CN107858385B - 一种生产及浓缩发酵产物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种生产及浓缩发酵产物的方法。该方法把菌种进行前期培养，将重复补料分批发酵和泡沫分离过程结合达到发酵产物高效生产和浓缩的效果。重复补料分批发酵获得的发酵液加入表面活性物质进行到第一级泡沫分离，浓缩初产物加入到第二级泡沫分离塔中，进一步浓缩获得更高富集比的产品。所述菌种为多粘芽孢杆菌、乳酸菌、蛹虫草菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、绿脓假单胞菌或假丝酵母菌；本发明具有发酵产物的产率高、生产成本低、环保、操作工艺及设备简单、表面活性剂有效去除、产物富集比高的特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及生产及浓缩发酵产物的方法。
背景技术
蛹虫草胞外多糖是从蛹虫草菌(cordyceps militaris)液体发酵液中提取的，蛹虫草胞外多糖具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗糖尿病、免疫调节等生物和药理学活性。蛹虫草菌发酵周期长、胞外多糖产量低，并且胞外多糖的分离困难，故限制了蛹虫草胞外多糖的工业化生产。因此在蛹虫草菌生产胞外多糖的过程中，必须找到合适的发酵生产方式和下游的分离技术。
目前，提高胞外多糖产量研究主要集中在优化发酵参数、环境因素、菌株改造等方面，但产率提高并不明显。也有研究通过改进发酵方式来增加产率，如补料分批、两阶段的液体培养。补料分批发酵相对于分批发酵可以减少发酵时间，但当胞外多糖积累到一定量时由于产物的抑制作用胞外多糖的产率就会降低。两阶段发酵方式可以有效的提高胞外多糖的产量，但由于蛹虫草菌的前期培养需要8天时间，所需的发酵时间仍然很长。多糖的分离浓缩大多采用树脂分离法，但这些方法比较耗时且所用的有机溶剂是昂贵的，有毒的，对环境和人体健康也会造成危害。
故上述方式不能满足蛹虫草菌生产胞外多糖的工业化生产。有研究表明重复补料分批发酵方式可以有效提高微生物的产量。近年来以重复补料分批发酵生产微生物产品主要技术专利有：凯文·贝里曼等申请的重复补料分批培养方法(专利号为201580045701.X)，表明此方法有利于微生物大规模的工业化生产。但未给出微生物发酵液最适的置换时间点。近年来以泡沫分离法分离多糖的专利有：李志洲的泡沫分离猪苓多糖提取液中多糖的装置和方法(专利号201110268643.0)。尽管此方法实现了猪苓多糖的有效分离，但是加入表面活性物质十二烷基苯磺酸钠并没有有效的去除，即增加了处理费用，又不利于后续的处理。所以在保证胞外多糖的有效浓缩外，有必要采取适宜的工艺解决蛹虫草菌生产效率低、发酵周期长、表面活性剂的污染、操作工艺复杂、易造成环境污染的问题。
发明内容
本发明的目的是针对当前技术的不足，提供一种生产及浓缩发酵产物的方法。该方法把菌种进行前期培养，用重复补料分批发酵生产代谢产物，发酵液中加入表面活性物质强化泡沫分离效果。浓缩初产物加入到第二级泡沫分离塔中，进一步浓缩获得更高富集比的产品。此方法提高发酵产物的产率、降低生产成本、环保、操作工艺及设备简单、有效去除表面活性剂、提高产物富集比。
本发明所采用的技术方案如下：
一种生产及浓缩发酵产物的方法，包括以下步骤：
第一步：菌种在活化和种子培养基中培养，获得种子液；
第二步：将第一步中获得的种子液接种到发酵培养基中进行重复补料分批发酵，获得发酵液；
所述的重复补料分批发酵的步骤包括：
a)确定接入种子液后的发酵培养基起始体积；
b)在菌种发酵的第4-6天取出体积百分比70％-90％的发酵液作为第一发酵液，并添加补料培养基至起始体积；
c)所述步骤b)中添加补料培养基后继续发酵1-3天，取出70％-90％的发酵液，并添加补料培养基至起始体积，所述取出的发酵液为第二发酵液；
d)重复步骤c)3-5次，然后收集每次取出的发酵液；
收集步骤b)、c)、d)中获得的发酵液，作为第二步发酵液；
第三步：将上面得到的第二步发酵液通过两级泡沫分离工艺浓缩获得产品；
所述第一步中菌种为多粘芽孢杆菌、乳酸菌、蛹虫草菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、绿脓假单胞菌或假丝酵母菌。
