CN107858291A - 一种高产多糖小球藻种的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高产多糖小球藻种的分离方法,包括:培养、初筛、多糖提取、复筛,培养步骤中以氨苄青霉素筛分出小球藻,然后经扩大培养进行初筛,选取高产多糖的小球藻进行复筛,复筛分离出高产多糖小球藻种。有益效果为:培养液中添加微量的(R)‑泛内脂能够刺激小球藻体内促进胞内多糖分泌的酶,提高相关酶的活性,从而提高小球藻胞内多糖的产量与产率;筛选分离高产多糖小球藻的方法简单易行,可以用于规模化培养,经过筛选与分离,可以分离出超出原始多糖产量35‑40%的小球藻种,分离效率较高,安全易行,是一种高效、安全的高产多糖小球藻种的分离方法。
Description
技术领域
本发明涉及小球藻的分离领域,尤其是涉及一种高产多糖小球藻种的分离方法。
技术背景
小球藻(Chlorella)为绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻,是一种球形单细胞淡水藻类,直径3-8微米,是地球上最早的生命之一,出现在20多亿年前,是一种高效的光合植物,以光合自养生长繁殖,分布极广。小球藻常单生,也有多细胞聚集。细胞球形、椭圆形,内有一个周生、杯状或片状的色素体。无性繁殖,每个细胞可以产生2、4、8或16个似亲孢子,成熟时母细胞破裂,孢子逸出,长大后即为新个体。世界各地均有分布,多生活于较小浅水,也有海产种类。天然条件下个体较少,人工培养大量繁殖。细胞内的蛋白质、脂肪和碳水化合物含量都很高,又有多种维生素,可食用和作为饵料。
小球藻多糖具有增强免疫活性的功能。小球藻这一营养成分的特殊功能使其在医疗保健领域得到应用。将小球藻经热水抽提、脱蛋白、乙醇沉淀得粗糖蛋白,粗糖蛋白经Sephadex-75 层析得到糖蛋白纯品。经过和单糖组分对比,小球藻糖蛋白中主要含葡萄糖、半乳糖、鼠李糖,它们的比例为7.3:1.97:1。另外还含有少量的***糖、木糖和甘露糖。但在不同提取液中提取所含单糖的组分会不同。
关于高产多糖小球藻种的分离技术有很多方法,现有技术如申请公布号为
CN 105713837 A的中国发明专利,公开了一种高产多糖小球藻种的分离方法,该发明方法是在Basal培养液中加入甘油、鼠李糖和维生素C配制成高产多糖小球藻种的培养液HPSC-M;从野生铁皮石斛茎上分离附生藻,并经高温干燥环境下进行压力筛选,获得高产多糖的小球藻,具有应用性强的优点,但是该发明的分离方法太过于繁琐,成本较高,太耗工时。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高产多糖小球藻种的分离方法,分离方法简单易行,成本较低,适合规模化生产。
本发明针对背景技术中提到的问题,采取的技术方案为:一种高产多糖小球藻种的分离方法,包括:培养、初筛、多糖提取、复筛,具体包括以下步骤:
培养:取海水样品按1:4-5加入到培养液中,弱光下培养4-5周;5000-6000r/min离心10-20分钟收集藻细胞,使用含80-90μg/mL氨苄青霉素的生理盐水洗涤,离心去上清,重复洗涤8-10次,以无菌生理盐水洗去残余抗生素,将1-2×10-5的稀释藻液涂布于固体培养基,倒置光照培养5-7天;以氨苄青霉素筛选出小球藻,然后经扩大培养为进一步是筛选出高产多糖的小球做准备;
初筛:挑选颜色、形态、大小有差异的单藻落划线分离培养,将获得的单藻转接于培养基中扩大培养,23-26℃、2000-2500lux下培养,每天摇动3-5次,每次3-5分钟,选取藻细胞不贴壁、生长较快、生物量积累较高的藻株,用于进一步筛选高产多糖的藻种;在一定培养液及摇动条件下进行培养,初步筛选出优质藻种;
多糖提取:称取小球藻干粉末,按照料液比1:20-25混合于1.5-2.0%的氢氧化钠溶液中,80-82℃浸提3-5小时,5000-6000r/min离心10分钟,取上清加入3-5倍体积的95-99%乙醇溶液,2-4℃静置过夜后离心取沉淀;多糖提取过程简单易行,易于操作,没有加入有机试剂,有利于提高多肽提取的精确程度;
