CN107847633B - 用于增强愈合的双层设备 - Google Patents

Abstract

本文公开了多层伤口敷料，包括：第一层，第一层包括促进伤口的新生血管形成的通道；以及与第一层接触的第二层，第二层具有与第一层相同或不同的化学组分；其中第二层包括具有纹理的至少一个表面，并且纹理的方向可用于促进细胞取向和生长。一种方法包括形成聚合物材料的第一层；在第一层上形成与第一层相同的聚合物材料的第二层；并且形成与第一层相同的聚合物材料的第二层的纹理化表面，纹理化表面在伤口敷料中使用时可用于促进定向细胞生长，其中利用增材制造工艺形成第一层和第二层。

Description

用于增强愈合的双层设备

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年4月23日提交的美国申请号为62/151875和62/151936的申请以及于2015年12月1日提交的美国申请号为62/261407的申请的优先权，他们通过引用整体并入本文。

关于联邦资助研究的声明

本发明是在国家卫生研究院(the National Institutes of Health)授予的合同/授权号为1R43 AR067584以及由NAVY/海军研究所(Office of Naval Research)授予的合同/授权号为N000141310443下由政府支持而进行的。政府对本发明具有权利。

技术领域

本公开涉及用于增强愈合的双层设备。

背景技术

没有临床可用的敷料具有对于有效的全层伤口愈合所需的所有特征。目前的标准是覆盖受影响区域的皮肤移植。然而，这种方法受到供体部位发病率和健康皮肤可用性的限制；因此，其对于大面积损伤不是可行的治疗。同种异体移植(例如，尸体皮肤或人工培养的上皮细胞片)经常被用于临时伤口覆盖。然而，长时间的培养时间、移植物的脆弱性以及排斥率在同种异体移植治疗中仍然是很大的障碍。虽然合成和生物合成的移植物不具有这些相同的缺点，但它们都缺乏同时处理真皮和表皮的能力，如目前可用的全层伤口敷料那样。虽然使用合成的皮肤移植物(例如Endoform^TM、

和

)来增强皮肤愈合，但是这些产品可能需要长达3周的时间才能血管化，从而使得发生并发症而延长愈合时间。

这些产品也不直接促进再上皮化。

和

例如包括硅基顶层，该硅基顶层必须在皮肤再生后去除以允许表皮愈合。需要去除这种敷料顶层是许多合成伤口敷料的主要缺点。其破坏上皮细胞迁移和新组织形成，并且增加成本和患者不适。在伤口护理专家的国际调查中，将近60％的人表示，他们更愿意使用单件复合材料进行烧伤治疗，以减少敷料改变的频率。

发明内容

本文公开了一种多层伤口敷料，包括：第一层，第一层包括促进伤口的新生血管形成的通道；以及与第一层接触的第二层，第二层具有与第一层相同或不同的化学组成；其中第二层包括具有纹理的至少一个表面，并且所述纹理的方向可用于促进细胞取向和生长。

本文还公开了包括以下步骤的方法：形成聚合物材料的第一层；在第一层上形成与所述第一层相同或不同的聚合物材料的第二层；以及在第二层上形成纹理化表面，其中所述纹理化表面在用于伤口敷料中时有助于定向细胞生长，其中利用增材制造工艺形成所述第一层和所述第二层。在一个实施例中，可以使用增材制造工艺(在本文中也称为3D打印)来打印部分结合第一层的的多个层。如上所述，该多个层可以具有a)不同的结构；b)不同的组成(例如，化学物质)；或c)不同的结构和化学成分。所述多个层可以具有结构或组成的逐渐变化(即，在结构或组成上具有梯度)，或者另选地，可以具有从一层到另一层的结构或组成的随机变化。

本文公开了一种方法，所述方法包括在伤口上或伤口中布置多层伤口敷料；其中所述多层敷料包括第一凝胶层；所述第一凝胶层包括当用于伤口敷料时促进新生血管形成的通道；以及与第一凝胶层接触的第二层；其中第二层包括具有纹理的至少一个表面；其中通道和纹理促进在一个或多个方向上的多层细胞生长。

本文还公开了一种制品，包括：第一凝胶层的，所述第一凝胶层包括当用于伤口敷料时促进新生血管形成的通道，其中第一层包括第一类型的生长细胞；以及与第一凝胶层接触的第二层；其中第二层包括具有纹理的至少一个表面；并且其中第二层包括第二类型的生长细胞。

本文公开了一种多层伤口敷料，包括：第一凝胶层，所述第一层包括的三维通，它促进伤口的新生血管形成并且包括天然或合成的生物可降解聚合物；以及与所述第一凝胶层接触的第二层，所述第二层包括具有纹理的至少一个表面，所述纹理的方向可用于促进细胞取向和生长。

本文还公开了一种包括以下步骤的方法：形成天然或合成的可生物降解聚合物材料的第一层；在第一层上形成聚合物材料的第二层；以及形成所述第二层的纹理化表面，所述纹理化表面在用于伤口敷料中时可用于促进定向细胞生长，其中利用增材制造工艺形成所述第一层和所述第二层。

附图说明

图1示出了用于伤口愈合的双层设备的实施例的示意图；

图2示出了a)和b)为在SM(光滑)表面和SK(+1.7SK2x2)(Sharklet)表面上培养的HEK，用于肌动蛋白(白色)和核(蓝色)染色。染色显示了SK上的接触引导(箭头表示图案方向)。刻度棒，50μm。c)改型的刮伤试验的结果显示，在SK上，在3天之后，受伤区域内的细胞覆盖范围相对于SM增加了33％。

图3示出了在生物可降解材料中复制的Sharklet^TM图案表明了与光滑表面相比增加的细胞迁移和伤口闭合率。改性的刮伤试验的结果显示，在+1SK10x5和+10SK50x50上，在4天之后，受伤区域内的细胞覆盖范围分别相对于光滑提高了46％和64％。

图4示出了通过其可以发生细胞生长的第一层中的3-D通道结构。该图像专门用于CAPGEL^TM材料，但其他材料可用于制成类似的3-D结构；

图5示出了受伤7天后大鼠皮肤的H&E染色切片的代表性显微照片；

图6是示出了组织学伤口愈合评分的曲线图；以及

图7包括受伤28天后大鼠皮肤的H&E染色切片的代表性显微照片。该图表明了伤口敷料随着时间的推移在体内降解。

具体实施方式

本文公开了增强新生血管形成、真皮愈合和自体表皮愈合的多层图案化的全厚度伤口敷料。敷料包括至少两层，其第一层是血管生成真皮基质层，并且其第二层是图案化顶层，以引导穿过伤口的细胞迁移。

在一个实施例中，第一层可以包括多个层，这多个层具有不同结构、组合物(例如化学物质)或组合物和结构两者。这些不同的结构和/或组合物可以是以梯度的形式渐进的或有规则的，或者可以是随机的。在一个实施例中，第一层通常具有促进新生血管形成的多个连续的三维通道，而第二层上的纹理化促进伤口愈合敷料中的定向细胞生长。第二层设置在第一层上并且可以与其直接接触。第二层具有至少一个具有纹理的表面。纹理的方向可用于促进细胞取向和生长。

第一层包含通道，而第二层包含纹理化表面。可以改变纹理化表面中的图案和通道的取向以产生具有不同取向的细胞层(在第一层中)。通过使不同层中的细胞不同地取向，相比于旧细胞层，可以提高新细胞层的强度。

通过纹理化第二层的表面，可以将伤口处不需要的流体排出，而将有助于愈合的其它需要的流体引向伤口。多层伤口敷料中的纹理也可用于减轻或消除伤口附近不想要的细菌或病毒的生长。

本文还公开了在伤口中或伤口上使用多层伤口敷料的方法。使用多层伤口敷料允许根据在其中一层中的微孔的取向和其中另一层中的通道取向，受伤区域中的细胞在单个方向或多个方向上生长。

本文所用的术语“通道”意指部分或完全延伸通过第一层或构成第一层的多个层的的通路。这些通道可以包括毛细管、孔、微孔，并且可以具有正方形、矩形、三角形、圆形、椭圆形、多边形或其组合的横截面几何形状。通道的尺寸在纳米范围或微米范围内。通道的平均横截面尺寸可以为10纳米至10微米，优选地为20纳米至1微米，更优选地为50纳米至5微米。在一些实施例中，通道可具有10微米至1毫米的平均横截面尺寸。较大的通道允许更多的流体输送，其对于成功地将营养物输送到大量伤口敷料是有用的。横截面尺寸垂直于通道的长度测量。通道的纵横比大于2:1，优选地大于5:1，更优选地大于10:1。

