CN107841489B

CN107841489B - 撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体K179M

Info

Publication number: CN107841489B
Application number: CN201711123463.7A
Authority: CN
Inventors: 祝连彩; 撖菁萱; 姚恺怡; 唐士金; 王伯初; 季顺林; 娄德帅; 谭君
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2017-11-14
Filing date: 2017-11-14
Publication date: 2020-02-18
Anticipated expiration: 2037-11-14
Also published as: CN107841489A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种撒丁岛梭菌7α‑羟基类固醇脱氢酶突变体K179M，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，是核酸序列为SEQ ID NO：1的7α‑羟基类固醇脱氢酶的第179位氨基酸由赖氨酸变为甲硫氨酸所得。该突变体对TCDCA的催化比活力是野生型的2.9倍。本发明的K179M突变体在生物转化TCDCA获得TUDCA的工业生产过程中具有巨大的应用潜力。

Description

撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体K179M

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体K179M。

背景技术

羰基的不对称还原一直是化学反应研究的热点之一。虽然目前化学方法已经取得了一定的成果，但是化学方法往往存在催化剂种类和数目有限、立体选择性不高、辅助试剂昂贵且不易回收等缺点。而酶促反应不仅具有高效性、化学选择性、区域选择性还具有高度的立体选择性。羟基类固醇脱氢酶(Hydroxysteroid dehydrogenase，HSDH)介导的酶促反应具有相对严格的立体选择性和“不严格”的底物特异性。例如，早在二十世纪八十年代初科学家就已经开始尝试利用微生物产生的7α-、7β-HSDH联合差向异构转化鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid，CDCA)合成熊去氧胆酸(Ursodesoxycholic acid，UDCA)，转化的过程如图1所示。而游离酶还可以催化结合态胆汁酸——牛磺鹅去氧胆酸(Taurochenodeoxycholic acid，TCDCA)转化为牛磺熊去氧胆酸(Tauroursodeoxycholicacid，TUDCA)。

HSDH的底物不仅仅局限在甾体类化合物，文献报道HSDH还可以催化烷基取代单环酮类、二环酮类等物质的羰基不对称还原。HSDH所具有的优秀催化品质决定了其在生物转化领域具有较大应用潜力。然而，活性更高的HSDH改造体是其在生物转化领域进一步应用的基本保障。近年来，科研人员逐渐认识到了7α-、7β-HSDH在生物转化领域所具有的巨大应用潜力。目前，本领域现存的7α-HSDH共有5个，它们分别来自于Bacteroidesfragilis、Clostridium scindens、Clostridium sordellii、Clostridium absonum和Escherichiacoli。上述双酶偶联构建的生物转化体系不但克服了辅酶循环难题，还实现了氧化、还原“一锅式”进行特定化学区域的羟基差向异构。

酶的热稳定性较低是限制其工业应用的主要因素之一，因此，如何提高酶活及酶稳定性，并开发一种酶活和稳定性都很好的酶，是本领域目前急需解决的问题。

发明内容

为满足上述领域存在的需求，本发明提供一种撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶(CA7α-HSDH)突变体，具有更高的催化效率，可用于多种底物的生物转化，在工业生产中有巨大的应用价值。

本发明请求保护的技术方案如下：

一种提高野生型撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶的酶活及稳定性的方法，其特征在于，将所述野生型撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶第179位的赖氨酸突变为甲硫氨酸。

所述野生型撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；进行所述突变后得到的撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶酶突变体的酶活及稳定性相较所述野生型撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶显著提高。

一种撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体K179M，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

编码所述的撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体K179M的基因。

所述基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

一种表达盒，其包含所述的基因。

一种载体，其包含所述的基因，和/或所述的表达盒。

一种重组细胞，其包含所述的基因，和/或所述的表达盒，和/或所述的载体。

一种催化剂，其特征在于，其有效成分包含所述的撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体K179M。

所述催化剂还包括与所述的撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体K179M同时使用时能够提高酶催化效率或增加酶稳定性的其它试剂。