所述第一步中菌种优选为蛹虫草菌CICC14015，所述发酵产物为蛹虫草胞外多糖，所述蛹虫草菌CICC14015是从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买。
所述蛹虫草菌的活化培养方法包括：将安瓿管中蛹虫草菌接种于活化培养基中，25℃培养6天，并转接3次恢复菌株的性状；
所述第一步中蛹虫草菌的种子培养方法包括：将活化后的蛹虫草菌接种到种子培养基中，种子培养条件为：25℃，转速150rpm培养72h，即得到种子液；
所述第二步中重复补料分批发酵方法包括：将得到的种子液以4％-8％的接种量接种到发酵培养基中，在24-27℃，转速140-160rpm培养；
优选的，所述补料培养基为所述发酵培养基；
所述的蛹虫草菌活化培养基的组成包括：马铃薯提取液1L/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾3g/L，无水硫酸镁1.50g/L，维生素B1微量，琼脂15g/L，pH 6。
所述的蛹虫草菌种子培养基的组成包括：20g/L蔗糖，5g/L酵母浸出粉，5g/L蛋白胨，0.20g/L硫酸镁，0.40g/L磷酸二氢钾。
所述的发酵培养基的组成包括：30g/L蔗糖，30g/L蛋白胨，0.50g/L磷酸二氢钾，0.40g/L酵母浸出粉，无水硫酸镁0.02g/L，0.10g/L维生素B1，pH 7；
其中，调节pH使用0.02mol/L的氢氧化钠。
所述的活化培养基、种子培养基和发酵培养基均在121℃经高压蒸汽灭菌25min。
所述第三步中两级泡沫分离工艺包括如下步骤：
第一级泡沫分离：将表面活性剂与第二步发酵液混合，加入到第一级泡沫分离塔中，其中，表面活性剂体积占发酵液体积的0.30％-0.70％，鼓入空气进行第一级泡沫分离，浓缩初产物从第一级泡沫分离塔顶部流出到第一泡沫收集器中；当泡沫不能从泡沫分离塔顶流出时，停止通气；其中，第一级泡沫分离塔中剩余的液体为一级残液；
将得到的一级残液生化处理后达到废水排放标准后排放；所述的生化处理为厌氧处理、好氧处理或好氧移动床生物膜法；
第二级泡沫分离：浓缩初产物经管路加入到第二级泡沫分离塔中，鼓入空气进行第二级泡沫分离，当泡沫不能从泡沫分离塔顶流出时，停止通气，获得浓缩产品；其中，第二级泡沫分离塔中剩余的液体为二级残液；二级残液由蠕动泵经管路泵入到第一级泡沫分离塔中作为下一循环生产中的一级进料液；
所述的表面活性剂包括吐温80、十二烷基磺酸钠、硬脂酸、季铵化合物、甜菜碱、脂肪酸甘油脂、聚山梨酯中的一种或两种以上。
优选的，在所述第二步发酵液加入第一级泡沫分离塔之前进行初步处理去除菌丝体，所述初步处理包括过滤、沉淀和离心。
优选的，所述第一级泡沫分离操作条件：通气速率50-70mL/min，装液量100-150mL，分布器的孔径是125μm；
优选的，所述第二级泡沫分离操作条件：通气速率30-50mL/min，装液量50-100mL，分布器孔径是425μm。
本发明的第二方面，涉及一种浓缩发酵液中发酵产物的两级泡沫分离装置，包括第一级泡沫分离塔、第二级泡沫分离塔、第一气体分布器、第二气体分布器、鼓气泵、蠕动泵、第一泡沫收集器、第二泡沫收集器；
其中，所述第一级泡沫分离塔侧面中部设置一级进料口、二级残液回流口、侧面下部设置一级残液排出口、塔底安装有第一气体分布器、塔顶连接第一泡沫导出管，所述第一泡沫导出管下方放置第一泡沫收集器，所述第一泡沫收集器底面设置开口；
所述第二级泡沫分离塔侧面中部设置二级进料口、侧面下部设置二级残液排出口、塔底安装有第二气体分布器、塔顶连接第二泡沫导出管，所述第二泡沫导出管下方放置第二泡沫收集器；
所述第一气体分布器和第二气体分布器通过管路连接在鼓气泵上，所述管路上均安装有转子流量计；
所述第一泡沫收集器的开口与所述的第二级泡沫分离塔二级进料口通过管路连接，所述管路设置进料阀，所述二级残液排出口与所述二级残液回流口通过管路连接，所述管路上安装蠕动泵。
本发明所述的“OD”是指光密度(Optical density,OD)即待测样品在波长490nm处所吸收的光密度。
本发明所述的“富集比”是指消泡液中胞外多糖的浓度与进料液中胞外多糖浓度的比值。
本发明所述的“回收率”是指消泡液中胞外多糖的质量与进料液中胞外多糖的比值。
本发明所述的“总的富集比”是指一级富集比和二级富集比的乘积。
本发明的有益效果为：
