CN109182226A - 一种高产γ-氨基丁酸的乳酸菌诱变方法及筛选方法 - Google Patents

一种高产γ-氨基丁酸的乳酸菌诱变方法及筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高产γ‑氨基丁酸的乳酸菌诱变方法及筛选方法，包括以下步骤：选取实验室保存的乳酸片球菌ZY‑6(Weissellaviridescens ZY‑6)为出发菌株，经过活化培养、菌悬液制备、诱变处理、培养得到诱变菌，再经诱变菌发酵培养、γ‑氨基丁酸产生菌初筛、高产γ‑氨基丁酸乳酸菌的复筛挑选出γ‑氨基丁酸产量较高的菌株。本发明方法简单易行，成本低，诱变株产GABA量高且稳定，是乳酸菌获得高效产GABA的一种有效方法，菌种长久保藏、应用前景广阔，而且反应条件温和，以L‑谷氨酸或L‑谷氨酸钠为唯一底物，转化液中无其他培养基成分，利用乳酸菌可能存在的谷氨酸脱羧酶，将底物L‑谷氨酸或L‑谷氨酸钠转化为γ‑氨基丁酸，通过纸层析分析转化液中是否存在GABA，提高筛选效率。

Description

一种高产γ-氨基丁酸的乳酸菌诱变方法及筛选方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种乳酸菌的诱变，具体涉及一种高产γ-氨基丁酸的乳酸菌诱变方法及筛选方法。
背景技术
γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid，GABA)，又叫氨酪酸，是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，为哺乳动物中枢神经***中最重要的抑制性神经递质，具有重要的生理功能：如降血压作用、改善脑机能、延长记忆力、镇静神经、抗焦虑作用、改善肝功能、活化肾功能和降低胆固醇。GABA除具有上述的生理作用外，还有调节激素分泌，改善更年期综合症，促进酒精代谢、消臭、高效减肥、诱发人***顶体、促进动物的抗病和生长等功能。另外，大量研究证明，GABA的缺乏将导致癫痫病的发生，因此在饮食中适当补充GABA对由于GABA的缺乏引起的癫痫病有一定预防作用。由于其特殊生理功能，GABA已经成为一种新型功能性因子，正被广泛用于食品保健、医药、化工和农业等行业，具有广阔的应用前景。
制备GABA的方法主要有化学合成法和生物合成法，其中生物合成法又包括植物富集法和微生物发酵法。生物合成法是利用生物体内的谷氨酸脱羧酶(glutamatedecarboxylase，GAD)作为催化剂，将L-谷氨酸或其钠盐α-脱羧生成GABA。相比而言，化学合成反应条件剧烈，采用的化学溶剂具有毒性和腐蚀性，副产物多，安全性差，主要应用于化工行业。生物合成法较化学合成法具有条件温和，环境污染相对较低、安全性高等优点。另外，由于微生物具有生长速度快、生长条件较简单、代谢过程特殊和分布广泛等特点，是生物酶的重要来源。因此，利用微生物生产GABA，不受资源、环境和空间的限制，具有显著的优点。
谷氨酸脱羧酶广泛分布于各种有机体活细胞，是生物催化谷氨酸脱羧生成GABA的唯一酶。而在多种细菌、真菌微生物中发现了谷氨酸脱羧酶的存在。乳酸菌被公认是一种食品安全级的微生物，研究发现乳酸菌也具有谷氨酸脱羧酶活性，可以催化GABA的合成，具有很高的潜在价值。目前已经发现多种乳酸菌具有GABA活力，但未见绿色魏斯氏菌产GABA的报道。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种高产γ-氨基丁酸的乳酸菌诱变方法。
本发明的目的之二是提供一种高产γ-氨基丁酸的乳酸菌筛选方法。
为实现上述目的，本发明提供一种高产γ-氨基丁酸的乳酸菌诱变方法，包括以下步骤：
(1)发酵液的制备：选取实验室保存的乳酸片球菌ZY-6(Weissella viridescensZY-6)作为出发菌株，该菌株已于2018年5月28日保存在中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60377，将该菌株接种到马铃薯或马丁氏液体培养基中活化培养2d-6d，得到发酵液；
(2)菌悬液制备：取上述发酵液10mL于三角瓶中，并加入50颗玻璃珠，震荡10min-20min，然后用无菌水按照1:10，1:100，1:1000比例，稀释成不同浓度，制得菌悬液；
(3)诱变处理：
①紫外诱变处理：不同浓度的菌悬液在红光灯下各吸5ml于9cm双碟中，放入搅拌子，于15W、距离照射菌悬液30cm的紫外灯下，分别照射0s、15s、30s、45s、60s、75s、90s，制定致死率曲线，选择致死率在70％-90％的时间诱变，制得处理液；
②处理液的分离：吸0.5ml的处理液于第1号稀释管中，得10-1稀释菌液，如此重复6次，依次稀释到10-6稀释菌液；