一种实现化学物质的羰基不对称还原的方法，其特征在于，使用所述的撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体K179M，和/或所述的催化剂与反应底物在20-50℃、pH 6.0-11.0条件下进行催化反应。

本发明的第一个方面提供一种提高野生型撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶的酶活及稳定性的方法，其特征在于，将所述野生型撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶第179位的赖氨酸突变为甲硫氨酸。

在具体的实施例中，所述野生型撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；进行所述突变后得到的撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶酶突变体的酶活及稳定性相较所述野生型撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶显著提高。

本发明第二个方面请求保护一种撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶(CA 7α-HSDH)突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的7α-HSDH的第179位氨基酸由Lys变为Met所得。

本文中的“突变体”指的是酶的突变体，即突变后的酶，也可以叫“突变酶”，是本领域的常规叫法。具体指，对某一个酶的单位点进行人工改造后的改造体，并不是指携带此突变酶的菌体或其它生物体。

本发明通过将野生型撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶179位的赖氨酸(K)突变为了甲硫氨酸。即改变了1个氨基酸残基，使酶的活性及稳定性均得到了显著提升。本领域知道，对于一段具有功能的蛋白序列，删减、增加、或改变1个或若干个氨基酸，蛋白功能可能保持不变；然而，酶经过自然选择和进化，其结构和功能相对已处于较优化状态。删减、增加、或改变1个或若干个氨基酸残基，其功能能保持或提高的几率并不高。本发明对野生型撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶进行了100余个突变和残基删除，活性提高的也仅有3个，其中包括本发明的所述酶突变体，并且本发明请求保护的酶突变体在酶的性能品质方面表现最好。

另一方面，本发明还请求保护编码上述撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶CA 7α-HSDH突变体的基因。

进一步地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本领域清楚，由于密码子的简并性，虽核苷酸序列有差别，但表达出的蛋白却是一样的(氨基酸序列相同、结构相同、功能相同)。密码子的简并性，仅会造成表达量和表达蛋白纯度的差异，从而影响纯化。本领域技术人员基于本发明公开的内容，并依据大肠杆菌的密码子偏好性，进行常规调整和选择，优化密码子，以降低杂蛋白的表达，进而提高目的蛋白(本发明的酶突变体)的表达纯度。

本发明的第四个方面提供一种表达盒，其特征在于，包含上述基因。

本发明的第五个方面提供一种载体，其特征在于，包含上述基因或表达盒。

本发明的第六个方面提供一种重组细胞，其特征在于，包含上述基因或表达盒或载体。

本发明的第七个方面提供一种制备上述CA 7α-HSDH突变体的方法，其特征在于，在能够成功诱导蛋白表达的条件下培养上述重组细胞并分离得到CA 7α-HSDH突变体。

本发明的第八个方面提供一种催化剂，其特征在于，其有效成分包含上述CA 7α-HSDH突变体。

所述催化剂，其特征在于，还包括与上述CA 7α-HSDH突变体同时使用时能够提高酶催化效率或增加酶稳定性的其它试剂。

本发明的第九个方面提供一种实现化学物质的羰基不对称还原的方法，其特征在于，使用上述CA 7α-HSDH突变体或任一上述催化剂与反应底物在20-50℃、pH 6.0-11.0条件下进行催化反应。

本文中的“CA 7α-HSDH”指撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶。

本发明首先从一级结构至高级结构多角度多层系比较了野生型CA 7α-HSDH与同源酶蛋白的异同，确定了影响CA 7α-HSDH酶学性质的位点为第179位氨基酸—赖氨酸。然后通过密码子替换将赖氨酸变为甲硫氨酸，并利用全基因合成技术获得了CA 7α-HSDH K179M突变体的基因。最后通过构建突变体基因的GST融合表达载体并导入基因工程菌E.coliBL21中诱导表达，获得了CA 7α-HSDH K179M突变体酶蛋白。本发明的K179M突变体在生物转化TCDCA获取TUDCA的工业生产过程中具有巨大的应用潜力。

