CN108977563A - 基于萝卜全基因组序列开发的ssr核心引物组及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一套基于萝卜全基因组序列开发的SSR核心引物组及其应用。本发明的SSR核心引物组包括21对引物，其核苷酸序列如SEQ No.1‑42所示。本发明所提供的SSR核心引物组在萝卜基因组中分布均匀、多态性高，扩增重复性好，带型清晰容易判读，同时适合普通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测平台和毛细管荧光检测平台检测，可以应用于萝卜遗传多样性分析、品种鉴定、DNA指纹图谱构建等领域。
Description
技术领域
本发明涉及萝卜SSR标记，具体地说是基于萝卜全基因组序列开发的SSR核心引物组及其应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术
萝卜原产我国，各地均有栽培，品种极多，常见有红萝卜、青萝卜、白萝卜、水萝卜和心里美等。根供食用，为我国主要蔬菜之一。萝卜的主要成分有蛋白质、糖类、B族维生素和大量的维生素C，以及铁、钙、磷和纤维、芥子油和淀粉酶。据测定，萝卜的维生素C含量比苹果、梨等水果高近10倍。萝卜性凉，味辛、甘，具有消积滞、化痰清热、下气宽中、解毒之功效。萝卜是地道的保健食品，能促进新陈代谢、增进食欲、帮助消化，可以化积滞，用于食积胀满、痰咳失音、吐血、消喝、痢疾、头痛、排尿不利等；常吃萝卜可降低血脂、软化血管、稳定血压，可预防冠心病、动脉硬化、胆石症等疾病。
萝卜是我国一种重要的大路蔬菜，全国各地均有种植。可四季栽培，周年供应，产销量也很大。由于人民生活水平的提高，消费习惯的改变，科学技术的发达，反季节栽培也有所发展，利用高山气候的差异，日光温室和塑料大、中、小棚配套栽培。实现了萝卜超时令上市，很受广大消费者欢迎。
近年来，我国萝卜新品种培育呈现良好的发展势头，培育出大量新品种。准确、快速进行农作物品种的鉴定，对于农作物品种审定、品种保护、真假品种辨别、品种的产权纠纷等方面均有重要作用。传统的品种鉴定方法是田间种植鉴定，是将鉴定品种种植在相同的生长条件下，在生长发育的各个阶段对多个质量性状、数量性状及抗病性等做出观察记载，并进行品种比较，鉴定品种的异同。传统品种鉴定方法存在鉴定周期长、易受环境影响、测试性状多、工作量大等问题，无法适应大量品种的鉴定需求。
分子标记是以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。分子标记检测技术具有测试周期短、不受环境影响和季节限制、没有组织特异性、供选择的标记数量多、可以进行高通量测试分析等优势，已逐步用于品种鉴定、种子纯度及品种真实性检测中。利用RAPD、AFLP、RFLP标记，可以将不同生态类型的萝卜品种区别开。但是，RAPD重复性较差；AFLP操作较复杂，稳定性较差；RFLP操作过程繁琐，效率低，成本高。SSR(Simple Sequence Repeats)是以1～6个核苷酸为单位、呈串联重复的DNA序列，广泛分布于真核生物基因组中。与其他分子标记相比，SSR标记具有共显性、多态性高、重复性好、操作简单等优点，已经作为重要的DNA标记广泛应用于植物遗传多样性研究、品种鉴定、遗传图谱的构建、QTL定位、标记辅助选择及比较基因组研究等领域。与水稻、小麦等作物相比，现有的萝卜SSR标记数量少，不能满足萝卜研究的需要，大量开发覆盖全基因组的SSR标记仍是目前萝卜研究的重要工作之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一套基于萝卜全基因组序列开发的SSR核心引物组，这些引物具有扩增稳定、电泳条带清晰、多态性丰富的优点，可有效用于萝卜遗传多样性分析、品种鉴定、DNA指纹图谱构建等研究。
本发明提供了一种基于萝卜全基因组序列开发的SSR核心引物组，其特征是，它包括21对引物，分别为：LB5-2、LB6-35、LB8-9、LB1-15、LB6-26、LB7-20、LB2-23、LB9-5、LB6-11、LB9-35、LB7-33、LB7-34、LB1-19、LB5-28、LB8-17、LB4-23、LB5-3、LB3-21、LB3-16、RS0027、RS0073，其核苷酸序列依次SEQ No.1-42所示或者表2所示。
本发明还提供了上述的SSR核心引物组在遗传多样性分析、品种鉴定、DNA指纹图谱构建方面的应用。
上述的SSR核心引物组在品种鉴定中的应用方法，其特征是，采用21对引物进行荧光毛细血管电泳检测，依据毛细血管电泳的检测结果，品种间差异位点数≥3为不同品种；品种间差异位点数<3为近似品种，可以形成鉴定结果。
本发明的有益效果：
1)本发明筛选出的21对SSR核心引物(即SSR标记)，在萝卜基因组中分布均匀、多态性高、带型清晰容易判读。相比于EST-SSR，本发明采用基因组SSR，其多态性更高，品种鉴别力更强，能够以更少的引物获得更佳的品种鉴别效果。
2)相比EST-SSR，本发明筛选出的21对SSR核心引物不仅能通过聚丙烯氨酰胺电泳平台筛选，更重要的是能够满足高通量的荧光毛细管电泳技术平台的要求。五色荧光毛细管电泳技术是当今主流的分子标记分析技术，分析效率是聚丙烯酰胺电泳技术的20倍以上，分析获得的等位变异数据重复性好，再现性强，分析过程清洁环保。
3)本发明的SSR核心引物组在萝卜基因组中分布均匀、多态性高，扩增重复性好，可用于萝卜遗传多样性分析、品种鉴定、DNA指纹图谱构建等领域，有利于保护育种者、生产者和消费者的合法权益，促进萝卜遗传育种水平的提高和萝卜产业的发展。
附图说明
图1为SSRHunter1.3软件搜索结果示意图；
图2为引物在萝卜中检测的多态性；其中A、B图分别为引物LB5-3、LB6-26在萝卜中检测的多态性，从图中可以看出：引物的多态性最丰富且带型清晰；
图3为21对引物对96个品种的聚类图。
具体实施方式
1.萝卜基因组DNA的提取
(1)材料96份萝卜品种(表1)
表1 96份萝卜品种
(2)CTAB法提取基因组DNA