复筛:选取光照:黑暗为20-21:4-3、光照强度4000-6000lux、25-26℃、起始pH为7.0作为培养条件,在培养液中添加葡萄糖1.08-1.12g/L、尿素0.20-0.22g/L、MgSO4·7H2O0.125-0.128g/L、(R)-泛内脂0.007-0.009g/L作为复筛培养基,选取初筛后多糖含量多的小球藻进行复筛培养,连续3-4次即可分离出高产多糖的小球藻;微量的(R)-泛内脂能够刺激小球藻体内促进胞内多糖分泌的酶,提高相关酶的活性,从而提高小球藻胞内多糖的产量与产率,筛选分离高产多糖小球藻的方法简单易行,可以用于规模化培养,经过筛选与分离,可以分离出超出原始多糖产量35-40%的小球藻种,分离效率较高,安全易行,是一种高效、安全的高产多糖小球藻种的分离方法。
作为优选,培养液为:NH4Cl0.375-0.385g/L,MgSO4·7H2O 0.1-0.2g/L,CaCl2·2H2O0.05-0.06g/L,K2HPO40.108-0.110g/L,KH2PO40.054-0.055g/L,Tris2.42-2.5g/L,冰醋酸1.0-1.2mL/L,微量元素1.0-1.2mL/L,以灭菌海水定容至1L,pH6.0-7.0,培养液中加入20-22g/L琼脂为固体培养基;培养液能够为小球藻提供充足的氮源、碳源,可以使小球藻迅速的恢复至生机巅峰的状态。
作为优选,微量元素为:乙二胺四乙酸二钠盐45-5Og/L,ZnSO4·7H2O 20-22g/L,H3B03 11.4-11.5g/L,MnCl2·4H20 5.06-5.10g/L,CoCl2·6H20 1.61-1.65g/L,CuSO4·5H201.57-1.60g/L,(NH4)6Mo7O24·4H2O 1.10-1.20g/L,FeSO4·7H204.19-4.20g/L;微量元素为小球藻提供充足的锌、硼、锰、钴、铜钼等微量元素,满足小球藻生长繁殖所需。
与现有技术相比,本发明的优点在于:1)微量的(R)-泛内脂能够刺激小球藻体内促进胞内多糖分泌的酶,提高相关酶的活性,从而提高小球藻胞内多糖的产量与产率;2)多糖提取过程简单易行,易于操作,没有加入有机试剂,有利于提高多糖提取的精确程度;3)筛选分离高产多糖小球藻的方法简单易行,可以用于规模化培养,经过筛选与分离,可以分离出超出原始多糖产量35-40%的小球藻种,分离效率较高,安全易行,是一种高效、安全的高产多糖小球藻种的分离方法。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明:
实施例1:
一种高产多糖小球藻种的分离方法,包括以下步骤:
1)取海水样品按1:4加入到培养液中,弱光下培养4周;5000r/min离心10分钟收集藻细胞,使用含80μg/mL氨苄青霉素的生理盐水洗涤,离心去上清,重复洗涤8次,以无菌生理盐水洗去残余抗生素,将1×10-5的稀释藻液涂布于固体培养基,倒置光照培养5天;2)挑选颜色、形态、大小有差异的单藻落划线分离培养,将获得的单藻转接于培养基中扩大培养,23℃、2000lux下培养,每天摇动3次,每次3分钟,选取藻细胞不贴壁、生长较快、生物量积累较高的藻株,用于进一步筛选高产多糖的藻种;在一定培养液及摇动条件下进行培养,初步筛选出优质藻种;3)称取小球藻干粉末,按照料液比1:20混合于1.5%的氢氧化钠溶液中,80℃浸提3小时,5000r/min离心10分钟,取上清加入3倍体积的95%乙醇溶液,2℃静置过夜后离心取沉淀;4)选取光照:黑暗为20:4、光照强度4000lux、25℃、起始pH为7.0作为培养条件,在培养液中添加葡萄糖1.08g/L、尿素0.20g/L、MgSO4·7H2O 0.125g/L、(R)-泛内脂0.007g/L作为复筛培养基,选取初筛后多糖含量多的小球藻进行复筛培养,连续3-4次即可分离出高产多糖的小球藻。
实施例2:
一种高产多糖小球藻种的分离方法,包括以下步骤:
1)培养:取海水样品按1:5加入到培养液中,弱光下培养5周; 6000r/min离心20分钟收集藻细胞,使用含90μg/mL氨苄青霉素的生理盐水洗涤,离心去上清,重复洗涤10次,以无菌生理盐水洗去残余抗生素,将2×10-5的稀释藻液涂布于固体培养基,倒置光照培养7天;以氨苄青霉素筛选出小球藻,然后经扩大培养为进一步是筛选出高产多糖的小球做准备;
2)初筛:挑选颜色、形态、大小有差异的单藻落划线分离培养,将获得的单藻转接于培养基中扩大培养,26℃、2500lux下培养,每天摇动5次,每次5分钟,选取藻细胞不贴壁、生长较快、生物量积累较高的藻株,用于进一步筛选高产多糖的藻种;在一定培养液及摇动条件下进行培养,初步筛选出优质藻种;