本发明提供的载体，可以是克隆载体，包含CA 7α-HSDH K179M突变体基因和质粒复制所需的其它元件；也可以是表达载体，包含CA 7α-HSDH K179M突变体基因和能够使蛋白成功表达的其它元件。在一些实施例中，所述表达载体为***了CA 7α-HSDH-K179M突变体基因的pGEX-6p-2载体。

本发明提供的重组细胞，可以是包含克隆载体的重组细胞，例如E.coli DH5α，通过培养细胞使细胞内的CA 7α-HSDH K179M突变体基因复制；也可以是包含表达载体的细胞，在适当的条件下培养细胞，例如，加入适量的IPTG，16℃诱导CA 7α-HSDH K179M突变体蛋白的表达。

本发明提供一种催化剂，其有效成分包括CA 7α-HSDHK179M突变体。所述催化剂也可以与其它适合的催化剂同时使用，从而提高酶催化效率或者在同一反应体系中先后进行两种催化反应。

本发明的CA 7α-HSDHK179M突变体，在20-50℃、pH 6.0-11.0条件下能够催化羰基不对称还原反应。

附图说明

图1.7α-、7β-HSDH联合转化TCDCA制备TUDCA。

图2.Overlapping PCR(重叠PCR)构建K179M突变体基因的琼脂糖凝胶电泳结果；其中，M为DNA Marker；1和2为K179M的overlapping PCR产物。

图3.质粒双酶切鉴定结果；其中，M为DNA Marker；1和2为酶切后的重组质粒。

图4.撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体K179M的SDS-PAGE电泳图；其中，M为蛋白质分子量标准(Marker)；1和2为K179M突变体蛋白。

图5.K179M基因与撒丁岛梭菌7α-HSDH基因的序列比对结果；其中，WT(图5中只有WT和179两个序列，没有Ca 7列-HSDH)为现有的撒丁岛梭菌7α-HSDH基因的核苷酸序列，179为本发明制备的7α-HSDH突变体核苷酸序列。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步描述本发明，需要声明的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。

主要试剂：

pGEX-6p-2为已知载体，本实验室保存；

E.coli BL21细胞为本实验室保存；

Lysis buffer，配制而得，10mM pH7.3的PBS含有PMSF 0.1mM、亮肽素Leupeptin0.5mg/mL；

Glutathione Sepharose 4B，购买自GE Healthcare，货号：10223836；

PreScission Protease，购买自GenScript公司，货号：Z02799-100；

BCA试剂盒，购买自Beyotime公司，货号：P0006；

TCDCA，购买自百灵威科技公司，货号：330776；

质粒提取试剂盒，购于OMEGA公司，货号：D6943；

以下实施例中未特别说明的生物化学试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得。

实施例1.CA 7α-HSDH突变体的制备

1.突变体基因合成

原始序列：密码子优化后的野生型CA 7α-HSDH基因序列(参见专利CN102827848A公布文本)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

通过从一级结构至高级结构的多角度多层系比较野生型CA 7α-HSDH与同源酶蛋白的异同，确定了影响酶学性质的位点为野生型CA 7α-HSDH的第179位氨基酸，所述氨基酸为赖氨酸，对应的核苷酸序列为第535-537位密码子。

将野生型CA 7α-HSDH基因序列的第535-537处密码子由AAA更改为ATG，将原来的赖氨酸替换成甲硫氨酸，得到CA 7α-HSDH突变体，命名为CA 7α-HSDH K179M突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.载体的构建

2.1K179M通过overlapping PCR法构建，克隆酶切位点为：BamHI和NotI，所用引物如下表：

获取K179M突变体基因的方法：利用overlapping PCR法获取突变基因；PCR模板：密码子优化后的CA 7α-HSDH质粒(pGEX-6p-1/CA 7α-HSDH)