通道可以被构成第一层的材料在所有侧上都被围绕，但不是必需由构成第一层的材料的壁在所有侧上都被围绕。相反，其可以使其一个或多个表面包括在第二层中使用的材料。另选地，通道的一个或多个表面是开放的表面，即，其对环境条件开放(即，其对大气开放)或接触一些其它形式的伤口敷料。

第一层和第二层可以包含相同或不同的聚合物材料。任选地可以使用粘合剂将第一层粘合到第二层。在一些实施例中，第一层和/或第二层是可以为热塑性材料或热固性材料的聚合物材料。热固性材料是可交联的并且能够利用热能和/或照射进行交联。照射可以包括紫外光、红外辐射、微波辐射、X射线、电子束辐射、质子或中子束辐射、或其组合。交联的材料可以是高度交联的或以凝胶形式轻度交联的。

聚合物材料可以包括低聚物、均聚物、共混物或低聚物和/或均聚物、共聚物、离聚物、聚电解质、树突状聚合物或其组合。共聚物可包括嵌段共聚物、无规共聚物、梯度共聚物、交替共聚物、星形嵌段共聚物或其组合。

可用于第一层和/或第二层的聚合物(均为热塑性或热固性)的示例是聚缩醛、聚烯烃、聚丙烯酸、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酯、聚酰胺、聚酰胺酰亚胺、聚芳酯、聚芳基砜、聚醚砜、聚苯硫醚、聚氯乙烯、聚砜、聚酰亚胺、聚醚酰亚胺、聚四氟乙烯、聚醚酮、聚醚醚酮、聚醚酮酮、聚苯并恶唑、多苯酞、聚缩醛、聚酐、聚乙烯醚、聚乙烯基硫醚、聚乙烯醇、聚乙烯基酮、聚卤乙烯、聚乙烯腈、聚酯、多磺酸酯、聚硫化物、聚硫酯、聚磷腈、聚硅氮烷、苯乙烯丙烯腈、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚氨酯、乙烯丙烯二烯橡胶(EPR)、聚四氟乙烯、含氟弹性体、氟化乙烯丙烯、全氟烷氧基乙烯、聚氯三氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚硅氧烷等，或其组合。

聚电解质的示例包括聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸、胶质、角叉菜胶、藻酸盐、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等，或其组合。

热固性聚合物的示例包括环氧聚合物、不饱和聚酯聚合物、聚酰亚胺聚合物、双马来酰亚胺聚合物、双马来酰亚胺三嗪聚合物、氰酸酯聚合物、乙烯基聚合物、苯并恶嗪聚合物、苯并环丁烯聚合物、丙烯酸树脂、醇酸树脂、酚醛聚合物、酚醛清漆、三聚氰胺-甲醛聚合物、脲-甲醛聚合物、羟甲基呋喃、异氰酸酯、邻苯二甲酸二烯丙酯、氰尿酸三烯丙酯、异氰脲酸三烯丙酯、不饱和聚酯酰亚胺等，或其组合。

热塑性聚合物的共混物的示例包括丙烯腈-丁二烯-苯乙烯/尼龙、聚碳酸酯/丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、丙烯腈丁二烯苯乙烯/聚氯乙烯、聚苯醚/聚苯乙烯、聚苯醚/尼龙、聚砜/丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、聚碳酸酯/热塑性聚氨酯、聚碳酸酯/聚对苯二甲酸、聚碳酸酯/聚对苯二甲酸丁二醇酯、热塑性弹性体合金、尼龙/弹性体、聚酯/弹性体、聚对苯二甲酸乙二醇酯/聚对苯二甲酸丁二醇酯、缩醛/弹性体、苯乙烯-马来酸酐/丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、聚醚醚酮/聚醚砜、聚醚醚酮/聚醚酰亚胺聚乙烯/尼龙、聚乙烯/聚缩醛等。

在一些实施例中，第一层是由生物可降解聚合物材料形成的生物可降解凝胶。在一个实施例中，第一层和/或第二层可以是热塑性层、生物可降解层和/或生物相容层，并且可以包含本文所述的任何聚合物。在一个实施例中，第一层和/或第二层可以是热固性层、生物可降解层和/或生物相容性层。本文使用的热塑性或热固性材料可以是生物可降解层和/或生物相容性层。用于形成第一层的生物可降解聚合物材料的示例包括但不限于本文所述的任何生物可降解聚合物。在一个实施例中，第一层包括由至少一种天然或合成的生物可降解聚合物形成的凝胶。在另一个实施例中，第一层由至少一种合成的生物可降解聚合物形成，第一层和至少一种合成的生物可降解聚合物不包括明胶、胶原、CAPGEL^TM凝胶、铜毛细管藻酸盐凝胶(CCAG)或/或天然生物可降解聚合物。在示例性实施例中，第一层是生物可降解水凝胶。在另一示例性实施例中，第一层和第二层是生物可降解水凝胶。

参考图1，示出了多层伤口敷料的实施例的示意图。多层伤口敷料100包括通过加速伤口的新生血管形成作为真皮模板的第一层110(本文也称为“骨架”)，并具有三维微通道结构。多层伤口敷料100还包括第二层120，其直接接触第一层，并且借助于设置在该第二层上的定向纹理130而通过引导的细胞迁移来促进自体表皮愈合，如本文进一步描述的。

第一层通常具有促进新生血管形成的多个通道，而第二层上的纹理化促进伤口敷料中的定向细胞生长。通道是直径在纳米到微米的量级之间的通路。

在一个实施例中，第二层具有与第一层相同的化学组成。第一层和第二层都不是凝胶。第一层和第二层可以是热塑性层、生物可降解层和/或生物相容层，并且可以包括本文所述的任何非凝胶聚合物。由于第一层和第二层在组成上相同，因此不需要中间层或反应层来将第一层与第二层结合。第一层和/或第二层可以是交联层。

在一个实施例中，伤口敷料可为特定患者的伤口定制。使用诸如计算机断层扫描(“CT”)扫描的图像来产生伤口位置处的患者解剖结构的三维计算机模型，包括组成伤口所在的位置中的患者皮肤的真皮/表皮连接处的微型脊和突起。利用计算机模型，第一层的与直接和第二层接触的表面相对的表面140被纹理化成具有与伤口所在的患者的真皮/表皮解剖结构互补的纹理。在第一层上产生的纹理利用物理导向引子以加速角质形成细胞对伤口的覆盖，从而进一步加速伤口的愈合过程。第一层由3D毛细结构组成，并且将用于促进皮肤愈合和/或新生血管形成。具有这种纹理的定制化第一层因此进一步促进了通过引导细胞迁移的自体真皮愈合。

在一个实施例中，一种方法包括形成聚合物材料的第一层；在所述第一层上形成与所述第一层相同的聚合物材料的第二层；并且形成与第一层相同的聚合物材料的第二层的纹理化表面，所述纹理化表面当用于伤口敷料中时用于促进定向细胞生长，其中利用增材制造工艺形成所述第一层和第二层。

在另一个实施例中，该方法还包括生成其中伤口位于其上的患者表皮的解剖结构的三维计算机模型；并且形成与第一层相同的聚合物材料的第二层的纹理化表面，纹理化表面与三维计算机模型互补。第二层是接触患者表皮的层。

多层伤口敷料的各层及其各自的纹理化表面各自使用相同的材料形成，并且一起利用增材制造工艺形成为单件。在一个实施例中，使用三维(“3D”)打印增材制造工艺将多层伤口敷料形成为三维物体。在3D打印增材制造工艺中，在计算机控制下形成连续的材料层，以基于三维计算机模型创建三维物体。三维计算机模型可以使用计算机辅助设计(“CAD”)包、3D扫描仪或通过普通数码相机和摄影测量软件来创建。

在一个实施例中，可以采用适用于3D打印的任何技术，包括但不限于使用粉末状材料基于挤出或熔融沉积和烧结的工艺。在一个实施例中，熔融沉积建模用于通过挤出硬化以形成层的材料的珠来产生三维物体。在另一个实施例中，颗粒床中的材料被选择性地熔融。该技术熔融了各层的部分，然后在工作区域向下移动，再加入另一层颗粒并重复该过程，直到块已被建成。该过程使用未熔融的介质来支撑正在生成的部分中的悬垂件和薄壁，这减少了对于该件的临时辅助支撑件的需要。然后可以使用激光将介质烧结成固体。

