Fab 중쇄의 C-말단에 연결된 scFv에서의 각각의 항원 결합 부위를 분석하였다. 하기 표 6에는 상이한 위치에 결합 모이어티를 갖는 구조체가 나열되어 있다.
Figure pct00019
대안적인 삼중 특이성 포맷의 설계
기타 항체 포맷 또는 상이한 항원 결합 서열이 본 발명의 삼중 특이성 항체를 생성하기 위한 요건(예를 들어, 생물학과의 매칭 원자가(matching valency), 상이한 표적에 대한 결합 활성의 보유, 상이한 표적과 동시에 결합하고 면역 세포를 종양 세포에 물리적으로 연결하는 능력)을 이행할 수 있는지의 여부를 조사하기 위해, 상이한 결합 서열, 상이한 포맷(예를 들어, scFv, sdAb, Fab 또는 Fc 기반) 및 이들의 조합을 이용하여 예시적인 삼중 특이성 분자를 조립하였다.
Fab 기반 구조체에 있어서, scFv 또는 sdAb는 Fab의 C-말단 영역에 융합되었다. Fc 기반 구조체에 있어서, scFv는 Fc 영역 또는 경쇄의 C-말단 영역에 대한 N-말단 또는 C-말단 융합체 중 하나로서 조립되었다. 노브-인투-홀(knobs-into-holes; KIHs) 기술은 Fc 부분의 이형 이량체화를 조장하고 삼중 특이성 분자의 정확한 형성을 방지할 수 있는 사슬의 쌍 형성 오류(mispairing)를 피하기 위해 사용되었다. 하기 표 7에는 대안적인 삼중 특이성 포맷을 갖는 구조체가 나열되어 있다.
Figure pct00020
발현
상이한 항체 사슬(즉, 중쇄 및 경쇄)을 암호화하는 합성 유전자는 트위스트 바이오사이언스 코포레이션(Twist Bioscience Corporation)에서 구축되었으며, HEK 293 6E 세포에서의 일시적인 발현을 위해 발현 벡터에 개별적으로 클로닝하였다. 통상적인 플라스미드 DNA 정제 방법(예를 들어, 퀴아젠 하이스피드(Qiagen HiSpeed) 플라스미드 맥시 키드(maxi kit); 카탈로그 번호: 12662)을 이용하여 발현 벡터 DNA를 제조하였다. 몇몇 예시적인 삼중 특이성 항원 결합 단백질 포맷은 각각의 특정 포맷의 수율 및 순도를 평가하기 위해 HEK293-6E 세포에서 발현되었다.
폴리에틸렌이민(40 kD의 선형 PEI)을 이용하여 현탁액에서 배양된 HEK293-6E 세포에서의 개개의 포유동물 발현 벡터의 일시적인 동시 형질 감염에 의해 삼중 특이성 항원 결합 단백질 및 이중 특이성 항원 결합 단백질 대조군을 발현시켰다. HEK293-6E 세포를 2 mM L-글루타민이 보충된 프리스타일(Freestyle) F17 배지에서 1.7 x 106개의 세포/㎖로 분주하였다. 보충제가 없는 50 ㎕의 배지에 DNA 및 PEI를 개별적으로 첨가함으로써 최종 생성 부피 1 ㎖ 당 DNA를 제조하였다. 분획 둘 모두를 혼합하고, 볼텍싱(vortexing)하고, 15분 동안 방치하여 1:2.5의 DNA:PEI 비율(1 ㎍의 DNA/㎖ 세포)을 얻었다. 세포 및 DNA/PEI 혼합물을 함께 모은 후, 진탕 장치(37℃, 5% CO2, 80% RH) 내에 놓여 있는 적절한 용기 내로 전달하였다. 24시간 후, 최종 생성 부피 1 ㎖ 당 25 ㎕의 트립톤 N1을 첨가하였다.
7일 후, 세포를 원심분리에 의해 수확하고, 멸균 여과하였다. 친화도 단계에 의해 항원 결합 단백질을 정제하였다. Fab 기반 구조체의 친화도 정제를 위해, 6 CV PBS(pH 7.4)로 평형화된 단백질 CH 칼럼(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), #494320005) 상에 상층액을 적재하였다. Capto L 칼럼(지이 헬쓰케어(GE Healthcare), # 17547815)을 이용하여 탠덤 scFv를 정제하였다. 동일한 완충제를 이용한 세척 단계 이후, 100 mM 시트르산(pH 3.0)을 이용한 스텝 용출(step elution)에 의해 칼럼으로부터 항원 결합 단백질을 용출하였다. 목적하는 항원 결합 단백질이 있는 분획을 1 M 트리스 완충제(pH 9.0)에 의해 1:10 비율로 즉시 중화시킨 후, 모으고, 투석하고, 원심 분리에 의해 농축하였다.
농축 및 PBS 완충제에 대한 투석 이후, SDS-PAGE 및 크기 배제 HPLC에 의해 정제된 단백질의 함량 및 순도를 평가하였다. HEK293-6E 세포에서 발현한 후, 단일 포획 단계에 의해 단백질을 정제하고, 분석용 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석하였다.
도 2는 상이한 조합으로 함께 부착된 하나 또는 몇몇 scFv 및/또는 Fab 모듈을 특징으로 하는 다양한 다기능성 단백질을 보여준다. scFv 단편은 이들의 안정성, 발현 수준 및 응집 경향에서의 상당한 다양성을 나타냈다. 따라서, 분자 001 내지 004가 바람직한 생물 물리학적 특징을 갖는 scFv 단편에서 유래하였기 때문에 이들을 참고물질로서 사용하였다(문헌[J Biol Chem. 2010 Mar 19; 285(12): 9054~9066]). 그 결과에 따르면 다양한 이중 특이성 및 삼중 특이성 포맷은 포유동물 세포에서 높은 수준으로 발현되었고, 항원 결합 단백질은 주로 단량체 형태였으며, 단백질의 관찰 가능한 클리핑(clipping) 또는 단편화가 존재하지 않은 것으로 나타났다(도 3).
실시예 2: 삼중 특이성 분자 및 이중 특이성 대조군이 이들의 표적과 결합하는 능력
예시적인 삼중 특이성 항원 결합 단백질이 이들의 개개의 표적에 결합하는 지를 결정하기 위해 결합 ELISA 검정을 수행하였다. 삼중 특이성 항체 CDR1-007이 항원과 결합하는 능력을 평가하였다. 인간 PD-L1 His-태그(노보프로테인(Novoprotein), #C315), 재조합 인간 BCMA Fc 키메라(HEK293-6E 세포에서의 일시적인 발현을 통해 내부에서 생성됨) 및 CD3 엡실론 His-태그(노보프로테인, #C578)에 대한 세포 외 도메인에 대한 결합에 대해 4 ng/㎖ 내지 10 ㎍/㎖ 범위의 최종 농도까지의 CDR-007의 연속 희석액을 ELISA에서 시험하였으며, 각각은 96-웰 플레이트 상에 코팅되었다. 염소 항-카파-LC 항체 HRP(써모 피셔 사이언티픽, #A18853)를 이용하여 삼중 특이성 항체를 검출하였다. 도 4a 내지 도 4c는 삼중 특이성 항체가 3개의 표적과 결합하는 능력을 확인하는, CDR1-007의 농도 의존적 결합을 보여준다.
