CN107827830B

CN107827830B - 一种奥司他韦衍生物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN107827830B
Application number: CN201711116836.8A
Authority: CN
Inventors: 黄兵; 鞠翰; 刘新泳; 马秀丽; 于可响; 张健; 胡峰; 刘存霞; 李玉峰; 艾武
Original assignee: Shandong University; Poultry Research Institute Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shandong University; Poultry Research Institute Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-11-13
Filing date: 2017-11-13
Publication date: 2021-08-06
Anticipated expiration: 2037-11-13
Also published as: CN107827830A

Abstract

本发明所述奥司他韦衍生物是一种全新靶向于430‑腔的碳1位羧基改造的奥司他韦衍生物，其抗流感活性结果显示其在抗病毒领域中的首次应用。同时，以标准药理学检验规程进行评价，表明本发明所述衍生物对H5N2和H9N2型流感病毒的神经氨酸酶具有较强的抑制作用，多个化合物的抑酶活性与阳性对照相当，本发明的新型奥司他韦衍生物可作为流感病毒神经氨酸酶抑制剂应用，用于制备预防和治疗N2型流感病毒引起的感染性疾病的药物，并具有很高的应用价值。

Description

一种奥司他韦衍生物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于有机化合物合成技术领域，具体涉及一种奥司他韦衍生物，并进一步公开其制备方法与应用。

背景技术

流行性感冒简称流感(influenza或者flu)，是一种由流感病毒引起的具有高致病率和高致死率的呼吸道传染性疾病，是一种传染性强、传播速度快的疾病。其主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播。流感典型的临床症状包括：急起高热、全身疼痛、显著乏力和轻度呼吸道症状。一般秋冬季节是流感的高发期，所引起的并发症和死亡现象非常严重。据调查，每年的流感流行可引起300-500万人的感染，并会导致25-50万人的死亡。

流感通常是由流感病毒引起，根据其核蛋白和基质蛋白抗原决定簇的不同可分为A(甲)型、B(乙)型、C(丙)型，其中A型流感病毒最易变异，且宿主范围最广，容易造成大流行或大暴发，对人类的威胁最大。又根据A型流感病毒表面蛋白血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)的不同，将其分为HnNm等多种亚型。自20世纪以来，流感发生了数次大规模的流行，其中，1918年H1N1(Spanish flu)、1957年H2N2(Asian flu)、1968年H3N2(Hong Kongflu)、2009年H1N1(swine flu)四次大规模的爆发给人类的生命安全造成巨大威胁。此外，于2013年3月底在上海和安徽两地发现的H7N9型禽流感是全球首次发现的新型流感病毒，截至2017年2月我国死亡人数已增至上百人，且病例广泛分布于沿海开放城市，疫情依然严峻。因此，流感不仅是世界公共卫生领域关注的焦点，也是我国重点预防和控制的病毒性传染疾病。

目前，已经上市的治疗流感的药物依据其靶点可分为三类：M2离子通道抑制剂、神经氨酸酶抑制剂及聚合酶抑制剂。其中，神经氨酸酶(NA)是流感病毒的功能蛋白，在流感病毒生命周期中发挥了十分重要作用，是目前抗流感药物设计的重要靶点。目前，已上市的神经氨酸酶抑制剂主要有四种，分别是扎那米韦(Zanamivir)、奥司他韦(Oseltamivir)、帕拉米韦(Peramivir)和拉尼娜米韦(Laninamivir)。其中，磷酸奥司他韦(Oseltamivirphosphate)作为唯一的口服NA抑制剂，是临床上用于治疗流感的首选药物。然而，已有研究表明，近几年出现的高致病性H5N1型禽流感病毒和多种季节性H1N1、H3N2型流感病毒株都对奥司他韦产生了不同程度的耐药性。此外，扎那米韦和新上市的帕拉米韦分别是通过吸入和静脉注射给药，对患者来说使用十分不方便，而且近年来也有诸多的耐药病毒株报道。因此，开发高效、抗耐药性的神经氨酸酶抑制剂一直是抗流感药物研究领域的热点和难点。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种奥司他韦衍生物，并进一步公开其制备方法，以及作为神经氨酸酶抑制剂在抗流感病毒药物中的应用。

为解决上述技术问题，本发明所述的如式(Ⅰ)所示的奥司他韦衍生物或其药学上可接受的盐：

其中，R选自取代或未取代的C₁-C₁₂的直链烷基，取代或未取代的C₁-C₁₂的支链烷基，取代或未取代的C₁-C₁₂的环烷基，C₁-C₁₂的酯基，取代或未取代的苄基，C₁-C₁₂烷氧基，C₃-C₁₂环烷氧基，部分或全部氟取代的C₁-C₃烷氧基，C₁-C₁₂烷硫基，C₃-C₁₂环烷硫基，部分或全部氟取代的C₁-C₃烷硫基、巯基、氨基、氰基、硝基，单或双C₁-C₁₂烷基取代的氨基、C₂-C₁₂脂肪酰胺、苯基、噻吩基或芳香杂环。

