CN102121004A - 葡萄病原菌诱导型启动子的分离方法及在抗病育种中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种启动子快速克隆法，以克隆获得两个葡萄病原菌诱导型启动子构建启动子::报告基因融合载体，两个启动子启动报告基因在葡萄叶片中的表达受白粉菌诱导，为葡萄抗病基因工程提供病原菌诱导型启动子的克隆方法并成功应用于葡萄抗病育种中。克隆的两个诱导型启动子均能在病原菌侵染时以精准方式调控转入外源基因，使转入基因仅在受病原菌诱导的条件下被启动表达，在葡萄抗病育种中，仅需把重组载体中启动子所启动的报告基因换成任何抗病基因，即可转化葡萄获得病原菌诱导表达外源抗病基因的转化植株，减少抗病基因工程育种中组成型启动子对转基因葡萄造成的负面影响，最大限度发挥转基因优势。

Description

葡萄病原菌诱导型启动子的分离方法及在抗病育种中的应用

技术领域

本发明涉及两个来源于葡萄病原菌诱导型启动子的分离方法，重组表达载体构建及在转基因葡萄中的应用，属于植物基因工程领域。

背景技术

启动子是调控基因表达过程中转录因子结合的重要DNA序列，它与转录因子一起决定下游基因表达的时间、类型、水平和组织器官特异性等。基因工程中按其作用方式及功能，启动子通常被分为三类：组织特异型启动子、组成型启动子和诱导型启动子。

组织特异性启动子，这类启动子仅在特定器官或组织中启动转基因表达，在定向改变组织器官性状的研究中，本类启动子应用比组成型启动子更有效。

组成型启动子，这类启动子能在所有组织细胞、任何时空启动基因表达。组成型启动子尽管能够不受时空及环境影响启动外源基因在转基因植株中高效表达，Kohli等在《植物杂志》1999年17：591-601“转基因水稻转化质粒重组的分子鉴定揭示烟草花叶病毒35S启动子中热点重组”中报道，正常环境下细胞内组成型表达抗逆蛋白不仅是一种能量浪费，还会导致植物的正常代谢受阻，致转基因植物发育异常或造成其它负面影响。由于它的强转录活性，能够组成型高效启动外源转基因表达，目前基因工程中广泛应用的烟草花叶病毒35S启动子仍占总数的80％。

诱导型启动子，诱导型启动子平时不启动基因表达或启动强度很低。在一定诱因下，启动活性增强。Behnam等在《植物细胞报告》2007年26：1275-1282“拟南芥rd29A启动子整合DREB1A基因提高转基因马铃薯抗冷性”中报道，rd29A诱导型启动子驱动拟南芥DRREB1在马铃薯中表达后，摄氏4度条件下，前半小时转基因马铃薯与野生型DREB1的表达都未检测到，半小时后，转基因马铃薯中DREB1开始表达，而野生型依然没有检测到，rd29A通过在低温条件下启动DREB1表达提高转基因马铃薯的抗寒性。其它干旱、盐碱、极端温度等胁迫诱导型启动子近两年也开始被逐渐重视并用于植物抗逆基因工程。

欧洲葡萄以其优良品质成为生产中的主载种，然而其本身并没有显著抗病性。传统育种通过对杂交后代表现型进行筛选相当耗财费时，基因工程技术已成为加快定向培育抗病葡萄品种的新趋势。病程相关蛋白基因是一类能有效提高葡萄抗病性的基因，被广泛应用于葡萄抗病基因工程育种中。然而，Ferreira等在《生物技术趋势》2004年22：168-173“不改变葡萄酒品质的情况下提高转基因葡萄抗病性”中指出，葡萄果实过多积累病程相关蛋白导致葡萄酒品质严重下降，因此组成型启动子启动病程相关蛋白基因表达的转基因葡萄果实可能将导致酒品质下降。截止到目前，还没有鉴定分离出有效的葡萄病原菌诱导型启动子并应用于基因工程研究。因此，获得葡萄病原菌诱导型启动子对于葡萄抗病基因工程建立一个高效、实用的表达***是非常重要的。