또한, 삼중 특이성 및 이중 특이성 항체가 BCMA 및 CD3과 동시에 결합하는 능력에 대해 이중 결합 ELISA를 이용하여 평가하였다. 간단하게는, 재조합 인간 BCMA Fc 키메라(HEK293-6E에서 일시적인 형질 감염 이후에 발현됨)로 코팅된 96-웰 ELISA 플레이트에 항체 분자인 CDR1-005, CDR1-007 및 CDR1-008의 연속 희석액을 첨가한 후, 재조합 인간 CD3 엡실론 His-태그 단백질(노보프로테인, 카탈로그 번호: C578)과 2차 연결하였다. 항-His 항체(압캠(Abcam), 카탈로그 번호: ab1187)를 이용하여 항원 쌍에 대한 동시 결합을 검출하였다. 도 5는 이중 특이성 및 삼중 특이성 분자의 BCMA 및 CD3에 대한 농도 의존적 결합을 보여준다. 이들 데이터에 따르면 이중 특이성 및 삼중 특이성 항체가 비슷한 방식으로 BCMA 및 CD3과 동시에 결합하는 것으로 확인되었다.
실시예 3: T 세포의 증식을 유도하는 CD3-결합암의 능력
인간 T 림프구 상의 항원 수용체 분자는 세포 표면 상에서 CD3 (T3) 분자 복합체와 비공유 연관되어 있었다. 항-CD3 단일클론성 항체를 이용한 이러한 복합체의 교란에 의해 T 세포 활성화가 유도될 수 있지만, 이러한 능력은 결합 친화도, 에피토프, 원자가, 항체 포맷 등과 같은 특정 특성에 의존한다.
이중 특이성 항체를 생성하기 위해 융합 단백질 내의 상이한 항원 결합 부위가 연결되면 종종 모 항체와 비교하여 이들의 표적 항원의 친화도가 감소하는 것으로 나타난다. 따라서, 기능성을 보장하기 위해 T 세포 관여항체의 CD3-결합암에 대해 평가하는 동안에 신중하게 고려되어야 할 것이다. T 세포를 활성화하는 CD3 작용성 항체의 능력을 평가하는 가장 흔한 방법들 중 하나는 시험관 내 자극 시의 T 세포 증식을 측정하는 것이다.
본 발명의 CD3-결합암 설계를, CD3+ 저캇 T 세포의 세포 증식을 야기하는 이의 능력에 대해 분석하였다. 항체 CDR1-005를 96-웰 플레이트 표면 상에 최종 농도가 0.01 ㎍/㎖ 내지 1 ㎍/㎖의 범위가 되도록 코팅하였다. 플레이트 표면 상에 고정된 항-CD3은 T 세포 상의 CD3의 가교 결합을 용이하게 하였으며, 따라서 가용성 항체보다 양호한 자극제였다. 저캇 T 세포 백혈병 세포주 E6-1 세포를 완전 RPMI 배지에서 1 ㎖ 당 1 x 106개의 (생존 가능한) 세포로 조절하고, 100 ㎕의 이러한 세포 현탁액을 음성 대조군으로서 항체의 존재 및 부재 하에 항-CD3이 고정되어 있는 96-웰 플레이트 내로 피펫팅(pipetting)하고, 37℃ 및 5% CO2에서 48시간 동안 배양하였다. 이러한 배양 기간 이후, 배양액에 웰 당 WST-1 세포 증식 시약(로슈(Roche), 카탈로그 번호: 5015944001) 10 ㎕을 첨가하고, 37℃ 및 5% CO2에서 최대 5시간 동안 배양하였다. 참조 파장으로서 450 nm 및 620 nm에서 최대 5시간의 배양 동안에 형성된 포르마잔 염료를 몇몇 시점에서 측정하였다.
도 6에 나타나 있는 바와 같이, 포르마잔 염료의 형성은 5시간의 배양 이후에 이의 최대치에 도달하였으며, CDR1-005 내의 CD3-결합암에 의해 자극된 저캇 T 세포가 0.1 ㎍/㎖의 가장 낮은 농도에서도 항-CD3 자극이 없는 세포보다 많이 증식한다는 것을 나타냈다. 이로 인해 T 세포 활성화를 유도하는 CD3-결합암 설계의 적합성이 확인되었다.
실시예 4: 인간 다발성 골수종 세포의 존재 또는 부재 하에 저캇 T 세포의 삼중 특이성 항체 매개 IL-2 사이토카인의 생성
삼중 특이성 항체인 CDR1-007을, 골수종 암세포의 관여 시에 저캇 T-세포에서의 IL-2 사이토카인의 생성을 유도하는 이의 능력에 대해 분석하였다. 저캇 E6-1 T 세포(효과기)를 10nM, 100 nM또는 200 nM의 CDR1-007의 존재 하에 NCI-H929 인간 다발성 골수종 세포(표적) 또는 인간 배아 신장(HEK) 293 세포와 동시 배양하였으며, 이때 효과기 대 표적 세포의 비율은 5:1이었다. 추가적으로, 양성 대조군으로서 T 세포의 비특이적 자극을 위해 저캇 E6-1 T 세포를 1 ㎍/㎖의 파이토헤마글루티닌(PHA)와 함께 또는 없이 동시 배양하였다.
37℃ 및 5% CO2에서 18시간 동안의 배양 이후, 검정 플레이트를 1000 x g에서 10분 동안 원심 분리하고, 후속적인 분석을 위해 상층액을 새로운 96-웰 플레이트 상에 전달하였다. 제조사의 설명서에 따라 인간 IL-2 ELISA 키트(써모 피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호: 88-7025)를 이용하여 인간 IL-2 사이토카인의 정량화를 수행하였다.
도 7에 나타나 있는 바와 같이, 삼중 특이성 항체인 CDR1-007은 H929 골수종 세포의 관여 시에 저캇 T 세포에 의한 IL-2 사이토카인의 생성을 강력하게 유도하였다. CDR1-007은 HEK293 세포와 동시 배양하는 경우에는 저캇 T 세포에 의한 IL-2 생성을 유도하지 않았으며, 이는 암세포의 관여 시에 CDR1-007의 활성이 유발되었다는 것을 보여준다.