第一次PCR反应体系及条件：

PCR反应体系1：

PCR反应体系2：

PCR反应条件：94℃预变性5分钟；40个循环，其中包括：98℃变性10秒，60℃退火15秒，72℃延伸15秒；反应结束后于72℃延伸10分钟。

第二次PCR反应体系及条件：

PCR反应体系：

PCR反应条件：94℃预变性5分钟；5个循环，其中包括：98℃变性10秒，60℃退火15秒，72℃延伸15秒。此处涉及重叠PCR，没有延伸10min这一步骤。

第三次PCR体系及条件：向第二次反应体系中加入上游引物1.5μL、下游引物1μL。采用以下条件完成PCR反应。

PCR反应条件：94℃预变性5分钟；3个循环，其中包括：98℃变性10秒，60℃退火15秒，72℃延伸15秒；反应结束后于72℃延伸10分钟。

琼脂糖凝胶电泳检测overlapping PCR结果，如图2所示，得到了K179M突变体基因。

2.2酶切和连接反应

利用BamHI和NotI限制性内切酶分别对重叠PCR获得的K179M突变体基因以及pGEX-6p-2体进行双酶切，然后按照以下体系和条件进行连接。

连接体系：

反应条件：16℃连接过夜，得到连接产物pGEX-6p-2/CA 7α-HSDH K179M。

2.3连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞

1)感受态细胞E.coli DH5α放置冰上融化。

2)将步骤2.2所得的连接体系加入融化的E.coli DH5α感受态中，冰上放置30分钟。

3)42℃热处理90s。

4)冰上2分钟。

5)加入LB培养基600μL，摇床温度37℃，摇床摇速150rpm，时间45分钟。

6)吸取200μL涂布Amp⁺抗性LB平板培养基。

7)37℃过夜培养。

2.4挑取单菌落扩大培养

挑取单菌落，接种Amp⁺LB培养基中，摇床温度37℃，摇床摇速220rpm。OD₆₀₀≈1.0时，8000rpm离心5分钟获取菌体用于质粒提取。

2.5提取质粒

按OMEGAPlasmid Mini Kit I(货号：D6943)说明书操作提取质粒。

2.6双酶切鉴定

双酶切鉴定体系：

反应条件：37℃酶切1.5小时。

双酶切结果如图3所示。

2.7测序确认

选取双酶切鉴定正确的重组质粒送TAKARA(中国，大连)公司测序，测序结果正确的重组质粒作为K179M突变体的表达载体。

3.酶蛋白的GST融合异源表达

(1)质粒转化E.coli BL21细胞

a.在-80℃中取出BL21感受态细胞E.coli冰上放置。

b.加入纯化后的pGEX-6p-2/CA 7α-HSDH K179M表达载体2μL，冰上放置30分钟。

c.42℃热处理90秒。

d.冰上放置2分钟。

e.复苏，加入600μLLB培养基，37℃，150rpm，45分钟。

f.吸取200μL培养基涂布于Amp⁺LB平板培养基中。

g.37℃培养过夜。

(2)蛋白表达与纯化

a.将菌种接种入无菌LB培养基中，氨苄青霉素终浓度为50μg/mL，37℃，180rpm培养。

b.待OD600≈0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，16℃诱导过夜(12h)。8000rpm，