更优的，所述苄基的取代基选自卤素、C₁-C₁₂烷基、部分或全部氟取代的C₁-C₃烷基、苯基、噻吩基或芳香杂环。

更优的，式(I)中，n＝1或2。

最优的，所述化合物具有如下A1-A11所示的结构：

本发明还公开了一种制备所述的奥司他韦衍生物或其药学上可接受的盐的中间体，具有如下式(Ⅱ)所示的结构：

本发明还公开了一种制备所述的奥司他韦衍生物或其药学上可接受的盐的方法，包括如下步骤：

(1)取磷酸奥司他韦溶于甲醇溶液中，加入Boc酸酐和三乙胺，于室温下进行反应，减压蒸馏蒸干甲醇后将反应液过滤，取固体用蒸馏水洗涤，真空干燥得白色粉末状固体A-1；

(2)将化合物A-1溶于甲醇中，滴加氢氧化钾溶液至不再有固体析出，室温搅拌后蒸除甲醇，加入水及盐酸调pH值为2，过滤并干燥滤饼得到白色粉末状固体A-2；

(3)称取化合物A-2，EDCI和HOBT溶于二氯甲烷，依次滴加丙炔胺和三乙胺，于室温下反应，反应结束后，蒸干溶剂，加入乙酸乙酯，先后以饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液进行洗涤，并以无水硫酸镁干燥、过滤，蒸除溶剂后进行快速柱层析分离得到淡黄色固体A-3；

(4)取化合物A-3，及具有R-N₃结构的化合物，以及硫酸铜和抗坏血酸钠溶于四氢呋喃-水溶剂中，于室温下进行反应，TLC检测反应结束后，蒸干四氢呋喃并加入饱和氯化钠溶液，随后以乙酸乙酯萃取并合并有机层，无水硫酸镁干燥、过滤，蒸除溶剂后进行快速柱层析分离得到黄色粉末状固体，即为式(Ⅱ)所示的中间体；

(5)取式(Ⅱ)所示的中间体化合物溶于甲醇，并加入浓盐酸室温下进行反应，反应结束后，蒸干反应液进行快速柱层析分离得到黄色粉末状固体，即为本发明所需的奥司他韦衍生物；

本发明还公开了所述的奥司他韦衍生物或其药学上可接受的盐用于制备流感病毒神经氨酸酶抑制剂以及治疗和/或预防流感药物中的用途。

所述流感病毒为禽流感病毒，并进一步是指N2型流感病毒，包括H5N2型或H9N2型。

本发明还公开了一种抗流感病毒的药物组合物，包括所述的奥司他韦衍生物或其药学上可接受的盐，以及至少一种药学上可接受的载体和/或赋形剂。

本发明中所述的“药学上可接受的盐”是指在可靠的医药评价范围内，化合物的盐类适于与人或较低等动物的组织相接触而无不适当的毒性、刺激及过敏反应等，具有相当合理的收益与风险比例，通常是水或油可溶的或可分散的，并可有效地用于其预期的用途。包括药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐，在这里是可做预期的用途并与式I化合物的化学性质相容的。这些盐是熟练技术人员熟知的，熟练的技术人员可制备本领域知识所提供的任何盐。此外，熟练技术人员可根据溶解度、稳定性、容易制剂等因素取某种盐而舍另一种盐，这些盐的测定和最优化在熟练技术人员的经验范围内。

本发明所述奥司他韦衍生物是一种全新靶向于430-腔的碳1位羧基改造的奥司他韦衍生物，其抗流感活性结果显示其在抗病毒领域中的首次应用。同时，以标准药理学检验规程进行评价，表明本发明所述衍生物对H5N2和H9N2型流感病毒的神经氨酸酶具有较强的抑制作用，多个化合物的抑酶活性与阳性对照相当，本发明的新型奥司他韦衍生物可作为流感病毒神经氨酸酶抑制剂应用，用于制备预防和治疗N2型流感病毒引起的感染性疾病的药物，具有很高的应用价值。

具体实施方式

下述实施例1-8用于合成本发明所述化合物A1-A8，其合成过程如下：

。

实施例1化合物A1的合成

本实施例所述化合物A1的合成，包括如下步骤：

(1)化合物A-1的制备

于100ml圆底烧瓶中加入磷酸奥司他韦(5g，1.22mmol)，加入25ml甲醇溶液使之溶解，搅拌条件下滴加加入Boc酸酐(5g，2.4mmol)和5ml三乙胺，室温反应12小时；减压蒸馏蒸干甲醇，反应液过滤，固体用蒸馏水洗涤，真空干燥箱干燥得白色粉末状固体A-1，计算收率为96.3％；