실시예 5: 인간 CD3+ T 세포 및 H929 다발성 골수종 세포에 대한 결합 시에 IL-2 사이토카인의 생성을 유도하는 삼중 특이성 및 이중 특이성 항체의 능력
골수종 암세포의 관여 시에 단리된 인간 CD3+ T-세포에서의 IL-2 사이토카인의 생성을 유도하는 능력에 대해 삼중 특이성 항체인 CDR1-007을 이중 특이성 탠덤 scFv BCMA-CD3(CDR1-008)과 일대일로 비교하였다. 간단하게는, 제조사의 설명서에 따라 EasySep 인간 T 세포 단리 키트(스템셀(Stemcell), 카탈로그 번호: 17911)를 이용하여 PBMC로부터 인간 CD3+ T 세포를 단리하였다. 농도가 1 nM 내지 100 nM의 범위인 항체의 존재 하에 1 x 105개의 단리된 CD3+ T 세포(효과기)를 5:1의 효과기 대 표적 세포의 비율로 NCI-H929 인간 다발성 골수종 세포(표적)와 함께 동시 배양하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 18시간 동안의 배양 이후, 검정 플레이트를 상기 실시예 4에서 기술된 바와 같이 가공 처리하였다.
도 8에 나타나 있는 바와 같이, 삼중 특이성 항체인 CDR1-007은 이중 특이성 CDR1-008보다 더 효율적으로 단리된 인간 T 세포에 의한 IL-2 사이토카인의 농도 의존적 생성을 유도하였다. 이들 결과에 따르면 삼중 특이성 항체 CDR1-007 내의 PD-L1에 대한 추가적인 결합 부위가 이중 특이성 CDR1-008과 비교하여 보다 강력한 T 세포 활성화에 기여하는 것으로 나타났다.
실시예 6: H929 골수종 세포의 항체 매개 리디렉팅된 T-세포 세포독성(LDH 방출 검정)
삼중 특이성 항체인 CDR1-007을 H929 인간 다발성 골수종 세포의 T 세포 매개 세포 자멸사를 유도하는 능력에 대해 이중 특이성 항체인 BCMA/CD3(CDR1-008: 도 9a) 및 PD-L1/CD3(CDR1-020: 도 9b)과 일대일로 비교하였다. 간단하게는, 단리된 인간 CD3+ T 세포 및 NCI-H929 인간 다발성 골수종 세포를 이중 특이성 또는 삼중 특이성 항체 중 하나의 존재 하에 실시예 5에 기술되어 있는 바와 같이 동시 배양하였다. 정확한 비교를 위해, 모든 항체 구조체를 동일한 몰농도로 조절하였으며, 이때 최종 농도는 8 pM 내지 200 nM의 범위였다.
37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안의 배양 이후, 피어스(Pierce) LDH 세포독성 검정 키트(써모 피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호: 88954)를 이용하여 인간 골수종 세포의 T 세포 매개 세포독성을 측정하였다. 정규화를 위해, 실험용 웰에서 사용되는 동일한 개수의 H929 세포(20,000개의 세포)를 용균 완충제와 함께 배양함으로써 H929 인간 다발성 골수종 세포의 최대 살해(100% LDH 방출에 상응함)를 구현하였다. 최소 용균은 임의의 시험 항체 없이 CD3+ T 세포와 함께 동시 배양된 H929 세포에 의해 방출된 LDH로서 정의된다. 항체에 의해 매개되는 H929 골수종 세포 살해의 농도-반응 곡선은 삼중 특이성 및 이중 특이성 항체의 농도에 대해 정규화된 LDH 방출 값을 플롯팅(plotting)함으로써 수득되었다. Prism GraphPad 소프트웨어를 이용하여 곡선을 4개 매개변수의 비선형 회귀 S자형 모델에 적용함으로써 EC50 값을 계산하였다.
도 9a 및 도 9b에 나타나 있는 바와 같이, 삼중 특이성 항체인 CDR1-007은 이의 이중 특이성 대응물인 CDR1-008 및 CDR1-020보다 더 강력하게 H929 골수종 세포의 용균을 유도하였다. 이들 결과는, 암세포 항원만을 표적화하는 이중 특이성 구조체와 비교하여 암세포의 보다 강력하고 효과적인 T 세포 매개 살해를 초래하는 PD-L1 차단과 결합된 BCMA를 표적화하는 시너지 효과(synergistic effect)를 시사한다.
실시예 7: 기타 삼중 특이성 분자
다음으로, 이전 실시예에 기술되어 있는 삼중 특이성 CDR1-007의 효과가 1) 각각의 결합 부위가 상이한 위치에서 평가되는 삼중 특이성 Fab-scFv; 및 2) 대안적인 항체 포맷 및/또는 상이한 항원 결합 서열로 전달 가능한지의 여부를 조사하였다.
삼중 특이성 항체 분자가 상이한 표적과 결합하는 능력에 대해 이중 결합 ELISA를 이용하여 시험하였다. 간단하게는, 0.01 pM 내지 10 nM 범위의 최종 농도까지의 삼중 특이성 분자(및 CDR1-007 대조군)의 연속 희석액을 재조합 인간 BCMA Fc 키메라(HEK293-6E에서 일시적인 형질 감염 이후에 발현됨)로 코팅된 96-웰 ELISA 플레이트에 첨가하고, 그 이후에 재조합 인간 CD3 엡실론 His-태그 단백질(노보프로테인, 카탈로그 번호: C578) 또는 재조합 인간 PD-L1 His-태그 단백질(HEK293-6E에서 일시적인 형질 감염 이후에 발현됨) 중 하나와 2차 연결하였다. 항원 쌍에 대한 동시 결합은 항-His 항체(압캠, 카탈로그 번호: ab1187)를 통해 검출하였다. 도 10a 및 도 10b는 Fab-scFv 구조체에서 각각의 결합 부위의 위치가 평가된 삼중 특이성 분자의 BCMA-PD-L1(도 10a) 및 BCMA-CD3(도 10b)에 대한 농도 의존적 결합을 보여준다. 도 11a 및 도 11b는 대안적인 항체 포맷 및 상이한 항원 결합 서열이 평가된 BCMA-PD-L1(도 11a) 및 BCMA-CD3(도 11b)에 대한 농도 의존적 결합을 보여준다. 이들 데이터에서는 3개의 상이한 표적에 대한 결합 활성을 보유하는 삼중 특이성 항체의 능력이 확인되었다.
다음으로, 상이한 삼중 특이성 구조체가 H929 인간 다발성 골수종 세포의 T 세포 매개 살해를 유도하는 능력에 대해 평가하였다. 최종 농도가 100 nM 및 2 nM인 삼중 특이성 항체를 실시예 6에 기술되어 있는 바와 같이 단리된 인간 CD3+ T 세포 및 NCI-H929 인간 다발성 골수종 세포와 함께 배양하였다. 대부분의 대안적인 삼중 특이성 분자는 H929 다발성 골수종 세포의 T-세포 매개 살해를 유사한 방식으로 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다(도 12a 및 도 12b).