发明内容

为克服组成型启动子给转基因抗病葡萄带来的负面影响，并避免染色体步移等方法克隆启动子的繁琐，本发明公开了一种启动子快速克隆法，以克隆获得两个葡萄病原菌诱导型启动子(GenBank登陆号分别为GU565705及HQ174899)构建启动子::报告基因融合载体，两个启动子启动报告基因在葡萄叶片中的表达受白粉菌诱导，为葡萄抗病基因工程提供病原菌诱导型启动子的克隆方法并成功应用于葡萄抗病育种中。

本发明是通过以下方法实现的：

中国野生华东葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’葡萄抗病转录因子基因VpWRKY1和VpWRKY2为白粉菌诱导表达型基因，其启动子具有受病原菌诱导启动基因上调表达的活性，采用GenBank葡萄基因组序列及白粉菌诱导表达的转录因子基因VpWRKY1和VpWRKY2序列设计引物，从中国野生华东葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’基因组DNA中进行启动子片段的克隆，获得了病原菌诱导型启动子PvpWRKY1全长序列694bp与病原菌诱导型启动子PvpWRKY2全长序列643bp，通过构建重组表达载体PvpWRKY1::GUS和PvpWRKY2::GUS，并用农杆菌介导的真空渗透法导入葡萄叶片，瞬时表达所克隆启动子启动的GUS报告基因，通过对接种葡萄白粉菌前后瞬时表达叶片的GUS染色观察，及对接种葡萄白粉菌前后瞬时表达叶片的GUS活性定量检测，验证了PvpWRKY1和PvpWRKY2受葡萄白粉菌诱导启动报告基因活性上调。

本发明克隆的诱导型启动子是以GenBank数据库与转录因子基因序列为基础设计引物直接克隆所得，避免了染色体步移等方法克隆启动子的繁琐，具有简便、快速等特点，此方法也完全适用于克隆其它启动子。瞬时转化PvpWRKY1::GUS和PvpWRKY2::GUS且未接种白粉菌的叶片浅度着色，接种后叶片染色程度加深，阴性对照叶片接种前后均未着色，阳性对照即转化35::GUS载体的叶片深度着色，而转化无启动子的GUS载体叶片染色后仅微弱变蓝。接种白粉菌前后转化叶片的GUS活性定量检测结果表明PvpWRKY1和PvpWRKY2启动的GUS本底活性相对较弱，但两启动子活性受白粉菌诱导后上升，PvpWRKY1启动的GUS在接种白粉菌后的活性是接种前3.21倍，而PvpWRKY2启动的GUS在接种白粉菌后的活性是接种前1.63倍，即本发明克隆的两个诱导型启动子均能在病原菌侵染时以精准方式调控转入外源基因，使转入基因仅在受病原菌诱导的条件下被启动表达。在葡萄抗病育种中，仅需把重组载体中启动子所启动的报告基因换成任何感兴趣的抗病基因，即可转化葡萄获得病原菌诱导表达外源抗病基因的转化植株，从而减少抗病基因工程育种中组成型启动子对转基因葡萄造成的负面影响，最大限度发挥转基因优势。

附图说明

附图1为本发明VpWRKY1和VpWRKY2表达模式图。

图示VpWRKY1和VpWRKY2在葡萄叶片接种白粉菌前后不同时间表达模式的半定量分析结果；VpWRKY1和VpWRKY2被白粉菌诱导先上调表达到最高，再逐渐下降至初始水平。

附图2为本发明重组载体构建示意图。

载体pCAMBIA1301的组成型35S启动子分别被置换成目标启动子或直接去掉，从而构建成新的重组载体。

附图3为本发明转化叶片GUS染色结果图。

w/o35S::GUS、PvpWRKY1::GUS、PvpWRKY2::GUS和35S::GUS分别为无启动子、PvpWRKY1、PvpWRKY2、35S启动GUS表达载体的农杆菌菌液侵染过的叶片，上排为葡萄白粉菌悬浮液接种12小时后各载体转化叶片的GUS染色结果，下排为水对照处理相同时间的染色结果，WT为对照，即仅空农杆菌LBA4404侵染。