1、提高发酵产物的产率。重复补料分批发酵节约了在每个发酵批次所需清洗、灭菌、接种的时间，当采用重复补料分批发酵生产蛹虫草菌的胞外多糖时，在发酵第5天取出80％发酵液，再加入补料培养基使得体积保持在起始体积，利用重复补料分批发酵方式发酵时间从25天(5次分批发酵)减少到13天，并且第一发酵液、第二发酵液、第三发酵液、第四发酵液、第五发酵液中胞外多糖的浓度分别为978.28mg/L，953.25mg/L，1218.80mg/L，1007.28mg/L，848.71mg/L与分批发酵(913.82mg/L)相比每个批次的产量不仅没有降低，第三和第四个循环的产量比分批发酵时还高。
2、降低生产成本，环保并能高效的浓缩发酵产物。本发明方法将两级泡沫分离技术应用于浓缩蛹虫草菌胞外多糖，第一级泡沫分离胞外多糖的回收率达65-75％，富集比达到2.52-3.50，消泡液中胞外多糖的浓度1500-2500mg/L；第二级泡沫分离进一步浓缩胞外多糖，回收率50-60％，富集比3.03-3.46，二级消泡液中胞外多糖的浓度5000-8500mg/L；二级残液浓度700-900mg/mL，可作为下一循环生产中的一级进料液。两级泡沫分离工艺大幅度提高了胞外多糖的富集比，不仅提高了分离的效果而且还降低了分离的处理费用。
3、表面活性剂的有效去除。本发明选择非离子表面活性剂吐温80，不会和胞外多糖形成不可逆的化学复合物，利用多糖和吐温80在乙醇中的溶解性不同实现两者的有效分离。
4、减少发酵产物的损失和操作步骤。将第一级泡沫分离和第二级泡沫分离过程用管路连接起来，减少了发酵产物在转移过程中的损失，并且在操作过程中只需打开进料阀即可实现浓缩初产物向第二级泡沫分离塔中的转移和打开蠕动泵即可实现二级残液向第一级泡沫分离塔中的转移，减少了操作步骤。
附图说明
图1为生产及浓缩蛹虫草菌胞外多糖的工艺流程图；
图2为本发明两级泡沫分离装置示意图；
其中，1：一级进料口；2：第一级泡沫分离塔；3：一级残液排出口；4：第一气体分布器；5：二级残液回流口；6：鼓气泵；7：第一转子流量计；8：第一泡沫收集器；9：二级进料口；10：第二泡沫收集器；11：第二级泡沫分离塔；12：第二气体分布器；13：开口；14：第一泡沫导出管；15：第二泡沫导出管；16：进料阀；17：蠕动泵；18：二级残液排出口；19：第二转子流量计。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的第一方面，涉及一种生产及浓缩发酵产物的方法，包括以下步骤：
第一步：菌种在活化和种子培养基中培养，获得种子液；
第二步：将第一步中获得的种子液接种到发酵培养基中进行重复补料分批发酵，获得发酵液；
所述的重复补料分批发酵的步骤包括：
a)确定接入种子液后的发酵培养基起始体积；
b)在菌种发酵的第4-6天取出体积百分比70％-90％的发酵液作为第一发酵液，并添加补料培养基至起始体积；
c)所述步骤b)中添加补料培养基后继续发酵1-3天，取出70％-90％体积的发酵液，并添加补料培养基至起始体积，所述取出的发酵液为第二发酵液；
d)重复步骤c)3-5次，然后收集每次取出的发酵液；
第三步：将上面得到的第二步发酵液通过两级泡沫分离工艺浓缩获得产品。
所述第一步中菌种为多粘芽孢杆菌、乳酸菌、蛹虫草菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、绿脓假单胞菌或假丝酵母菌；
所述第一步中菌种优选为蛹虫草菌CICC14015，所述发酵产物为蛹虫草胞外多糖，所述蛹虫草菌CICC14015是从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买。
所述第一步中蛹虫草菌的活化培养方法包括：将安瓿管中蛹虫草菌接种于活化培养基中，25℃培养6天，并转接3次恢复菌株的性状；
所述第一步中蛹虫草菌的种子培养方法包括：将活化后的蛹虫草菌接种到种子培养基中，种子培养条件为：25℃，转速150rpm培养72h，即得到种子液；
优选的，所述第二步中重复补料分批发酵方法包括：将得到的种子液以4％-8％的接种量接种到发酵培养基中，在24-27℃，转速140-160rpm培养；进一步优选的，接种量为5％-7％，在24-26℃，转速150-160rpm条件下培养；最优选的，接种量为5％，在25℃，转速150rpm条件下培养。
优选的，所述步骤b)中菌种为蛹虫草菌，在所述蛹虫草菌发酵的第5天取出80％的发酵液；所述步骤c)中添加补料培养基后继续发酵2天，取出80％的发酵液；所述步骤d)中重复次数为4次。