실시예 8: 항-PD-L1 항체 친화도 변이체
상술한 실시예에 따르면 PD-L1 신호의 차단이 삼중 특이성 항체의 항-BCMA(종양 항원-결합암) 및 CD3-결합암과 시너지 작용하여 종양을 강력하게 제거하는 것으로 나타냈다. 암세포 상에서 PD-L1이 과발현될지라도 많은 정상 조직에서의 이의 발현은 표적 내의 오프-종양 독성을 초래할 수 있으며, 삼중 특이성 항체의 치료 효능을 최소화할 수 있는 항원 싱크를 야기할 수 있다. 본 실시예에서, PD-L1에 대해 감소된 친화도로 암세포 상의 PD-L1 및 BCMA를 동시 표적화하는 삼중 특이성 T 세포 관여항체 항체를 생성하였다. 이들의 특징으로 인해 종양 세포에 대한 삼중 특이성 항체의 선별적 결합이 용이하게 되었다.
간단하게는, 완전 자동화된 단백질 구조 상동성-모델링 서버(웹사이트: expasy.org/swissmod)를 이용하여 CDR1-007의 PD-L1 결합암에 대한 분자 모델을 생성하였으며, 결합에 중요한 것으로 여겨지는 CDR 영역에서 용매에 노출된 잔기는 알라닌으로의 돌연변이로 인해 선별되었다(M.-P.Lefranc, 2002; 웹사이트: imgt.cines.fr; A. Honegger, 2001; 웹사이트: unizh.ch/~antibody). 표 8은 PD-L1 결합암의 친화도를 감소시키기 위해 후보물질로서 CDR1-007의 CDR-영역에 도입된 알라닌 돌연변이를 보여준다. 10 나노그램의 CDR1-007 발현 벡터를 주형으로 사용하고, 1.5 ㎕의 돌연변이된 프라이머(10 μmol) 및 Q5 부위-디렉팅된 돌연변이 유발 키트(뉴잉글랜드 바이로랩스(New England Biolabs), 카탈로그 번호: E0554S)(제조사의 설명서에 따라 사용됨)를 사용하여 알라닌 돌연변이를 생성하였다. 얻어진 돌연변이체를 HEK293-6E 세포에서 동시 형질 감염시키고, 실시예 1에 기술되어 있는 바와 같이 삼중 특이성 돌연변이체의 발현을 위해 배양하였다. 96-웰 플레이트 상에 코팅된 인간 PD-L1의 세포 외 도메인에 대한 결합을 위해 ELISA에 의해 0.5 ng/㎖ 내지 50 ㎍/㎖ 범위의 최종 농도까지의 항체의 연속 희석액을 시험하였다.
Figure pct00021
도 13에 나타나 있는 바와 같이, 삼중 특이성 돌연변이체의 농도-반응 곡선은 고정된 PD-L1에 대한 상이한 결합 프로파일을 보여주며, 이는 매우 다양한 결합 친화도를 나타낸다. 삼중 특이성 분자인 CDR1-007, CDR1-011 및 CDR1-017은 높은 친화도, 중간 친화도 및 낮은 친화도 범위를 나타내는 것으로 간주되며, 프리게(Friguet) 등(문헌[J Immunol Methods. 1985 Mar 18; 77(2): 305~19])에 의해 기술된 바와 같이 경쟁 ELISA에 의해 용액에서의 친화도 특성 분석용으로 선별되었다. 먼저, 고정된 농도의 삼중 특이성 항체(Ab)와 다양한 농도의 PD-L1 항원(Ag)의 혼합물을 평형상태에 도달하기에 충분한 시간 동안 배양하였다. 이어서, 평형상태에서 불포화 상태로 남아 있는 삼중 특이성 항체(PD-L1 항원과 연관되어 있지 않음)의 농도를 PD-L1-코팅된 플레이트를 이용하여 전형적인 간접 ELISA에 의해 측정하였다. 웰에 코팅된 항원의 양 및 ELISA를 위한 배양 시간은, ELISA 동안에 용액에서의 평형상태가 삼중 특이성-PD-L1 복합체(X)의 해리를 피하기 위해 유의하게 변경되지 않도록 하는 정도였다. 하기 식을 이용하여 스캐차드 플롯(Scatchard plot)으로부터 Kd를 계산하였다:
Figure pct00022
Figure pct00023
친화도 측정을 확인하기 위해, KinExA 3200(사피다인 인스트루먼츠 (Sapidyne Instruments), 미국) 유동 형광광도계를 이용하여 동역학적 배제 검정(KinExA®)에 의해 삼중 특이성 구조체인 CDR1-007 및 CDR1-017의 항-PD-L1 결합암의 결합 친화도를 또한 결정하였다. 연구는 고정된 항체 농도를 갖는 샘플 내의 유리 항체 및 상이한 농도의 항원 PD-L1을 평형상태에서 측정하기 위해 설계되었으며, 반응 혼합은 1 ㎎/㎖의 BSA와 함께 PBS(pH 7.4)에서 수행되었다. 200 pM의 CDR1-007 및 PD-L1 항원을 5 nM 내지 5 pM 범위의 농도로 함유하는 샘플(2배 연속 희석액)을 이용하여 측정을 수행하였다. 삼중 특이성 CDR1-017에 있어서, 1 nM의 항체, 및 PD-L1 항원에 대한 100 nM 내지 100 pM의 2배 연속 희석액을 이용하여 측정을 수행하였다. Kd를 결정하기 위해 KinExA Pro 소프트웨어(버전 4.2.10; 사피다인 인스트루먼츠)를 이용하여 평형 적정 및 동력학 데이터를 1:1 가역적 결합 모델에 적용하였다. Kd 값은 삼중 특이성 CDR1-007의 경우에 21.7 pM 내지 42 pM 범위 내에서 예상되고, 삼중 특이성 CDR1-017의 경우에는 9.4 nM 내지 20.6 nM 범위 내에서 예상되었다. 종합하면, KinExA에 의한 Kd 측정치는 경쟁 ELISA에 의한 용액에서의 친화도 특성 분석에 의해 결정된 값, 및 SPR 실험(본원에 기술하지 않음)에 의해 수득된 일부 예비 값보다 낮았다. KinExA로부터의 친화도 데이터에서는 CDR1-017과 CDR1-007(WT) 사이에서 PD-L1에 대해 약 1000배의 친화도 차이가 입증되었다.