附图4为本发明转化叶片GUS活性定量图。

不同启动子启动的GUS活性在葡萄叶片接种白粉菌前后的定量比较。灰色和柱子黑色分别表示同一载体转化叶片接种前、后的GUS活性。

具体实施方式

以下结合实施例及附图对本发明做进一步详细描述：

实施例一：葡萄VpWRKY1和VpWRKY2基因启动子的分离方法

a.葡萄VpWRKY1和VpWRKY2基因半定量反转录PCR检测取样：

首先对葡萄叶片进行白粉菌接种处理，当新梢长至25-30cm长，新叶长至5-6cm宽时，在每新梢上选取3片幼叶，压片前预先喷雾无菌水使叶片上有微小液滴，但无明显露点出现，从田间发病葡萄上采摘白粉病发病症状一致的叶片对选取的叶进行压片接种，压片时间超过5s，压片后即套袋24小时保湿以利白粉菌孢子萌发，在接种后0、6、12、24、48、72、96、120小时采集叶片在田间用液氮冻存，去离子水处理的叶片做为对照；

b.RNA分离采用SDS/酚法，cDNA第一链合成参照Promega公司M-MMLV反转录酶使用说明进行；

c.引物设计及反转录PCR检测

选择VpGAPDH为内参基因，根据目的基因及内参基因序列设计引物如下：

VpWRKY1上游引物：GCGTCCTCGTCGGAGGGGAT

VpWRKY1下游引物：ATCTGGACCTGTTTGGTTGC

VpWRKY2上游引物：CAGAGAAGGCTGAACCGAAC

VpWRKY2下游引物：AGCCTTTGGAAATGGTGATG

VpGAPDH上游引物：ATCCACGGGAGCAGCAAA

VpGAPDH下游引物：AGAACGCGAAAATTAGAACAGG

反转录PCR反应采用天根公司预混上样缓冲液的2×PCR mix反应试剂盒，反应程序：94℃预变性3分钟，然后94℃变性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸30秒条件下扩增25循环，最后72℃延伸5分钟，

中国野生华东葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’转录因子基因VpWRKY1和VpWRKY2被葡萄白粉菌诱导12小时后先上调表达到最高，后随时间延长逐渐下降至初始水平，表明这两个基因启动子为病原菌诱导型启动子，以‘白河-35-1’基因组DNA为模板，根据VpWRKY1和VpWRKY2基因序列设计启动子下游引物，根据NCBI欧洲葡萄基因组同源序列设计启动子上游引物，PCR先直接快速扩增出包含与基因重叠区域启动子片段，回收PCR产物克隆、测序；

d.PCR扩增启动子片段

PvpWRKY1上游引物：CTATTAGGAGGAGTTGGTTG

PvpWRKY1下游引物：CTCATGGTGGCGTCTGTG

PvpWRKY2上游引物：ATGGTCTCCGTTCCGTCTT

PvpWRKY2下游引物：ACTCGGGGTTCGGCTCAG；

e.葡萄基因组按小量提取法进行：

e.1采摘1cm²左右叶片放入离心管中，

e.2加0.4ml提取缓冲液，提取缓冲液配制：200mM Tris PH：7.5，250mMNaCl，25mM EDTA PH：8.0，0.5％SDS，

e.3用与离心管配套的小塑料研棒按顺、逆时针交替旋转法将样品在缓冲液中磨碎，

e.4在12000rpm，离心5分钟，

e.5上清液转移至新管，

e.6加入0.4ml酚：氯仿：异戊醇溶液，其体积比为25∶24∶1，PH值为6.5，

e.7加0.4ml异丙醇，混匀，

e.8放置5分钟，

e.9全速离心5分钟，

e.10弃上清，管底剩下DNA，

e.11加1ml 70％乙醇上下轻柔颠倒至白色片状物悬浮，室温放置2分钟，

e.12在12000rpm，离心1分钟，弃上清，

e.13开放空间干燥10分钟以上，至乙醇挥发干净，

e.14加50ul灭菌ddH20，

e.15稀释5倍直接进行PCR扩增；

f.目地片段的TA连接测序方法按Promega载体使用说明进行。

实施例二：启动子重组载体的构建和应用

a.重组载体构建，为构建GUS报告重组载体，重新设计带有酶切位点XbaI和Nco I的引物仅扩增不包含与基因重叠区域启动子片段部分，分别命名为PvpWRKY1和PvpWRKY2，用目的启动子替换pCAMBIA1301的35S，使GUS处于所克隆启动子控制下，构建成promoter::GUS重组表达载体，此外，用BamHI和BglII酶切pCAMBIA1301的35S启动子，利用同尾酶互补将载体重新连接成没有35S的GUS载体，命名为w/o35S::GUS，pCAMBIA1301做为阳性对照，即35组成型启动GUS表达；