所述的蛹虫草菌活化培养基及制备方法：马铃薯提取液1L/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾3g/L，无水硫酸镁1.50g/L，维生素B1微量，琼脂15g/L，所用溶液为马铃薯提取液，搅拌均匀，调节pH至6。
所述的蛹虫草菌种子培养基及制备方法：20g/L蔗糖，5g/L酵母浸出粉，5g/L蛋白胨，0.20g/L硫酸镁，0.40g/L磷酸二氢钾，所用溶液为蒸馏水，搅拌均匀，pH自然。
本发明所述的发酵培养基及制备方法：30g/L蔗糖，30g/L蛋白胨，0.50g/L磷酸二氢钾，0.40g/L酵母浸出粉，无水硫酸镁0.02g/L，0.10g/L维生素B1，所用溶液为蒸馏水，搅拌均匀，调节pH至7。
其中，调节pH使用0.02mol/L的氢氧化钠。
本发明所述的活化培养基、种子培养基和发酵培养基均在121℃经高压蒸汽灭菌25min。
所述第三步中两级泡沫分离工艺包括如下步骤：
第一级泡沫分离：将表面活性剂与第二步发酵液混合，加入到第一泡沫分离塔中，表面活性剂体积占发酵液体积的0.30％-0.70％，鼓入空气进行第一级泡沫分离，浓缩初产物从第一级泡沫分离塔顶部流出到第一泡沫收集器中；当泡沫不能从泡沫分离塔顶流出时，停止通气；其中，第一级泡沫分离塔中剩余的液体为一级残液；
将得到的一级残液生化处理后达到废水排放标准后排放；所述的生化处理处理为厌氧处理、好氧处理或好氧移动床生物膜法；
第二级泡沫分离：将第一级泡沫分离获得的浓缩初产物从第一泡沫收集器中加入到第二级泡沫分离塔中，鼓入空气进行二级泡沫分离，待泡沫不能从泡沫分离塔顶流出时，停止通气，获得浓缩产品；其中，第二级泡沫分离塔中剩余的液体为二级残液；二级残液由蠕动泵泵入到第一级泡沫分离塔中作为下一循环生产中的一级进料液。
所述的表面活性剂包括吐温80、十二烷基磺酸钠、硬脂酸、季铵化合物、甜菜碱、脂肪酸甘油脂、聚山梨酯中的一种或两种以上。优选的，所述表面活性剂为吐温80。
优选的，在所述第二步发酵液加入第一级泡沫分离塔之前进行初步处理去除菌丝体，所述初步处理包括过滤、沉淀、离心；所述表面活性剂的加入量占一级泡沫分离塔装液量体积的0.50％；所述浓缩产品可以用乙醇沉淀法获得粗多糖。
所述的蛹虫草胞外多糖的检测方法是苯酚-硫酸法，即取1mL稀释后的蛹虫草胞外多糖溶液，加入1mL 6％的苯酚，再加入5mL的浓硫酸，摇匀，在25℃水浴中反应20min后，在490nm测定OD值。
本发明的一个具体实施例中，通过非离子表面活性剂吐温80强化泡沫分离效果，它不会和胞外多糖形成不可逆的化学复合物，利用多糖和吐温80在乙醇中的溶解性不同实现两者的有效分离。吐温80可以溶于乙醇而蛹虫草胞外多糖不溶于乙醇，在二级消泡液中加入95％的乙醇，吐温80会溶于95％的乙醇而多糖会沉淀下来，此过程获得粗多糖同时吐温80被有效去除。
优选的，所述第一级泡沫分离操作条件：通气速率50-70mL/min，装液量100-150mL，分布器的孔径是125μm；进一步优选的，通气速率60-65mL/min，装液量100mL，分布器的孔径是125μm；最优选的，通气速率65mL/min，装液量100mL，分布器的孔径是125μm。
优选的，所述第二级泡沫分离操作条件：通气速率30-50mL/min，装液量50-100mL，分布器孔径是425μm；进一步优选的，通气速率35-45mL/min，装液量50mL，分布器孔径是425μm；最优选的，通气速率40mL/min，装液量50mL，分布器孔径是425μm。
本发明的第二方面，涉及一种浓缩发酵液中发酵产物的两级泡沫分离装置，包括第一级泡沫分离塔、第二级泡沫分离塔、第一气体分布器、第二气体分布器、鼓气泵、第一转子流量计、第二转子流量计、蠕动泵、第一泡沫收集器、第二泡沫收集器；
其中，所述第一级泡沫分离塔侧面中部设置一级进料口、二级残液回流口、侧面下部设置一级残液排出口、塔底安装有第一气体分布器、塔顶连接第一泡沫导出管，所述第一泡沫导出管下方放置第一泡沫收集器，所述第一泡沫收集器底面设置开口；
所述第二级泡沫分离塔侧面中部设置二级进料口、侧面下部设置二级残液排出口、塔底安装有第二气体分布器、塔顶连接第二泡沫导出管，所述第二泡沫导出管下方放置第二泡沫收集器；
所述第一气体分布器和第二气体分布器通过管路连接在鼓气泵上，所述管路上均安装有转子流量计；