对所得化合物A-1进行结构检测，谱图数据为：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ7.80(d,J＝9.1Hz,1H),6.61(d,J＝6.9Hz,2H),4.21–3.99(m,3H),3.75–3.61(m,1H),3.57(td,J＝15.6,10.1Hz,1H),3.38(dd,J＝10.9,5.5Hz,1H),2.46(d,J＝4.7Hz,1H),2.25(dd,J＝17.5,10.3Hz,1H),1.78(s,3H),1.52–1.28(m,13H),1.22(t,J＝7.1Hz,3H),0.80(dt,J＝26.5,7.3Hz,6H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ169.66(s),165.99(s),155.78(s),138.66(s),129.08(s),81.49(s),78.04(s),75.44(s),60.88(s),54.61(s),49.31(s),30.61(s),28.65(s),26.17(s),25.65(s),23.31(s),14.52(s),9.88(s),9.43(s)。可见，结构正确；

(2)化合物A-2的制备

将化合物A-1(3g，0.73mmol)溶于20mL甲醇中，滴加加入4M的氢氧化钾溶液直至不再有固体析出，室温搅拌2小时；蒸除甲醇，并加入20mL水，用3M盐酸调pH＝2，过滤并干燥滤饼得到白色粉末状固体A-2，计算其收率为93.3％；

对所得化合物A-2进行结构检测，谱图数据为：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ12.55(s,1H),7.81(d,J＝9.1Hz,1H),6.65–6.52(m,2H),4.06(d,J＝7.5Hz,1H),3.69(dd,J＝19.4,9.2Hz,1H),3.56(dt,J＝16.1,10.2Hz,1H),3.37(dd,J＝11.4,5.9Hz,1H),2.46(dd,J＝17.9,4.9Hz,1H),2.21(dd,J＝17.5,10.3Hz,1H),1.78(s,3H),1.52–1.28(m,13H),0.80(dt,J＝26.1,7.3Hz,6H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ169.71(s),167.70(s),155.80(s),138.13(s),129.71(s),81.44(s),78.04(s),75.55(s),54.70(s),49.44(s),30.73(s),28.66(s),26.19(s),25.63(s),23.32(s),9.89(s),9.42(s)。可见，产物结构正确；

(3)化合物A-3的制备

称取化合物A-2(0.38g，1mmol)，EDCI(0.19，1mmol)、HOBT(0.15g，1mmol)溶于二氯甲烷室温搅拌2小时，然后依次滴加丙炔胺(0.055g，10mmol)和三乙胺0.5ml，室温下搅拌；TLC检测反应结束后，蒸干溶剂，加入100ml乙酸乙酯，用饱和碳酸氢钠溶液100ml洗涤三次，再用100ml的饱和氯化钠溶液洗涤一次；无水硫酸镁干燥并过滤，蒸除溶剂后进行快速柱层析分离，得到淡黄色固体即为化合物A-3，计算其收率为54.7％；

对所得化合物A-3进行结构检测，谱图数据为：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.41(s,1H),7.79(d,J＝9.1Hz,1H),6.59(d,J＝9.0Hz,1H),6.35(s,1H),4.03(d,J＝7.7Hz,1H),3.93–3.81(m,2H),3.69(dd,J＝18.9,9.4Hz,1H),3.56(dt,J＝15.8,10.0Hz,1H),3.41–3.35(m,1H),3.08(t,J＝2.3Hz,1H),2.46–2.38(m,1H),2.22(dd,J＝17.4,10.3Hz,1H),1.78(s,3H),1.56–1.22(m,13H),0.81(dt,J＝27.7,7.3Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ169.67(s),166.42(s),155.78(s),132.93(s),132.01(s),81.81(s),81.38(s),78.02(s),75.60(s),73.09(s),54.71(s),49.51(s),28.67(s),26.23(s),25.58(s),23.33(s),9.90(s),9.48(s)。可见，产物结构正确；

(4)化合物b-1的制备

将叠氮化钠(0.65g，10mmol)溶于DMF：水＝5：1的溶剂中，滴加4-硝基溴苄(2.16g，10mmol)，50℃下搅拌24小时；TLC检测反应结束后，蒸干溶剂，加入100ml水，用30mL乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，加无水硫酸镁干燥并过滤，蒸除溶剂后进行快速柱层析分离得到淡黄色油状液体，即为化合物b-1(n＝1)；