在另一个实施例中，可以采用适于3D打印的任何技术，包括但不限于使用粉末状材料的立体光刻、生物打印、基于挤出或熔融沉积和烧结的工艺。在示例性实施例中，采用立体光刻或生物打印喷墨3D打印工艺。

在另一个实施例中，熔融沉积建模用于通过挤出硬化以形成层的材料的珠来生成三维物体。在另一个实施例中，颗粒床中的材料被选择性地熔融。该技术熔融了各层的部分，然后在工作区域向下移动，再加入另一层颗粒并重复该过程，直到该块完成。该过程使用未熔合的介质来支撑正在生成的部件中的悬垂和薄壁，这减少了对于该件的临时辅助支撑件的需要。然后可以使用激光将介质烧结成固体。

在另一个实施例中，三维物体经由喷墨3D打印***产生。打印机通过使用喷墨式工艺在一部分的横截面中铺展一层粉末并打印结合剂来一次创建三维物体的一个层。重复该过程，直到每一层都被打印出来。因此形成连续的材料层以构建多层伤口敷料的第一和第二相应层及其各自的表面。类似地，构建连续的材料层以形成第一层的微通道结构。

在一个实施例中，伤口敷料可针对特定患者的伤口定制。使用诸如计算机断层扫描(“CT”)扫描的图像在伤口位置中产生患者解剖结构的三维计算机模型。利用计算机模型，以与伤口所在的患者解剖结构互补的尺寸和几何形状创建第一层的与第二层直接接触的表面相对的表面140。在第二层上产生的纹理利用物理导向因子加速角质形成细胞对伤口的覆盖，从而进一步加速伤口的愈合过程。具有这种纹理的定制第一层因此进一步促进了通过导向细胞迁移的自体表皮愈合。

在另一个实施例中，第一层用作“骨架”，并且通过加速新生血管形成作为真皮模板并用凝胶制成。示例性凝胶是在美国专利No.7,601,525中有详细描述的CAPGEL^TM。第二层可以直接接触或可以不直接接触第一层，并且借助于设置在该层上的定向纹理，通过引导的细胞迁移来促进自体表皮愈合。如果需要，多层伤口敷料可以包括三个、四个、五个或更多个层。在一个示例性实施例中，第一层和第二层可以都包含相同的凝胶。在另一示例性实施例中，第一层和第二层在组成上可以彼此不同。

在一个实施例中，第一层可以包括多个层，即：第一层可以包括2个或更多个初级层、3个或更多个初级层，4个或更多个初级层等等。第一层的多个层被称为初级层。因此，第一层可以包括三个初级层：第一初级层，其在第一表面上接触第二层，同时接触与第一表面相对的第二表面上的第二初级层，其中第二初级层接触在与第一初级层接触的表面相对的表面上的第三初级层。该多个层可以通过增材制造来制造。

这些层可以具有逐渐变化的物理结构，例如，第一初级层中的通道可以具有比第二初级层中的那些通道更大的横截面面积，而第二初级层中的通道可以具有比第三初级层中的那些通道大的横截面积等等。

在另一个实施例中，第一层的各层可以具有逐渐变化的化学物质：第一初级层可以具有比第二初级层更高的交联密度，第二初级层具有比第三初级层更高的交联密度。

在一个实施例中，第一层包括交联聚合物凝胶，同时第二层包括交联聚合物凝胶。两种交联聚合物凝胶都是生物相容的且可生物可降解的。生物相容性聚合物是能够嵌入生物体内而没有任何不良副作用的聚合物。经历降解的生物可降解聚合物可以被身体消耗，而没有任何不期望的副作用。在另一个实施例中，第一层包括交联的聚合物凝胶，而第二层包括热塑性聚合物。期望第一层和第二层能够共价或离子地结合在一起。第一层通常具有促进新生血管形成的通道，而第二层上的纹理化促进伤口愈合敷料中的定向细胞生长。

第一层通常包括生物可降解凝胶。在第一层使用的凝胶是稳定在流体和生物环境中的铜毛细管藻酸盐凝胶(CCAG)。在一个实施例中，通过与至少一种碳二亚胺的交联来稳定CCAG。在优选的实施例中，稳定化涉及通过加入壳聚糖或寡壳聚糖或两者的组合与形成聚电解质层压复合物(PEC)的阳离子(优选钡)交换离子。在一个实施例中，第一层可以包括多个凝胶子层。第一层可以包含两个或更多个、三个或更多个、或五个或更多个凝胶层。

在另一个优选的实施例中，第一层包含聚氨酯和聚乳酸的共聚物或聚氨酯和聚乳酸-乙醇酸的共聚物。

在一个实施例中，第一层的制造细节在Gelateized Copper-Capillary AlginateGel Functions(糊化的铜–毛细管藻酸盐凝胶功能)中作为Willenberg等人的用于干细胞移植的可注射组织骨架***(an Injectable Tissue Scaffolding System for StemCell Transplants)提供，发表在Biomaterials Science 22(2011)1621-1637的期刊中，其全部内容通过引用并入本文。

凝胶可用作生物材料骨架，以提供用于容纳、生长和/或再生生物试剂用于随后在人体或动物体内植入的结构。本发明的一个方面涉及可在第一层中使用的经改型或稳定的CCAG。CCAG包括具有连续平行微管结构的软水凝胶。有利地，稳定的CCAG能够对生长和再生的细胞和组织施加结构顺序。微管或毛细管直径(也称为微孔)能够在约3μm(微米)至约300μm的范围内。优选地，毛细管直径在约10μm至约250μm的范围内。更优选地，毛细管直径在约25μm至约30μm的范围内。

有利地，能够设计细胞形态以促进有效的细胞生长。本领域技术人员将理解，在不同的曲面处，细胞的行为不同。例如，细胞可以不同地传播和/或增殖。形态可以通过冷冻干燥技术调整到所需的形状。

毛细管直径可以以不同的凝胶水平变化，因为其是凝胶厚度的函数。目标骨架的其他物理性能也随凝胶厚度而变化。例如，随着母体凝胶厚度增加，毛细管密度降低，其中母体凝胶是指从其衍生出样品以制备稳定的第一层的最初生长的原始CCAG。平均表面积也随着母体凝胶厚度的增加而降低。

有利地，当在流体环境中使用时，稳定的CCAG具有优于单独的CCAG的优异性能。稳定的CCAG经历了溶胀的减小和更大的机械性能的维持。稳定的凝胶结构、正表面电荷和亲水特性可用于制备用于多种细胞类型的生长和再生的骨架。稳定试剂可以选自各种化合物和离子。关键是稳定剂对生长中的细胞或其周围环境无毒，或者以不会释放到周围生理环境的方式与藻酸盐凝胶结合。示例可以包括但不限于阳离子、多糖和碳二亚胺。优选地，阳离子是二价阳离子。更优选地，二价阳离子是钡离子。钡离子是对细胞有毒性的试剂的示例。然而，其在生理环境中仍然与藻酸盐凝胶结合，从而消除其毒性。可以使用任何二价离子。钙和钡也可用于稳定凝胶。

优选地，多糖是壳聚糖或寡壳聚糖。优选地，碳二亚胺选自N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺、NN'-二环己基-碳二亚胺(DCC)、N'-二异丙基-碳二亚胺、N'N'-二叔丁基碳二亚胺1(4-二乙基氨基环己基)碳二亚胺、1,3-二(4-二乙基氨基环己基)碳二亚胺、1-环己基-3-(-二乙基氨基乙基碳二亚胺和1-环己基-1-环己基-3-(2-吗啉基-(4)-乙基)碳二亚胺1-环己基-3-(4-二乙基-氨基环己基)碳二亚胺。另外，由于骨架包括潜在的可食用成分，因此它们可用作生长和再生动物细胞的合成肉制品的基础。相反，CCAG单独溶解在细胞培养环境中，并且铜离子浸出并渗透到周围环境中。