③紫外-氯化锂复合处理：将稀释到10-6稀释菌液重复上述紫外诱变处理进行二次诱变，将二次诱变后的菌液涂布在含0.2％-0.3％的氯化锂培养基上；
(4)培养：所有涂布完成的培养基放入培养箱中在35℃-40℃条件下培养36h-72h。
进一步地，步骤(3)中进行紫外照射前紫外灯先预热15-20min，使光波稳定。
优选的，步骤(1)中，所述马铃薯液体培养基的组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15～20g和水1000mL；所述马丁氏液体培养基的组成为：磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂15～20g和水1000ml。
优选的，步骤(3)中，所述氯化锂培养基的组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15～20g、水1000mL和0.2g～0.3氯化锂；或者是磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂15～20g、水1000ml和0.2g～0.3氯化锂。
本发明还提供一种高产γ-氨基丁酸的乳酸菌的筛选方法，包括以下步骤：
(1)供试乳酸菌发酵培养：诱变后的菌种接种于MRS培养基中，用MRS培养基对供试乳酸菌在41℃静置厌氧培养24h，以3％的接种量接种到含有1％L-谷氨酸钠的GYP发酵培养基中，静置厌氧培养48h，取发酵液进行离心，转速2000r/min、离心时间10min，取上清液；
(2)γ-氨基丁酸产生菌初步筛选：用微量进样器吸取上清液2μL，点样于G型薄层硅胶板上，点样线距底边2cm，点样点间距1.5cm，以展开剂***：正丁醇：乙酸：水＝5：3：2，采用4g/L茚三酮作为显色剂，当层析到达硅胶板上端1-2cm时结束层析，在65℃条件下烘干滤纸，以是否存在γ-氨基丁酸对应的斑点作为检测指标，同时以1％的γ-氨基丁酸和L-谷氨酸钠标准样品做为对照检测，筛选出能够合成γ-氨基丁酸的乳酸菌；
(3)高产γ-氨基丁酸乳酸菌的复筛：将初筛出的乳酸菌菌株接种到含有150mL无菌种子培养基的三角瓶中，41℃静置培养24h后，以5％的接种量接入含有150mL无菌发酵培养基的三角瓶中，每瓶种子接三瓶发酵液进行对照，41℃静置培养24h，采用液相色谱法测定发酵液中GABA的含量，挑选出γ-氨基丁酸产量较高的菌株。
优选的，步骤(3)中，所述无菌种子培养基的组成为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂1.5g和纯化水1000ml。
优选的，步骤(3)中，所述无菌发酵培养基的组成为：酪胨15g、酵母浸出粉5g、葡萄糖5g、氯化钠2.5g、L-胱氨酸0.5g、琼脂0.75g和纯化水1000ml。
优选的，步骤(1)中，所述MRS培养基的组成为：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、柠檬酸氢二铵2g、葡萄糖20g、吐温801mL、乙酸钠5g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂18.0g和蒸馏水1000mL。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明所采用的方法简单易行，成本低，诱变株产GABA量高且稳定，是乳酸菌获得高效产GABA的一种有效方法，菌种长久保藏、应用前景广阔，而且反应条件温和，以L-谷氨酸或L-谷氨酸钠为唯一底物，转化液中无其他培养基成分，利用乳酸菌可能存在的谷氨酸脱羧酶，将底物L-谷氨酸或L-谷氨酸钠转化为γ-氨基丁酸，通过纸层析分析转化液中是否存在GABA，提高筛选效率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
一种高产γ-氨基丁酸的乳酸菌诱变方法，包括以下步骤：
(1)发酵液的制备：选取实验室保存的乳酸片球菌ZY-6(Weissella viridescensZY-6)作为出发菌株，该菌株已于2018年5月28日保存在中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60377，将该菌株接种到马铃薯或马丁氏液体培养基中活化培养2d-6d，得到发酵液；
所述马铃薯液体培养基的组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15～20g和水1000mL；马丁氏液体培养基的组成为：KH2PO41g、MgSO4·7H2O 0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂15～20g和水1000ml；