(5)中间体化合物Ⅱ-1的制备

将化合物A-3(0.32g，1mmol)，b-1(0.17g，1mmol)，硫酸铜(0.12g，0.5mmol)，抗坏血酸钠(0.1g，0.5mmol)溶于四氢呋喃：水＝1：1的溶剂中，室温下搅拌，TLC检测反应结束后，蒸干四氢呋喃，加入100ml饱和氯化钠溶液，用30mL乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，无水硫酸镁干燥，过滤，蒸除溶剂后进行快速柱层析分离得到黄色粉末状固体，即为中间体化合物Ⅱ-1，计算其收率为75.8％；

(6)化合物A1的制备

将中间体化合物Ⅱ-1(0.1g，0.16mmol)投入50ml的圆底烧瓶，加入10ml甲醇溶解，再加入10ml的12M的浓盐酸，室温下搅拌1小时，TLC检测反应结束后，油泵蒸干反应液进行快速柱层析分离得到黄色粉末状固体，即为化合物A1，计算其收率58％；

对所得化合物A1进行结构检测，谱图数据为：¹H NMR(400MHz,D₂O)δ7.94(dd,J＝8.0,3.1Hz,3H),7.29(d,J＝8.2Hz,2H),6.28(s,1H),5.59(s,2H),4.42(s,2H),4.16(d,J＝8.5Hz,1H),3.92(dd,J＝11.6,9.0Hz,1H),3.49(td,J＝10.9,5.6Hz,1H),3.43–3.26(m,1H),2.78(dd,J＝17.0,5.2Hz,1H),2.51–2.33(m,1H),1.97(s,3H),1.34(tdt,J＝21.5,14.2,7.0Hz,4H),0.77–0.57(m,6H).¹³C NMR(101MHz,D₂O)δ175.21(s),168.78(s),147.35(s),142.10(s),132.91(s),130.28(s),128.78(s),124.00(s),84.21(s),75.00(s),53.00(s),52.64(s),49.10(s),34.54(s),28.36(s),25.40(s),25.03(s),22.36(s),8.44(d,J＝6.4Hz).ESI-MS:m/z 500.6(M+1)。可见，产物结构正确。

实施例2化合物A2的合成

本实施例所述化合物A2的合成，具体合成步骤同实施例1，其区别仅在于，所述步骤(4)中以2-硝基溴苄为原料制备得到化合物b-2，并利用化合物b-2继续进行反应，得到产物为黄色粉末状固体，即为化合物A2，计算产物总收率为43.5％。

对所得化合物A2进行结构检测，谱图数据为：¹H NMR(400MHz,D₂O)δ8.03(dd,J＝8.2,1.1Hz,1H),7.86(s,1H),7.61(td,J＝7.6,1.1Hz,1H),7.55–7.45(m,1H),7.12(d,J＝7.6Hz,1H),6.33(s,1H),5.83(s,2H),4.43(s,2H),4.20(d,J＝8.9Hz,1H),3.96(dd,J＝11.7,9.0Hz,1H),3.51(td,J＝10.8,5.6Hz,1H),3.39(dd,J＝11.1,5.6Hz,1H),2.80(dd,J＝16.8,5.6Hz,1H),2.54–2.39(m,1H),2.00(s,3H),1.38(dtd,J＝28.1,14.2,7.0Hz,4H),0.73(dd,J＝13.1,7.3Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,D₂O)δ175.23(s),168.88(s),147.20(s),144.63(s),134.80(s),132.78(s),131.03(s),130.25(d,J＝29.5Hz),130.11–129.92(m),129.50(s),125.54(s),124.71(s),84.27(s),75.07(s),52.67(s),51.32(s),49.13(s),34.60(s),28.38(s),25.42(s),25.05(s),22.36(s),8.46(d,J＝3.8Hz).ESI-MS:m/z500.5(M+1)。可见，产物结构正确。

实施例3化合物A3的合成

本实施例所述化合物A3的合成，具体合成步骤同实施例1，其区别仅在于，所述步骤(4)中以3-氟溴苄为原料制备得到化合物b-3，并利用化合物b-3继续进行反应，得到产物为白色粉末状固体，即为化合物A3，计算其总收率为67.4％。

对所得化合物A3进行结构检测，谱图数据为：¹H NMR(400MHz,D₂O)δ7.84(s,1H),7.28(dd,J＝14.4,7.5Hz,1H),6.99(t,J＝8.0Hz,2H),6.92(d,J＝9.7Hz,1H),6.32(s,1H),5.48(s,2H),4.42(s,2H),4.19(d,J＝8.9Hz,1H),3.96(dd,J＝11.7,9.0Hz,1H),3.51(td,J＝10.9,5.6Hz,1H),3.43–3.32(m,1H),2.79(dd,J＝17.1,5.2Hz,1H),2.54–2.37(m,1H),2.00(s,3H),1.50–1.27(m,4H),0.73(td,J＝7.4,4.7Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,D₂O)δ175.23(s),168.88(s),163.84(s),161.41(s),132.78(s),130.84(d,J＝8.4Hz),130.37(s),123.73(d,J＝2.9Hz),115.55(s),115.34(s),114.81(s),114.58(s),53.21(s),52.64(s),49.12(s),34.61(s),28.35(s),25.41(s),25.05(s),22.35(s),8.45(d,J＝4.6Hz).ESI-MS:m/z 473.5(M+1)。可见，产物结构正确。

