CN107858315A

CN107858315A - 一株防治子莲腐败病的解淀粉芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN107858315A
Application number: CN201711372342.6A
Authority: CN
Inventors: 肖炎农; 张臻; 孟俊峰; 王高峰; 肖雪琼
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2017-12-14
Filing date: 2017-12-14
Publication date: 2018-03-30
Anticipated expiration: 2037-12-14
Also published as: CN107858315B

Abstract

本发明公开了一株防治子莲腐败病的解淀粉芽孢杆菌及其应用，所述的解淀粉芽孢杆菌为（Bacillus amyloliquefaciens）B‑36，保藏编号：CCTCC NO：M 2017652。在室内平板对峙试验中，B‑36菌株对镰孢菌的生长抑制率达到74.07%；20%浓度的B‑36发酵液对镰孢菌的生长抑制率高到90.46%；室内盆栽试验结果显示，B‑36菌悬液处理组的子莲叶片直径和叶片高度相对空白对照明显提高，在子莲生长后期防治子莲腐败病效可达46.20%，因此该菌株是一株极具开发潜力的防治子莲腐败病的生防细菌。

Description

一株防治子莲腐败病的解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及一株防治子莲腐败病的解淀粉芽孢杆菌及其应用。

背景技术

子莲是一种常见水生蔬菜，莲籽鲜食清甜可口，也可制成多种菜肴，是一种常用食材。此外，莲籽、莲心、莲叶、莲花等都具有多种保健和药用功能。因此，近年来子莲产业迅猛发展，成为农民增加收入的新亮点。在子莲生产中，藕塘连年使用为病原菌侵染子莲诱发腐败病的发生创造了条件。由于藕节等残体的残留，病原菌在藕塘内逐年积累，致使连作的藕塘病原菌数量多、种类杂，子莲腐败病发生程度逐年加重。由于水体稀释扩散，病原菌随着水流转移，致使全塘成为发病侵染点，往往呈现全塘发病，造成整塘绝收的重大损失。

子莲腐败病的病原物为镰孢菌(Fusarium spp.)，其中尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)最常见，申请人从发病植株中分离的木贼镰孢菌(Fusarium equiseti)也可以引起典型病害。病菌侵染植物组织后，常常引起所侵染的组织部位腐烂，然后扩展至整个植株，极大地降低了作物的品质和产量。由于病原来源于土壤或种藕带菌，无法进行根除，因此繁育无病种藕和清除藕田病原是防治子莲腐败病的关键。目前此病防治以化学药剂为主，农业辅助措施、生态防治等防治方法投入较少，收效甚微。

长期以来，我国农作物的病虫害防治主要依赖化学农药，子莲生产中，腐败病以化学防治为主。由于子莲腐败病属于维管束病害，防治时期一般在发病初期。化学药剂主要施用方法有利用药剂对土壤、种藕进行消毒，喷雾叶面，茎杆注射等措施。化学药剂高效，易使用，但是由于农药污染较为严重，食品中农药检出率高达90％以上，这严重危害了消费者的身体健康。因此，农药残留已成为食品安全生产中急需解决的问题。相比化学农药，生物农药具有安全、环保和无残留等优点。注重低毒、高效和选择性强的生物农药开发已成为当前的研究热点之一。

目前，许多研究者提倡开发利用生物防治技术来控制植物的枯萎病害。生物防治措施既对环境友好，对人畜安全，又能有效控制病害的发生与蔓延，所以颇受青睐。目前已经报道过的生防菌有芽胞杆菌(Bacillus spp.)、部分木霉(Trichoderma spp.)等。其中芽胞杆菌是分布最广、抑菌广谱性能强、应用较为广泛的一类生防细菌，防治效果较好。

由于子莲的水生习性，腐败病的生物防治过程难以操作，相关研究较为缺乏。关于利用解淀粉芽孢杆菌防治子莲腐败病的研究尚未被报道过。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)B-36(以下简称B-36菌株)，该菌株对子莲腐败病有较强的防治效果。

本发明的第二个目的是在于提供解淀粉芽孢杆菌B-36或其发酵产物在制备防治子莲腐败病生物制剂药物中的应用。

本发明的第三个目的是提供解淀粉芽孢杆菌B-36在促进子莲生长中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B-36，通过以下方式获得：

