CN104150977B

CN104150977B - 一种海藻寡糖生物肥的制备方法及应用

Info

Publication number: CN104150977B
Application number: CN201410359147.XA
Authority: CN
Inventors: 曾润颖; 陈兴麟; 产竹华; 易志伟
Original assignee: Third Institute of Oceanography SOA
Current assignee: Lannao Technology Xiamen Co ltd; Third Institute of Oceanography MNR
Priority date: 2014-07-25
Filing date: 2014-07-25
Publication date: 2017-02-15
Anticipated expiration: 2034-07-25
Also published as: CN104150977A

Abstract

一种海藻寡糖生物肥的制备方法及应用，涉及海藻肥。所述海藻寡糖生物肥的制备方法：1)将太平洋火色杆菌(Flammeovirga Pacifica)H2用活化培养基平板进行活化后，接种于种子培养基中，振荡培养得发酵液；所述太平洋火色杆菌(Flammeovirga Pacifica)H2保藏编号为CCTCC NO:M2012229；2)将步骤1)中得到的发酵液接种入产糖培养基中，继续振荡发酵培养后离心，收集上清液；3)将上清液用管式膜进行过滤，收集滤出液；4)将步骤3)收集的滤出液用蛋白酶处理，即得海藻寡糖生物肥。所制备的海藻寡糖生物肥可在作物栽培中应用。

Description

一种海藻寡糖生物肥的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及海藻肥，特别是涉及一种海藻寡糖生物肥的制备方法及应用。

背景技术

海藻是一类巨大的吸附剂，它可以浓缩44万倍海洋中的营养物质，非常适合供给贫瘠的土地。土地中大量的营养物质通过雨水和河流被排入到海洋中而形成合理的生物循环。全世界大约有2150万吨的氮和200万吨的钾从陆地通过雨水流入到河流中，而后又流入到海洋。海藻作为农业植物生长调节剂就是将那些本来来自陆地的营养物质通过海藻这个“吸附剂”重新组合又返回到陆生植物中。

海藻肥是以海洋植物海藻作为主要原料，经科学加工制成的生物肥料，它的发展经历了三个阶段，分别是腐烂海藻、海藻灰(粉)、海藻提取物。海藻肥中的核心物质是纯天然海藻提取物，主要原料选自天然海藻，经过特殊生化工艺处理，提取海藻中的精华物质，极大地保留了天然活性组分，含有大量的非含氮有机物、陆植物无法比拟的钾、钙、镁、锌、碘等四十余种矿物质元素和丰富的维生素，特别含有海藻中所特有的海藻多糖、藻朊酸、高度不饱和脂肪酸和多种天然植物生长调节剂，具有很高的生物活性，可刺激植物体内非特异性活性因子的产生，调节内源激素平衡。

海藻肥中的有效组分经过特殊处理后，呈极易被植物吸收的活性状态，在使用后的2-3个小时进入植物体内，并具有很快的吸收传导速度。海藻肥中含有天然植物生长调节剂如：生长素、细胞***素类物质和赤霉素等，具有很高的生物活性，各种物质的比例与陆生植物中各激素比例相近。海藻肥中的海藻酸可以降低水的表面张力，在植物表面形成一层薄膜，增大接触面积，使水溶性物质比较容易透过茎叶表面细胞膜进入植物细胞，使植物最有效地吸收海藻提取液中的营养成分，因此如果海藻液体肥和杀虫剂、杀菌剂以及化学肥料混合使用，效果更佳，可降低喷洒费用，对农药和化学肥料具有增效作用。国外报导海藻酸中所含天然抗生素具有抗病毒作用。海藻肥原料选自天然海藻，与陆生植物有良好的亲和性，对人、畜无毒无害，对环境无污染，具有其他任何肥料都无法比拟的优点。

海藻肥可直接使土壤或通过植物使土壤增加有机质，激活土壤中的各种有益微生物，这些生物可在植物—微生物代谢物循环中起着催化剂的作用，使土壤的生物效力增加。植物和土壤微生物的代谢物可为植物提供更多的养分。海藻肥是一种天然生物制剂，可与植物—土壤生态***和谐地起作用。它含有的天然化合物如藻朊酸钠是天然土壤调理剂，能促进土壤团粒结构的形成，改善土壤内部孔隙空间，协调土壤中固、液、气三者比例，恢复由于土壤负担过重和化学污染而失去的天然胶质平衡，增加土壤生物活力，促进速效养分的释放，有利于根系生长，提高作物的抗逆性。

