CN102863433A - 莫匹罗星的一种纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了莫匹罗星的一种纯化方法，属于生物技术范畴。本发明利用莫匹罗星的结构特点，采用复合溶剂提取及调节pH值去除发酵液中的小分子，通过纳滤、离子交换、柱层析及重结晶，获得高纯度莫匹罗星产品，经检测产品纯度达到98％以上，可满足医药行业的需求。本发明具有技术先进，工艺简单、产率高、成本低、产品纯度高等优点，有利于我国莫匹罗星生产技术和产业化水平的提高。
Description
一、技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是涉及到一种莫匹罗星纯化的方法。
二、背景技术
莫匹罗星又名假单孢菌酸A(pseudomonic acid A)、bactroban、BRL4910A，是一种天然产生的广谱抗生素，由荧光假单孢菌浸没发酵后产生，在结构上较特殊，与其他抗生素无关联。由荧光假单孢菌产生的这类物质包括有假单孢菌酸A、B、C、D。假单孢菌A为其主要活性部分，占90-95％。莫匹罗星为细菌中异亮氯酰t-RNA合成酶的竞争抑制剂，抑制蛋白质合成，其作用部位为细胞壁上的异亮氨酸转移核糖核酸酶，使异亮氨酸和转移核糖核酸不能形成异亮氨酸转移核糖核酸，因而不能将异亮氨酸运至核糖体而转入增长的蛋白链中，致使蛋白合成停止。它能在皮肤表层达到并保持很高的药物浓度，不易产生抗药性，低浓度时有抑菌作用，高浓度时有杀菌作用。对革兰阳性球菌有很强的抗菌活性，对某些革兰阴性菌也有抗菌作用，对多种耐抗生素的菌株几乎都敏感，与其他抗生素无交叉耐药性。以莫匹罗星为原料生产获得的药剂作为一种新型的唯一专供局部应用的抗生素，1985年起己在国外正式生产，对一些常见的皮肤细菌感染性疾病具有良好的疗效，适用于各种细菌性皮肤感染，主要用于革兰阳性球菌引起的皮肤软组织感染，如脓疱疮、疖毛囊炎等原发性感染以及湿疹、皮炎、溃疡、外伤等皮肤病的继发性感染。
莫匹罗星由于与其他抗生素无交叉耐药性而备受青睐，全球对莫匹罗星的需求量极大，目前国内外市场需求量大约为13吨左右，并会随着时间的推移而继续增加，因此对莫匹罗星原料药的开发具有极为广阔的市场前景。但由于其生产难度较高，许多年来国际市场上莫匹罗星原料均由史克公司独家生产。目前，由莫匹罗星生产的中美史克“百多邦”软膏已转换为非处方药物在市场上发售，其进一步拉动了莫匹罗星的需求量。
美国专利(4222942)涉及一种分离莫匹罗星的方法，其通过在具有水介质的与水不混溶的有机溶剂中萃取粗品莫匹罗星制剂的溶液，降低所述水溶液的pH，并用极性水不相溶的有机溶剂萃取该溶液，此后加入充分非极性的稀释剂以降低所述极性有机溶剂的极性，但是该稀释剂与所述极性有机溶剂是可混溶的，以便影响莫匹罗星的结晶。该专利涉及步骤多，产品收率低，溶剂使用量大，成本高。
美国专利(6254921)公开了一种分离莫匹罗星的方法，其包括使用氯化脂肪烃或醋酸异丁酯萃取酸化的培养基，这样可以获得含有莫匹罗星的萃取物，并通过水相与有机相之间萃取物的分配从所述萃取物中提纯莫匹罗星，所述有机相含有至少一种有机溶剂和蒸发用的有机溶剂。该专利有机溶剂的使用量大，产品纯度低。
丹麦阿尔法马股份有限公司申请的专利(申请号200680005554.4)公开了一种莫匹罗星的提纯方法，其包括引发或使得莫匹罗星从其水溶液中沉淀；回收沉淀物；将回收的沉淀物溶解在有机溶剂中。该专利产物收率低，同时产品纯度不高。
上述方法存在提取步骤多、有机溶剂使用量大、产品收率低、纯度不高等不足，难以满足莫匹罗星产业化推广的需要。
在此背景下，本发明利用莫匹罗星的结构特点，采用复合溶剂提取及调节pH值去除发酵液中的小分子，通过纳滤、离子交换、柱层析及重结晶，完成莫匹罗星的纯化，为我国莫匹罗星生产技术的改进，产业水平的提高提供一定的技术支持。
三、发明内容