申请人从中国湖北省武汉市华中农业大学藕塘基地中分离、筛选得到一株对子莲腐败病具有较强防治效果的菌株，将其命名为B-36。通过形态学及分子生物学的鉴定，鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。该菌株已于2017年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2017652。

解淀粉芽孢杆菌B-36菌株菌落特征：菌落呈乳白色、扁平光滑近圆形，边缘呈锯齿状，菌落不透明、无光泽、质地干燥、无色素产生；革兰氏染色呈阳性。

解淀粉芽孢杆菌B-36及其发酵产物在制备防治子莲腐败病生物制剂药物中的应用，包括利用该菌株或其发酵产物作为唯一有效成分或有效成分之一制备成防治子莲腐败病病害的药物。

解淀粉芽孢杆菌B-36在促进子莲生长中的应用，包括利用所述的解淀粉芽孢杆菌B-36发酵液用于制备子莲促生长制剂。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明筛选出一株防治莲腐败病的新菌株B-36，该菌株是一种解淀粉芽孢杆菌，目前没有关于该菌株防治子莲腐败病的相关报道。

2.本发明筛选出的B-36菌株在室内与木贼镰孢菌进行平板对峙试验中，该菌对木贼镰孢菌的生长抑制率达到74.07％。浓度分别为1％、5％、10％、20％的B-36的发酵上清液对木贼镰孢菌生长的抑制率分别为42.74％、74.03％、89.78％、90.6％。B-36菌悬液对子莲腐败病盆栽试验结果表显示，在子莲生长的前期、中期和后期，经B-36菌悬液处理后，子莲腐败病的发病率分别为:37.35％、31.19％、37.92％，B-36对子莲腐败病的相对防效分别为：47.19％、53.52％、46.20％。

3.本发明使用的菌株对子莲腐败病防效较高，对人畜无毒；成本低。

4.本发明利用解淀粉芽孢杆菌B-36菌株的发酵菌液直接防治子莲腐败病，生产和使用均十分简单，生产中没有用到有机溶剂，降低了生产过程中和产品中的污染，也不会产生溶剂中毒，具有生物农药对人畜安全的优点。

附图说明

图1为菌株B-36在NA平板上的菌落形态及革兰氏染色显微图。

图2为B-36菌株与木贼镰孢菌室内平板对峙3天的菌落形态。

图3为20％浓度的B-36菌株发酵液对木贼镰孢菌生长影响的菌落形态图。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。本发明所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：解淀粉芽孢杆菌B-36菌株的分离及鉴定

1、B-36菌株的分离

申请人从中国湖北省武汉市华中农业大学藕塘基地子莲植株中分离、筛选得到一株对子莲腐败病具有较强防治效果的菌株，将其命名为B-36。本发明的B-36菌株的分离和纯化采用稀释涂布平板法、平板划线、生物测定等方法。具体方法如下：

(1)采集30块子莲块茎作为材料，将材料用流水清洗，为了保证清洗效果，清洗时加入洗洁精，或用流水清洗时用超声波进行处理，最后用无菌水进行冲洗；

(2)无菌水冲洗过的组织切块先后用75％酒精浸泡5min、2％次氯酸钠浸泡5min、无菌水涮洗3遍后，置于80℃的无菌水中水浴10min，无菌滤纸上去除多余水分备用；将消毒后的植物材料用无菌工具剪成小块后，研磨或加入一定量的石英砂再研磨，成匀浆后再进行PDA平板涂布；

(3)采用平板对峙法对分离得到的芽孢杆菌进行筛选，选取抑菌圈(细菌菌落中心至病原菌菌丝边缘)半径最大的拮抗细菌，得到对木贼镰孢菌生长抑制率最高的解淀粉芽孢杆菌B-36。

2、菌株的鉴定

菌株的形态学鉴定：通过观察菌落的颜色、形态、边缘、透明度、光泽度、培养基的颜色等，并通过革兰氏染色观察菌体形态特征。

将B-36菌株在NA培养基平板上划线培养，从图1中可以看到：B-36菌落呈乳白色、扁平光滑近圆形，边缘呈锯齿状，菌落不透明、无光泽、质地干燥、无色素产生；革兰氏染色呈阳性，上述形态特征表明菌株B-36属于芽孢杆菌属。