(2)菌悬液制备：取上述发酵液10mL于三角瓶中，并加入50颗玻璃珠，震荡10min-20min，然后用无菌水按照1:10，1:100，1:1000比例，稀释成不同浓度，制得菌悬液；
(3)诱变处理：
①紫外诱变处理：紫外诱变处理前，开启超净工作台紫外灯，预热15～20min，使光波稳定；不同浓度的菌悬液在红光灯下各吸5ml于9cm双碟中，放入搅拌子，于15W、距离照射菌悬液30cm的紫外灯下，分别照射0s、15s、30s、45s、60s、75s、90s，制定致死率曲线，选择致死率在70％-90％的时间诱变，制得处理液；
②处理液的分离：取1ml的无菌吸管吸0.5ml的处理液于第1号稀释管中，得10-1稀释菌液，如此重复6次，依次稀释到10-6稀释菌液；
③紫外-氯化锂复合处理：将稀释到10-6稀释菌液重复上述紫外诱变处理进行二次诱变，将二次诱变后的菌液涂布在含0.2％-0.3％的氯化锂培养基上；
所述氯化锂培养基的组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15～20g、水1000mL和0.2g～0.3氯化锂；或者是KH2PO41g、MgSO4·7H2O 0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂15～20g、水1000ml和0.2g～0.3氯化锂；
(4)培养：所有涂布完成的培养基放入培养箱中在35℃-40℃条件下培养36h-72h。
实施例2
一种高产γ-氨基丁酸的乳酸菌的筛选方法，包括以下步骤：
(1)供试乳酸菌发酵培养：取实施例1诱变后的菌种接种于MRS培养基中，用MRS培养基对供试乳酸菌在41℃静置厌氧培养24h，以3％的接种量接种到含有1％L-谷氨酸钠的GYP发酵培养基中，静置厌氧培养48h，取发酵液进行离心，转速2000r/min、离心时间10min，取上清液；
所述MRS培养基的组成为：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、柠檬酸氢二铵2g、葡萄糖20g、吐温801mL、乙酸钠5g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂18.0g和蒸馏水1000mL；
(2)γ-氨基丁酸产生菌初步筛选：用微量进样器吸取上清液2μL，点样于G型薄层硅胶板上，点样线距底边2cm，点样点间距1.5cm，以展开剂***：正丁醇：乙酸：水＝5：3：2，采用4g/L茚三酮作为显色剂，当层析到达硅胶板上端1-2cm时结束层析，在65℃条件下烘干滤纸，以是否存在γ-氨基丁酸对应的斑点作为检测指标，同时以1％的γ-氨基丁酸和L-谷氨酸钠标准样品做为对照检测，筛选出能够合成γ-氨基丁酸的乳酸菌；
(3)高产γ-氨基丁酸乳酸菌的复筛：将初筛出的菌株接种到含有150mL无菌种子培养基的250mL三角瓶中，41℃静置培养24h后，以5％的接种量接入含有150mL无菌发酵培养基的250mL三角瓶中，每瓶种子接三瓶发酵液进行对照，41℃静置培养24h，采用液相色谱法测定发酵液中GABA的含量，挑出GABA产量较高的菌株；
所述无菌种子培养基的组成为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂1.5g和纯化水1000ml；
所述无菌发酵培养基的组成为：酪胨15g、酵母浸出粉5g、葡萄糖5g、氯化钠2.5g、L-胱氨酸0.5g、琼脂0.75g和纯化水1000ml。
设置对照组：把未紫外诱变处理原液按10-6稀释后进行活计数；将0.2ml的10-6菌液涂布于含0.2％-0.3％的氯化锂培养基上，放入培养箱中在35℃-40℃条件下培养36h-72h；随后按照实施例2所述的方法进行高产γ-氨基丁酸的乳酸菌的筛选。
比较对照组和实验组的诱变率以及GABA产量，见如下表格：
诱变率(‰) GABA产量(mmol/L)
实验组1 1.0 1.18
实验组2 1.5 1.35
实验组3 1.2 1.26
对照组 0.3 0.36
由上表可以看出，对照组由于没有经过紫外诱变，直接由氯化锂培养基诱变筛选乳酸菌，其诱变率较低，处理后的乳酸菌产GABA产量较低，且稳定性较差。

Claims (8)

1.一种高产γ-氨基丁酸的乳酸菌诱变方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)发酵液的制备：选取实验室保存的乳酸片球菌ZY-6(Weissella viridescens ZY-6)作为出发菌株，该菌株已于2018年5月28日保存在中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60377，将该菌株接种到马铃薯或马丁氏液体培养基中活化培养2d-6d，得到发酵液；