本发明的目的是提出莫匹罗星的一种纯化方法，可有效提高莫匹罗星产品的提取率和产品纯度，降低生产成本。
莫匹罗星的一种纯化方法，主要通过如下技术方案实现：
(1)发酵液酸化处理
莫匹罗星发酵液内加入乙酸或盐酸调节溶液pH值至3.0-6.5之间。
(2)有机溶剂抽提
酸化处理的发酵液离心去除上清液，沉淀部分加入2倍体积的甲醇，搅拌均匀后浸泡4h，抽滤后留滤液备用。
(3)纳滤浓缩
有机溶剂抽滤获得滤液进行纳滤浓缩，操作参数为：纳滤膜的截流分子量为500-600，进口及出口温度均为常温，进料速度1.0～1.5L/h，操作压力0.1～1MPa，滤液备用。
(4)离子交换
将聚苯乙烯二乙烯苯磺酸盐DOW[XFS.43278.002]强酸钠型树脂加入纳滤浓缩液中，室温搅拌6-8h，去离子水冲洗树脂，后用pH10.0-11.0的氢氧化钠溶液解吸，收集解吸液，备用。
(5)纳滤浓缩
离子交换获得解吸液进行纳滤浓缩，操作参数为：纳滤膜的截流分子量为500-600，进口及出口温度均为常温，进料速度1.0～1.5L/h，操作压力0.1～1MPa，滤液备用。
(6)结晶
将经离子交换处理的解析液经纳滤浓缩至40％-50％后，加入4-5倍体积的甲醇，搅拌均匀后投入晶种，4℃静置12h，获得莫匹罗星晶体，备用。
(7)柱层析
将获得莫匹罗星晶体溶解后与少量硅胶混合后挥干后上硅胶柱，依次用丙酮、甲醇∶水体积比为1∶1～1∶1.5(V/V)、甲醇∶HCl(0.2M)体积比为1∶0.5～1∶1.5的洗脱剂洗脱硅胶柱，得到莫匹罗星三组分的混合物，后以甲酸铵(4g/L)∶甲醇的混合液为流动相，进行柱层析，混合流动相内酸铵(4g/L)∶甲醇的体积比为1∶3～1∶5，收集洗脱液，备用。
(8)纳滤浓缩
柱层析获得洗脱液进行纳滤浓缩，操作参数为：纳滤膜的截流分子量为500-600，进口及出口温度均为常温，进料速度1.0～1.5L/h，操作压力0.1～1MPa，滤液浓缩，精滤去除杂质后，干燥，获得莫匹罗星纯品。
到目前为止，发酵法是莫匹罗星实现工业生产唯一可行的方法。但发酵液过滤产生的滤液、树脂脱色提纯后得到的解析液中产物的浓度很低，现有工艺通常都采用溶剂萃取、薄膜蒸发、减压蒸馏等工艺进行纯化、浓缩。
本成果采用纳滤膜对发酵滤液、离子交换及柱层析得到的解析液进行浓缩，可大大节省能源消耗，降低生产成本。同时，由于纳滤膜浓缩技术操作在常温下进行，对莫匹罗星无破坏作用，无二次污染，大大提高了产品的收率及产品的质量，本发明主要先进性表现在以下几点：
(1)利用莫匹罗星的结构特点，先用复合溶剂提取，后通过改变溶液pH值，使莫匹罗星变成溶于水的钠盐，进入水相，使小分子得以去除。
(2)进一步采用超滤技术，去除色素、蛋白和多糖等杂质，后调节溶液pH值，进行反萃取，最后通过柱层析纯化和重结晶得到高纯度的莫匹罗星产品。
(3)在产品的分离纯化过程中引入了先进的纳滤膜浓缩纯化技术，产品产率及提取收率大于75％。
(4)在产品精制的过程中综合使用了离子交换技术、溶媒结晶技术和层析技术等，获得的莫匹罗星产品质量优，纯度大于98％。
四、附图说明
图1：莫匹罗星纯化工艺技术路线图
五、具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。
实施例一
量取100L发酵液，加入1M盐酸，调节pH值至4.0，搅拌20min后，3000r/min离心分离获得菌丝体，备用。酸化处理后获得菌丝体加入2倍体积的甲醇，搅拌均匀后浸泡4h，抽滤后留滤液备用。
选用截流分子量为500-600的纳滤膜进行第一次纳滤浓缩，设定进口及出口温度均为常温，有机溶剂抽滤获得滤液的进料速度1.0L/h，操作压力0.5MPa，收集纳滤浓缩液，备用。
向纳滤浓缩液中加入5％的聚苯乙烯二乙烯苯磺酸盐DOW[XFS.43278.002]强酸钠型树脂，室温搅拌6h，去离子水冲洗树脂，后用pH10.0的氢氧化钠溶液解吸，收集解析液，备用。