凝胶用作生物材料骨架，其在体内或体外对细胞无毒性，其中所述骨架包含藻酸盐凝胶和至少一种稳定剂；其中所述凝胶还包括多个连续的微管铜通道。虽然本公开内容讨论了铜通道，但是也可以使用铜以外的金属。本发明的组合物(例如，稳定的凝胶骨架或稳定化的凝胶第一层)能够用作生物活性剂的原位递送的载体。在本发明的组合物中掺入或作为增材包含的生物活性剂可包括但不限于药物、维生素、矿物质补充剂、用于治疗、预防、诊断、治愈或减轻疾病或病的物质、影响身体结构或功能的物质、或药物。生物活性剂能够用于例如便于将组合物植入患者体内并促进随后的整合和愈合过程。活性剂包括但不限于抗体、抗体片段、抗生素、抗真菌剂、抗菌剂、抗病毒剂、抗寄生虫剂、生长因子、神经营养因子、血管生成因子、麻醉剂、粘多糖、金属、细胞、蛋白质、多核苷酸、多肽酶、降解剂、脂质、碳水化合物、诸如药物的化学化合物和其它伤口愈合剂。这些物质可以是治疗剂、诊断材料和/或研究试剂。

可以并入或以其他方式与组合物关联的蛋白质的示例是胶原(各种类型)和纤连蛋白。组合物可以适于允许生物活性剂的延迟释放或随时间的控制释放。

在处理本发明的组合物之后，随后能够允许活细胞通过组织工程技术渗透组合物。有利地，本发明的骨架(例如，导管)的平行微管结构便于组织向内生长并且可以在植入部位或细胞培养物中渗入营养物质和/或细胞材料。营养物质也可以扩散到稳定的CCAG上以滋养在铜通道内接种的细胞。

如上所述，细胞可以接种到本发明的藻酸盐凝胶的铜通道上和/或内部。类似地，诸如软骨或神经组织之类的组织可以在植入患者体内之前与凝胶相关联。所用的细胞可以包括由外胚层、中胚层或内胚层生殖细胞层产生的那些细胞。细胞的示例包括但不限于胰岛细胞、骨细胞(如破骨细胞、成骨细胞、软骨细胞和骨细胞)、血细胞、骨髓细胞、上皮细胞、神经细胞(例如，神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞)、肌肉细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、韧带细胞、真皮细胞、成纤维细胞和牙细胞(成牙质细胞和成釉细胞)。种子细胞可以是对骨架植入的患者是自体的、同种异体的或异种的。种子细胞可以被包封或未包封。细胞可以是干细胞或祖细胞(例如任何上述分化的细胞类型的干细胞或祖细胞)或成熟的分化细胞。例如，接种在藻酸盐凝胶上和/或内部的细胞可以是造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞或其他细胞。干细胞、祖细胞或成熟细胞可进行遗传修饰或非遗传修饰。

如本文所用，术语“细胞”旨在包括原代细胞、细胞培养的细胞和细胞系细胞(例如肿瘤细胞或永生化细胞)，除非另有说明。如本领域技术人员将理解的，人体中有超过200种细胞类型。本发明的方法和组合物可以单独或组合地使用这些细胞类型中的任何一种。适用于本发明的组合物和方法的其它细胞包括由Spier R.E.等人编辑的Encyclopedia ofCell Technology(2000)，John Wiley&Sons Inc.和和Alberts B.等人编辑的MolecularBiology of the Cell(1994)，第三版，Garland Publishing Inc.，例如第1188-1189页，其全部内容通过引用并入本文。

本发明的一个实施例是带负电的CCAG第一层。优选地，尽管可以使用其它离子，例如Cd²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺，Ni²⁺、Co²⁺和Mn²⁺，但钡离子通过与骨架内和整个骨架的藻酸盐附加交联而稳定CCAG。有利地，钡稳定化骨架的孔形态在放置在流体环境中时是圆形的。本发明的另一个实施例是带正电的CCAG骨架。在另一具体实施例中，使用寡壳聚糖来稳定CCAG。寡壳聚糖和藻酸盐凝胶反应以形成围绕CCAG的内核的交联皮肤。

在另一个实施例中，与如钡的阳离子的离子交换和与形成聚电解质络合物(PEC)的至少一个静电部分的反应都用于稳定CCAG骨架。这些部分可以包括但不限于壳聚糖、其衍生物、寡壳聚糖、聚赖氨酸、碳二亚胺和乙二胺。也可以使用其它阳离子，例如Cd²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Co²⁺和Mn²⁺。有利地，细胞在带正电荷的壳聚糖表面上粘附、扩散和增殖。此外，PEC稳定化骨架可以用多个PEC层制备。优选地，存在三至五层PEC。多层CCAG的优点是提高机械完整性，并且如果用作药物的载体，则控制扩散速率的灵活性更大。

制备CCAG的方法是本领域公知的，例如由以下公开：Hassan等人的PolymerScience期刊，1991,29(11)：1645；European Polymer Journal，1988,24(12)：1173；Thiele，H.r Histolyse und Histogenese、Gewebe und ionotrope Gele、Prinzip einerStukturbildung，1967，Frankfurt：Akademische Verlagsgesellschaft；Schuberth，R.Ionotropic Copper Alginates:Investigations into the formation of capillarygels and filtering properties of the primary membrane,1992,University ofRegensburg:Regensburg。

藻酸碱盐可以衍生自棕色海藻。海藻酸盐可以衍生自例如但不限于北方海带(Laminaria hyperborea)或巨藻(Macrocystis pyrifera)。

制备钡稳定化铜毛细管凝胶的方法包括首先在去离子(DI)水中洗涤CCAG足够的时间以除去过量的未反应的铜离子，同时在搅拌下将CCAG浸没在水钡溶液中，并洗涤形成的骨架。优选地，钡溶液是Ba(OH)₂。Ba(OH)₂溶液的浓度从约0.01M至约0.1M变化，优选为约0.05M的Ba(OH)₂。浸没步骤持续一段时间足以使Ba²⁺离子扩散到CCAG上。通过观察从浅蓝绿色到深蓝色的凝胶颜色变化可以测量扩散。优选地，浸没步骤在约12至约48小时内进行。更优选地，浸没步骤在约12至约24小时内进行。任选地，钡溶液能够以周期性间隔完全交换。优选地，大约每十二小时将约0.05M Ba(OH)₂的新鲜溶液与废溶液交换。最后的洗涤步骤发生在DI水浴、生理平衡的盐溶液洗涤液或两者中。这些步骤在约13℃至约33℃之间变化的温度下进行。优选地，步骤在室温(约23℃)下进行。不良洗涤的样品在凝胶内表现出黑色层。

第一层还可以包括壳聚糖稳定的CCAG。壳聚糖是从甲壳类动物细胞制备的天然多糖，其已知具有许多有益的特质，例如生物相容性、伤口愈合特性和抗微生物特性(Otterlei，M.等人，Vaccine，1994,12：825-32；Muzzarelli，R.等人，Biomaterials，1988,10：598-603；Pappineau，A.M.等人，Food Biotechnol，1991,5：45-47；Erbacher，P.等人，Pharm Res，1998,15：1332-9；Richardson，S.C.等人，Int J Pharm，1999,178：231-43)。寡壳聚糖是小链状的，因此是低分子量的壳聚糖。有利地，寡壳聚糖在中性pH下是水溶性的。

本文所用的术语“壳聚糖”将被本领域技术人员理解为包括甲壳素或聚-N-辛酰基-D-葡糖胺的所有衍生物(包括所有不同的葡糖胺材料的聚葡萄糖胺和低聚物分子量)，其中较大比例的N-乙酰基已通过水解除去。通常，壳聚糖是由(1→4)-交联的2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖(GlcNAc，A-单元)和2-氨基-2-脱氧β-D-葡萄糖组成的阳离子、二元杂多糖家族(GlcN；D-单位)(Varum K.M.等人，Carbohydr.Res.，1991,217：19-27；Sannan T.等人，Macromol.Chem.，1776,177：3589-3600)。优选地，壳聚糖具有正电荷。可以使用壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖的盐(例如硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、盐酸盐、谷氨酸盐、乳酸盐或乙酸盐)，并且包括在术语“壳聚糖”的含义内。如本文所用，术语“壳聚糖衍生物”旨在包括通过酰基和/或烷基与壳聚糖的OH基团而不是NH₂基团键合而形成的酯、醚或其它衍生物。示例是壳聚糖的O-烷基醚和壳聚糖的O-酰基酯。改性壳聚糖，特别是与聚乙二醇缀合的壳聚糖包括在该定义中。低粘度和中等粘度的壳聚糖(例如CL113、G210和CL110)可以从各种来源获得，包括PRONOVA Biopolymer，Ltd.(UK)；SEIGAGAKU美国公司(美国马里兰州)；MERON(印度)有限公司(印度)；VANSON有限公司(美国弗吉尼亚州)；和AMS生物技术有限公司(英国)。合适的衍生物包括在Roberts，Chitin Chemistry，MacMillan Press Ltd.，London(1992)中公开的衍生物。结构变量的优化，例如用于生物活性剂的递送效率的壳聚糖的电荷密度和分子量被考虑并包括在本发明中。