龙须菜是一种江蓠属海藻，属于红藻类海洋植物，种养成本低、生长周期短，同时也是一种高膳食纤维、高蛋白、低脂肪、低热能，且富含矿物质和维生素的天然优质海洋蔬菜。近年来，沿海各地龙须菜养殖业发展迅速，加上龙须菜具有藻体大、适应性强、生长快等优点，各地龙须菜资源十分丰富。由于龙须菜藻体较硬和藻腥味较浓，民间很少直接食用，除小部分作为鲍鱼饲料外，大部分被用作琼胶生产的原料。但近年由于琼胶替代物的不断出现及大量废弃物的排放等原因影响了利用龙须菜制琼胶企业的更大规模化发展，造成养殖龙须菜的大量积压。因此，扩大龙须菜的应用范围，改变龙须菜加工产品单一局面，意义重大。

中国专利CN103304304A公开一种碘化壳寡糖海藻生物肥料的制备方法，步骤如下：(1)壳聚糖的酶解反应：壳聚糖经剪切粉碎后，用非专一性复合酶进行酶解反应，得到分子聚合度在4-8的壳寡糖溶液。(2)壳寡糖的碘化反应：向得到的壳寡糖溶液中以一定的速度加入碘化钾溶液，进行壳寡糖的碘化反应，得到碘化壳寡糖溶液。(3)海藻提取液的螯合反应：取酶解方法制备的海藻提取液，与碘化壳寡糖溶液，按照一定的比例进行螯合反应，复配一定浓度的微量元素，最终得到碘化壳寡糖海藻生物肥料。

中国专利CN103304278A公开一种含有海藻浸提液的海藻菌肥，所述海藻菌肥是由下述制备方法得到的：(1)海藻浸提；(2)发酵培养基的配制；(3)接种并发酵。所述海藻菌肥是一种利用纯物理和生物方法生产获得的海藻活性生物菌剂肥料，兼具海藻活性和生物菌剂的活体调节功能，其有效活菌数≥2.0×109CFU/ml，同时富含由海藻胶经生物发酵降解转化的海藻酸、海藻寡糖、赤霉素(GA)、吲哚乙酸(IAA)等植物生长调节活性物质。

中国专利CN103710281A公开一种胶冻样芽孢杆菌菌株及其在海藻生物肥料中的应用，利用该菌株制备的海藻微生物肥料含有丰富的胶冻样芽孢杆菌繁殖代谢产生的荚膜多糖(或胞外多糖)和由海藻成分经生物发酵降解转化的海藻酸、海藻寡糖、赤霉素(GA)、吲哚乙酸(IAA)等植物生长调节活性物质，有效活菌数≥2.0×109CFU/ml。

本申请人在中国专利CN102827899A中提供了一种龙须菜琼胶寡糖及其制备方法与应用，制备方法：1)将菌株太平洋火色杆菌(Flammeovirga Pacifica)H2用活化培养基平板进行活化后，接种于种子培养基中，振荡培养得发酵液；所述活化培养基平板为：含经60～80目过筛后的龙须菜粉末1％，酵母膏0.2％，NaCl 3％，琼胶粉1.5％，蒸馏水配制，经121℃，20min灭菌后使用；所述种子培养基为：含CMC-Na2 0.5％～1.5％，酵母膏0.2％，NaCl3％，蒸馏水配制，经121℃，20min灭菌后使用；所述太平洋火色杆菌(FlammeovirgaPacifica)H2已于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2012229。

发明内容

本发明的目的在于针对现有龙须菜应用范围不够广泛的现状，提供可直接施用于土壤，拓展龙须菜应用范围的一种海藻寡糖生物肥的制备方法及应用。

所述海藻寡糖生物肥的制备方法，包括以下步骤：

1)将太平洋火色杆菌(Flammeovirga Pacifica)H2用活化培养基平板进行活化后，接种于种子培养基中，振荡培养得发酵液；所述太平洋火色杆菌(FlammeovirgaPacifica)H2与本申请人在中国专利CN102827899A中提供的太平洋火色杆菌(Flammeovirga Pacifica)H2相同，该菌株已于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2012229，地址为中国武汉大学(邮编430072)；