实施例4化合物A4的合成

本实施例所述化合物A4的合成，具体合成步骤同实施例1，其区别仅在于，所述步骤(4)中以3，4-二氟溴苄为原料制备得到化合物b-4，并利用化合物b-4继续进行反应，得到产物为白色粉末状固体，即为化合物A4，计算其总收率为69.1％。

对所得化合物A4进行结构检测，谱图数据为：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ5.86(s,1H),5.24–4.89(m,3H),4.33(s,1H),3.46(s,2H),2.42(s,2H),2.20(d,J＝8.8Hz,1H),1.96(dd,J＝11.6,9.0Hz,1H),1.52(td,J＝11.0,5.5Hz,1H),1.39(dd,J＝11.0,5.5Hz,1H),0.80(dd,J＝17.2,5.2Hz,1H),0.57–0.38(m,1H),-0.00(s,3H),-0.61(dtt,J＝28.2,14.1,7.1Hz,4H),-1.27(td,J＝7.3,3.9Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,D₂O)δ175.22(s),168.88(s),151.20(dd,J＝12.3,6.4Hz),148.68(d,J＝6.5Hz),132.81(s),131.74(dd,J＝5.8,4.0Hz),130.33(s),124.68(dd,J＝6.9,3.7Hz),124.07(s),117.75(d,J＝17.7Hz),117.07(d,J＝18.1Hz),84.30(s),75.05(s),52.84(s),52.63(s),49.10(s),34.53(s),28.33(s),25.39(s),25.04(s),22.34(s),8.43(d,J＝7.3Hz).ESI-MS:m/z 491.6(M+1)。可见，产物结构正确。

实施例5化合物A5的合成

本实施例所述化合物A5的合成，具体合成步骤同实施例1，其区别仅在于，所述步骤(4)中以4-溴溴苄为原料制备得到化合物b-5，并利用化合物b-5继续进行反应，得到产物为白色粉末状固体，即为化合物A5，计算其总收率为81.6％。

对所得化合物A5进行结构检测，谱图数据为：¹H NMR(400MHz,D₂O)δ7.84(s,1H),7.24(d,J＝8.2Hz,2H),7.02(d,J＝2.9Hz,2H),6.25(s,1H),5.37(s,2H),4.39(s,2H),4.14(d,J＝8.7Hz,1H),3.98–3.84(m,1H),3.48(td,J＝11.0,5.6Hz,1H),3.30(s,1H),2.82–2.70(m,1H),2.45(dd,J＝15.0,12.3Hz,1H),1.98(s,3H),1.43–1.19(m,4H),0.75–0.54(m,6H).¹³C NMR(101MHz,D₂O)δ175.18(s),168.65(s),133.79(s),132.87(s),131.90(s),130.32(s),129.89(s),122.16(s),84.00(s),74.95(s),53.27(s),52.66(s),49.10(s),34.52(s),28.40(s),25.44(s),25.03(s),22.38(s),8.51(d,J＝4.0Hz).ESI-MS:m/z534.0(M+1)。可见，产物结构正确。

实施例6化合物A6的合成

本实施例所述化合物A6的合成，具体合成步骤同实施例1，其区别仅在于，所述步骤(4)中以溴苄为原料制备得到化合物b-6，并利用化合物b-6继续进行反应，得到产物为淡黄色粉末状固体，即为化合物A6，计算其总收率为90.4％。

对所得化合物A6进行结构检测，谱图数据为：¹H NMR(400MHz,D₂O)δ7.85(s,1H),7.34–7.09(m,5H),6.31(s,1H),5.46(s,2H),4.40(s,2H),4.18(d,J＝9.0Hz,1H),3.94(dd,J＝11.7,9.0Hz,1H),3.49(td,J＝11.0,5.6Hz,1H),3.38(p,J＝5.5Hz,1H),2.77(dd,J＝16.9,5.3Hz,1H),2.54–2.38(m,1H),1.98(s,3H),1.37(ddd,J＝21.1,13.6,6.7Hz,4H),0.72(td,J＝7.3,1.6Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,D₂O)δ175.23(s),169.05–168.85(m),134.62(s),132.85(s),130.32(s),129.11(s),128.78(s),128.05(s),84.29(s),75.05(s),54.06(s),52.63(s),49.11(s),34.51(s),28.34(s),25.41(s),25.04(s),22.36(s),8.46(d,J＝2.2Hz).ESI-MS:m/z 455.6(M+1)。可见，产物结构正确。