BCMA에 대한 삼중 특이성 항체인 CDR1-007의 친화도는 마이크로스케일 열영동(MicroScale Thermophoresis; MST)을 이용하여 추가로 결정하였다. 인간 BCMA는 형광 염료로 표지하고, 2 nM의 일정한 농도로 유지하였다. 결합 반응은 2 nM의 형광 표지된 BCMA 및 500 nM 내지 15.3 pM 범위의 최종 농도의 CDR1-007을 함유하는 샘플(2배 연속 희석액)을 이용하여 PBS(pH 7.4), 0.05% 트윈-20, 1% BSA에서 수행하였다. 샘플은 25℃에서 5% LED 전력 및 40% 레이저 전력으로 Monolith NT.115 Pico 상에서 분석하였다. 삼중 특이성 항체와 BCMA 사이의 상호작용은 큰 진폭(9 내지 10 유닛) 및 높은 신호 대 노이즈 비율(10.7 내지 14.9)을 나타내며, 이는 최적의 데이터 품질을 나타낸다. BCMA 결합암의 결합 친화도는 2회의 상이한 측정 시에 8.5 내지 9.9 nM인 것으로 결정되었다. 어떠한 점착 또는 응집 효과도 검출되지 않았다.
실시예 9: PD-L1에 대해 상이한 결합 친화도를 갖는 삼중 특이성 항체에 의해 유도된 H929 골수종 세포의 리디렉팅된 T-세포 세포독성
PD-L1에 대해 상이한 결합 친화도를 갖는 삼중 특이성 항체들을, H929 인간 다발성 골수종 세포의 T 세포 매개 세포 자멸사를 유도하는 능력에 대해 비교하였다. 최종 농도가 8 pM 내지 200 nM 범위인 삼중 특이성 항체인 CDR1-007, CDR1-011 및 CDR1-017을 실시예 5에 기술되어 있는 바와 같이 단리된 인간 CD3+ T 세포 및 NCI-H929 인간 다발성 골수종 세포와 함께 배양하였다. 도 14a 및 도 14b에 나타나 있는 바와 같이, 삼중 특이성 항체 모두는 H929 골수종 세포의 강력한 용균을 유도하였으며, EC50 값은 PD-L1에 대한 겉보기 친화도와 일치하였다.
실시예 10: 삼중 특이성 항원 결합 단백질을 이용한 생체 외 검정
다발성 골수종 세포주 및 PBMC, 또는 정상 헌혈자에서 유래한 정제된 T 세포를 이용한 시험관 내 검정은 이들이 다발성 골수종 환자에서의 골수의 면역 억제 환경의 복잡성 및 영향을 전적으로 반영하지 못하므로 일부 제한이 있다. 따라서, 시험관 내 검정보다 환자에서의 상황을 더 밀접하게 모방하는 다발성 골수종 환자에서 유래한 골수 흡입액을 이용하여 생체 외 검정을 수행하였다. 이를 위해, 새로 수득된 세포(냉동 저장하지 않음)를 새로 진단된 다발성 골수종 환자, 재발된 다발성 골수종 환자 및 여러 번 재발된 다발성 골수종 환자로부터 수집된 골수 흡입액으로부터 제조하였다. 유동 세포 분석법을 통해 마커-양성 세포의 비율(%)을 결정하기 위해 얻어진 단핵세포 현탁액을 분석하였다. 이어서, 5% CO2가 보충된 10% FBS 함유 RPMI 배양 배지(37℃)에서 삼중 특이성 화합물 및 관련 대조군의 존재 하에 단핵세포 현탁액을 384-웰 이미지화 플레이트에 넣었다. 최대 72 시간의 배양 시간 이후, 문헌[Nat Chem Biol. 2017 Jun; 13(6): 681~690]에 기술되어 있는 바와 같이 자동화 현미경 플랫폼(automated microscopy platform)을 이용하여 배양액을 면역 형광 염색 및 이미지화하였다. 모든 화합물은 4개의 농도에서 기술적으로 5회 반복 검정하였다. 이미지 기반 생체 외 시험에서 평가된 화합물은 PD-L1에 대해 높은 친화도, 중간 친화도 및 낮은 친화도에 (각각) 상응하는 CDR1-007, CDR1-011 및 CDR1-017, 이중 특이성 대조군(CDR1-008), 이중 특이성 항체 CDR1-008의 조합, 항-PD-L1 억제제인 아벨루맙(Avelumab)(문헌[Expert Opin. Biol. Ther. 2017. 17(4): 515~523]) 및 음성 대조군으로서의 PBS이었다.
골수 샘플 내의 상이한 세포 군집은 혈장 세포의 경우에 CD138, CD269 또는 CD319에 대해 형광 태깅된 항체, T 세포의 경우에 CD3에 대해 형광 태깅된 항체 및 단핵구의 경우에 CD14에 대해 형광 태깅된 항체를 이용하여 분류하였다. 각각의 환자 샘플에 대한 골수 흡입액의 유동 세포 분석에서는 세포 군집에 대한 비율(%)이 상이하고 골수 샘플의 혈장 세포의 비율(4% 내지 최대 58%)과 다발성 골수종 환자에 대한 질병 상태 사이에서의 일관성이 강한 것으로 나타났다(도 15).
T 세포와 정상 세포의 가교 결합을 회피하는 PD-L1에 대해 상이한 친화도를 갖는 삼중 특이성 항체의 능력을 생체 외에서 평가하였다. 환자 샘플 및 시험 화합물을 함유하고 있는 이미지화 플레이트를 24시간 동안 배양하고, 형광 태깅된 항체 및 정상 세포를 이용하여 CD3+ 세포를 DAPI-염색 유래 핵 검출(세포 외 마커인 CD3, CD138, CD269, CD319 또는 CD14에 대해 염색하지 않음)에 기초하여 확인하였다. 정상 세포와 CD3+ 세포의 상호작용은 문헌[Nat. Chem. Biol. 2017 June; 13(6): 681~690]에 기술되어 있는 바와 같이 상호작용 점수에 기초하여 평가하였다. 증가된 세포간 상호작용은 새로 진단된 다발성 골수종 환자(도 16a), 재발된 다발성 골수종 환자(도 16b) 및 여러 번 재발된 다발성 골수종 환자(도 16c)에서 유래한 샘플에서 CDR1-007 및 CDR1-011과 함께 배양된 CD3+ 세포와 정상 세포 사이에서 관찰되었다. 중요하게는, CDR1-017은 정상 세포와 CD3+ 세포의 상호작용을 증가시키지 않았으며, 이는 PD-L1에 대한 친화도의 감소가 PD-L1만을 발현하는 정상 세포에 대한 삼중 특이성 CDR1-017의 결합을 성공적으로 감소시켰다는 것을 보여준다.
이어서, CDR1-017 삼중 특이성 항체가 CD3+ T 세포를 CD138, CD269 또는 CD319에 대해 염색하는 표적 세포 군집으로 리디렉팅하는 능력에 대해 평가하였다. 도 22에 나타나 있는 바와 같이, 삼중 특이성 항체인 CDR1-017(채워진 박스)은 상이한 다발성 골수종 환자에서 유래한 샘플 내의 T 세포와 혈장 세포 사이의 상호작용을 이중 특이성 항체인 CDR1-008(빈 박스)보다 더 효율적으로 증가시켰다. 이들 결과는 삼중 특이성 항체인 CDR1-017 내의 PD-L1에 대한 추가적인 결합 부위가 이중 특이성 항체인 CDR1-008과 비교하여 T 세포의 보다 효율적인 리디렉션에 기여한다는 것을 시시하였다.