2)将步骤1)中得到的发酵液接种入产糖培养基中，继续振荡发酵培养后离心，收集上清液；

3)将上清液用管式膜进行过滤，收集滤出液；

4)将步骤3)收集的滤出液用蛋白酶处理，即得海藻寡糖生物肥。

在步骤1)中，所述活化培养基平板可为：含经60～80目过筛后的龙须菜粉末1.5％，酵母膏0.2％，NaCl 3.5％，琼胶粉1％，蒸馏水配制，经121℃，20min灭菌后使用；所述种子培养基可为：含CMC-Na 1％～2％，酵母膏0.2％，NaCl 3.5％，蒸馏水配制，经121℃，20min灭菌后使用；所述振荡培养的条件可为：在25～37℃条件下，250r/min振荡培养至OD₆₀₀＝1.0～1.5。

在步骤2)中，所述产糖培养基可为：含经60～80目过筛的龙须菜粉末1％～5％，MgSO₄ 0.1％～0.5％，KCl 0.05～0.2％，蒸馏水配制，经121℃，20min灭菌后使用；发酵液接种按质量百分比可为产糖培养基的5％；所述振荡发酵培养的条件可为：在25～37℃条件下，300r/min振荡发酵培养24～72h；所述离心的条件可为：11000rpm离心15min。

在步骤3)中，所述过滤可采用膜过滤设备，将上清液依次用0.8μm，0.45μm和0.22μm管式膜进行过滤；所述管式膜可采用卷式有机膜。

在步骤4)中，所述蛋白酶可采用市售的木瓜蛋白酶，例如生工生物工程(上海)股份有限公司生产的木瓜蛋白酶(P16J12-100g)；所述处理可于37℃处理3h。

所制备的海藻寡糖生物肥可在作物栽培中应用。

所述应用的方法可为：用水将海藻寡糖生物肥稀释成含终浓度为25～500mg/L的寡糖，每7～10d灌根一次，前4次的施用剂量为50mL/次，以后施用剂量为100mL/次，有效提高了土壤中磷、蛋白质、有机质的含量，尤其是提高了钾的含量，从而提高土壤肥力。

本发明采用菌株与龙须菜共培养的方法，利用太平洋火色杆菌H2所产的酶系直接降解龙须菜，释放出各种植物活性因子，过滤除菌后，再加入木瓜蛋白酶，将藻蛋白降解为多肽及氨基酸，同时为植物提供了优质的氮肥。

本发明将太平洋火色杆菌H2接种入含有龙须菜的培养基中，利用菌株所产的酶系将龙须菜中含有的海藻多糖降解为海藻寡糖，经膜过滤除去菌体和残留的龙须菜粉末后，加入木瓜蛋白酶进行酶解，即得所述的生物肥。本发明还给出了所述生物肥的应用方式，在发芽期和幼苗初期按25mg的量进行灌根4次，后提升至50mg的量灌根，有效提高了土壤中磷、蛋白质、有机质的含量，从而提高土壤肥力。

附图说明

图1为不同浓度寡糖灌根后土壤速效磷含量。

图2为不同浓度寡糖灌根后土壤速效钾含量。

图3为不同浓度寡糖灌根后土壤速效氮含量。

图4为不同浓度寡糖灌根后土壤有机质含量。

图5为不同处理组的黄杆菌(Flavobacterium)所占比例。

在图1～5中，各标记为：1代表对照组，即0mg/L；2代表实验组，为25mg/L；3代表实验组，为50mg/L；4代表实验组，为100mg/L；5代表实验组，为500mg/L。

具体实施方式

为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例。

实施例1海藻寡糖生物肥的制备

(1)将太平洋火色杆菌(Flammeovirga Pacifica)H2用活化培养基平板(含经60目过筛后的龙须菜粉末1.5％，酵母膏0.2％，NaCl 3.5％，，琼胶粉1％，蒸馏水配制，经121℃，20min灭菌后使用)进行活化后，接种于种子培养基(含CMC-Na 1.5％，酵母膏0.2％，NaCl3.5％，蒸馏水配制，经121℃，20min灭菌后使用)中，在25℃条件下，250r/min振荡培养至OD₆₀₀＝1.2，得发酵液；

(2)将步骤(1)中得到的发酵液接种入产糖培养基(含经60目过筛的龙须菜粉末1％，MgSO₄ 0.1％，KCl 0.2％，蒸馏水配制，经121℃，20min灭菌后使用)中，在25℃条件下，300r/min振荡发酵培养72h，后11000rpm离心15min，收集上清液；