优选使用的壳聚糖(或壳聚糖衍生物或盐)的分子量为1,000道尔顿以上，优选为1,000～4,000道尔顿。能够通过使用壳聚糖酶的壳聚糖的降解或通过加入亚硝酸来制备不同低分子量的壳聚糖。两种方法是本领域技术人员熟知的，并且在各种出版物(Li等人，Plant Physiol.Biochem.，1995,33：599-603；Allan和Peyron，Carbohydrate Research，1995,277：272；Damard和Cartier，Int.J.Biol.Macromol.，1989,11：297-302)。优选地，壳聚糖是水溶性的，并且可以通过脱乙酰化由几丁质生成至大于40％，优选50％至98％，更优选70％至90％的程度。

制备壳聚糖稳定的CCAG的一种方法包括：在去离子(DI)水浴中洗涤CCAG以除去任何过量的铜离子；通过使溶液通过微管结构流过CCAG而使壳聚糖溶液与CCAG接触；以及将所得到的稳定的骨架在溶液中洗涤以除去任何未粘合或过量的壳聚糖。可以省略一个洗涤步骤。壳聚糖溶液的浓度可以在约0.1w/v％至约3w/v％之间变化。优选地，壳聚糖溶液的浓度为约0.2w/v％至约2w/v％。更优选地，溶液的浓度为约2w/v％。有利地，溶液的溶剂可以是水或乙酸。

任选地，接触步骤和第二洗涤步骤可以重复，交替藻酸盐和壳聚糖或寡壳聚糖溶液以在骨架上产生多层PEC。优选地，接触步骤和第二洗涤步骤重复约三到五次以产生三至五层CCAG。换句话说，第一层可以包含两层或更多层凝胶，其含有促进新血管形成的通道

制备由钡和壳聚糖稳定的CCAG第一层的一种方法涉及：将DI水中的原始CCAG洗涤足够的时间以除去过量的未反应的铜离子；在搅拌的同时将CCAG浸没在钡水溶液中；洗涤所得到的骨架；使壳聚糖溶液与钡稳定的CCAG接触；并进行第三次洗涤以除去任何未结合或过量的壳聚糖。再次，可以省略一个或两个洗涤步骤。

第二层可以包括与第一层的组成相似的生物可降解的凝胶。生物可降解的凝胶可以由天然聚合物(即明胶或胶原蛋白)或合成的非天然聚合物组成。合成的生物可降解水凝胶的示例包括聚乙二醇(PEG)嵌段共聚物，其包括聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己内酯(PCL)或它们的组合。第二层还可以包括与可由细胞分泌物例如基质金属蛋白酶(MMP)可降解的可酶降解的肽序列交联的水凝胶。MMP-2和MMP-9在伤口环境中是普遍存在的。在另一个实施例中，第二层可以包括能够与第一层离子或共价反应的可生物可降解的热塑性材料。在另一个实施例中，第二层与第一层相容并且不需要化学反应性键合。

热塑性生物可降解聚合物的合适示例是聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、聚氨酯和聚乳酸-乙醇酸的共聚物、聚氨酯、聚己内酯(PCL)、聚乳酸-乙醇酸和聚己内酯的共聚物(PCL-PLGA共聚物)、聚羟基丁酸酯-戊酸酯(PHBV)、聚原酸酯(POE)、聚环氧乙烷-对苯二甲酸丁二醇酯(PEO-PBTP)、聚-D、L-乳酸-对-二恶烷酮-聚乙二醇嵌段共聚物(PLA-DX-PEG)等，或包含至少一种前述生物可降解聚合物的组合。这些聚合物能够被进行表面处理以促进与明胶层的共价或离子键合。这可能涉及用电离辐射、电子束辐射、X射线辐射或用强酸(盐酸、硝酸、硫酸等)表面处理热塑性可生物可降解材料以含有反应性基团如伯胺和羧酸。

也可以使用生物相容但不可生物降解的其它热塑性聚合物。示例包括聚四氟乙烯或聚有机硅氧烷。用于第一层和第二层的优选聚合物是上述生物可降解聚合物。

第二层具有设置在至少一个表面上的纹理。第二层的有纹理的表面不接触第一层。纹理促进沿着由纹理取向确定的特定方向的细胞生长。

第二层可以具有任何种类的纹理。表面纹理的示例在Spath的US 20050003146A1、Brennan等人的US 7143709B2以及Brennan等人的具有序列号12/550,870的专利申请中有详细描述，其全部内容通过引用整体并入本文。

第二层的至少一个表面包括多个间隔的特征；所述特征被布置成多个分组；特征的分组相对于彼此布置，以便在沿第一方向观察时限定曲折路径。当沿第二方向观察时，特征的分组被布置成限定线性路径。也可以使用径向图案。在径向图案中，图案从焦点发出并沿径向向外扩展。

在一个实施例中，当沿第二方向观察时，特征之间的路径可以是非线性的和非正弦的。换句话说，通路可以是非线性和非周期性的。在另一个实施例中，特征之间的路径可以是线性的，但是具有变化的厚度。多个间隔的特征可以从表面向外突出或突出到表面中。在一个实施例中，多个间隔的特征可以具有与表面相同的化学成分。在另一个实施例中，多个间隔的特征可以具有与表面不同的化学成分。

多个特征各自具有至少一个微量级(微米或纳米尺寸)的尺寸，并且具有至少一个相邻特征，该至少一个相邻特征具有基本上不同的几何形状。相邻特征之间的平均第一特征间距在表面的至少一部分中在10纳米至100微米之间，其中所述多个间隔的特征由周期函数表示。在一个实施例中，在表面的至少一部分中，第一特征间距在0.5微米(μm)至5μm之间。在另一个实施例中，在所述表面的至少一部分中，第一特征间距为15至60μm。如上所述，周期函数包括两个不同的正弦波。在一个实施例中，地形类似于鲨鱼皮肤的形貌(例如，Sharklet微形态学)。在另一个实施例中，图案包括设置在表面的一部分上的至少一个多元素平台层，其中平台层的元件之间的间隔距离提供第二特征间距；所述第二特征间距与所述第一特征间距相比显著不同。应当注意，多个特征中的每个特征彼此分离并且不彼此接触。

通过曲折路径将纹理的图案与相邻图案分开。曲折路径可以由周期函数表示。每个曲折路径的周期函数可能不同。在一个实施例中，能够通过可由两个或更多个周期函数表示的曲折路径将图案彼此分开。周期函数可以包括正弦波。在示例性实施例中，周期函数可以包括两个或更多个正弦波。

在另一个实施例中，当多个不同的曲折路径分别由多个周期函数表示时，相应的周期函数可以被固定的相位差分开。在另一个实施例中，当分别由多个周期函数表示多个不同的曲折路径时，各个周期函数可以由可变相位差分开。

在一个实施例中，多个间隔开的特征具有基本平坦的顶表面。在另一个实施例中，多元素平台层能够设置在表面的一部分上，其中所述平台层的元件之间的间隔距离提供第二特征间距；当与第一特征间隔相比时，第二特征间距基本上不同。

在一个实施例中，由两个相邻分组共享的多个特征的和等于奇数。在另一实施例中，由两个相邻分组共享的多个特征的和等于偶数。纹理的细节(以图的形式)可以在Brennan等人的序列号为12/550,870的专利申请中看到，其全部内容通过引用整体并入本文。

在一个实施例中，在制造多层伤口敷料的一种方法中，首先将可转化为凝胶的前体溶胶置于模具中。凝胶优选是明胶。前体溶胶含有在最初固化时产生上述凝胶的前体。初始固化步骤部分固化溶胶以产生凝胶。明胶的初始交联用EDC(学名：N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(学名为N-羟基琥珀酰亚胺)的溶液进行。

