CN103667367A - 以红糖为碳源明串珠菌发酵产甘露醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以红糖为碳源明串珠菌发酵产甘露醇的方法，涉及微生物发酵工艺，该培养基的配方为红糖19～21克、酵母浸粉1.9～2.1克、乙酸钠5克、磷酸氢二钾2克、柠檬酸铵2克，溶于1000ml水中；250ml三角瓶中分装50ml培养基后灭菌；活化好的明串珠菌菌种以1%接菌量加入到培养基中，于30℃120转/分振荡养16～18小时；培养液经10000转/分离心10分钟，去除沉淀(菌体)，往上清液中加入等量的乙醇，经12000转/分离心15分钟，去除沉淀(葡聚糖)，将上清液在4℃结晶而获得甘露醇；从而有效地降低了培养基的成本。
Description
技术领域
本发明涉及发酵生产甘露醇技术领域，具体地说是涉及以红糖为碳源制备培养基以及应用该培养基通过明串珠菌发酵产甘露醇的方法。
背景技术
甘露醇被广泛的应用于医药、食品、化工和电子等行业。全球甘露醇消费量约占多元醇总量的11%，每年约为15万吨。美国是甘露醇的最大消费国。其它如欧洲国家，用于生产口香糖、***片、嘴嚼片的用量均较大。我国目前甘露醇消费主要是直接用于生产甘露醇注射液、药品辅助添加剂和无糖型食品添加剂等。由于食品行业尤其是口香糖对甘露醇需求量快速增加，甘露醇市场容量迅速扩大。甘露醇在医药行业用量较大，目前我国仅甘露醇注射液每年就要消耗甘露醇4500吨，2003年医药行业消费甘露醇5600吨。近年来我国肥胖和糖尿病较为严重，而且有越来越严重的趋势，因此对无糖并具有营养的甜味剂甘露醇需求潜力巨大，2004年我国食品及其添加剂领域对甘露醇的需求量约3000吨。
目前生产甘露醇的方法主要有四种：
(1)海藻提取法：提取1吨甘露醇约需13～15吨干海带，生产过程产生大量废水，能耗高，污染严重，收率低；
(2)催化加氢法：以蔗糖或葡萄糖为原料的催化加氢法具有原料来源稳定，生产期限不受限制，成本低，但是其产率较低，且有山梨醇伴生；
(3)酶转化法：酶法氢化须要在体系中加入价格昂贵的辅酶，不经济；
(4)微生物发酵法：自然界中能合成甘露醇的微生物种类较多，细菌、酵母和霉菌中都有一些菌株具有产甘露醇的能力。在乳酸菌转化甘露醇的过程中，甘露醇为主要产物，同时产乳酸、乙酸、乙醇和二氧化碳，而不产生其它多元醇等副产物，因而易于纯化分离及精制，并且条件温和、转化率较高。同时乳酸菌是一种相对安全的菌种，用乳酸菌来生产甘露醇的研究有着明显的优势。目前，微生物发酵法处于实验室研究阶段。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种以红糖为碳源的制备培养基和明串珠菌应用该培养基发酵产甘露醇的方法；该培养基是根据红糖的成分改进MRS培养基而制成的，降低了培养基的成本，缩短了发酵时间，从而克服了微生物发酵法生产甘露醇的瓶颈问题。
本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：以红糖为碳源明串珠菌发酵产甘露醇的方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）以红糖为碳源制备培养基：
（1.1）准备原料
准确称取红糖19～21克、酵母浸粉1.9～2.1克、乙酸钠5克、磷酸氢二钾2克、柠檬酸铵2克备用；
（1.2）调配与溶化
磁力搅拌器上放置装300ml水的烧杯，将步骤（1.1）称取的原料加入到烧杯的水中，充分溶化后补加700ml水，即制成培养基；
（1.3）分装与灭菌
在250ml三角瓶中加入步骤（1.2）制备的培养基50ml后封口，置于高压灭菌锅中121℃灭菌20分钟；
（2）明串珠菌发酵产甘露醇
（2.1）活化菌种
将明串珠菌以1%接菌量加入到50ml三角瓶内的10ml MRS培养基中，振荡培养12～16小时；所述明串珠菌的分类命名为肠膜明串珠菌，拉丁文学名是Leuconostoc mesenteroides,保***与2009年12月31日交由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ＣＧＭＣＣ)进行保藏，保藏单位根据保***的申请于2013年9月18日出具存活证明。
（2.2）接菌