(2)菌悬液制备：取上述发酵液10mL于三角瓶中，并加入50颗玻璃珠，震荡10min-20min，然后用无菌水按照1:10，1:100，1:1000比例，稀释成不同浓度，制得菌悬液；
(3)诱变处理：
①紫外诱变处理：不同浓度的菌悬液在红光灯下各吸5ml于9cm双碟中，放入搅拌子，于15W、距离照射菌悬液30cm的紫外灯下，分别照射0s、15s、30s、45s、60s、75s、90s，制定致死率曲线，选择致死率在70％-90％的时间诱变，制得处理液；
②处理液的分离：吸0.5ml的处理液于第1号稀释管中，得10-1稀释菌液，如此重复6次，依次稀释到10-6稀释菌液；
③紫外-氯化锂复合处理：将稀释到10-6稀释菌液重复上述紫外诱变处理进行二次诱变，将二次诱变后的菌液涂布在含0.2％-0.3％的氯化锂培养基上；
(4)培养：所有涂布完成的培养基放入培养箱中在35℃-40℃条件下培养36h-72h。
2.根据权利要求1所述的高产γ-氨基丁酸的乳酸菌的诱变方法，其特征在于，步骤(3)中进行紫外照射前紫外灯先预热15-20min。
3.根据权利要求1或2所述的高产γ-氨基丁酸的乳酸菌的诱变方法，其特征在于，所述马铃薯液体培养基的组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15～20g和水1000mL；马丁氏液体培养基的组成为：磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂15～20g和水1000ml。
4.根据权利要求1或2所述的高产γ-氨基丁酸的乳酸菌的诱变方法，其特征在于，所述氯化锂培养基的组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15～20g、水1000mL和0.2g～0.3氯化锂；或者是磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂15～20g、水1000ml和0.2g～0.3氯化锂。
5.一种高产γ-氨基丁酸的乳酸菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)供试乳酸菌发酵培养：将权利要求1或2所述的方法诱变后的供试乳酸菌菌种接种于MRS培养基中，在41℃静置厌氧培养24h，以3％的接种量接种到含有1％L-谷氨酸钠的GYP发酵培养基中，静置厌氧培养48h，取发酵液进行离心，转速2000r/min、离心时间10min，取上清液；
(2)γ-氨基丁酸产生菌初步筛选：吸取上清液2μL，点样于G型薄层硅胶板上，点样线距底边2cm，点样点间距1.5cm，以展开剂***：正丁醇：乙酸：水＝5：3：2，采用4g/L茚三酮作为显色剂，当层析到达硅胶板上端1-2cm时结束层析，在65℃条件下烘干滤纸，以是否存在γ-氨基丁酸对应的斑点作为检测指标，同时以1％的γ-氨基丁酸和L-谷氨酸钠标准样品做为对照检测，筛选出能够合成γ-氨基丁酸的乳酸菌；
(3)高产γ-氨基丁酸乳酸菌的复筛：将初筛出的乳酸菌菌株接种到含有150mL无菌种子培养基的三角瓶中，41℃静置培养24h后，以5％的接种量接入含有150mL无菌发酵培养基的三角瓶中，每瓶种子接三瓶发酵液进行对照，41℃静置培养24h，采用液相色谱法测定发酵液中GABA的含量，挑选出γ-氨基丁酸产量较高的菌株。
6.根据权利要求5所述的高产γ-氨基丁酸的乳酸菌的筛选方法，其特征在于，所述无菌种子培养基的组成为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂1.5g和纯化水1000ml。
7.根据权利要求5所述的高产γ-氨基丁酸的乳酸菌的筛选方法，其特征在于，所述无菌发酵培养基的组成为：酪胨15g、酵母浸出粉5g、葡萄糖5g、氯化钠2.5g、L-胱氨酸0.5g、琼脂0.75g和纯化水1000ml。
8.根据权利要求5所述的高产γ-氨基丁酸的乳酸菌的筛选方法，其特征在于，所述MRS培养基的组成为：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、柠檬酸氢二铵2g、葡萄糖20g、吐温801mL、乙酸钠5g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂18.0g和蒸馏水1000mL。
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