实施例7化合物A7的合成

本实施例所述化合物A7的合成，具体合成步骤同实施例1，其区别仅在于，所述步骤(4)中以3-氯溴苄为原料制备得到化合物b-7，并利用化合物b-7继续进行反应，得到产物为淡黄色粉末状固体，即为化合物A7，计算其总收率为67.7％。

对所得化合物A7进行结构检测，谱图数据为：¹H NMR(400MHz,D₂O)δ7.81(s,1H),7.31–6.95(m,4H),6.26(s,1H),5.41(s,2H),4.38(s,2H),4.13(d,J＝8.1Hz,1H),3.98–3.83(m,1H),3.46(td,J＝10.9,5.6Hz,1H),3.37–3.23(m,1H),2.84–2.67(m,1H),2.52–2.33(m,1H),1.96(s,3H),1.47–1.18(m,4H),0.68(dd,J＝17.3,7.4Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,D₂O)δ175.20(s),168.78(s),136.66(s),134.05(s),132.76(s),130.40(d,J＝12.8Hz),128.61(s),127.77(s),126.35(s),124.05(s),84.17(s),74.97(s),53.15(s),52.61(s),49.08(s),34.55(s),28.33(s),25.38(s),25.00(s),22.32(s),8.51(s).ESI-MS:m/z 490.0(M+1)。可见，产物结构正确。

实施例8化合物A8的合成

本实施例所述化合物A8的合成，具体合成步骤同实施例1，其区别仅在于，所述步骤(4)中以(2-溴乙基)苯为原料制备得到化合物b-8，并利用化合物b-8继续进行反应，得到产物为白色粉末状固体，即为化合物A8，计算其总收率为80.9％。

对所得化合物A8进行结构检测，谱图数据为：¹H NMR(400MHz,D₂O)δ7.51(s,1H),7.23–7.05(m,3H),7.00–6.82(m,2H),6.31(s,1H),4.57(t,J＝6.5Hz,2H),4.32(s,2H),4.23(d,J＝8.7Hz,1H),3.97(dd,J＝11.6,9.1Hz,1H),3.52(td,J＝11.0,5.6Hz,1H),3.47–3.35(m,1H),3.06(t,J＝6.5Hz,2H),2.77(dd,J＝16.9,5.3Hz,1H),2.54–2.37(m,1H),1.99(s,3H),1.52–1.28(m,4H),0.75(dd,J＝16.0,7.6Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,D₂O)δ175.26(s),168.61(s),137.24(s),132.91(s),130.25(s),128.69(d,J＝4.6Hz),126.91(s),124.66(s),84.28(s),75.06(s),52.69(s),52.03(s),49.15(s),35.66(s),34.20(s),28.37(s),25.48(s),25.06(s),22.38(s),8.52(d,J＝6.9Hz).ESI-MS:m/z469.6(M+1)。可见，产物结构正确。

实施例9化合物A9的合成

本实施例所述化合物A9的合成路线如下：

。

本实施例所述化合物A9的合成，具体合成步骤同实施例1，其区别仅在于，所述步骤(4)中以溴代环己烷为原料制备得到化合物b-9，并利用化合物b-9继续进行反应，得到产物为白色粉末状固体，即为化合物A9，计算其总收率为77.3％。

对所得化合物A9进行结构检测，谱图数据为：¹H NMR(400MHz,D₂O)δ7.90(s,1H),6.34(s,1H),4.40(d,J＝6.5Hz,2H),4.19(d,J＝8.8Hz,1H),3.93(dd,J＝11.7,9.1Hz,1H),3.60–3.45(m,1H),3.39(dd,J＝10.9,5.5Hz,1H),2.87(s,1H),2.76(dd,J＝17.0,5.3Hz,1H),2.50–2.38(m,1H),1.99(s,2H),1.95(s,3H),1.73(d,J＝13.5Hz,2H),1.60(ddd,J＝16.6,11.8,8.2Hz,3H),1.46–1.23(m,6H),1.19–1.07(m,1H),0.71(dt,J＝10.5,7.4Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,D₂O)δ175.20(s),168.94(s),132.98(s),130.22(s),122.58(s),84.37(s),75.07(s),61.26(s),52.60(s),49.08(s),47.08(s),34.25(s),32.63(s),28.31(s),25.38(s),25.01(s),24.49(s),22.31(s),8.44(s)，8.41(s).ESI-MS:m/z447.6(M+1)。可见，产物结构正确。