PvpWRKY1::GUS上游引物：gggtctagaCTATTAGGAGGAGTTGGTTG

PvpWRKY1::GUS下游引物：gggccatggACTCACCAAGTGAAGATCAA

PvpWRKY2::GUS上游引物：gggtctagaTGGTCTCCGTTCCGTCTTTC

PvpWRKY2::GUS下游引物：gggccatggGGCCGATTCGGAGAGAAG

以TA连接好的载体为模板进行PCR扩增，将PCR回收产物与pCAMBIA1301空载体分别进行XbaI和NcoI双酶切后，PCR与载体酶切产物进行连接，转化后送测序保证重组载体中启动子***位置正确无误；

b.电转化农杆菌感受态细胞的制备：

b.1将LBA4404菌株接种于20ml含有40mg/L链霉素和50mg/L利福平终浓度的LB液体培养基，28℃培养24小时，

b.2将培养好的菌液加入100ml新鲜LB中至OD值0.2，28℃继续振荡培养，至OD值0.6，

b.3从摇床中取出菌液，冰浴15分钟，

b.4菌液转移至50ml离心管，4℃5000rpm离心15分钟，弃上清，

b.5用冰浴的灭菌ddH₂O 35ml重悬细胞，离心，弃上清，重复用ddH₂O洗一次，

b.6用冰浴的灭菌10％甘油25ml轻柔重悬浮细胞，离心，沉淀会很松散，弃上清，重复用10％甘油洗一次，

b.7用2ml冰浴后的10％甘油重悬细胞即成感受态细胞，

b.8将感受态细胞按100μl分装到1.5ml离心管，立即置于冰上准备电转化；

c.农杆菌转化，

c.1将测序正确的promoter::GUS菌液及阴性对照w/o35S::GUS和pCAMBIA1301提取质粒后，用50ul无菌ddH₂O溶解备用，

c.2将电转化用的电极杯及盖子用ddH₂O洗净后，80％乙醇侵泡5分钟，用紫外交联仪紫外线照射30分钟以除去残留DNA，并将温度设置为30℃烘干电极杯，

c.3将电极杯盖好与感受态细胞一起分别置于冰上预冷20分钟，

c.4加入ddH₂O溶解的质粒0.2ul于感受态细胞中，轻轻吸打混匀继续冰浴30分钟，

c.5将混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使均匀进入电极杯底部且内部不产生气泡，

c.6打开电穿孔仪，选择细菌转化模式，调节电压至1.8KV，

c.7将电极杯侧面用吸水纸完全拭干后按狭缝向前方向放入卡槽中，

c.8将卡槽推入电转化仪，按start键，听到两声轻微蜂鸣后，取出电极杯置于冰上，待最后一个样品电击完毕，在超净台内向每个电极杯中加200μl液体LB将细胞洗出并移入1.5ml离心管中，至于28℃培养1.5小时后涂布于筛选平板上，

c.9对筛选出的菌落进行PCR鉴定，并对阳性菌进行液体培养基培养获得工程菌；

d.工程菌转化葡萄叶片，诱导启动转基因表达，用真空渗透法将工程菌转化入葡萄叶片，并在接种前后染色，获得报告基因的瞬时表达，

d.1将含有目地质粒的农杆菌菌液接种到20ml含有40mg/L链霉素和50mg/L利福平终浓度的LB液体培养基，28℃、200rpm振荡培养36小时，

d.2将5ml培养液加入200ml新鲜含有相同抗生素的LB在28℃、200rpm振荡培养16小时，

d.3在5000rpm离心10分钟，弃上清，用20ml重悬液重悬菌体至OD值0.6，重悬液配制：10mM MES pH 5.6，10mM MgCL₂，2％(W/V)蔗糖，150μM乙酰丁香酮，将配好的重悬液高压灭菌15分钟，冷却备用，