5分钟收集菌体。

c.按1L培养体系加30mL Lysis buffer的比例重悬菌体，超声破菌至澄清。12000rpm，20分钟。取上清。

d.上清与Glutathione Sepharose 4B结合，填料使用的比例为每升培养体系使用5mL填料，4℃结合2小时。轻轻垂直颠倒混悬。

e.结合完毕后，500rpm，5分钟沉淀填料。填料用4℃预冷PBS冲洗3-5个柱体积。去除杂蛋白。

f.加入PreScission Protease酶切缓冲液，加入PreScission Protease酶。

g.4℃酶切过夜。酶切完毕后，将上清从层析柱中放出。

h.将所得样品进行SDS-PAGE，鉴定其分子量大小及纯度、BCA试剂盒测试纯化蛋白的浓度。

结果如图4所示，SDS-PAGE检测结果显示K179M突变体可溶性表达成功，并且经一步亲和层析后蛋白的条带单一。

实施例2.K179M突变体酶活检测

酶活测定：

在室温条件下，向比色皿中加入1958uL 50mM Tris-HCl(PH＝8.0)溶液，20uL50mM的NADP⁺溶液，再向其中加入2uL实施例1获得的K179M酶蛋白溶液，混匀后调零，最后加入20uL 50mM的TCDCA溶液，混匀、开始计时。每分钟读取一次340nm处光吸收的变化值。

与此同时，按照上述相同的方法测定CA7α-HSDH的酶活。

结果表明，本发明突变体K179M催化TCDCA的7位羟基的差向异构，使其生成TUDCA的中间体牛磺7-酮石胆酸(T7K-LCA)。本发明K179M酶蛋白以及撒丁岛梭菌7α-HSDH酶蛋白对TCDCA的比活力如表1所示。

比活力(U/mg)定义：在上述反应条件下，每毫克蛋白所含的酶活力单位数。

结果如表1所示，CA 7α-HSDH K179M突变体在以NADP⁺为辅酶，催化转化TCDCA的比活力是野生型CA 7α-HSDH的2.9倍。

表1.K179M突变体与野生型CA 7α-HSDH催化TCDCA的酶比活力比较

实施例5.K179M突变体热稳定性研究

将酶样品(不含甘油)在50℃金属浴放置20分钟，按照实施例2测定酶活的方法检测残余酶活。每个样品进行不少于3次的重复实验。

结果如表2所示，热处理20分钟后，野生型CA 7α-HSDH酶活迅速下降，仅保留32.33％的酶活，而K179M仍保留45.09％的酶活。表明相比野生型CA 7α-HSDHK179M具有更好的热稳定性，更适于工业应用。

表2.野生型CA 7α-HSDH与7α-HSDHJ-1-1热稳定性比较

序列表

<110> 重庆大学

<120> 撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体K179M

<130> P1730479CN-CN-CQD-CQ

<141> 2017-11-14

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 262

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Leu Ala Leu Gly Gly Leu Val Ala Ile Val Thr Ser Ser Thr Ala

1 5 10 15

Gly Ile Gly Ala Ala Ser Ala Gly Ala Leu Ala Leu Gly Gly Ala Leu

20 25 30

Val Thr Leu Ala Ala Ala Ser Gly Gly Leu Ala Ala Gly Val Ile Ala

35 40 45

Ala Ile Leu Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Pro Val Thr Pro Ala Ala

50 55 60

Ala Gly Gly Gly Thr Thr Thr Ser Met Val Gly Leu Val Ala Gly Ala

65 70 75 80

Gly Gly Ala Ile Ala Ile Leu Val Ala Ala Thr Gly Gly Thr Ala Val

85 90 95

Ala Leu Ala Leu Ala Leu Thr Ala Gly Ala Thr Ala Gly Pro Pro Ala

100 105 110

Ile Leu Leu Ala Ala Val Gly Ser Val Thr Leu Pro Ala Leu Ala Ala

115 120 125

Ile Pro His Met Gly Leu Val Gly Gly Gly Ser Ile Val Ala Ile Ser

130 135 140

Thr Ile Gly Ser Val Val Pro Ala Ile Ser Ala Ile Ala Thr Cys Val

145 150 155 160

Ser Leu Ser Ala Ile Ala Ser Leu Thr Gly Ala Ile Ala Leu Gly Thr

165 170 175

Ala Ala Leu Ala Ile Ala Cys Ala Ala Val Leu Pro Gly Leu Ile Gly

180 185 190

Thr Ala Ala Ala Leu Gly Ala Met Thr Ala Gly Pro Ala Ala Ser Pro

195 200 205

Leu Gly His Val Pro Leu Ala Ala Val Gly Ala Pro Gly Ala Ile Ala

210 215 220

Ala Ala Val Leu Thr Thr Ala Ser Ala Ala Ser Gly Thr Val Thr Gly

225 230 235 240

Met Ile His Gly Val Ala Gly Gly Pro Ala Leu Gly Thr Pro Gly Thr

245 250 255

Ser Gly Thr Cys Pro Ala

260

<210> 2

<211> 262

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Leu Ala Leu Gly Gly Leu Val Ala Ile Val Thr Ser Ser Thr Ala