实施例10化合物A10的合成

本实施例所述化合物A10的合成路线如下：

本实施例所述化合物A10的合成，包括如下步骤：

(1)化合物c-1的制备

在-20℃的条件下，将溴乙酰溴(2g，10mmol)的二氯甲烷溶液滴加到四氢吡咯(0.7g，10mmol)和三乙胺的二氯甲烷溶液中，滴加完毕后移除冰浴条件，室温下搅拌45分钟；向反应液中加入100mL1M的盐酸溶液，用50ml的二氯甲烷溶液萃取三次合并有机层，合并有机层，无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂后，经过硅胶柱层析分离，得黄色油状液体，即为化合物c-1；

(2)化合物d-1的制备

取叠氮化钠(0.65g，10mmol)溶于DMF：水＝5：1的溶剂中，滴加化合物c-1(0.19g，1mmol)，50℃下搅拌；TLC检测反应结束后，蒸干溶剂，加入100ml水，用30mL乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，无水硫酸镁干燥，过滤，蒸除溶剂后进行快速柱层析分离得到黄色油状液体，即为化合物d-1；

(3)化合物Ⅱ-10的制备

将化合物A-3(0.32g，1mmol)，d-1(0.15g，1mmol)，硫酸铜(0.25g，0.5mmol)，抗坏血酸钠(0.1g，0.5mmol)溶于四氢呋喃：水＝1：1的溶剂中，室温下搅拌，TLC检测反应结束后，蒸干四氢呋喃，加入100ml饱和氯化钠溶液，用30mL乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，无水硫酸镁干燥，过滤，蒸除溶剂后进行快速柱层析分离得到黄色粉末状固体，即为化合物Ⅱ-10，计算其收率为70.0％；

(4)化合物A10的制备

将化合物Ⅱ-10(0.1g，0.17mmol)投入50ml的圆底烧瓶，加入10ml甲醇溶解，再加入10ml的12M的浓盐酸，室温下搅拌1小时，TLC检测反应结束后，油泵蒸干反应液进行快速柱层析分离得到黄色粉末状固体，即为化合物A10，计算其收率为83.9％。

对所得化合物A10进行结构检测，谱图数据为：¹H NMR(400MHz,D₂O)δ7.81(s,1H),6.35(s,1H),5.28(s,2H),4.43(s,2H),4.20(d,J＝8.5Hz,1H),3.94(dd,J＝11.5,9.1Hz,1H),3.52–3.37(m,4H),3.31(t,J＝6.8Hz,2H),2.77(dd,J＝16.8,5.2Hz,1H),2.51–2.40(m,1H),1.96(s,3H),1.88(dd,J＝13.3,6.7Hz,2H),1.82–1.72(m,2H),1.48–1.24(m,4H),0.72(dt,J＝11.2,7.4Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,D₂O)δ175.20(s),168.68(d,J＝47.2Hz),168.35–168.23(m),165.39(s),132.93(s),130.27(s),125.59(d,J＝6.4Hz),84.34(s),75.09(s),52.60(s),51.63(s),49.11(s),46.62(s),46.37(s),34.57(s),28.34(s),25.39(d,J＝4.8Hz),25.01(s),23.63(s),22.35(s),8.45(d,J＝1.6Hz).ESI-MS:m/z 477.6(M+1)。可见，产物结构正确。

实施例11化合物A11的合成

本实施例所述化合物A11的合成路线如下：

。

本实施例所述化合物A11的合成，包括如下步骤：

(1)化合物A-1，A-2，A-3的制备步骤同实施例1中步骤(1)-(3)；

(2)化合物Ⅱ-11的制备

取化合物A-3(0.32g，1mmol)，齐多夫定(0.26g，1mmol)，硫酸铜(0.12g，0.5mmol)，抗坏血酸钠(0.1g，0.5mmol)溶于四氢呋喃：水＝1：1的溶剂中，室温下搅拌12小时，TLC检测反应结束后，蒸干四氢呋喃，加入100ml饱和氯化钠溶液，用30mL乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，无水硫酸镁干燥及过滤，蒸除溶剂后，用甲醇重结晶得到白色粉末状固体，即为化合物Ⅱ-11，计算其收率为77.3％。

(3)化合物A11的制备

将化合物Ⅱ-11(0.1g，0.14mmol)投入50ml的圆底烧瓶，加入10ml甲醇溶解，再加入10ml的12M的浓盐酸，室温下搅拌1小时，TLC检测反应结束后，油泵蒸干反应液进行快速柱层析分离得到白色粉末状固体，即为化合物A11，计算其收率60.5％。