3)多糖提取:称取小球藻干粉末,按照料液比1:25混合于2.0%的氢氧化钠溶液中,82℃浸提5小时, 6000r/min离心10分钟,取上清加入5倍体积的99%乙醇溶液,4℃静置过夜后离心取沉淀;多糖提取过程简单易行,易于操作,没有加入有机试剂,有利于提高多肽提取的精确程度;
4)复筛:选取光照:黑暗为21:3、光照强度6000lux、26℃、起始pH为7.0作为培养条件,在培养液中添加葡萄糖1.12g/L、尿素0.22g/L、MgSO4·7H2O 0.128g/L、(R)-泛内脂0.009g/L作为复筛培养基,选取初筛后多糖含量多的小球藻进行复筛培养,连续4次即可分离出高产多糖的小球藻;微量的(R)-泛内脂能够刺激小球藻体内促进胞内多糖分泌的酶,提高相关酶的活性,从而提高小球藻胞内多糖的产量与产率,筛选分离高产多糖小球藻的方法简单易行,可以用于规模化培养,经过筛选与分离,可以分离出超出原始多糖产量35-40%的小球藻种,分离效率较高,安全易行,是一种高效、安全的高产多糖小球藻种的分离方法。
培养液为:NH4Cl 0.385g/L,MgSO4·7H2O 0.2g/L,CaCl2·2H2O 0.06g/L,K2HPO40.110g/L,KH2PO4 0.055g/L,Tris 2.5g/L,冰醋酸1.2mL/L,微量元素1.2mL/L,以灭菌海水定容至1L,pH7.0,培养液中加入22g/L琼脂为固体培养基;培养液能够为小球藻提供充足的氮源、碳源,可以使小球藻迅速的恢复至生机巅峰的状态。
微量元素为:乙二胺四乙酸二钠盐5Og/L,ZnSO4·7H2O 22g/L,H3B03 11.5g/L,MnCl2·4H20 5.10g/L,CoCl2·6H20 1.65g/L,CuSO4·5H20 1.60g/L,(NH4)6Mo7O24·4H2O1.20g/L,FeSO4·7H20 4.20g/L;微量元素为小球藻提供充足的锌、硼、锰、钴、铜钼等微量元素,满足小球藻生长繁殖所需。
实施例3:
一种高产多糖小球藻种的分离方法,包括:培养、初筛、多糖提取、复筛,具体包括以下步骤:
培养:取海水样品按1:5加入到培养液中,弱光下培养4-5周;5500r/min离心15分钟收集藻细胞,使用含80μg/mL氨苄青霉素的生理盐水洗涤,离心去上清,重复洗涤8次,以无菌生理盐水洗去残余抗生素,将2×10-5的稀释藻液涂布于固体培养基,倒置光照培养6天;以氨苄青霉素筛选出小球藻,然后经扩大培养为进一步是筛选出高产多糖的小球做准备;
初筛:挑选颜色、形态、大小有差异的单藻落划线分离培养,将获得的单藻转接于培养基中扩大培养,25℃、2400lux下培养,每天摇动4次,每次3分钟,选取藻细胞不贴壁、生长较快、生物量积累较高的藻株,用于进一步筛选高产多糖的藻种;在一定培养液及摇动条件下进行培养,初步筛选出优质藻种;
多糖提取:称取小球藻干粉末,按照料液比1:22混合于1.6%的氢氧化钠溶液中,80℃浸提4小时,5500r/min离心10分钟,取上清加入4倍体积的98%乙醇溶液,3℃静置过夜后离心取沉淀;多糖提取过程简单易行,易于操作,没有加入有机试剂,有利于提高多肽提取的精确程度;
复筛:选取光照:黑暗为20:4、光照强度5000lux、25℃、起始pH为7.0作为培养条件,在培养液中添加葡萄糖1.10g/L、尿素0.20g/L、MgSO4·7H2O 0.126g/L、(R)-泛内脂0.008g/L作为复筛培养基,选取初筛后多糖含量多的小球藻进行复筛培养,连续3-4次即可分离出高产多糖的小球藻;微量的(R)-泛内脂能够刺激小球藻体内促进胞内多糖分泌的酶,提高相关酶的活性,从而提高小球藻胞内多糖的产量与产率,筛选分离高产多糖小球藻的方法简单易行,可以用于规模化培养,经过筛选与分离,可以分离出超出原始多糖产量35-40%的小球藻种,分离效率较高,安全易行,是一种高效、安全的高产多糖小球藻种的分离方法。
培养液为:NH4Cl0.38g/L,MgSO4·7H2O 0.15g/L,CaCl2·2H2O0.05g/L,K2HPO40.11g/L,KH2PO40.055g/L,Tris2.45g/L,冰醋酸1.1mL/L,微量元素1.2mL/L,以灭菌海水定容至1L,pH6.5,培养液中加入21g/L琼脂为固体培养基;培养液能够为小球藻提供充足的氮源、碳源,可以使小球藻迅速的恢复至生机巅峰的状态。