采用CTAB法提取供试萝卜品种的DNA：取幼嫩组织混合样0.2g，放入1.5mL离心管中，在液氮中研碎。或将种子研碎，放入1.5mL离心管中。将DNA提取液预热到65℃，每管加入400μL，混匀样品。将离心管置于65℃金属浴或水浴锅中，保温23min后取下，保温过程中震荡离心管，使样品与提取液充分混合。向离心管中加入400μL 24:1氯仿-异戊醇(V/V)，振荡混匀。10 000g离心10min。将上清液200μL转入另一只1.5mL离心管，加入400μL-20℃预冷无水乙醇沉淀DNA。10 000g离心1min，弃上清液，加入500μL乙醇-乙酸铵溶液(称取154.6mg乙酸铵，加入140ml无水乙醇，用去离子水定容至200mL)，6 000g离心5min收集沉淀。室温晾干，加入100μL TE(pH 8.0)溶液溶解DNA，检测DNA浓度。-20℃保存。
其中，DNA提取液的配方为：分别称取20.0g十六烷基三乙基溴化铵和81.82g氯化钠放入烧杯中，然后加入40mL乙二胺四乙酸二钠盐溶液(pH8.0)、100mL 1mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液(pH8.0)和10.0g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，再加入800ml去离子水，65℃水浴中加热溶解，冷却后定容至1000mL。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min。于4℃保存。
2.萝卜基因组SSR引物的开发
(1)萝卜基因组序列的获得
萝卜全基因组测序结果从萝卜基因组数据库Brassica Database(http://brassicadb.org/brad/downloadOverview.php)下载，约391Mb，共包含76592条序列。
(2)已定位序列的获得
通过Raphanus sativus Genome DataBase(http://radish.kazusa.or.jp/index.html)，在76592中找出已经定位染色体信息的580条序列。
(3)萝卜基因组序列中SSR序列的鉴定
采用SSR搜索软件SSRHunter1.3，对已定位的580条序列进行SSR位点搜索。搜索条件为：重复次数至少为5、构成重复基元的核苷酸数最多是6个。统计完全型SSR、不完全型SSR和复合型SSR。SSRHunter1.3软件搜索结果如图1所示。
(4)萝卜基因组SSR引物的设计
依据步骤(3)获得的SSR位点，选择重复次数在10以上或者重复碱基数在18以上的SSR位点，利用重复序列两端的保守侧翼序列，用Primer 5.0设计引物。引物设计的条件是：PCR产物长度为100～350bp；退火温度(Tm)为50～70℃，保证两引物间Tm值相差不超过4℃；GC％含量为40～65％；引物长度为18～28bp；引物5’端最好是G/C，3’端避免出现A。为了保证引物的特异性，用于设计引物的保守侧翼序列与微卫星位点至少间隔20～23个碱基。成功设计出353对引物，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
3.萝卜基因组SSR引物的筛选
选择8份萝卜品种，用于检测萝卜基因组SSR标记的扩增情况及多态性。
采用合成的353对引物，以8份材料的基因组DNA进行扩增，根据扩增结果，筛选可稳定扩增、带型清晰且多态性丰富的引物。
根据筛选结果，从萝卜每条染色体上选取2～4对多态性最丰富且带型清晰的引物(如图2所示)，共21对(表2)。
4.利用21对SSR引物对96份萝卜品种进行PCR扩增及毛细管电泳
PCR扩增采用25μL的反应体积，含每种dNTP 0.25mmol/L，正向引物、反向引物各0.4mol/L，Taq DNA聚合酶1.0单位，1×PCR缓冲液(不含Mg2+)，MgCl2 1.5mmol/L，样品DNA10-40ng。反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，65℃退火45s，72℃延伸45s，每循环降1℃，共15个循环；94℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
毛细管电泳按照以下步骤进行：将6-FAM和HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，TAMRA和ROX荧光标记的PCR产物稀释10倍。分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合，从混合液中吸取1L加入到DNA分析仪专用深孔板孔中。板中各孔分别加入0.1LLIZ500分子量内标和8.9L去离子甲酰胺。将样品在PCR仪上95℃变性5min，取出，立即置于碎冰上，冷却10min以上。瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上(ABI3730XL)。除待测样品外，每个SSR位点还应同时包括3～4个参照品种的扩增产物。
分析毛细管电泳结果。根据参照品种的扩增片段大小，确定待测样品该位点的等位变异大小。纯合位点的等位变异记录为X/X，杂合位点的等位变异记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异片段大小，小片段在前，大片段在后。无效等位变异记录为0/0，多个位点的数据整合在一起形成不同萝卜品种的SSR指纹图谱(表3)。依据21对SSR引物的检测结果进行判定：品种间差异位点数≥3为不同品种；品种间差异位点数<3为近似品种，形成鉴定结果。比较96份品种的指纹数据，发现任两个品种间的差异位点数都大于3，说明这21对核心引物可以有效的把这些品种鉴别开。
利用PowerMarker V3.25软件计算引物的等位基因数(Na)、基因多样性指数(He)、多态性信息量(PIC)。利用NTSYS-pc V2.10e软件计算品种间的遗传相似系数，用UPGMA法进行聚类分析，绘制树状图(图3)。从图3中可以看出：大多数品种的遗传相似性系数小于0.05，可以把所有品种区别开。