1 5 10 15

Gly Ile Gly Ala Ala Ser Ala Gly Ala Leu Ala Leu Gly Gly Ala Leu

20 25 30

Val Thr Leu Ala Ala Ala Ser Gly Gly Leu Ala Ala Gly Val Ile Ala

35 40 45

Ala Ile Leu Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Pro Val Thr Pro Ala Ala

50 55 60

Ala Gly Gly Gly Thr Thr Thr Ser Met Val Gly Leu Val Ala Gly Ala

65 70 75 80

Gly Gly Ala Ile Ala Ile Leu Val Ala Ala Thr Gly Gly Thr Ala Val

85 90 95

Ala Leu Ala Leu Ala Leu Thr Ala Gly Ala Thr Ala Gly Pro Pro Ala

100 105 110

Ile Leu Leu Ala Ala Val Gly Ser Val Thr Leu Pro Ala Leu Ala Ala

115 120 125

Ile Pro His Met Gly Leu Val Gly Gly Gly Ser Ile Val Ala Ile Ser

130 135 140

Thr Ile Gly Ser Val Val Pro Ala Ile Ser Ala Ile Ala Thr Cys Val

145 150 155 160

Ser Leu Ser Ala Ile Ala Ser Leu Thr Gly Ala Ile Ala Leu Gly Thr

165 170 175

Ala Ala Met Ala Ile Ala Cys Ala Ala Val Leu Pro Gly Leu Ile Gly

180 185 190

Thr Ala Ala Ala Leu Gly Ala Met Thr Ala Gly Pro Ala Ala Ser Pro

195 200 205

Leu Gly His Val Pro Leu Ala Ala Val Gly Ala Pro Gly Ala Ile Ala

210 215 220

Ala Ala Val Leu Thr Thr Ala Ser Ala Ala Ser Gly Thr Val Thr Gly

225 230 235 240

Met Ile His Gly Val Ala Gly Gly Pro Ala Leu Gly Thr Pro Gly Thr

245 250 255

Ser Gly Thr Cys Pro Ala

260

<210> 3

<211> 789

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atgaaacgcc tggaaggcaa agtggcaatt gtgaccagct ctactcgtgg cattggccgt 60