d.4将大小薄厚一致的葡萄叶片均匀加入培养好的菌液中，菌液深度不超过1.5cm，在真空泵压力0.085-0.09MPa下抽真空45分钟，

d.5擦去叶片表面菌液，正面朝上将叶柄固定于湿润的脱脂棉内，放于托盘中，覆盖带孔保鲜膜，于27℃培养箱暗培养16小时，再在弱光下培养至3天，期间喷雾保湿，

d.6每处理取出半数叶片，用去离子水冲洗，基中两片用于蛋白测定，其余放入GUS染色液中再抽真空10分钟，37℃染色，

d.7对另半数叶片用压片法接种葡萄白粉菌，压片前预先喷雾无菌水使叶片上有微小液滴，但无明显露点出现，从田间采摘发病严重且一致的叶片对转化叶片进行压片接种，压片时间5秒，压片后继续覆盖带孔保鲜膜保湿，12小时后取两片用于蛋白测定，其余放入GUS染色液中染色；

e.转基因葡萄叶片病原诱导GUS活性的定量检测

GUS活性检测方法按Jefferson经典方案，以4-甲基伞形酮酰-β-D-葡萄糖酸苷(4-MUG)为底物，GUS催化使之水解为4-甲基伞形酮(4-MU)与β-D-葡萄糖醛酸，4-MU分子中的羟基解离后被365nm的光激发，产生455nm的荧光，荧光值由荧光分光光度计测定。

Claims (3)

1.葡萄病原菌诱导型启动子的分离方法，中国野生华东葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’葡萄抗病转录因子基因VpWRKY1和VpWRKY2为白粉菌诱导表达型基因，其启动子具有受病原菌诱导启动基因上调表达的活性，采用GenBank葡萄基因组序列及白粉菌诱导表达的转录因子基因VpWRKY1和VpWRKY2序列设计引物，从中国野生华东葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’基因组DNA中进行启动子片段的克隆，获得了病原菌诱导型启动子PvpWRKY1全长序列694bp与病原菌诱导型启动子PvpWRKY2全长序列643bp，其特征在于：通过构建重组表达载体PvpWRKY1::GUS和PvpWRKY2::GUS，并用农杆菌介导的真空渗透法导入葡萄叶片，瞬时表达所克隆启动子启动的GUS报告基因，通过对接种葡萄白粉菌前后瞬时表达叶片的GUS染色观察，及对接种葡萄白粉菌前后瞬时表达叶片的GUS活性定量检测，验证了PvpWRKY1和PvpWRKY2受葡萄白粉菌诱导启动报告基因活性上调。

2.如权利要求1所述的葡萄病原菌诱导型启动子的分离方法，其特征在于：

2.a葡萄VpWRKY1和VpWRKY2基因半定量反转录PCR检测取样，首先对葡萄叶片进行白粉菌接种处理，当新梢长至25-30cm长，新叶长至5-6cm宽时，在每新梢上选取3片幼叶，压片前预先喷雾无菌水使叶片上有微小液滴，但无明显露点出现，从田间发病葡萄上采摘白粉病发病症状一致的叶片对选取的叶进行压片接种，压片时间超过5s，压片后即套袋24小时保湿以利白粉菌孢子萌发，在接种后0、6、12、24、48、72、96、120小时采集叶片在田间用液氮冻存，去离子水处理的叶片做为对照；

2.b RNA分离采用SDS/酚法，cDNA第一链合成参照Promega公司M-MMLV

反转录酶使用说明进行；

2.c引物设计及反转录PCR检测

选择VpGAPDH为内参基因，根据目的基因及内参基因序列设计引物如下：

VpWRKY1上游引物：GCGTCCTCGTCGGAGGGGAT

VpWRKY1下游引物：ATCTGGACCTGTTTGGTTGC

VpWRKY2上游引物：CAGAGAAGGCTGAACCGAAC

VpWRKY2下游引物：AGCCTTTGGAAATGGTGATG

VpGAPDH上游引物：ATCCACGGGAGCAGCAAA

VpGAPDH下游引物：AGAACGCGAAAATTAGAACAGG

反转录PCR反应采用天根公司预混上样缓冲液的2×PCR mix反应试剂盒，反应程序：94℃预变性3分钟，然后94℃变性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸30秒条件下扩增25循环，最后72℃延伸5分钟，