在超净工作台将步骤（2.1）活化好的菌种以1%接菌量加入到步骤（1.3）灭菌后的250ml三角瓶内的50ml培养基中；
（2.3）培养
将步骤（2.2）接菌后的三角瓶置于摇床中，在30℃下以120转/分的速度振荡培养16～18小时，得培养液；
（2.4分离纯化
将步骤（2.3）制得的培养液经10000转/分离心10分钟，去除菌体沉淀得上清液A；在上清液A中加入等量的乙醇，经12000转/分离心15分钟，去除葡聚糖沉淀得上清液B，将上清液B在4℃结晶即制得甘露醇。
上述步骤（2）中明串珠菌发酵产甘露醇的工艺中，所用到的试剂由供应商提供，成分均是公知的；所涉及到的设备和工艺操作方法均为本技术领域技术人员所公知的。需要说明的，本发明所用的明串珠菌的分类命名为肠膜明串珠菌，拉丁文学名是Leuconostoc mesenteroides；保藏日期为2009年12月31日，保藏单位全称是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号：CGMCC1.10327。
本发明的有益效果是：
（1）与海藻提取法、催化加氢法、酶转化法相比，本发明的特别之处在于：通过乳酸细菌专一性地产生甘露醇这一主产物，因此生产过程是环境友好的，符合产业发展方向；
（2）与现有微生物发酵法生产甘露醇的技术相比，本发明的以红糖为碳源明串珠菌发酵产甘露醇的方法与以蔗糖或果糖、葡萄糖为碳源发酵乳酸细菌生产甘露醇的方法相比，有效地降低了培养基的成本。这是因为红糖是从甘蔗或甜菜中粗提的产物，价格较低；蔗糖是高纯度的化工原料，蔗糖或果糖、葡萄糖的价格相对要高；相比于现有技术中以蔗糖为原料明串珠菌发酵生产甘露醇的工艺，本发明的原料组成中去除了蛋白胨、酵母浸粉的用量减少很多，因此制备成本便降低很多。
生物材料保藏说明
分类命名：肠膜明串珠菌
拉丁文学名：Leuconostoc mesenteroides；
保藏日期：2009年12月31日
保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位简称：ＣＧＭＣＣ
保藏编号：1.10327
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
以红糖为碳源明串珠菌发酵产甘露醇的方法，其步骤如下。
第一步，准备原料
准确称取红糖19克、酵母浸粉1.9克、乙酸钠5克、磷酸氢二钾2克、柠檬酸铵2克；
第二步，调配与溶化
磁力搅拌器上放置装300ml水的烧杯，按照第一步中准备的原料加入到烧杯的水中，充分溶化后补加700ml水。
第三步，分装与灭菌
250ml三角瓶中加入50ml培养基后封口，置于高压灭菌锅中121℃灭菌20分钟。
第四步，活化菌种
于零下80℃冰箱保存的菌种，以1%接菌量加入到50ml三角瓶的10ml MRS培养基中，振荡培养14小时。
第五步，接菌
在超净工作台将活化好的菌种以1%接菌量加入到250ml三角瓶的50ml培养基中。
第六步，培养
接好菌的三角瓶置于摇床中，于30℃120转/分振荡养18小时。
第七步，分离纯化
培养液经10000转/分离心10分钟，去除沉淀(菌体)，往上清液中加入等量的乙醇，经12000转/分离心15分钟，去除沉淀(葡聚糖)，将上清液在4℃结晶而获得甘露醇。
实施例2
以红糖为碳源明串珠菌发酵产甘露醇的方法，其步骤如下。
第一步，准备原料
准确称取红糖21克、酵母浸粉2.1克、乙酸钠5克、磷酸氢二钾2克、柠檬酸铵2克。
第二步，调配与溶化
磁力搅拌器上放置装300ml水的烧杯，按照第一步中准备的原料加入到烧杯的水中，充分溶化后补加700ml水。
第三步，分装与灭菌
250ml三角瓶中加入50ml培养基后封口，置于高压灭菌锅中121℃灭菌20分钟。
第四步，活化菌种
于零下80℃冰箱保存的菌种，以1%接菌量加入到50ml三角瓶的10ml MRS培养基中，振荡培养13小时。
第五步，接菌
在超净工作台将活化好的菌种以1%接菌量加入到250ml三角瓶的50ml培养基中。
第六步，培养
接好菌的三角瓶置于摇床中，于30℃120转/分振荡养18小时。
第七步，分离纯化
培养液经10000转/分离心10分钟，去除沉淀(菌体)，往上清液中加入等量的乙醇，经12000转/分离心15分钟，去除沉淀(葡聚糖)，将上清液在4℃结晶而获得甘露醇。
实施例3
以红糖为碳源明串珠菌发酵产甘露醇的方法，其步骤如下。
第一步，准备原料