gcatctgcag aagcactggc aaaagaaggt gctctggtgt atctggcagc acgtagcgag 120

gaactggcta atgaagttat tgcagatatt aaaaaacagg gtggcgtggc taaatttgtt 180

tactttaatg ctcgtgaaga agaaacttac actagcatgg tggaaaaagt tgctgaagct 240

gaaggccgca ttgatattct ggttaataac tacggtggca ccaatgttaa tctggataaa 300

aacctgactg ctggcgatac cgatgaattc tttcgcattc tgaaagataa cgttcagagc 360

gtgtacctgc cggcaaaagc tgctattccg catatggaaa aagtgggcgg tggcagcatt 420

gttaatatca gcactattgg cagcgttgtt ccggatatta gccgcattgc ttactgcgtg 480

agcaaaagcg ctattaactc tctgactcag aacattgcac tgcagtatgc acgcatgaat 540

atccgctgca atgcagtgct gccgggtctg attggcactc gcgcagcact ggaaaatatg 600

actgatgaat ttcgcgacag cttcctgggc catgttccgc tgaatcgcgt gggccgcccg 660

gaagatattg caaatgcagt tctgtactat gcctctgatg atagcggtta tgtgaccggc 720

atgattcatg aagttgcagg cggttttgca ctgggcactc cgcagtatag cgaatactgc 780

ccgcgctaa 789

<210> 4

<211> 789

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

atgaaacgcc tggaaggcaa agtggcaatt gtgaccagct ctactcgtgg cattggccgt 60

gcatctgcag aagcactggc aaaagaaggt gctctggtgt atctggcagc acgtagcgag 120

gaactggcta atgaagttat tgcagatatt aaaaaacagg gtggcgtggc taaatttgtt 180

tactttaatg ctcgtgaaga agaaacttac actagcatgg tggaaaaagt tgctgaagct 240

gaaggccgca ttgatattct ggttaataac tacggtggca ccaatgttaa tctggataaa 300

aacctgactg ctggcgatac cgatgaattc tttcgcattc tgaaagataa cgttcagagc 360

gtgtacctgc cggcaaaagc tgctattccg catatggaaa aagtgggcgg tggcagcatt 420

gttaatatca gcactattgg cagcgttgtt ccggatatta gccgcattgc ttactgcgtg 480

agcaaaagcg ctattaactc tctgactcag aacattgcac tgcagtatgc acgcaaaaat 540

atccgctgca atgcagtgct gccgggtctg attggcactc gcgcagcact ggaaaatatg 600

actgatgaat ttcgcgacag cttcctgggc catgttccgc tgaatcgcgt gggccgcccg 660

gaagatattg caaatgcagt tctgtactat gcctctgatg atagcggtta tgtgaccggc 720

atgattcatg aagttgcagg cggttttgca ctgggcactc cgcagtatag cgaatactgc 780

ccgcgctaa 789

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

cgggatccat gaaacgcctg gaaggc 26

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

cttttgcggc cgcttagcgc gggcagtatt c 31

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

tgcagtatgc acgcatgaat atccgct 27

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

attgcagcgg atattcatgc gtgcatac 28

Claims

1.一种提高野生型撒丁岛梭菌 7α-羟基类固醇脱氢酶的酶活及稳定性的方法，其特征在

于，将所述野生型撒丁岛梭菌 7α-羟基类固醇脱氢酶第 179 位的赖氨酸突变为甲硫氨酸；所述野生型撒丁岛梭菌 7α-羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列如 SEQ ID NO：1 所示。

2.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，进行所述突变后得到的撒丁岛梭菌 7α-羟基类固醇脱氢酶酶突变体的酶活及稳定性相较所述野生型撒丁岛梭菌 7α-羟基类固醇脱氢酶显著提高。

3.一种撒丁岛梭菌 7α-羟基类固醇脱氢酶突变体 K179M，其特征在于，其氨基酸序列如

SEQ ID NO：2 所示。

4.编码权利要求 3 所述的撒丁岛梭菌 7α-羟基类固醇脱氢酶突变体 K179M 的基因。

5.根据权利要求 4 所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID NO：3 所示。

6.一种表达盒，其特征在于，包含权利要求 4 所述的基因。

7.一种载体，其特征在于，包含权利要求 4 所述的基因，和/或权利要求 6 所述的表达盒。

8.一种重组细胞，其特征在于，包含权利要求 4 所述的基因，和/或权利要求 6 所述的表达盒，和/或权利要求 7 所述的载体。

9.一种催化剂，其特征在于，其有效成分包含权利要求3所述的撒丁岛梭菌 7α-羟基类固醇脱氢酶突变体 K179M。

10.根据权利要求 9 所述的催化剂，其特征在于，还包括与权利要求 3 所述的撒丁岛梭菌 7α-羟基类固醇脱氢酶突变体 K179M 同时使用时能够提高酶催化效率或增加酶稳定性的其它试剂。

11.一种实现化学物质的羰基不对称还原的方法，其特征在于，使用权利要求3所述的撒丁岛梭菌 7α-羟基类固醇脱氢酶突变体 K179M，和/或权利要求 9 或 10 所述的催化剂与反应底物在 20-50°C、pH 6.0-11.0 条件下进行催化反应。