中国野生华东葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’转录因子基因VpWRKY1和VpWRKY2被葡萄白粉菌诱导12小时后先上调表达到最高，后随时间延长逐渐下降至初始水平，表明这两个基因启动子为病原菌诱导型启动子，以‘白河-35-1’基因组DNA为模板，根据VpWRKY1和VpWRKY2基因序列设计启动子下游引物，根据NCBI欧洲葡萄基因组同源序列设计启动子上游引物，PCR先直接快速扩增出包含与基因重叠区域启动子片段，回收PCR产物克隆、测序；

2.d PCR扩增启动子片段

PvpWRKY1上游引物：CTATTAGGAGGAGTTGGTTG

PvpWRKY1下游引物：CTCATGGTGGCGTCTGTG

PvpWRKY2上游引物：ATGGTCTCCGTTCCGTCTT

PvpWRKY2下游引物：ACTCGGGGTTCGGCTCAG；

2.e葡萄基因组按小量提取法进行：

2.e.1采摘1cm²左右叶片放入离心管中，

2.e.2加0.4ml提取缓冲液，提取缓冲液配制：200mM Tris PH：7.5，250mM NaCl，25mM EDTA PH：8.0，0.5％SDS，

2.e.3用与离心管配套的小塑料研棒按顺、逆时针交替旋转法将样品在缓冲液中磨碎，

2.e.4在12000rpm，离心5分钟，

2.e.5上清液转移至新管，

2.e.6加入0.4ml酚：氯仿：异戊醇溶液，其体积比为25∶24∶1，PH值为6.5，

2.e.7加0.4ml异丙醇，混匀，

2.e.8放置5分钟，

2.e.9全速离心5分钟，

2.e.10弃上清，管底剩下DNA，

2.e.11加1ml 70％乙醇上下轻柔颠倒至白色片状物悬浮，室温放置2分钟，

2.e.12在12000rpm，离心1分钟，弃上清，

2.e.13开放空间干燥10分钟以上，至乙醇挥发干净，

2.e.14加50ul灭菌ddH2O，

2.e.15稀释5倍直接进行PCR扩增；

2.f.目地片段的TA连接测序方法按Promega载体使用说明进行。

3.如权利要求1所述的葡萄病原菌诱导型启动子在抗病育种中的应用，其特征在于：

3.a重组载体构建，为构建GUS报告重组载体，重新设计带有酶切位点Xba I和Nco I的引物仅扩增不包含与基因重叠区域启动子片段部分，分别命名为PvpWRKY1和PvpWRKY2，用目的启动子替换pCAMBIA1301的35S，使GUS处于克隆所克隆启动子控制下，构建成promoter::GUS重组表达载体，此外，用BamHI和BglII酶切pCAMBIA1301的35S启动子，利用同尾酶互补将载体重新连接成没有35S的GUS载体，命名为w/o35S::GUS，pCAMBIA1301做为阳性对照，即35组成型启动GUS表达；

PvpWRKY1::GUS上游引物：gggtctagaCTATTAGGAGGAGTTGGTTG

PvpWRKY1::GUS下游引物：gggccatggACTCACCAAGTGAAGATCAA

PvpWRKY2::GUS上游引物：gggtctagaTGGTCTCCGTTCCGTCTTTC

PvpWRKY2::GUS下游引物：gggccatggGGCCGATTCGGAGAGAAG

以TA连接好的载体为模板进行PCR扩增，将PCR回收产物与pCAMBIA1301空载体分别进行XbaI和NcoI双酶切后，PCR与载体酶切产物进行连接，转化后送测序保证重组载体中启动子***位置正确无误；