所述第一泡沫收集器的开口与所述第二级泡沫分离塔的二级进料口通过管路连接，所述管路设置进料阀，所述二级残液排出口与所述二级残液回流口通过管路连接，所述管路上安装蠕动泵。
本发明所述的“OD”是指光密度(Optical density,OD)即待测样品在波长490nm处所吸收的光密度。
本发明所述的“富集比”是指消泡液中胞外多糖的浓度与进料液中胞外多糖浓度的比值。
本发明所述的“回收率”是指消泡液中胞外多糖的质量与进料液中胞外多糖的比值。
本发明所述的“总的富集比”是指一级富集比和二级富集比的乘积。
实施例1
图1为生产及浓缩蛹虫草菌胞外多糖的工艺流程图，其中，蛹虫草菌经过活化和种子培养，获得种子液；将种子液接种到发酵培养基中进行重复补料分批发酵，获得发酵液；发酵液通过两级泡沫分离工艺浓缩获得产品。
图2为浓缩发酵液中发酵产物的两级泡沫分离装置示意图，其中，包括第一级泡沫分离塔2、第二级泡沫分离塔11、第一气体分布器4、第二气体分布器12、鼓气泵6、第一转子流量计7、第二转子流量计19、蠕动泵17、第一泡沫收集器8、第二泡沫收集器10；
其中，所述第一级泡沫分离塔2侧面中部设置一级进料口1、二级残液回流口5、侧面下部设置一级残液排出口3、塔底安装有第一气体分布器4、塔顶连接第一泡沫导出管14，所述第一泡沫导出管14下方放置第一泡沫收集器8，所述第一泡沫收集器8底面设置开口13；所述第二级泡沫分离塔11侧面中部设置二级进料口9、侧面下部设置二级残液排出口18、塔底安装有第二气体分布器12、塔顶连接第二泡沫导出管15，所述第二泡沫导出管15下方放置第二泡沫收集器10；
所述第一气体分布器4和第二气体分布器12均通过管路连接在鼓气泵6上，所述管路上均安装有转子流量计；
所述开口13与所述二级进料口9通过管路连接，所述管路设置进料阀16，所述二级残液排出口18与所述二级残液回流口5通过管路连接，所述管路上安装蠕动泵17。
两级泡沫分离工艺操作时，首先将表面活性剂与第二步发酵液混合，从一级进料口1将发酵液加入到第一级泡沫分离塔2中，其中，表面活性剂体积为发酵液体积的0.30％-0.70％。然后打开鼓气泵6，通过连接第一气体分布器4的管路鼓入空气，此时连接第二气体分布器12的管路为关闭状态，其中通气速率由第一转子流量计7控制，进行第一级泡沫分离，泡沫沿着第一级泡沫分离塔2经第一泡沫导出管14流入第一泡沫收集器8中，当泡沫不能从第一级泡沫分离塔2的塔顶流出时，停止通气，第一级泡沫分离结束。第一级泡沫分离工艺结束后，进行第二级泡沫分离。打开进料阀16，将第一泡沫收集器8收集到的一级消泡液从开口13通过管路从二级进料口9加入到第二级泡沫分离塔11中，然后打开连接第二气体分布器12的管路，由第二转子流量计19控制通气速率鼓入空气，进行第二级泡沫分离，泡沫沿着第二级泡沫分离塔11从第二泡沫导出管15流出至第二泡沫收集器10中，待泡沫不能从泡沫分离塔11的塔顶流出时，停止通气，第二级泡沫分离结束。第二泡沫收集器10收集到的二级消泡液即为浓缩产品。第二级泡沫分离工艺结束后，第二级泡沫分离塔11中残留的液体从二级残液排出口18通过蠕动泵17泵入第一级泡沫分离塔2作为一级进料液。
所述两级泡沫分离的过程，把以往两个单独的泡沫分离过程通过管路将其连接起来，一方面在第二级泡沫分离过程开始时，只需打开进料阀16初级浓缩产物就会被加入到第二级泡沫分离塔11中，省去先将一级消泡液收集到容器中再将其加入第二级泡沫分离塔11中的步骤，并且可以减少发酵产物的损失；另一方面二级残液可以通过蠕动泵17直接泵入到第一泡沫分离塔2中，省去将二级消泡液从第二级泡沫分离塔11中收集到容器中再加入到第一泡沫分离塔2中的步骤。
实施例2
一、培养基配方
蛹虫草菌活化培养基及制备方法：马铃薯提取液1L/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾3g/L，无水硫酸镁1.50g/L，维生素B1微量，琼脂15g/L，所用溶液为马铃薯提取液，搅拌均匀，调节pH至6。
蛹虫草菌种子培养基及制备方法：20g/L蔗糖，5g/L酵母浸出粉，5g/L蛋白胨，0.20g/L硫酸镁，0.40g/L磷酸二氢钾，所用溶液为蒸馏水，搅拌均匀，pH自然。
蛹虫草菌发酵培养基及制备方法：30g/L蔗糖，30g/L蛋白胨，0.50g/L磷酸二氢钾，0.40g/L酵母浸出粉，无水硫酸镁0.02g/L，0.10g/L维生素B1，所用溶液为蒸馏水，搅拌均匀，调节pH至7。
其中，调节pH使用0.02mol/L的氢氧化钠，活化培养基、种子培养基和发酵培养基均在115-121℃经高压蒸汽灭菌25min。