模具壁含有所需的表面纹理，并且在最初固化时赋予凝胶至少一个表面的纹理。在成型期间，可以增加模具的温度和模具中的压力以赋予凝胶强度。温度约束似乎非常敏感，以避免图案的气泡/中断。该过程中所涉及的温度/pH也在生理温度的范围内，我们认为其可能会引入额外的生物活性蛋白质/分子。

当被放置在模具中时，使溶胶固化以形成具有一个或多个纹理化表面的凝胶。该层与纹理是第二层。在一个实施例中，两个或更多个表面可以被纹理化。在另一个实施例中，三个或更多个表面可以被纹理化。在另一个实施例中，所有表面可以被纹理化，包括接触第一层的表面。与第一层接触的表面的纹理化可以促进和改善第一和第二层之间的机械粘合，而不使用共价键或离子键。

如上所述，第二层不必包含凝胶。其可以由热塑性可生物可降解的聚合物制造，并且在这种特殊情况下，不需要第二层的固化。

在另一个实施例中，在制造第二层的另一种方法中，首先通过毛细管装置或装有针的注射器挤出凝胶来制造凝胶珠。所述珠具有上面公开的内部通道。将凝胶挤出成包含质地的模具。凝胶不一定是珠的形式。其可以包括凝胶的不规则形状的部分。将纹理转移到凝胶表面以形成第二层。

在纹理化和初始固化第二层之后，将溶胶的薄液体层设置在初始固化的凝胶(第二层)上，以促进第二层与第一层的结合。在该另一初始固化凝胶层(第一层)之后可以如上所述制造，并且然后设置在第二层上。然后使用溶胶的液体层将第二层接合到第一层。第一层的表面通常是非纹理化的，但如果需要，可以是纹理化的。

现在彼此接触的第一和第二层可以使用另一种EDC/NHS溶液结合在一起以形成固体双层设备。固体双层设备可以用作伤口敷料。

在一个实施例中，多层装置可以设置在伤口中或伤口上。细胞将开始在第一层中的微孔中并沿着由第二层中的纹理提供的表面纹理生长。由于多层伤口敷料中的一层或多层是生物可降解的，因此孔和通道的取向促进了初始细胞生长的发展，并且当生物可降解材料开始分解时，这些初始细胞进一步用作用于进一步细胞生长的模板。

通过在每个层中具有多个具有不同微孔取向的不同层，可以获得多个细胞层，每个细胞层具有不同的取向，使得愈合区域明显比其在伤口发生之前更强。另外，通过选择用于纹理以及各层中的微孔的不同长宽比，新细胞的长宽比也可以改变以改善愈合过程。

不同种类的细胞可以选自包括以下构成的组：胚胎干细胞、成体干细胞、胚细胞、克隆细胞、受精卵、胎盘细胞、角质形成细胞、基底表皮细胞、毛干细胞、毛根皮细胞、表面上皮细胞、基底上皮细胞、尿上皮细胞、唾液腺细胞、粘液细胞、浆液细胞、von Ebner's腺细胞、乳腺细胞、泪腺细胞、宫颈腺细胞、外分泌汗腺细胞、分泌汗腺细胞、Moll腺细胞、皮脂腺细胞、Bowman腺细胞、Brunner腺细胞、精囊细胞、***细胞、球囊腺细胞、Bartholin腺细胞、Littré腺细胞、子宫内膜细胞、呼吸道或消化道的杯状细胞、胃粘膜细胞、胃腺的酶原细胞、胃腺的泌酸细胞、产生胰岛素的β细胞、产生胰高血糖素的α细胞、产生生长抑素的δ细胞、胰腺多肽产生细胞、胰腺导管细胞、小肠Paneth细胞、肺的II型肺细胞、肺的Clara细胞、垂体前叶细胞、中间垂体细胞、垂体后叶细胞、肠道或呼吸道的激素分泌细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾上腺细胞、性腺细胞、肾脏的肾小球细胞、肾脏的黄斑细胞、肾脏的肾周细胞、肾小球系膜细胞、肠道刷状缘细胞、外分泌腺的纹管细胞、胆囊上皮细胞、肾脏的近端小管的刷状缘细胞、肾脏的远端肾小管上皮细胞、输精小管的无纤毛细胞、附睾主细胞、附睾基底细胞、肝细胞、脂肪细胞、I型肺细胞、胰管细胞、汗腺的无横纹管细胞、唾液腺的无横纹管细胞、乳腺的无横纹管细胞、肾小球壁细胞、肾小球足细胞、亨利环循环细胞、收集管细胞、精囊导管细胞、***导管细胞、血管内皮细胞、滑膜细胞、浆膜细胞、衬在耳廓外淋巴隙的鳞状细胞、衬在耳廓淋巴隙的细胞、脉络丛神经细胞、蛛网膜下腔鳞状细胞、眼睫状上皮细胞、角膜内皮细胞、具有推进功能的纤毛细胞、成釉细胞、耳前庭器官的半球形细胞、Corti器官的***、成纤维细胞、血液通道的周细胞、椎间盘的髓核细胞、成牙骨质细胞、牙骨质胶质细胞、成牙质细胞、牙质细胞、软骨细胞、成骨细胞、骨细胞、骨祖细胞、眼玻璃体的玻璃体细胞、耳外淋巴隙的星形细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、肌上皮细胞、红细胞、巨核细胞、单核细胞、***巨噬细胞、Langerhan's细胞、破骨细胞、树突状细胞、小胶质细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、浆细胞、辅助T细胞、抑制T细胞、杀伤T细胞、免疫球蛋白M、免疫球蛋白G、免疫球蛋白A、免疫球蛋白E、杀伤细胞、杆细胞、锥细胞、Corti器官的内毛细胞、Corti器官的外毛细胞、耳前庭器官的I型毛细胞、耳前庭器官的II型细胞、II型味蕾细胞、嗅觉神经元、嗅觉上皮基质细胞、I型颈动脉体细胞、Ii型颈动脉体细胞、Merkel细胞、专门用于触摸的初级感觉神经元、专门用于温度的初级感觉神经元、专门用于疼痛的初级神经元、本体感觉性初级感觉神经元、自主神经***的胆碱能神经元、自主神经***的肾上腺能神经元、自主神经***的肽能神经元、Corti器官的内支柱细胞、Corti器官的外支柱细胞、Corti器官的内指骨细胞、Corti器官的外指骨细胞、边缘细胞、Hensen细胞、前庭装置的支持细胞、味蕾的支持细胞、嗅上皮的支持细胞、施万细胞、卫星细胞、肠神经胶质细胞、中枢神经***的神经元、中枢神经***星形胶质细胞、中枢神经***少突胶质细胞、前晶状体上皮细胞、晶状体纤维细胞、黑素细胞、视网膜色素上皮细胞、虹膜色素上皮细胞、卵原细胞、***、***细胞、***、卵泡细胞、塞尔托利氏细胞和胸腺上皮细胞、或其组合。

在以下非限制性实施例中公开了双层设备和制造方法。

示例1

通过低靠负硅晶片模具浇注聚二甲基硅氧烷弹性体(Xiameter RTV-4232-T2，DowCorning；PDMSe)来制备平滑(SM)和微图案化(+1.7SK2x2)样品。将圆形样品(d＝20mm)粘附到具有与细胞迁移方向平行排列的特征的12孔板上，并用纤连蛋白(15μg/mL经夜)处理以促进细胞附着。沿着样品的中心放置SM PDMSe矩形(5mm×20mm)，以产生修改的刮擦测定。将人表皮角质形成细胞(HEK)以1×10 4个细胞/cm2接种在整个构型上，并保持在完全角化细胞生长培养基(真皮细胞基础培养基，0.4％牛垂体提取物，0.5ng/ml rh TGF-α，6mM L-谷氨酰胺，100ng/ml氢化可的松，5μg/ml胰岛素，1μM肾上腺素，5μg/ml载脂蛋白转运蛋白，50U/ml青霉素/链霉菌素和1μg/ml Fungizone抗真菌剂)。在约70％汇合处，去除PDMSe矩形以允许细胞迁移穿过空的图案化区域。通过光学显微镜监测迁移，直到第7天，样品用CellTracker Orange染色并固定。拍摄受伤区域的荧光显微镜图像，并使用ImageJ软件计算该区域内细胞覆盖的平均面积。