상이한 판독에서, 시험 화합물의 존재 하에 CD3+ 군집 상에서의 CD25 발현 강도를 정량화함으로써 T 세포 활성화를 평가하였다. 도 17a 내지 도 17c는 CDR1-017이 세포 군집의 상이한 비율에 관계없이 새로 진단된 환자, 재발된 환자 및 여러 번 재발된 환자에서 유래한 T 세포를 강력하게 활성화한다는 것을 보여준다. 실제로, CDR1-017은 항-PD-L1과 BCMA/CD3 이중 특이성 항체를 통해 수득된 T 세포 활성화뿐만 아니라 BCMA/CD3 이중 특이성 항체를 이용하여 달성된 T 세포 활성화의 수준을 유의하게 능가하였다.
이러한 실험에 따르면 CDR1-017이 T 세포를 암세포로 효과적으로 리디렉팅하고, 동시에 PD-L1을 발현하는 세포에 의해 생성된 잠재적인 '항원 싱크'를 회피하면서 PD-1/PD-L1 차단을 통해 T 세포의 국부적 활성화를 유도한다는 것이 증명되었다. 종합하면, 이들 결과에 따르면 복합 요법의 시너지 혜택을 종양 세포로 특이적으로 디렉팅하기 위한 실행 가능한 전략으로서 종양 항원과 함께 CD3 및 PD-L1을 표적화하는 삼중 특이성 항체가 확립되었다.
실시예 11: 열적 안정성 평가
본 발명의 항체를 이용한 열적 풀림(thermal unfolding) 실험을 2개의 방법, 1) 통상적인 시차 주사 형광측정법(DSF); 및 2) 나노-DSF를 이용하여 수행하였다. 간단하게는, DSF 실험의 경우, 선형 온도 램프(linear temperature ramp)를 적용하여 단백질 샘플을 풀리게 하였으며, 단백질 풀림은 가열 시에 용매에 노출되는 소수성 패치(hydrophobic patch)를 갖는 형광 염료(SYPRO® Orange)의 상호작용에 기초하여 검출되었다. DSF에 의한 열적 풀림 시험에 대한 대표적인 데이터는 도 18에 나타나 있다. 25℃에서 98℃까지의 온도 기울기를 이용하여 3℃/분의 가열 속도로 샘플을 10 mM 인산나트륨(pH 6.5) 및 150 mM NaCl 완충제에서 2 μM 내지 3 μM 범위의 농도에서 측정하였다. CDR1-007, CDR1-011 및 CDR1-017은 74℃에서의 풀림 전이와 함께 높은 안정성을 나타냈다. 나노DSF 실험의 경우, 7개의 삼중 특이성 항체 및 2개의 Fab를 1.6 μM 내지 5 μM 범위의 농도에서 측정하였으며, 여기에 Prometheus NT. Plex(나노템퍼(Nanotemper))를 이용하여 1℃/분의 가열 속도로 20℃에서 95℃까지의 온도 기울기를 적용하였다. μDSC 데이터와 나노DSF로부터의 Tm 데이터의 비교에 따르면 CDR1-007, CDR1-0011 및 CDR1-017에 대해 단일 풀림 사건이 검출되는 방법들 사이에는 일치가 양호한 것으로 나타났다. DSF에서 결정된 보다 높은 Tm은 보다 빠른 스캔 속도에 기인하였다.
실시예 12: 삼중 특이성 항체를 이용한 안정성 연구
삼중 특이성 항체의 올리고머화/단편화 경향을 평가하기 위해, CDR1-007, CDR1-011 및 CDR1-017을 제형 완충제(10 mM 인산염, 140 mM NaCl; pH 6.5)에서 10 ㎎/㎖까지 농축하고, 37℃에서 2주 동안 배양하였다. 단량체성 단백질, 응집체 및 저분자량 종의 정량화를 위해 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 샘플을 14일간의 배양 이전 및 이후에 분석하였다. TSKgel Super SW2000 칼럼(토소 바이오사이언스(TOSOH Bioscience)) 상의 HPLC에 의해 비단량체성 종으로부터 단량체를 용해하였다. 단량체성 단백질의 비율(%)은 모든 생성물 피크의 총 면적으로 나눈 단량체 피크의 면적으로서 계산하였다.
모든 삼중 특이성 샘플은 37℃에서의 2주간 배양 이후에 최적화되지 않은 완충제에서 양호한 안정성을 나타냈다. 도 19는 CDR1-007(도 19a), CDR1-011(도 19b) 및 CDR1-017(도 19c)에 대한 크기 배제 크로마토그래피 분석을 보여준다. 주요 피크는 대략 7.8분(예상 용출 시간과 일치함) 이후에 칼럼으로부터 용출된 단량체성 단백질에 할당되었으며, 단량체와 응집체 피크(단편도 포함) 사이에는 양호한 해상도가 수득되었다. 배양 이전의 삼중 특이성 단백질 샘플의 단량체 함량은 CDR1-007 및 CDR1-011의 경우에 대략 94%이고, CDR1-017의 경우에 92%이었다. 37℃에서 2주간의 배양 이후 최적화되지 않은 완충제에서의 샘플의 단량체 손실은 모든 샘플에 있어서 약 4%이었다. 추가적인 피크는 규정된 분자량의 응집체 및 저분자량 종에 할당되었다.
실시예 13: 암 세포주의 관여 시에 T 세포를 활성화하는 상이한 TAA에 대해 특이성을 갖는 삼중 특이성 항체의 능력
상이한 종양 연관 항원(TAA)에 결합하는 3개의 삼중 특이성 항체를, 관련 암 세포주의 연관 시에 단리된 인간 CD3+ 세포에서 IL-2 사이토카인의 생성을 유도하는 이들의 능력에 대해 평가하였다. CD3, PD-L1 및 CD19에 대해 특이성을 갖는 항체인 CDR1-061 및 CD3, PD-L1 및 HER2에 대해 특이성을 갖는 CDR1-08을, IL-2 생성 함수로서 측정된 T 세포를 활성화하는 이들의 능력에 대해 이들 개개의 이중 특이성 대조군(CDR1-063 및 CDR1-083)과 일대일 비교하였다. BCMA에 대해 특이성을 갖는 삼중 특이성 항체인 CDR1-007 및 이중 특이성 대조군인 CDR1-008을 또한 참조물질로서 포함시켰다.