对所得化合物A11进行结构检测，谱图数据为：¹H NMR(400MHz,D₂O)δ7.94(s,1H),7.63(s,1H),6.45–6.25(m,2H),5.30(dd,J＝14.3,5.8Hz,1H),4.42(s,2H),4.34(d,J＝5.1Hz,1H),4.20(d,J＝8.7Hz,1H),3.95(dd,J＝11.5,9.1Hz,1H),3.78(dd,J＝12.7,3.1Hz,1H),3.68(dd,J＝12.7,4.2Hz,1H),3.48(dd,J＝11.2,5.7Hz,1H),3.40(d,J＝5.4Hz,1H),2.93–2.62(m,3H),2.46(dd,J＝15.2,12.2Hz,1H),1.96(s,3H),1.79(s,3H),1.36(ddd,J＝21.4,13.6,6.9Hz,4H),0.73(dt,J＝10.1,7.4Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,D2O)δ175.21(s),168.94(s),166.47(s),151.53(s),137.68(s),132.86(s),130.31(s),123.34(s),85.47(s),84.38(s),84.20(s),75.08(s),60.49(s),59.54(s),52.61(s),49.10(s),36.83(s),34.62(s),28.33(s),25.39(s),25.01(s),22.31(s),11.50(s),8.45(s),8.41(s).ESI-MS:m/z589.7(M+1)。可见，产物结构正确。

实验例

1、对流感病毒神经氨酸酶的抑制活性

对上述实施例1-11中合成的奥司他韦衍生物进行酶水平的抗禽流感H5N2和H9N2毒株的的活性筛选，并以盐酸奥司他韦羧酸为阳性对照。

本实验例采用标准荧光(Anal.Bio-chem.1979,94,287-296)法测定化合物A1-A11对流感病毒神经氨酸酶的抑制活性。

酶活测试原理：

MUNANA(2’-4-methylumbelliferyl-α-N-acetylneuraminate)是流感病毒NA的特异性底物，它在NA的作用下产生的代谢产物在355nm照射光激发下，可以产生460nm的荧光，通过检测荧光强度的变化可以灵敏地反映NA的活性，从而间接地反映了化合物对NA的抑制活性。

测试方法：

酶促反应体系中含有10μL酶溶液，70μL缓冲液(33mmol/L吗啉乙磺酸，4mmol/LCaCl₂)，10μL待测化合物的不同浓度的溶液，同时设空白组和对照组；

37℃条件下孵育十分钟后，加入20μmol/L底物MUNANA10μL，反应体系总体积100μL，充分混匀。37℃条件下孵育40分钟，加150μL终止液(14mmol/L NaOH，83％乙醇配制)，测定荧光强度；

设定参数：EX＝355nM，EM＝460nM，计算抑制率，对抑制率大于50％的化合物进行复筛，分五个浓度梯度，计算化合物对酶的半数抑制浓度(IC₅₀)，抑制率＝(酶值-测定样品酶值)/(酶值-空白)×l00％。计算化合物A1-A11的抑酶活性结果，记录于下表1。

表1化合物对H5N2和H9N2毒株流感病毒神经氨酸酶的抑制活性

注：^aIC₅₀:半数抑制浓度；A代表化合物IC₅₀<100nM，B代表化合物IC₅₀的范围为100-500nM，C代表化合物IC₅₀的范围为500-1000nM，D代表化合物IC₅₀>1000μM；阳性药物为奥司他韦羧酸形式。

由表1中结果可以看出，本发明实施例1-11制得的奥司他韦衍生物是一系列结构新颖的环己烯类NA抑制剂，表现出了较强的抗N2型禽流感活性。其中化合物A5和A11对H5N2和H9N2型禽流感抑酶活性(IC₅₀值)与阳性对照药盐酸奥司他韦羧酸在同一数量级。

2、抗禽流感病毒活性

本实施例对经实验例1进一步优选的化合物A5进行了鸡胚模型试验测定其在生物体内抗禽流感病毒活性。

测试方法包括：将受精后的鸡蛋在37.7℃、相对湿度为50％的条件下孵育11天，用灯光照射去除未受精和死亡的鸡胚。在鸡蛋蛋壳上用打孔器打一个直径1mm的孔用于进行尿囊胚接种。将0.2ml200TCID50的病毒溶液(H5N2和H9N2亚型毒株)与等体积的不同浓度的化合物溶液(用0.9％的生理盐水稀释)进行混合，孵育1h后。从开孔处进行尿囊胚注射，用蜡将开孔密封，在37.7℃、相对湿度为50％的条件下孵育48小时。后用灯光照射检查记录鸡胚的存活和死亡数目。同时设计对照组和空白试验组，空白组只注射0.2ml的0.9％的生理盐水。对照组注射0.1ml的病毒溶液和0.1ml的生理盐水，记录鸡胚地存活数和死亡数，鸡胚存活情况见下表2。

表2各组鸡胚的存活和死亡数

由表2数据可以看出，化合物A5在鸡胚模型中对N2型流感病毒H5N2和H9N2毒株的抗病毒活性与阳性对照奥司他韦羧酸形式相当。

因此该类新型奥司他韦衍生物具有进一步研究与开发的价值，可作为抗N2型流感病毒(H5N2型或H9N2型)的先导化合物加以应用。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。