这里采用的命名法(例如，+1.7SK2x2)应译解如下：+1.7表示纹理高于基面的高度，而SK是指在Brennan等人的US 7143709 B2以及Brennan等人的具有序列号12/550,870的专利申请中描绘和描述的Sharklet图案。1.7之前的负号(-)表示纹理低于基面。SK2x2中的第一个2表示图案中每个特征的宽度，而第二个2表示图案中的要素之间的间距。

基于先前报告的结果，Sharklet微图案(表1)已经被设计在两个尺寸尺度(例如，5-μm和50μm的间距)上，这表明这些尺寸的通道增强了再上皮化，并且再现了天然表皮-真皮连接处的纹理。各种纵横比(即，地形高度与地形宽度的比率)将允许我们优化用于引导细胞迁移和新组织形成的微影像学高度。图2示出了a)和b)为在SM(光滑)表面和SK(+1.7SK2x2)(Sharklet)表面上培养的HEK，用于肌动蛋白(白色)和核(蓝色)染色。染色显示了SK上的接触引导(箭头表示图案方向)。刻度棒，50μm。c)改型的刮伤试验的结果显示，在SK上，在3天之后，受伤区域内的细胞覆盖范围相对于SM增加了33％；

表1.待测试的Sharklet微图。

使用与上述相同的测定法测试在生物可降解明胶材料中复制的新设计的Sharklet^TM图案的初步结果显示，在增加的特征尺寸和纵横比的情况下细胞迁移和伤口闭合率显著增加(图3)。图3示出了在生物可降解材料中复制的Sharklet^TM图案表明了与光滑表面相比增加的细胞迁移和伤口闭合率。改型的刮伤试验的结果显示，在+1SK10x5和+10SK50x50上，在4天之后，受伤区域内的细胞覆盖范围分别相对于光滑表面提高了46％和64％。

示例2

随着对伤口愈合的复杂性的了解的发展，伤口敷料市场相应地增长。替换失去的皮肤的要求很大程度上取决于伤口的类型和程度，因为损伤导致皮肤结构的损失程度不同。表面伤口导致皮肤或表皮的最外层的损失。该层保持皮肤的屏障功能，并且主要由称为角质形成细胞的上皮细胞组成。在更严重的损伤中，表皮层和部分或全部真皮的损失(例如，分别为部分或全部的伤口)导致需要更换或重建两种重要组织类型以恢复皮肤完整性。真皮是造成皮肤机械性能的***。其主要由成纤维细胞及其相关的细胞外基质(ECM)组成。皮肤伤口愈合在四个精确整合的阶段中进行：止血；炎症；增殖和重塑。为了成功愈合伤口，所有四个阶段必须按照正确的顺序和时间进行。Sharklet微图案、全层伤口治疗将是首次可用的敷料，其同时加速增殖期的两个关键步骤：血管化和再上皮化。

血管化或伤口床中新血管的形成促进肉芽组织的形成，这为再上皮化提供了基础。新皮肤细胞的再上皮化或伤口的覆盖是伤口愈合的最佳功能和美学效果。

响应于下面基底的物理特性细胞的取向和极化(即伸长)被称为接触引导。这种现象是血管生成(新血管形成)和细胞迁移的重要调节因素。物理引导的能力通过双层的、Sharklet微图案伤口敷料加速伤口床的血管化以及伤口表面的覆盖。第一层将由CAPGEL^TM(一种可注入的基于藻酸盐的材料)组成，该材料通过自组装形成规则有序的、可调谐的各向异性通道。已经显示了在CAPGEL^TM内形成的3D微通道结构(见图4)以支持大鼠心肌梗塞模型中的血管浸润。还已经表明，全层创伤之后的皮肤血运重建通过血管从伤口边缘向内生长通过先前形成的通道进行。据认为，甚至注射入最复杂的全层伤口床中的液体CAPGEL^TM可能够成将促进新生血管形成和肉芽组织形成的双层敷料的基础。

由CAPGEL^TM技术产生的真皮基础将加速伤口敷料的顶端Sharklet微图案表面上的表皮愈合。角质形成细胞对伤口的覆盖或再上皮细胞化被认为是伤口愈合成功的标志。角质形成细胞的增殖和迁移的再上皮化在损伤后72小时内开始并持续约14天。在增殖愈合阶段，细胞迁移是愈合过程的有价值的元素。Sharklet微图案使用在顶层的接触引导来主动地取向迁移的方向和速度，以可预测地加速伤口闭合。结果，早期再上皮化将不仅降低感染风险和降低患者的疼痛，而且还会引发下层肉芽组织的重塑，这从而降低了肥大性瘢痕形成的可能性。在没有创新的全层伤口护理敷料的情况下，真皮基底层的组织结构和由真皮成纤维细胞产生的细胞外基质(ECM)纤维的组织分别从伤口边缘引导成纤维细胞和上皮细胞迁移。事实上，天然皮肤中的真皮/表皮连接处并不平坦，而是由一系列微尺度的脊和突起构成。这些物理因子调节角质形成细胞的成熟、分化和功能，继而也是组织机构和皮肤结构完整性所必需的。可以综合利用这些原理来更有效地实现类似的结果，例如，150μm深和50μm宽的简单通道增强了再上皮化速率，并导致类似于在无细胞真皮上培养的相同细胞实现的组织结构。同样，间隙为1μm至10μm、深度为1μm和5μm的微槽增强了单个上皮细胞和完整上皮组织细胞的直接迁移。这表明微形貌直接导致细胞迁移，无论存在于伤口边缘的物理因子是生物还是非生物的。因此，Sharklet微图案敷料将通过引导顶端细胞增殖和迁移来增强伤口愈合环境，以实现快速的表皮伤口闭合，同时还引导下层真皮内的细胞侵袭和毛细血管生长。

示例3

将来自HEK迁移测定的表现最好的Sharklet微图案(+10SK50x50)放大至用于伤口敷料的适当尺寸，并在大鼠中建立的延迟愈合模型中进行测试，以验证广泛范围的非愈合/慢性伤口的愈合行为。伤口敷料原型的顶层按照上述相同的程序产生以制备明胶水凝胶。然后将溶液填充的模具用1小时冷却至4℃以固化明胶。接下来，如前所述合成2ml的CAPGEL^TM浆料，并将其装入固体明胶顶部的PDMSe模具(d＝20mm)中。将顶部明胶层和基底CAPGEL^TM层用0.6M EDC和0.2M NHS的溶液在PBS中在4℃下化学交联18小时。将硅胶模具从构建体中取出，并使用6-mm活检冲头制备适当尺寸的敷料。然后将敷料在PBS中洗涤1小时，然后在24小时的过程中将10x盐酸柠檬酸钠(SSC)(20x SSC，Fisher BioReagants，用去离子水稀释至10x)进行三次更换。最后，在24小时的过程中用三次生理盐水洗涤敷料，然后在最终PBS冲洗之前通过在Minncare Sterilant(3％的去离子水溶液)(Mar Cor，PlymouthMN)中浸泡10分钟灭菌和植入。

所有的动物实验都是根据佛罗里达大学动物护理和使用委员会批准的方案进行的，并符合国家卫生研究院(NIH)发布的“实验动物护理和使用指南”中的标准。经适当的麻醉之后，刮去20只体重～250-300g的雄性Sprague-Dawley大鼠的背部面，并将矩形模板对中于肩胛骨的基部与髂嵴之间的脊柱上。该模板被用于构形四个圆形孔的放置和垂直组织瓣切口的放置。在相应的标记上使用6-mm活检穿孔器来创建四个全层伤口。将这些正常的皮肤穿孔器固定在10％的中性缓冲***中以供后续分析。为了创建短暂性脑缺血的病症，沿着模板的侧面切割出两条平行的线性切口。所产生的皮瓣被提升以切断下面的脉管***、在每个侧面重新定位和装订。四种敷料中的每一种：1)具有组合的CAPGEL^TM新血管生成技术的新颖双层Sharklet微图案顶层，2)具有CAPGEL^TM的光滑顶层，3)Endoform，目前临床上用作商业竞争者的真皮模板和4)没有治疗。内皮真皮模板由天然衍生的羊胶原蛋白ECM组成。所有伤口都用可压缩的二次敷料覆盖，并且用Vetrap(3M)覆盖。