간단하게는, 인간 CD3+ T 세포를 실시예 4 및 실시예 5에 기술되어 있는 바와 같이 PBMC로부터 단리하고, 1 x 105개의 단리된 CD3+ T 세포(효과기)를 0.1 nM 및 2 nM 농도의 항체의 존재 하에 5:1의 효과기 대 표적 세포의 비율로 NCI-H929 인간 다발성 골수종 세포, B-세포 림프종 세포주 Raji(ATCC® CCL-86TM) 및 인간 결장 암종 세포주 HCT116(ATCC® CCL-247TM)와 함께 동시 배양하였다. 도 20은 상이한 삼중 특이성 항체 및 이들 개개의 이중 특이성 대조군의 존재 하에 H929 다발성 골수종 세포(도 20a), Raji 림프종 세포(도 20b) 및 HCT116 세포(도 20c)와 함께 동시 배양된 T 세포의 상층액에서 측정된 IL-2를 보여준다. 이들 실험 결과에 따르면 3개의 삼중 특이성 항체 모두는 단리된 인간 T 세포에 의한 IL-2 사이토카인의 생성을 이중 특이성 대조군보다 더 효율적으로 유도하는 것으로 나타나 있다. 이는 이러한 접근법이 인간 T 세포 활성화의 PD-L1 매개 억제를 구제하기 위해 일부 악성 종양에서 효과적으로 사용될 수 있다는 것을 보여준다.

Claims (66)

  1. 삼중 특이성 항원 결합 단백질로서,
    a) 종양 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인;
    b) 상기 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인; 및
    c) 면역 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제3 결합 도메인을 포함하며,
    이때 상기 제1 결합 도메인은 비종양 세포 또는 상기 세포 표면 단백질의 가용성 형태에 대한 결합을 억제하도록 감소된 친화도로 종양 세포의 세포 표면 단백질에 결합하는 것인, 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  2. 삼중 특이성 항원 결합 단백질로서,
    a) 종양 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인;
    b) 상기 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인; 및
    c) 면역 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제3 결합 도메인을 포함하며,
    이때 상기 제1 및 제2 결합 도메인은 비종양 세포에 대한 결합을 억제하도록 감소된 친화도로 표적 항원과 결합하는 것인, 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 종양 세포의 세포 표면 단백질은 BCMA, CD19, CD20, CD33, CD123, CEA, LMP1, LMP2, PSMA, FAP 및 HER2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 결합 도메인은 상기 종양 세포 상의 BCMA와 결합하는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질은 CD40, CD47, CD80, CD86, GAL9, PD-L1 및 PD-L2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 결합 도메인은 상기 종양 세포 상의 PD-L1과 결합하는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 결합 도메인은 상기 면역 세포 상의 CD3, TCRα, TCRβ, CD16, NKG2D, CD89, CD64 또는 CD32a와 결합하는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 결합 도메인은 상기 면역 세포 상의 CD3과 결합하는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 결합 도메인의 친화도는 약 1 nM과 약 100 nM 사이인 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 결합 도메인의 친화도는 약 1 nM과 약 100 nM 사이인 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 결합 도메인의 친화도는 약 10 nM과 약 80 nM 사이인 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 결합 도메인의 친화도는 약 10 nM과 약 80 nM 사이인 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 결합 도메인은 결합 친화력(binding avidity)을 증가시키기 위해 상기 동일한 세포 상의 표적 항원과 결합하는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 결합 도메인은 건강한 세포 또는 상기 세포 표면 단백질의 가용성 형태에 대한 가교 결합을 감소시키기 위해 상기 종양 세포의 세포 표면 단백질에 대한 낮은 친화도를 포함하는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 결합 도메인은 건강한 세포에 대한 가교 결합을 감소시키기 위해 상기 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질에 대한 낮은 친화도를 포함하는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 결합 도메인 각각은 상기 종양 세포의 표적 항원에 대한 낮은 친화도를 포함하며, 이때 상기 삼중 특이성 항원 결합 단백질은 건강한 세포에 대한 가교 결합 대비 상기 종양 세포에 대한 향상된 가교 결합을 포함하는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 결합 도메인은 건강한 조직에 대한 비표적 결합(off-target binding)을 감소시키기 위해 상기 동일한 세포 상의 표적 항원과 결합하는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3 결합 도메인은 감소된 비표적 결합을 갖는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 세포의 세포 표면 단백질은 종양 세포 대비 건강한 세포 상에서 존재하지 않거나 제한적인 발현을 나타내는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 결합 도메인은 건강한 세포 상에서의 관문 억제를 감소시키기 위해 상기 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질에 대한 낮은 친화도를 갖는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3 결합 도메인은 항체를 포함하는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3 결합 도메인은 scFv, sdAb 또는 Fab 단편을 포함하는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 결합 도메인은 1가인 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 결합 도메인은 1가인 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3 결합 도메인은 하나 이상의 링커에 의해 함께 연결되는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 삼중 특이성 항원 결합 단백질은 약 75 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량을 갖는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 삼중 특이성 항원 결합 단백질은 약 60 kDa 이하의 분자량을 갖는 항원 결합 단백질 대비 증가된 혈청 반감기를 갖는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  28. 삼중 특이성 항원 결합 단백질로서,
    a) 종양 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인;
    b) 상기 종양 세포의 표면 상의 PD-L1에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인; 및
    c) T 세포의 표면 상의 CD3에 결합할 수 있는 제3 결합 도메인을 포함하며,
    이때 상기 제1 및 제2 결합 도메인은 종양 세포의 세포 표면 단백질에 결합하고, 비종양 세포에 대한 결합을 억제하도록 감소된 친화도로 PD-L1에 결합하는 것인, 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  29. 제28항에 있어서, 상기 종양 세포의 세포 표면 단백질은 BCMA, CD19, CD20, CD33, CD123, CEA, LMP1, LMP2, PSMA, FAP 및 HER2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  30. 제29항에 있어서, 상기 제1 결합 도메인은 상기 종양 세포 상의 BCMA와 결합하는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 결합 도메인의 친화도는 약 1 nM과 약 100 nM 사이인 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 결합 도메인의 친화도는 약 1 nM과 약 100 nM 사이인 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 결합 도메인의 친화도는 약 10 nM과 약 80 nM 사이인 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  34. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 결합 도메인의 친화도는 약 1 nM과 약 80 nM 사이인 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  35. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 결합 도메인은 결합 친화력을 증가시키기 위해 상기 동일한 세포 상의 표적 항원과 결합하는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  36. 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 결합 도메인은 건강한 세포 또는 상기 세포 표면 단백질의 가용성 형태에 대한 가교 결합을 감소시키기 위해 상기 종양 세포의 세포 표면 단백질에 대한 낮은 친화도를 포함하는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  37. 제28항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 결합 도메인은 건강한 세포에 대한 가교 결합을 감소시키기 위해 상기 종양 세포의 표면 상의 PD-L1에 대한 낮은 친화도를 포함하는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  38. 