准确称取红糖20克、酵母浸粉2克、乙酸钠5克、磷酸氢二钾2克、柠檬酸铵2克。
第二步，调配与溶化
磁力搅拌器上放置装300ml水的烧杯，按照第一步中准备的原料加入到烧杯的水中，充分溶化后补加700ml水。
第三步，分装与灭菌
250ml三角瓶中加入50ml培养基后封口，置于高压灭菌锅中121℃灭菌16分钟。
第四步，活化菌种
于零下80℃冰箱保存的菌种，以1%接菌量加入到50ml三角瓶的10ml MRS培养基中，振荡培养14小时。
第五步，接菌
在超净工作台将活化好的菌种以1%接菌量加入到250ml三角瓶的50ml培养基中。
第六步，培养
接好菌的三角瓶置于摇床中，于30℃120转/分振荡养18小时。
第七步，分离纯化
培养液经10000转/分离心10分钟，去除沉淀(菌体)，往上清液中加入等量的乙醇，经12000转/分离心15分钟，去除沉淀(葡聚糖)，将上清液在4℃结晶而获得甘露醇。
实施例4
以红糖为碳源明串珠菌发酵产甘露醇的方法，其步骤如下。
第一步，准备原料
准确称取红糖21克、酵母浸粉1.9克、乙酸钠5克、磷酸氢二钾2克、柠檬酸铵2克，溶于1000ml水中。
第二步，调配与溶化
磁力搅拌器上放置装300ml水的烧杯，按照第一步中准备的原料加入到烧杯的水中，充分溶化后补加700ml水。
第三步，分装与灭菌
250ml三角瓶中加入50ml培养基后封口，置于高压灭菌锅中121℃灭菌20分钟。
第四步，活化菌种
于零下80℃冰箱保存的菌种，以1%接菌量加入到50ml三角瓶的10ml MRS培养基中，振荡培养15小时。
第五步，接菌
在超净工作台将活化好的菌种以1%接菌量加入到250ml三角瓶的50ml培养基中。
第六步，培养
接好菌的三角瓶置于摇床中，于30℃120转/分振荡养17小时。
第七步，分离纯化
培养液经10000转/分离心10分钟，去除沉淀(菌体)，往上清液中加入等量的乙醇，经12000转/分离心15分钟，去除沉淀(葡聚糖)，将上清液在4℃结晶而获得甘露醇。
硫酸镁和硫酸锰是在发酵过程中必需的成分，但本专利中使用了红糖就不用添加硫酸镁和硫酸锰，这是因为红糖中都含有镁离子和锰离子。经过测定，实施例1-4中发酵所获得的甘露醇含量如表1所示。
表1实施例1-4所获得的甘露醇含量
| 项目 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 |
| 甘露醇含量 | 7.18g/L | 7.21g/L | 7.30g/L | 7.25g/L |
上述实施例1～4中，所述红糖、酵母浸粉、乙酸钠、磷酸氢二钾和柠檬酸铵由供应商提供，成分均是公知的；所用的菌种是本公司保存的；所涉及到的设备和工艺操作方法均为本技术领域技术人员所公知的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.以红糖为碳源明串珠菌发酵产甘露醇的方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）以红糖为碳源制备培养基：
（1.1）准备原料
准确称取红糖19～21克、酵母浸粉1.9～2.1克、乙酸钠5克、磷酸氢二钾2克、柠檬酸铵2克备用；
（1.2）调配与溶化
磁力搅拌器上放置装300ml水的烧杯，将步骤（1.1）称取的原料加入到烧杯的水中，充分溶化后补加700ml水，即制成培养基；
（1.3）分装与灭菌
在250ml三角瓶中加入步骤（1.2）制备的培养基50ml后封口，置于高压灭菌锅中121℃灭菌20分钟；
（2）明串珠菌发酵产甘露醇
（2.1）活化菌种
将明串珠菌以1%接菌量加入到50ml三角瓶内的10ml MRS培养基中，振荡培养12～16小时；
（2.2）接菌
在超净工作台将步骤（2.1）活化好的菌种以1%接菌量加入到步骤（1.3）灭菌后的250ml三角瓶内的50ml培养基中；
（2.3）培养
将步骤（2.2）接菌后的三角瓶置于摇床中，在30℃下以120转/分的速度振荡培养16～18小时，得培养液；
（2.4）分离纯化
将步骤（2.3）制得的培养液经10000转/分离心10分钟，去除菌体沉淀得上清液A；在上清液A中加入等量的乙醇，经12000转/分离心15分钟，去除葡聚糖沉淀得上清液B，将上清液B在4℃结晶即制得甘露醇。
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