在手术后第7、10和14天，对大鼠(N＝6)进行安乐死。术后第28天对两只老鼠也进行安乐死，以定性观察敷料降解的程度。使用8mm的活检穿孔器收集组织活体，将组织活体固定在10％的中性缓冲***中，包埋在石蜡中，切片并用苏木精和伊红(H&E)或Masson's Trichrome染色。组织学伤口切片由兽医病理学家评估，由美国兽医病理学家学会认证，用于使用已建立的半定量组织学评分量表(表2)的敷料位置、再上皮化、急性和慢性炎症、肉芽组织形成和新血管形成。分析结果以评估增强伤口愈合环境的每种治疗的临床相关结果，例如上皮覆盖、血管形成和整体伤口愈合，综合得分包括所有测量结果。

缺血性伤口模型

创伤后7天大鼠皮肤的H&E染色切片的代表性显微照片的定性评估(图5b)与未处理的对照相比显示了双层敷料治疗伤口的愈合结果改善的迹象。一般来说，未治疗的伤口与未受伤的皮肤相比表现出较高的收缩水平，不完全的再上皮化和真皮结构的差异(图5c)。两种双层敷料结构都显示出与未经治疗或Endoform治疗的伤口相比更完整的再上皮化，减少了挛缩，并且更接近模仿天然皮肤的真皮再生(图5d和5e)。用Endoform(一种临床上可用的真皮模板敷料)治疗的伤口在第7天(图5f)比利用双层结构敷盖的伤口显示出更高的收缩水平、不完全上皮化和肉芽组织形成的量和成熟度减少。

来自组织学分级的半定量伤口愈合评分显示，与未治疗的伤口相比，双层结构改善整体愈合，并且这些改善与在Endoform-治疗的伤口上测量的改善没有统计学差异(图6a)。复合伤口愈合评分包括敷料位置、再上皮化、急性和慢性炎症、肉芽组织形成和新生血管形成的评估。与无治疗相比，受伤后在7天(22％增加，p≤0.05)、10天(32％增加，p≤0.001)和14天(31％增加，p≤0.05)，所有敷料、光滑、Sharklet图案和Endoform均显示出复合平均伤口愈合评分增加。再上皮化的评估显示组间无明显差异(图6b)。新生血管形成的平均伤口愈合评分显示所有治疗组比无治疗阴性控制增加，但治疗组间差异不明显。在10天(14％，p≤0.05)和14(29％，p≤0.001)后(图6c)，与无治疗控制相比，敷料导致每个高功率视野(40倍放大)更多的血管。伤口28天后大鼠皮肤的H&E染色切片的定性观察(N＝2)表明双层水凝胶敷料在这段时间内在体内降解(图7)。

表2.定量伤口愈合组织学评分***。

图5显示了受伤7天后大鼠皮肤的H&E染色切片的代表性显微照片。a)在未受伤控制的大鼠皮肤中表皮的结构。b)在未受伤控制的大鼠皮肤中真皮的结构。c)表示无治疗组上的受伤区域。与天然皮肤相比，这些伤口表现出更高的收缩水平、不完全的上皮覆盖和真皮结构的差异。d)表示使用平滑敷料处理的皮肤上的受伤区域。在该图像中，敷料未完全并入表皮下(评分2)，上皮化不完全，并且真皮结构与未受伤皮肤不一致。e)显示用Sharklet敷料处理的皮肤上的伤口区域。这些伤口表现出完全的再上皮化，与没有治疗或Endoform-治疗的伤口相比减少的挛缩和更接近模仿天然皮肤的真皮结构。f)表示使用Endoform处理的伤口区域，Endoform是临床上可用的真皮模板敷料。用Endoform治疗的伤口在第7天显示出比使用双层结构更高的收缩水平，不完全的上皮形成和肉芽组织形成的量的减少和成熟。

图6示出了组织学伤口愈合评分。a)平均整体伤口愈合评分复合物，包括敷料位置分级、再上皮化、急性和慢性炎症、肉芽组织形成和新生血管形成。所有敷料类型相对于无治疗显示出明显改善的愈合。对于所有敷料而言，相对于无治疗统计学上的显著提高被报告，该提高在各组之间无显著差异。b)平均再上皮化评分表明各治疗组之间无显著差异。c)平均新生血管形成结果显示，相对于无治疗，在利用敷料治疗的伤口中形成的新血管数量较多，但是在敷料类型之间没有显著差异。总体改善的愈合相对于无治疗以及相当于标准护理治疗(即Endoform真皮模板)的结果显示了对于双层伤口敷料结构改善愈合结果的潜力。

图7包括在受伤28天后大鼠皮肤的H&E染色切片的代表性显微照片。这些图像在质量上示出了双层水凝胶敷料在体内在28天内完全降解。箭头表示只有一小块敷料留在植入有Sharklet图案敷料的伤口的组织中。在利用平滑的双层敷料治疗的伤口中没有可见的敷料。

应当理解，虽然已经结合本发明的优选具体实施例描述了本发明，但是前面的描述以及随后的实施例旨在说明而不是限制本发明的范围。在本发明的范围内的其它方面、优点和修改对于本发明所属领域的技术人员将是显而易见的。

Claims (12)

1.一种多层伤口敷料，该多层伤口敷料包括：

第一层，所述第一层包括促进伤口的新生血管形成的通道；以及

与所述第一层接触的第二层，所述第二层具有与所述第一层相同或不同的化学组分；其中所述第二层包括具有纹理的至少一个表面，所述纹理包括多个间隔的特征；其中每个特征具有与相邻特征实质不同的几何形状；所述多个间隔的特征被布置成多个分组，每个分组内的所述间隔的特征间隔开10纳米至200微米的平均距离；特征的相邻分组彼此间隔开以限定中间曲折路径；操作所述纹理的方向以促进细胞的定向和生长，其中，所述第二层的纹理表面不与第一层接触。

2.根据权利要求1所述的多层伤口敷料，其中所述第一层包括具有与所述伤口所在的患者解剖结构互补的纹理的表面。

3.根据权利要求1或2所述的多层伤口敷料，其中所述第一层和所述第二层是可生物降解层。

4.根据权利要求1或2所述的多层伤口敷料，其中所述第一层包括在流体和生物环境中稳定的铜毛细管藻酸盐凝胶。

5.根据权利要求3所述的多层伤口敷料，其中所述第一层包括在流体和生物环境中稳定的铜毛细管藻酸盐凝胶。

6.根据权利要求4所述的多层伤口敷料，其中所述铜毛细管藻酸盐凝胶是通过钡离子稳定化的。

7.根据权利要求4所述的多层伤口敷料，其中所述铜毛细管藻酸盐凝胶是使用Cd²⁺、Cu^{2 +}、Ca²⁺、Ni²⁺、Co²⁺和Mn²⁺稳定化的。

8.根据权利要求1所述的多层伤口敷料，其中所述第一层和所述第二层包括聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、聚己内酯（PCL）、聚乳酸-乙醇酸和聚己内酯的共聚物（PCL-PLGA共聚物）、聚羟基丁酸酯-戊酸酯（PHBV）、聚原酸酯（POE）、聚环氧乙烷-对苯二甲酸丁二醇酯（PEO-PBTP）、聚-D,L-乳酸-对-二恶烷酮-聚乙二醇嵌段共聚物（PLA-DX-PEG）或包含至少一种上述聚合物的组合。

9.根据权利要求1所述的多层伤口敷料，其中所述第一层和所述第二层包括聚氨酯和聚乳酸的共聚物或聚氨酯和聚乳酸-乙醇酸的共聚物。

10.一种方法，所述方法包括：

形成聚合物材料的第一层，所述第一层包括促进伤口新生血管形成的通道；

在所述第一层上形成与所述第一层相同的聚合物材料的第二层；以及

将第二层的表面纹理化，其中，所述纹理包括多个间隔的特征；其中每个特征具有与相邻特征实质不同的几何形状；所述多个间隔的特征被布置成多个分组，每个分组内的所述间隔的特征间隔开10纳米至200微米的平均距离；特征的相邻分组彼此间隔开以限定中间曲折路径，操作所述纹理的方向以促进细胞的定向和生长，其中，所述第二层的纹理表面不与第一层接触。

11.根据权利要求10所述的方法，其中使用三维打印增材制造工艺形成所述第一层和所述第二层。

12.根据权利要求11所述的方法，还包括：

产生伤口所在的患者表皮的解剖结构的三维计算机模型；以及

在第一层上形成纹理化表面，所述纹理化表面与三维计算机模型互补。

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