菌株B-36的分子鉴定：在无菌操作台中用接种环挑取B-36单菌落于分装好的NA液体培养基中，35℃，180rpm条件下震荡培养12h，并利用gyrA基因设计引物gyrA-f(5′-CAGTCA GGA AAT GCG TAC GTC CTT-3′)和gyrA-r(5′-CAA GGT AAT GCT CCA GGC ATT GCT-3′)进行菌液PCR扩增。PCR扩增程序为：95℃预变性5min，95℃30s、55℃30s、72℃45s，30个循环，72℃10min，4℃保存。PCR反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测合格后送武汉天一辉远公司测序。

经测序获得菌株B-36的gyrA基因片段大小为1004bp，其序列如SEQ ID NO.1所示，通过Blast分析，选取与之同源性较高的菌株，利用软件MEGA6.0进行***发育分析、NJ法构建***发育树。结果表明B-36与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)聚在一个分支上，统计支持率为100％，结合之前形态特征和生理生化实验，将B-36鉴定为解淀粉芽孢杆菌。

所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B-36，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2017年11月3日，保藏编号：CCTCC NO：M 2017652。

培养B-36菌株使用的是NA培养液，其组分及配方如下：蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，牛肉膏3g，补充蒸馏水至1000mL，调pH至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30min。

3、摇瓶发酵培养

用接种环挑取细菌单个菌落，接种于含有4mL NA培养液的10mL离心管中，在28℃、280r/min下摇培24h，再以1％体积比转接于含有100mL PDB培养基的锥形瓶中，在28℃、280r/min下摇培72h。

所述的PDB培养基，其组分如下：马铃薯200g、葡萄糖20g、蒸馏水1000mL，121℃高温灭菌30min。

72h摇培后的发酵液在12000r/min下离心10min后，收集上清液，利用布式漏斗抽滤，通过孔径0.45μm滤膜进行过滤，发酵液最后在无菌条件下，通过一次性0.22μm无菌过滤器获得无菌滤液，用于实施例3。

实施例2：B-36菌株在平板中对木贼镰孢菌生长的影响

挑取B-36单菌落在分别距平板中央2cm处划两条直线，平板中央同时移入一直径0.3cm的木贼镰孢菌的琼脂块，置于25℃培养箱培养，每个菌株4次重复。对照不进行细菌划线，只接种木贼镰孢菌菌丝块。3天后测量抑菌圈半径(B-36菌落中心至病原菌菌丝边缘)的大小，并计算抑菌率。

抑菌率＝(对照镰孢菌的生长速率﹣处理镰孢菌的生长速率)/对照镰孢菌的生长速率×100％。

表1B-36在平板中对木贼镰孢菌生长的影响(3d，25℃)

B-36菌株在平板中对木贼镰孢菌生长影响的结果显示：B-36菌株在平板中能明显抑制木贼镰孢菌的生长(见图2)，其对木贼镰孢菌的抑制率达到了74.07％。

实施例3：B-36菌株发酵上清液对木贼镰孢菌生长的影响

将B-36的无菌滤液与适温的PDA培养基分别以1％、5％、10％、20％的体积比(V/V)混合制成PDA平板，接种活化后的木贼镰孢菌菌丝块，25℃下黑暗培养观察，7d后用十字交叉法测定镰孢菌菌落直径并计算抑菌率。以PDA培养基上接种木贼镰孢菌为对照。

表2B-36发酵上清液对木贼镰孢菌生长的影响(7d，25℃)

B-36菌株发酵上清液对木贼镰孢菌生长的影响实验结果显示：不同浓度的B-36菌株发酵上清液对木贼镰孢菌的生长具有一定的抑制作用，且随着发酵液浓度的提高，其抑制率也增加，在浓度为20％时，抑制率最高，达到90.46％(表2)。本试验说明B-36菌株发酵上清液对木贼镰孢菌的生长具有较强的抑制作用。

实施例4：B-36菌株防治子莲腐败病的塑料大棚盆栽试验

子莲种植：土壤采用试验田未发病的藕塘淤泥与田间土壤按体积比1：1混合。4月中下旬，筛选大小一致的无病子莲块茎(太空莲6号)作为试验材料，栽于口径30cm的花盆内，自然条件下生长。

B-36菌悬液制备：挑取B-36单菌落接种到装有200mL NA液体培养基的三角瓶中，28℃，180rpm，摇培72h，得到B-36菌悬液。

病原菌接种：子莲长出第一片立叶后，接种子莲腐败病原菌尖孢镰孢菌F-8(Fusarium oxysporum)(分离自湖北省武汉市华中农业大学发病藕田)。用注射器吸取尖孢镰孢菌1×10⁴CFU/mL的孢子悬浮液注射于子莲块茎，注射量100μL/株。