제28항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 결합 도메인 각각은 상기 종양 세포의 표적 항원에 대한 낮은 친화도를 포함하며, 이때 상기 삼중 특이성 항원 결합 단백질은 건강한 세포에 대한 가교 결합 대비 상기 종양 세포에 대한 향상된 가교 결합을 포함하는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  39. 제28항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 결합 도메인은 건강한 조직에 대한 비표적 결합을 감소시키기 위해 상기 동일한 세포 상의 표적 항원과 결합하는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  40. 제28항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3 결합 도메인은 감소된 비표적 결합을 갖는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  41. 제28항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 세포의 세포 표면 단백질은 종양 세포 대비 건강한 세포 상에서 존재하지 않거나 제한적인 발현을 나타내는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  42. 제28항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 결합 도메인은 건강한 세포 상에서의 관문 억제를 감소시키기 위해 상기 종양 세포의 표면 상의 PD-L1에 대한 낮은 친화도를 갖는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  43. 제28항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3 결합 도메인은 항체를 포함하는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  44. 제28항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3 결합 도메인은 scFv, sdAb 또는 Fab 단편을 포함하는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  45. 제28항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 결합 도메인은 1가인 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  46. 제28항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 결합 도메인은 1가인 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  47. 제28항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3 결합 도메인은 하나 이상의 링커에 의해 함께 연결되는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  48. 제28항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 삼중 특이성 항원 결합 단백질은 약 75 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량을 갖는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  49. 제28항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 삼중 특이성 항원 결합 단백질은 약 60 kDa 이하의 분자량을 갖는 항원 결합 단백질 대비 증가된 혈청 반감기를 갖는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  50. 삼중 특이성 항원 결합 단백질로서,
    a) 종양 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제1 항체 결합 도메인;
    b) 상기 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질에 결합할 수 있는 제2 항체 결합 도메인; 및
    c) 면역 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제3 항체 결합 도메인을 포함하는 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
    [청구항 50]
    2개의 상이한 사슬을 포함하는 삼중 특이성 항원 결합 단백질로서,
    a) 하나의 사슬은 적어도 하나의 추가적인 결합 도메인에 연결된 Fab 단편의 적어도 하나의 중쇄(Fd 단편)를 포함하고;
    b) 다른 사슬은 적어도 하나의 추가적인 결합 도메인에 연결된 Fab 단편의 적어도 하나의 경쇄(L)를 포함하며,
    이때 상기 Fab 도메인은 선택적으로 상기 추가적인 결합 도메인이 선택적으로 연결되어 있는 특정 이형 이량체화 스캐폴드(heterodimerization scaffold)로서 작용하고, 상기 결합 도메인은 상이한 특이성을 갖는 것인, 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  51. 제50항에 있어서, 상기 추가적인 결합 도메인은 scFv 또는 sdAb인 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  52. 제50항에 있어서, 상기 삼중 특이성 결합 단백질은,
    i) 종양 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인;
    ii) 상기 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인; 및
    iii) 면역 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제3 결합 도메인을 포함하는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  53. 제50항에 있어서, 상기 추가적인 결합 도메인은 상기 Fab 단편의 중쇄 또는 경쇄의 N 말단 또는 C 말단에 연결되어 있는 것인 삼중 특이성 항원 결합 단백질.
  54. 개체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    상기 개체에 치료적 유효량의 삼중 특이성 항원 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함하며,
    이때 상기 삼중 특이성 항원 결합 단백질은,
    a) 종양 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인;
    b) 상기 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인; 및
    c) 면역 세포의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 제3 결합 도메인을 포함하며,
    이때 상기 제1 및 제2 결합 도메인은 비종양 세포에 대한 결합을 억제하도록 감소된 친화도로 표적 항원에 결합하는 것인, 개체에서 암을 치료하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 종양 세포의 세포 표면 단백질은 BCMA, CD19, CD20, CD33, CD123, CEA, LMP1, LMP2, PSMA, FAP 및 HER2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 제1 결합 도메인은 상기 종양 세포 상의 BCMA와 결합하는 것인 방법.
  57. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질은 CD40, CD47, CD80, CD86, GAL9, PD-L1 및 PD-L2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 제2 결합 도메인은 상기 종양 세포 상의 PD-L1과 결합하는 것인 방법.
  59. 제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 결합 도메인은 상기 면역 세포 상의 CD3, TCRα, TCRβ, CD16, NKG2D, CD89, CD64 또는 CD32a와 결합하는 것인 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 제3 결합 도메인은 상기 면역 세포 상의 CD3과 결합하는 것인 방법.
  61. 제54항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 흑색종, EBV 연관 암, 및 B 세포 림프종 및 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  62. 종양 세포의 세포 표면 단백질 및/또는 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 식별하는 생체 외 방법(ex vivo method)으로서,
    a) 암을 앓고 있는 환자로부터 종양 세포를 단리하는 단계;
    b) 상기 종양 세포를 일군의 항원 결합 도메인과 접촉시키는 단계;
    c) 항원 결합 도메인의 이들의 표적 항원에 대한 결합 친화도를 결정하는 단계; 및
    d) 대조군 항원 결합 도메인 대비 보다 약한 친화도를 갖는 항원 결합 도메인을 선별하는 단계를 포함하는 것인, 생체 외 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 선별된 항원 결합 도메인을 삼중 특이성 항원 결합 단백질 내로 혼입하는 단계 e)를 추가로 포함하는 것인 생체 외 방법.
  64. 종양 세포의 세포 표면 단백질 및 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질에 대한 결합 중 하나 또는 둘 모두를 할 수 있는 항원 결합 도메인을 식별하는 생체 외 방법으로서,
    a) 암을 앓고 있는 환자로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 골수 혈장 세포(PC) 및 자가 골수 침윤성 T 세포를 단리하는 단계;
    b) 상기 PBMC 또는 PC를 일군의 삼중 특이성 항원 결합 단백질과 접촉시키는 단계로서, 상기 삼중 특이성 항원 결합 단백질의 제1 도메인은 T 세포 상의 CD3에 결합하고, 상기 삼중 특이성 항원 결합 단백질의 제2 도메인은 종양 세포의 세포 표면 단백질 및/또는 종양 세포의 세포 표면 면역 관문 단백질에 결합하는 단계;
    c) 면역 매개 암세포 살해에 미치는 하나 이상의 삼중 특이성 항원 결합 단백질의 효과를 측정함으로써 암세포의 약물 살해를 결정하는 단계; 및
    d) 상기 삼중 특이성 항원 결합 단백질을 면역 매개 암세포 살해를 유도하는 이들의 능력에 기초하여 선별하는 단계를 포함하는 것인, 생체 외 방법.
  65. 제64항에 있어서, 면역 매개 암세포 살해에 미치는 삼중 특이성 항원 결합 단백질의 효과는 락테이트 데하이드로게나아제(lactate dehydrogenase; LDH) 방출을 포함하는 것인 생체 외 방법.
  66. 제64항에 있어서, 면역 매개 암세포 살해에 미치는 삼중 특이성 항원 결합 단백질의 효과는 표적 암세포 개수의 감소를 포함하는 것인 생체 외 방법.
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