3.b电转化农杆菌感受态细胞的制备：

3.b.1将LBA4404菌株接种于20ml含有40mg/L链霉素和50mg/L利福平终浓度的LB液体培养基，28℃培养24小时，

3.b.2将培养好的菌液加入100ml新鲜LB中至OD值0.2，28℃继续振荡培养，至OD值0.6，

3.b.3从摇床中取出菌液，冰浴15分钟，

3.b.4菌液转移至50ml离心管，4℃5000rpm离心15分钟，弃上清，

3.b.5用冰浴的灭菌ddH₂O 35ml重悬细胞，离心，弃上清，重复用ddH₂O洗一次，

3.b.6用冰浴的灭菌10％甘油25ml轻柔重悬浮细胞，离心，沉淀会很松散，弃上清，重复用10％甘油洗一次，

3.b.7用2ml冰浴后的10％甘油重悬细胞即成感受态细胞，

3.b.8将感受态细胞按100μl分装到1.5ml离心管，立即置于冰上准备电转化；

3.c农杆菌转化，

3.c.1将测序正确的promoter::GUS菌液及阴性对照w/o35S::GUS和pCAMBIA1301提取质粒后，用50ul无菌ddH₂O溶解备用，

3.c.2将电转化用的电极杯及盖子用ddH₂O洗净后，80％乙醇侵泡5分钟，用紫外交联仪紫外线照射30分钟以除去残留DNA，并将温度设置为30℃烘干电极杯，

3.c.3将电极杯盖好与感受态细胞一起分别置于冰上预冷20分钟，

3.c.4加入ddH₂O溶解的质粒0.2ul于感受态细胞中，轻轻吸打混匀继续冰浴30分钟，

3.c.5将混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使均匀进入电极杯底部且内部不产生气泡，

3.c.6打开电穿孔仪，选择细菌转化模式，调节电压至1.8KV，

3.c.7将电极杯侧面用吸水纸完全拭干后按狭缝向前方向放入卡槽中，

3.c.8将卡槽推入电转化仪，按start键，听到两声轻微蜂鸣后，取出电极杯置于冰上，待最后一个样品电击完毕，在超净台内向每个电极杯中加200μl液体LB将细胞洗出并移入1.5ml离心管中，至于28℃培养1.5小时后涂布于筛选平板上，

3.c.9对筛选出的菌落进行PCR鉴定，并对阳性菌进行液体培养基培养获得工程菌；

3.d工程菌转化葡萄叶片，诱导启动转基因表达，用真空渗透法将工程菌转化入葡萄叶片，并在接种前后染色，获得报告基因的瞬时表达，

3.d.1将含有目地质粒的农杆菌菌液接种到20ml含有40mg/L链霉素和50mg/L利福平终浓度的LB液体培养基，28℃、200rpm振荡培养36小时，

3.d.2将5ml培养液加入200ml新鲜含有相同抗生素的LB在28℃、200rpm振荡培养16小时，

3.d.3在5000rpm离心10分钟，弃上清，用20ml重悬液重悬菌体至OD值0.6，重悬液配制：10mM MES pH 5.6，10mM MgCL₂，2％(W/V)蔗糖，150μM乙酰丁香酮，将配好的重悬液高压灭菌15分钟，冷却备用，

3.d.4将大小薄厚一致的葡萄叶片均匀加入培养好的菌液中，菌液深度不超过1.5cm，在真空泵压力0.085-0.09MPa下抽真空45分钟，

3.d.5擦去叶片表面菌液，正面朝上将叶柄固定于湿润的脱脂棉内，放于托盘中，覆盖带孔保鲜膜，于27℃培养箱暗培养16小时，再在弱光下培养至3天，期间喷雾保湿，

3.d.6每处理取出半数叶片，用去离子水冲洗，基中两片用于蛋白测定，其余放入GUS染色液中再抽真空10分钟，37℃染色，

3.d.7对另半数叶片用压片法接种葡萄白粉菌，压片前预先喷雾无菌水使叶片上有微小液滴，但无明显露点出现，从田间采摘发病严重且一致的叶片对转化叶片进行压片接种，压片时间5秒，压片后继续覆盖带孔保鲜膜保湿，12小时后取两片用于蛋白测定，其余放入GUS染色液中染色；

3.e转基因葡萄叶片病原诱导GUS活性的定量检测

GUS活性检测方法按Jefferson经典方案，以4-甲基伞形酮酰-β-D-葡萄糖酸苷(4-MUG)为底物，GUS催化使之水解为4-甲基伞形酮(4-MU)与β-D-葡萄糖醛酸，4-MU分子中的羟基解离后被365nm的光激发，产生455nm的荧光，荧光值由荧光分光光度计测定。

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