表2 21对引物的序列
| 序号 | 引物名称 | 荧光 | 前引物序列 | 后引物序列 |
| 1 | LB5-2 | 5′6-FAM | TAACAAGGAAATGGATTACAAAGTC | AAGAGGAGAAACAGTAGTGGAGAAG |
| 2 | LB6-35 | 5′-HEX | TCGACAGCTTTGGCGGCGTACTC | ACCCCCCATTCTCCGATCCTTCTTA |
| 3 | LB8-9 | 5′-TAMRA | CGGCAAAAATACCATCCTACATAAA | GTCTCTGTTCGCTGCTAATAGTCAAT |
| 4 | LB1-15 | 5′6-FAM | GATAATGATGTTCAGGAAAACGGCA | TCCTGGCATTCATTATGTACTGATTTG |
| 5 | LB6-26 | 5′-HEX | CTGTGAATGCTTTGTTTTCCCGAC | TTGTGGTTGGTGTTAAAGGATGTGG |
| 6 | LB7-20 | 5′-HEX | GAGTAGAGAGATTTTGCGGGTGTT | TCTCTGTTAAGCAACTTCCTCTGGT |
| 7 | LB2-23 | 5′6-FAM | CTTCAAGATGACGACAAGAACAGC | ACAACCATACATTAACAAGATCCAA |
| 8 | LB9-5 | 5′-HEX | CGGATAGAGTGAACCTGATGAGAG | GCTGAAGATAGACATTGGAGAGTAAG |
| 9 | LB6-11 | 5′-ROX | CTTTGCTAAATAAGACGCTGAATACG | GAGAGATTACAGATCGATTTTTGAAGG |
| 10 | LB9-35 | 5′-TAMRA | CTATGGGGAGACAATGCTCAGGT | GAACTATGCTAGGGCTAAAAAACGC |
| 11 | LB7-33 | 5′-ROX | GAAAGCACAAGAGGAAGTAGACAGAG | TAATCAAGACCTACCAAGAACACAAAC |
| 12 | LB7-34 | 5′-TAMRA | TTATTTCTCAGATTTTCGAGTGATGTG | GAATGGGGGAGGGAGAATAAAGTT |
| 13 | LB1-19 | 5′6-FAM | GCATGACGGTGAGGATTAAACGC | ATTGGGGGACTAAAATGAAAGGGAG |
| 14 | LB5-28 | 5′-HEX | GAGGAAAACAGAAGCCACAGCAGC | GGTGAAGGAGGACGATGAGTTGATG |
| 15 | LB8-17 | 5′-ROX | CGACCTCCTCTTGTTTCGTCTGTAG | CATTAAAAAGTGCGTGTGGCTG |
| 16 | LB4-23 | 5′-TAMRA | CTACCGTTTTTAGCACACGCAGC | ATCTTATGTAGGGGGAAGTGTTGGA |
| 17 | LB5-3 | 5′6-FAM | GTCGCTCGCTGAGGCTAGGCTT | CATTCAACTTGTCCACTTGTTTCTGC |
| 18 | LB3-21 | 5′-HEX | GATAGCAGACAGACCCTCAAAACAG | GGACAGTGCTGCTTATCAGAGGAC |
| 19 | LB3-16 | 5′-ROX | GAGAGATTCTGATCATTTGGGGGTT | GAGGAGGTTGGGGATAGTGACGAG |
| 20 | RS0027 | 5′-ROX | GACACGCCTCTTCCTTCTTG | TCAAGTACCACTTCCCGAGG |
| 21 | RS0073 | 5′-TAMRA | ATCGAGACAAGGGAAGGGTT | TCAGTCCATCCAACAGACCA |
表3 96份品种的指纹数据
续表3
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省农业科学院作物研究所
<120> 基于萝卜全基因组序列开发的SSR核心引物组及其应用
<130> 0
<160> 42
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
taacaaggaa atggattaca aagtc 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcgacagctt tggcggcgta ctc 23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
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<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
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<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
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<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
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<210> 9
<211> 24
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<213> 人工序列
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<212> DNA