二、实验方法
将蛹虫草菌CICC14015，接种于活化培养基中，25℃培养6天，并转接3次恢复菌株的性状,。随后将活化后的菌种接种到种子培养基中，在25℃，转速150rpm，培养72h得到种子液。将获得的种子液按5％的接种量接种到发酵培养基中，在24℃，转速140rpm培养。
分批发酵方式生产胞外多糖作为对照实验，其中发酵培养基的体积为200mL，发酵时间为5天。
重复补料分批发酵确定发酵培养基的起始体积为200mL，在菌种发酵的第4天取出70％的发酵液为第一发酵液，并添加70％的发酵培养基。之后每隔一天移除发酵液70％，并添加70％的发酵培养基，共重复5次，获得第二发酵液、第三发酵液、第四发酵液、第五发酵液、第六发酵液。重复补料分批发酵获得的第二步发酵液首先在4000r/min，离心15min除去菌丝体，并添加0.30％吐温80，然后测定第一发酵液中胞外多糖的含量。最后将除去菌丝体并添加吐温80的第一发酵液作为一级进料液。
第一级泡沫分离在通气速率50mL/min，装液量100mL，气体分布器孔径125μm的条件下进行第一级泡沫分离，第一级泡沫分离结束后收集一级消泡液和一级残液，并计算第一级泡沫分离胞外多糖的一级富集比和一级回收率。第二级泡沫分离在通气速率30mL/min，装液量50mL，气体分布器孔径425μm的条件下进行第二级泡沫分离，第二级泡沫分离结束后收集二级消泡液和二级残液，并计算第二级泡沫分离胞外多糖的二级富集比和二级回收率。三、检测方法
发酵液在4000rpm离心15min，取2mL上述离心后获得的上清液加入6mL的95％的无水乙醇，混匀，放在4℃的冰箱中沉淀24h，随后在10000rpm离心10min获得胞外多糖沉淀，弃去上清液，加入2mL蒸馏水，即得到蛹虫草胞外多糖溶液，稀释X倍，在490nm测定OD值。苯酚-硫酸法测定胞外多糖的含量，即取1mL稀释后的蛹虫草胞外多糖溶液，加入1mL 6％的苯酚，再加入5mL的浓硫酸，摇匀，在25℃水浴中反应20min后，在490nm测定OD值。
葡萄糖的标准曲线为C＝93.875OD490+0.0056(R2＝0.997)。
富集比和回收率的计算公式：
其中E表示富集比，R表示回收率，Ci，Cf分别表示进料液中胞外多糖的浓度、消泡液中胞外多糖的浓度。Vi，Vf分别是进料液的体积和消泡液的体积。
四、实验结果
分批发酵获得的发酵液中胞外多糖的浓度为923.61mg/L。重复补料分批发酵过程中第一发酵液、第二发酵液、第三发酵液、第四发酵液、第五发酵液、第六发酵液中胞外多糖的浓度分别为747.37mg/L，637.61mg/L，687.43mg/L，704.39mg/L，668.43mg/L，603.88mg/L。一级消泡液胞外多糖浓度为2106.74mg/L，一级残液胞外多糖的浓度为532.68mg/L，一级回收率为73％，一级富集比为2.80。二级消泡液胞外多糖的浓度为6530.72mg/L，二级残液浓度为873.13mg/L，二级回收率为56％，二级富集比为3.11。二级消泡液即为蛹虫草胞外多糖的浓缩产品。二级残液和发酵液中胞外多糖的浓度差不多可混合作为一级进料液。实验结束测得发酵时间从30天减少到9天，总的富集比为8.72。
实施例3
一、培养基配方
与实施例2同。
二、试验方法
将蛹虫草菌CICC14015，接种于活化培养基中，25℃培养6天，并转接3次恢复菌株的性状。随后将活化后的菌种接种到种子培养基中，在25℃，转速150rpm，培养72h得到种子液。将获得的种子液按8％的接种量接种到发酵培养基中，在25℃，转速150rpm培养。
分批发酵方式生产胞外多糖作为对照实验，其中发酵培养基的体积为200mL，发酵时间为5天。
重复补料分批发酵确定发酵培养基的起始体积为200mL，在菌种发酵的第5天取出80％的发酵液，作为第一发酵液，并添加80％的发酵培养基。之后每隔两天取出发酵液80％，并添加80％的发酵培养基，共重复4次，获得第二发酵液、第三发酵液、第四发酵液、第五发酵液。重复补料分批发酵获得发酵液首先在4000r/min，离心15min除去菌丝体，并添加0.50％吐温80，然后测定第一发酵液中胞外多糖的含量。最后将除去菌丝体并添加吐温80的第一发酵液作为下一循环中的一级进料液。