(3)采用膜过滤设备，将上清液依次用0.8μm，0.45μm和0.22μm卷式有机膜进行过滤，收集滤出液；

(4)向步骤(3)中的滤出液加入生工生物工程(上海)股份有限公司的(P16J12-100g)木瓜蛋白酶(每升加入8U)，于37℃处理3h，即为海藻寡糖生物肥。

以下给出所制备的海藻寡糖生物肥的应用方法及效果：

取制备好的海藻寡糖，分别加水稀释成终浓度为25mg/L、50mg/L、100mg/L、500mg/L，并以清水为对照。施用于圣女果的根系中。

施用频率为每7～10d施用一次，前4次的施用剂量为50mL，后4次为100mL。

分析不同实验组的土壤成分，以及根系微生物菌群的组成，发现速效氮、速效磷以及土壤有机质的含量都有不同程度的提高，而速效钾的含量则提高了3倍以上。具体变化见图1～4。

黄杆菌属(Flavobacterium)是土壤中一类主要的解磷菌属，在施用海藻寡糖生物肥后土壤中黄杆菌的含量也得到提高，如图5所示。

实施例2

与实施例1类似，其区别在于在步骤(1)中所述培养温度为37℃，振荡培养至OD₆₀₀＝1.5，步骤(2)所述产糖培养基中龙须菜粉末的含量为5％，MgSO₄ 0.3％。

实施例3

与实施例1类似，其区别在于步骤(2)所述产糖培养基中龙须菜粉末的含量为3％，KCl0.05％。所述振荡发酵培养温度为37℃，培养时间为24h。

实施例4

与实施例1类似，其区别在于步骤(2)所述培养时间为48h。

实施例5

与实施例4类似，其区别在于步骤(2)所述培养温度为30℃。

Claims

1.一种海藻寡糖生物肥的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将太平洋火色杆菌(Flammeovirga Pacifica)H2用活化培养基平板进行活化后，接种于种子培养基中，振荡培养得发酵液；所述太平洋火色杆菌(Flammeovirga Pacifica)H2保藏编号为CCTCC NO:M2012229；所述活化培养基平板为：含经60～80目过筛后的龙须菜粉末1.5％，酵母膏0.2％，NaCl 3.5％，琼胶粉1％，蒸馏水配制，经121℃，20min灭菌后使用；所述种子培养基为：含CMC-Na 1％～2％，酵母膏0.2％，NaCl 3.5％，蒸馏水配制，经121℃，20min灭菌后使用；

2)将步骤1)中得到的发酵液接种入产糖培养基中，继续振荡发酵培养后离心，收集上清液；所述产糖培养基为：含经60～80目过筛的龙须菜粉末1％～5％，MgSO₄ 0.1％～0.5％，KCl 0.05～0.2％，蒸馏水配制，经121℃，20min灭菌后使用；

3)将上清液用管式膜进行过滤，收集滤出液；

4)将步骤3)收集的滤出液用蛋白酶处理，即得海藻寡糖生物肥；所述蛋白酶采用市售的木瓜蛋白酶。

2.如权利要求1所述一种海藻寡糖生物肥的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述振荡培养的条件为：在25～37℃条件下，250r/min振荡培养至OD₆₀₀＝1.0～1.5。

3.如权利要求1所述一种海藻寡糖生物肥的制备方法，其特征在于在步骤2)中，发酵液接种按质量百分比为产糖培养基的5％。

4.如权利要求1所述一种海藻寡糖生物肥的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述振荡发酵培养的条件为：在25～37℃条件下，300r/min振荡发酵培养24～72h；所述离心的条件为：11000rpm离心15min。

5.如权利要求1所述一种海藻寡糖生物肥的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述过滤采用膜过滤设备，将上清液依次用0.8μm，0.45μm和0.22μm管式膜进行过滤。

6.如权利要求5所述一种海藻寡糖生物肥的制备方法，其特征在于所述管式膜采用卷式有机膜。

7.如权利要求1所述一种海藻寡糖生物肥的制备方法，其特征在于所述市售的木瓜蛋白酶采用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的木瓜蛋白酶P16J12-100g。

8.如权利要求1所述一种海藻寡糖生物肥的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述处理是于37℃处理3h。

9.如权利要求1～8中任一所述一种海藻寡糖生物肥的制备方法所制备的海藻寡糖生物肥在作物栽培中的应用。

10.如权利要求9所述应用，其特征在于应用的方法为：用水将海藻寡糖生物肥稀释成含终浓度为25～500mg/L的寡糖，每7～10d灌根一次，前4次的施用剂量为50mL/次，以后施用剂量为100mL/次。