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cttcaagatg acgacaagaa cagc 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ctttgctaaa taagacgctg aatacg 26
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<213> 人工序列
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<400> 19
ctatggggag acaatgctca ggt 23
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<213> 人工序列
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<210> 21
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<213> 人工序列
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gaaagcacaa gaggaagtag acagag 26
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taatcaagac ctaccaagaa cacaaac 27
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ggtgaaggag gacgatgagt tgatg 25
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<400> 31
ctaccgtttt tagcacacgc agc 23
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cattcaactt gtccacttgt ttctgc 26
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gatagcagac agaccctcaa aacag 25
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ggacagtgct gcttatcaga ggac 24
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gagagattct gatcatttgg gggtt 25
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<213> 人工序列
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gaggaggttg gggatagtga cgag 24
<210> 39
<211> 20
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<213> 人工序列
<400> 39
gacacgcctc ttccttcttg 20
<210> 40
<211> 20
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tcaagtacca cttcccgagg 20
<210> 41
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atcgagacaa gggaagggtt 20
<210> 42
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<400> 42
tcagtccatc caacagacca 20
Claims (5)
1.基于萝卜全基因组序列开发的SSR核心引物组，其特征在于，包括21对引物：LB5-2、LB6-35、LB8-9、LB1-15、LB6-26、LB7-20、LB2-23、LB9-5、LB6-11、LB9-35、LB7-33、LB7-34、LB1-19、LB5-28、LB8-17、LB4-23、LB5-3、LB3-21、LB3-16、RS0027、RS0073，其核苷酸序列依次如SEQ No.1-42所示。
2.权利要求1所述的基于萝卜全基因组序列开发的SSR核心引物组在萝卜品种多样性分析中的应用。
3.权利要求1所述的基于萝卜全基因组序列开发的SSR核心引物组在萝卜DNA指纹图谱构建方面的应用。
4.权利要求1所述的基于萝卜全基因组序列开发的SSR核心引物组在萝卜品种鉴定中的应用。
5.权利要求4所述的基于萝卜全基因组序列开发的SSR核心引物组在萝卜品种鉴定中的应用方法，其特征是，采用SSR核心引物组进行荧光毛细血管电泳检测，依据毛细血管电泳的检测结果，品种间差异位点数≥3为不同品种；品种间差异位点数<3为近似品种，可以形成鉴定结果。
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| CN114231651A (zh) * | 2021-11-25 | 2022-03-25 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 一套适用于SSR-Seq技术的萝卜全基因组SSR核心引物组合及其应用 |
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| CN105112523A (zh) * | 2015-08-26 | 2015-12-02 | 山东省农业科学院作物研究所 | 基于大白菜全基因组序列开发的ssr核心引物组及应用 |
-
2018
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