第一级泡沫分离在通气速率60mL/min，装液量125mL，气体分布器孔径125μm的条件下进行第一级泡沫分离，第一级泡沫分离结束后收集一级消泡液和一级残液，并计算第一级泡沫分离胞外多糖的一级富集比和一级回收率。第二级泡沫分离在通气速率40mL/min，装液量75mL，气体分布器孔径425μm的条件下进行第二级泡沫分离，第二级泡沫分离结束后收集二级消泡液和二级残液，并计算第二级泡沫分离胞外多糖的二级富集比和二级回收率。三、检测方法
与实施例2同。
四、实验结果
分批发酵获得的发酵液中胞外多糖的浓度为913.82mg/L。重复补料分批发酵过程中第一发酵液、第二发酵液、第三发酵液、第四发酵液、第五发酵液中胞外多糖的浓度分别为978.28mg/L，953.25mg/L，1218.80mg/L，1007.28mg/L，848.71mg/L。一级消泡液胞外多糖浓度为2587.32mg/L，一级残液胞外多糖的浓度为512.12mg/L，第一级泡沫分离回收率为75％，富集比为2.93。二级消泡液胞外多糖的浓度为8439.14mg/L，二级残液浓度为903.43mg/L，二级回收率为56％，二级富集比为3.27。二级消泡液即为蛹虫草胞外多糖的浓缩产品。二级残液和发酵液中胞外多糖的浓度差不多可混合作为一级进料液。实验结束测得发酵时间从25天减少到13天，总的富集比为9.63。
实施例4
一、培养基配方
与实施例2同。
二、试验方法
将蛹虫草菌CICC14015，接种于活化培养基中，25℃培养6天，并转接3次恢复菌株的性状。随后将活化后的菌种接种到种子培养基中，在25℃，转速150rpm，培养72h得到种子液。发酵培养：将获得的种子液按4％的接种量接种到发酵液中，在27℃，转速160rpm培养。
分批发酵方式生产胞外多糖作为对照实验，其中发酵培养基的体积为200mL，发酵时间为5天。
重复补料分批发酵确定发酵培养基的起始体积为200mL，在菌种发酵的第6天取出90％的发酵液，作为第一发酵液，并添加90％的发酵培养基。之后每隔3天取出发酵液90％，并添加90％的发酵培养基，共重复3次，获得第二发酵液、第三发酵液、第四发酵液。重复补料分批发酵获得发酵液首先在4000r/min，离心15min除去菌丝体，并添加0.70％吐温80，然后测定第一发酵液中胞外多糖的含量。最后将除去菌丝体并添加吐温80的第一发酵液作为下一循环中的级进料液。
第一级泡沫分离在通气速率70mL/min，装液量150mL，气体分布器孔径125μm的条件下进行第一级泡沫分离，第一级泡沫分离结束后收集一级消泡液和一级残液，并计算第一级泡沫分离胞外多糖的一级富集比和一级回收率。第二级泡沫分离在通气速率50mL/min，装液量100mL，气体分布器孔径425μm的条件下进行第二级泡沫分离，第二级泡沫分离结束后收集二级消泡液和二级残液，并计算第二级泡沫分离胞外多糖的二级富集比和二级回收率。三、检测方法
与实施例2同。
四、实验结果
分批发酵获得的发酵液中胞外多糖的浓度为879.63mg/L。重复补料分批发酵过程中第一发酵液、第二发酵液、第三发酵液、第四发酵液中胞外多糖的浓度为803.63mg/L，772.17mg/L，685.93mg/L，605.27mg/L。一级消泡液胞外多糖浓度为1750.12mg/L，一级残液胞外多糖的浓度为432.16mg/L，一级回收率为70％，富集比为2.62。二级消泡液胞外多糖的浓度为5250.44mg/L，二级残液浓度为733.17mg/L，二级回收率为52％，二级富集比为3.01。二级消泡液即为蛹虫草胞外多糖的浓缩产品。二级残液和发酵液中胞外多糖的浓度差不多可混合作为下一循环中的一级进料液。实验结束测得发酵时间从20天减少到15天，总的富集比为7.82。
从上面的实施例可以看出，在发酵第5天取出80％发酵液，再加入新鲜的发酵液，每隔2天置换发酵液，蛹虫草菌在发酵能力没有明显下降的情况下可以连续进行5个循环的发酵，发酵时间从25天减少到13天。重复补料分批发酵可以利用发酵罐中剩余的菌丝体继续发酵生产胞外多糖，不仅节省了蛹虫草菌的种子培养培养时间而且还节省了每个批次发酵罐清洁和灭菌的步骤。本发明将从重复补料分批发酵和泡沫分离过程结合，再将重复补料分批发酵置换出的发酵液及时有效浓缩的前提下表面活性剂得到了有效去除，且总的富集比达到9.63。
本发明未尽事宜为公知技术。
Claims (3)
1.一种生产及浓缩发酵产物的方法，其特征为该方法包括以下步骤：
第一步：菌种在活化和种子培养基中培养，获得种子液；
第二步：将第一步中获得的种子液接种到发酵培养基中进行重复补料分批发酵，获得发酵液；