选用截流分子量为500-600的纳滤膜进行第二次纳滤浓缩，设定进口及出口温度均为常温，收集获得离子交换解吸液的进料速度1.2L/h，操作压力0.6MPa，解析液浓缩至40％后收集纳滤浓缩液，加入4倍体积的甲醇，搅拌均匀后投入晶种，4℃静置12h，获得莫匹罗星晶体，备用。
将获得莫匹罗星晶体溶解后与少量硅胶混合后挥干后上硅胶柱，依次用丙酮、甲醇∶水体积比为1∶1.3(V/V)、甲醇∶HCl(0.2M)体积比为1∶1的洗脱剂洗脱硅胶柱，得到莫匹罗星三组分的混合物，后以甲酸铵(4g/L)∶甲醇的混合液为流动相，进行柱层析，混合流动相内酸铵(4g/L)∶甲醇的体积比为1∶4，收集洗脱液，备用。
选用截流分子量为500-600的纳滤膜进行第三次纳滤浓缩，设定进口及出口温度均为常温，柱层析获得洗脱液的进料速度1.5L/h，操作压力0.8MPa，解析液浓缩至40％后收集纳滤浓缩液，精滤去除杂质后干燥获得莫匹罗星纯品，产品收率达到75.8％，产品纯度为98.2％。
实施例二
量取100L发酵液，加入1M盐酸，调节pH值至4.5，搅拌20min后，3000r/min离心分离获得菌丝体，备用。酸化处理后获得菌丝体加入2倍体积的甲醇，搅拌均匀后浸泡4h，抽滤后留滤液备用。
选用截流分子量为500-600的纳滤膜进行第一次纳滤浓缩，设定进口及出口温度均为常温，有机溶剂抽滤获得滤液的进料速度1.2L/h，操作压力0.6MPa，收集纳滤浓缩液，备用。
向纳滤浓缩液中加入5％的聚苯乙烯二乙烯苯磺酸盐DOW[XFS.43278.002]强酸钠型树脂，室温搅拌8h，去离子水冲洗树脂，后用pH10.5的氢氧化钠溶液解吸，收集解析液，备用。
选用截流分子量为500-600的纳滤膜进行第二次纳滤浓缩，设定进口及出口温度均为常温，收集获得离子交换解吸液的进料速度1.2L/h，操作压力0.8MPa，解析液浓缩至45％后收集纳滤浓缩液，加入5倍体积的甲醇，搅拌均匀后投入晶种，4℃静置12h，获得莫匹罗星晶体，备用。
将获得莫匹罗星晶体溶解后与少量硅胶混合后挥干后上硅胶柱，依次用丙酮、甲醇∶水体积比为1∶1.2(V/V)、甲醇∶HCl(0.2M)体积比为1∶1.2的洗脱剂洗脱硅胶柱，得到莫匹罗星三组分的混合物，后以甲酸铵(4g/L)∶甲醇的混合液为流动相，进行柱层析，混合流动相内酸铵(4g/L)∶甲醇的体积比为1∶3，收集洗脱液，备用。
选用截流分子量为500-600的纳滤膜进行第三次纳滤浓缩，设定进口及出口温度均为常温，柱层析获得洗脱液的进料速度1.5L/h，操作压力1.0MPa，解析液浓缩至40％后收集纳滤浓缩液，精滤去除杂质后干燥获得莫匹罗星纯品，产品收率达到75.5％，产品纯度为98.5％。
实施例三
量取100L发酵液，加入1M乙酸，调节pH值至4.2，搅拌20min后，3000r/min离心分离获得菌丝体，备用。酸化处理后获得菌丝体加入2倍体积的甲醇，搅拌均匀后浸泡4h，抽滤后留滤液备用。
选用截流分子量为500-600的纳滤膜进行第一次纳滤浓缩，设定进口及出口温度均为常温，有机溶剂抽滤获得滤液的进料速度1.0L/h，操作压力0.4MPa，收集纳滤浓缩液，备用。
向纳滤浓缩液中加入5％的聚苯乙烯二乙烯苯磺酸盐DOW[XFS.43278.002]强酸钠型树脂，室温搅拌7h，去离子水冲洗树脂，后用pH10.0的氢氧化钠溶液解吸，收集解析液，备用。
选用截流分子量为500-600的纳滤膜进行第二次纳滤浓缩，设定进口及出口温度均为常温，收集获得离子交换解吸液的进料速度1.2L/h，操作压力0.5MPa，解析液浓缩至40％后收集纳滤浓缩液，加入4倍体积的甲醇，搅拌均匀后投入晶种，4℃静置12h，获得莫匹罗星晶体，备用。
将获得莫匹罗星晶体溶解后与少量硅胶混合后挥干后上硅胶柱，依次用丙酮、甲醇∶水体积比为1∶1(V/V)、甲醇∶HCl(0.2M)体积比为1∶1.5的洗脱剂洗脱硅胶柱，得到莫匹罗星三组分的混合物，后以甲酸铵(4g/L)∶甲醇的混合液为流动相，进行柱层析，混合流动相内酸铵(4g/L)∶甲醇的体积比为1∶5，收集洗脱液，备用。