拮抗菌株B-36注射接种：子莲接种尖孢镰孢菌孢子液15d后接种拮抗菌株。共设3个处理，每个处理设3个重复，设置喷雾多菌灵500mL的阳性对照和只接病原菌的对照。注射接种拮抗菌株后1、2、3月后统计发病情况。其中在接种后第三次统计时，由于子莲浮叶的生理衰败，仅在立叶上统计病害发生情况，计算发病率和防病效果。

各处理设置如下：

发病率(％)＝病叶数/总叶数×100％

防治效果(％)＝(对照发病率—处理发病率)/对照发病率×100％

表3各生长时期不同处理发病率及防病效果测定

注：*喷雾多菌灵处理作为阳性对照；同列数据后字母相同表示差异不显著(LSD，P≤0.05)。

子莲生长情况的调查结果表明：比较接种拮抗菌株后，各处理在子莲生长前期、中期和后期腐败病的发病率和防病效果。如表3所示：3个调查时期，B-36菌株注射处理组相比对照发病率降低，差异显著；随着生长推移，注射处理相比对照组发病率降低程度加大，到生长后期，B-36菌株注射处理相比对照均表现出显著性差异。随着生长时间的增加，阳性对照组发病率增加，接种处理各组中，发病率呈现出降低趋势，生长中后期阳性对照发病率高于B-36菌株注射处理组的发病率。

表4生长后期各处理的子莲生物学性状测定

观察生长后期各组子莲生物学性状，结果如表4所示：相比只接病原菌的对照，处理组立叶比例增加13.7％-26.1％，其中B-36菌株注射处理组相比对照达到显著性差异；处理组在叶柄高度、叶片直径和立叶比例中均高于对照组，且在0.05水平上存在显著差异，进而说明B-36菌株对子莲的生长具有一定的促进作用。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一株防治子莲腐败病的解淀粉芽孢杆菌及其应用

<130> 一株防治子莲腐败病的解淀粉芽孢杆菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1004

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccggcatgca tgagcgttat cgtatcccgg gcgcttccgg atgtgcgtga cggtctgaag 60

ccggttcaca gacggatttt gtacgcaatg aatgatttag gcatgaccag tgacaaacca 120

tataaaaaat ctgcccgtat cgtcggtgaa gttatcggta agtaccaccc gcacggtgac 180

tcagcggttt acgaatcaat ggtcagaatg gcgcaggatt ttaactaccg ctacatgctt 240

gttgacggac acggcaactt cggttcggtt gacggcgact cagcggccgc gatgcgttac 300

acagaagcga gaatgtcaaa aatcgcaatg gaaattctgc gtgacattac gaaagacacg 360

attgactatc aagataacta tgacggttca gaaagagagc ctgccgtcat gccttcgaga 420

tttccgaatc tgctcgtaaa cggggctgcc ggtattgcgg tcggaatggc gacaaacatt 480

cccccgcatc agcttgggga agtcattgaa ggcgtgcttg ccgtaagtga gaatcctgag 540

attacaaacc aggagctgat ggaatacatc ccgggcccgg attttccgac tgcaggtcag 600

attttgggcc ggagcggcat ccgcaaggca tatgaatccg gacggggatc aatcacgatc 660

cgggctaagg ctgaaatcga agagacttca tcgggaaaag aaagaattat tgtcacggaa 720

cttccttatc aggtgaacaa agcgagatta attgaaaaaa tcgcggatct tgtccgagac 780

aaaaaaatcg aaggaattac cgatctgcga gacgaatccg accgtaacgg aatgagaaat 840

cgtcattgag atccgccgtg acgccaatgc tcacgtcatt ttgaataacc tgtacaaaca 900

aacggccctg cagacgttct ttcggaatca atctgctggc gctcgttgac ggacagccga 960

agtactaaag cctgaaagca ttgcctggag ccattacctt aaaa 1004

Claims

1.一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)B-36，保藏编号为CCTCC NO：M 2017652。

2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述的解淀粉芽孢杆菌B-36的gyrA基因片段如SEQ ID NO.1所示。

3.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在制备治疗或预防子莲腐败病制剂中的应用。

4.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌发酵产物在抑制子莲腐败病中的应用。

5.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在促进子莲生长中的应用。