所述的重复补料分批发酵的步骤包括：
a）确定接入种子液后的发酵培养基起始体积；
b）在菌种发酵的第4-6天取出体积百分比70%-90%的发酵液作为第一发酵液，并添加补料培养基至起始体积；
c）所述步骤b）中添加补料培养基后继续发酵1-3天，取出70%-90%的发酵液，并添加补料培养基至起始体积，所述取出的发酵液为第二发酵液；
d）重复步骤c）3-5次，然后收集每次取出的发酵液；
收集步骤b)、c)、d）中获得的发酵液，作为第二步发酵液；
第三步：将上面得到的第二步发酵液通过两级泡沫分离工艺浓缩获得产品；
所述第三步，具体包括如下步骤：
第一级泡沫分离：将表面活性剂与第二步发酵液混合，加入到第一级泡沫分离塔中，其中，表面活性剂体积占发酵液体积的0.30%-0.70%，鼓入空气进行第一级泡沫分离，浓缩初产物从第一级泡沫分离塔顶部流出到第一泡沫收集器中；当泡沫不能从泡沫分离塔顶流出时，停止通气；其中，第一级泡沫分离塔中剩余的液体为一级残液；
将得到的一级残液生化处理后达到废水排放标准后排放；所述的生化处理为厌氧处理、好氧处理或好氧移动床生物膜法；
第二级泡沫分离：浓缩初产物经管路加入到第二级泡沫分离塔中，鼓入空气进行二级泡沫分离，当泡沫不能从泡沫分离塔顶流出时，停止通气，获得浓缩产品；其中，第二级泡沫分离塔中剩余的液体为二级残液；二级残液由蠕动泵经管路泵入到第一级泡沫分离塔中作为下一循环生产中的一级进料液；
所述的表面活性剂包括吐温80、十二烷基磺酸钠、硬脂酸、季铵化合物、甜菜碱、脂肪酸甘油脂、聚山梨酯中的一种或两种以上；
所述的两级泡沫分离工艺中的装置，包括第一级泡沫分离塔、第二级泡沫分离塔、第一气体分布器、第二气体分布器、鼓气泵、蠕动泵、第一泡沫收集器、第二泡沫收集器；
其中，所述第一级泡沫分离塔侧面中部设置一级进料口、二级残液回流口、侧面下部设置一级残液排出口、塔底安装有第一气体分布器、塔顶连接第一泡沫导出管，所述第一泡沫导出管下方放置第一泡沫收集器，所述第一泡沫收集器底面设置开口；
所述第二级泡沫分离塔侧面中部设置二级进料口、侧面下部设置二级残液排出口、塔底安装有第二气体分布器、塔顶连接第二泡沫导出管，所述第二泡沫导出管下方放置第二泡沫收集器；
所述第一气体分布器和第二气体分布器通过管路连接在鼓气泵上，所述管路上均安装有转子流量计；
所述第一泡沫收集器的开口与所述的第二级泡沫分离塔二级进料口通过管路连接，所述管路设置进料阀，所述二级残液排出口与所述二级残液回流口通过管路连接，所述管路上安装蠕动泵；
所述第一步中菌种为蛹虫草菌；
所述蛹虫草菌的活化培养方法包括：将安瓿管中蛹虫草菌接种于活化培养基中，25℃培养6天，并转接3次恢复菌株的性状；
所述第一步中蛹虫草菌的种子培养方法包括：将活化后的蛹虫草菌接种到种子培养基中，种子培养条件为：25℃，转速150 rpm培养72 h，即得到种子液；
所述第二步中重复补料分批发酵方法包括：将得到的种子液以4%-8%的接种量接种到发酵培养基中，在24-27℃，转速140-160 rpm培养；
所述补料培养基为所述发酵培养基；
所述的蛹虫草菌活化培养基的组成包括：马铃薯提取液1 L/L，葡萄糖20 g/L，磷酸二氢钾3 g/L，无水硫酸镁1.50 g/L，维生素B1微量，琼脂15 g/L，pH 6；
所述的蛹虫草菌种子培养基的组成包括：20 g/L蔗糖，5 g/L酵母浸出粉，5 g/L蛋白胨，0.20 g/L硫酸镁，0.40 g/L磷酸二氢钾；
所述的发酵培养基的组成包括：30 g/L蔗糖，30 g/L蛋白胨，0.50 g/L磷酸二氢钾，0.40 g/L酵母浸出粉，无水硫酸镁0.02 g/L，0.10 g/L维生素B1，pH 7；
其中，调节pH使用0.02 mol/L的氢氧化钠；
所述的活化培养基、种子培养基和发酵培养基均在121℃经高压蒸汽灭菌25 min。
2.如权利要求1所述的生产及浓缩发酵产物的方法，其特征为所述第二步发酵液加入第一级泡沫分离塔之前进行初步处理去除菌丝体，所述初步处理包括过滤、沉淀和离心。
3.如权利要求1所述的生产及浓缩发酵产物的方法，其特征为所述第一级泡沫分离操作条件：通气速率50-70 mL/min，装液量100-150 mL，分布器的孔径是125 µm；
所述第二级泡沫分离操作条件：通气速率30-50 mL/min，装液量50-100 mL，分布器孔径是425 µm。
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