选用截流分子量为500-600的纳滤膜进行第三次纳滤浓缩，设定进口及出口温度均为常温，柱层析获得洗脱液的进料速度1.4L/h，操作压力0.7MPa，解析液浓缩至40％后收集纳滤浓缩液，精滤去除杂质后干燥获得莫匹罗星纯品，产品收率达到75.2％，产品纯度为98.6％。
实施例四
量取100L发酵液，加入1M乙酸，调节pH值至3.5，搅拌20min后，3000r/min离心分离获得菌丝体，备用。酸化处理后获得菌丝体加入2倍体积的甲醇，搅拌均匀后浸泡4h，抽滤后留滤液备用。
选用截流分子量为500-600的纳滤膜进行第一次纳滤浓缩，设定进口及出口温度均为常温，有机溶剂抽滤获得滤液的进料速度1.0L/h，操作压力0.3MPa，收集纳滤浓缩液，备用。
向纳滤浓缩液中加入5％的聚苯乙烯二乙烯苯磺酸盐DOW[XFS.43278.002]强酸钠型树脂，室温搅拌8h，去离子水冲洗树脂，后用pH10.0的氢氧化钠溶液解吸，收集解析液，备用。
选用截流分子量为500-600的纳滤膜进行第二次纳滤浓缩，设定进口及出口温度均为常温，收集获得离子交换解吸液的进料速度1.2L/h，操作压力0.5MPa，解析液浓缩至40％后收集纳滤浓缩液，加入5倍体积的甲醇，搅拌均匀后投入晶种，4℃静置12h，获得莫匹罗星晶体，备用。
将获得莫匹罗星晶体溶解后与少量硅胶混合后挥干后上硅胶柱，依次用丙酮、甲醇∶水体积比为1∶1.3(V/V)、甲醇∶HCl(0.2M)体积比为1∶1的洗脱剂洗脱硅胶柱，得到莫匹罗星三组分的混合物，后以甲酸铵(4g/L)∶甲醇的混合液为流动相，进行柱层析，混合流动相内酸铵(4g/L)∶甲醇的体积比为1∶4，收集洗脱液，备用。
选用截流分子量为500-600的纳滤膜进行第三次纳滤浓缩，设定进口及出口温度均为常温，柱层析获得洗脱液的进料速度1.5L/h，操作压力0.8MPa，解析液浓缩至40％后收集纳滤浓缩液，精滤去除杂质后干燥获得莫匹罗星纯品，产品收率达到75.3％，产品纯度为98.1％。
Claims (8)
1.莫匹罗星的一种纯化方法，其特征是利用莫匹罗星的结构特点，采用复合溶剂提取及调节pH值去除发酵液中的小分子，通过纳滤浓缩、离子交换、柱层析及重结晶，获得高纯度莫匹罗星产品。
2.如权利要求1中所述的调节pH值去除发酵液中的小分子，其特征在于：调节溶液可选择乙酸和盐酸。
3.如权利要求1中所述的调节pH值去除发酵液中的小分子，其特征在于：pH值的调节范围为3.0-6.5。
4.如权利要求1中所述的纳滤浓缩，其特征在于：纳滤膜的截流分子量为500-600，进口及出口温度均为常温，进料速度1.0～1.5L/h，操作压力0.1～1MPa。
5.如权利要求1所述的离子交换，其特征在于：离子交换树脂可采用聚苯乙烯二乙烯苯磺酸盐DOW[XFS.43278.002]和732型强酸钠型树脂，将树脂加入莫匹罗星发酵浓缩液中，室温搅拌6-8h，去离子水冲洗树脂，后用pH10.0-11.0的氢氧化钠溶液解吸。
6.如权利要求1所述的结晶，其特征在于：将经离子交换处理的解析液经纳滤浓缩至40％-50％后，加入4-5倍体积的甲醇，搅拌均匀后投入晶种，4℃静置12h，获得莫匹罗星晶体。
7.如权利要求1所述的柱层析，其特征在于：将获得莫匹罗星晶体溶解后与少量硅胶混合后挥干后上硅胶柱，依次用丙酮、甲醇∶水体积比为1∶1～1∶1.5(V/V)、甲醇∶HCl(0.2M)体积比为1∶0.5～1∶1.5的洗脱剂洗脱硅胶柱，得到莫匹罗星三组分的混合物，后以甲酸铵(4g/L)∶甲醇的混合液为流动相，进行柱层析，混合流动相内酸铵(4g/L)∶甲醇的体积比为1∶3～1∶5。
8.如权利要求1所述的莫匹罗星的一种纯化方法，其特征在于：制备获得的莫匹罗星纯度达到98％以上，提取率达到75％以上。
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