微量元素为:乙二胺四乙酸二钠盐48g/L,ZnSO4·7H2O 20g/L,H3B03 11.4g/L,MnCl2·4H20 5.08g/L,CoCl2·6H20 1.64g/L,CuSO4·5H20 1.58g/L,(NH4)6Mo7O24·4H2O1.15g/L,FeSO4·7H204.19-4.20g/L;微量元素为小球藻提供充足的锌、硼、锰、钴、铜钼等微量元素,满足小球藻生长繁殖所需。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知,在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明,应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例,并不用于限制本发明,凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种高产多糖小球藻种的分离方法,包括:培养、初筛、多糖提取、复筛,其特征在于:所述的复筛步骤为:选取光照:黑暗为20-21:4-3、光照强度4000-6000lux、25-26℃、起始pH为7.0作为培养条件,在培养液中添加葡萄糖1.08-1.12g/L、尿素0.20-0.22g/L、MgSO4·7H2O 0.125-0.128g/L、(R)-泛内脂0.007-0.009g/L作为复筛培养基,选取初筛后多糖含量多的小球藻进行复筛培养,连续3-4次即可分离出高产多糖的小球藻。
2. 根据权利要求1所述的一种高产多糖小球藻种的分离方法,其特征在于:所述复筛步骤中的培养液为NH4Cl0.375-0.385g/L,MgSO4·7H2O 0.1-0.2g/L,CaCl2·2H2O0.05-0.06g/L,K2HPO40.108-0.110g/L,KH2PO40.054-0.055g/L,Tris2.42-2.5g/L,冰醋酸1.0-1.2mL/L,微量元素1.0-1.2mL/L,以灭菌海水定容至1L,pH6.0-7.0,培养液中加入20-22g/L琼脂为固体培养基。
3. 根据权利要求2所述的一种高产多糖小球藻种的分离方法,其特征在于:所述培养液中的微量元素为乙二胺四乙酸二钠盐45-5Og/L,ZnSO4·7H2O 20-22g/L,H3B03 11.4-11.5g/L,MnCl2·4H20 5.06-5.10g/L,CoCl2·6H20 1.61-1.65g/L,CuSO4·5H20 1.57-1.60g/L,(NH4)6Mo7O24·4H2O 1.10-1.20g/L,FeSO4·7H204.19-4.20g/L。
4.根据权利要求1所述的一种高产多糖小球藻种的分离方法,其特征在于:所述培养步骤为:取海水样品按1:4-5加入到培养液中,弱光下培养4-5周。5000-6000r/min离心10-20分钟收集藻细胞,使用含氨苄青霉素的生理盐水洗涤,离心去上清,重复洗涤8-10次,以无菌生理盐水洗去残余抗生素,将1-2×10-5的稀释藻液涂布于固体培养基,倒置光照培养5-7天。
5.根据权利要求4所述的一种高产多糖小球藻种的分离方法,其特征在于:所述培养步骤中的氨苄青霉素的浓度为80-90μg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种高产多糖小球藻种的分离方法,其特征在于:所述初筛步骤为:挑选颜色、形态、大小有差异的单藻落划线分离培养,将获得的单藻转接于培养基中扩大培养,每天摇动3-5次,每次3-5分钟,选取藻细胞不贴壁、生长较快、生物量积累较高的藻株,用于进一步筛选高产多糖的藻种。
7.根据权利要求6所述的一种高产多糖小球藻种的分离方法,其特征在于:所述初筛步骤中的培养温度为23-26℃,光照为2000-2500lux。
8.根据权利要求1所述的一种高产多糖小球藻种的分离方法,其特征在于:所述多糖提取步骤为:称取小球藻干粉末,按照料液比1:20-25混合于1.5-2.0%的氢氧化钠溶液中,80-82℃浸提3-5小时,5000-6000r/min离心10分钟,取上清加入3-5倍体积的95-99%乙醇溶液,2-4℃静置过夜后离心取沉淀。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180330 |
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