PT2627334E - Composições para utilização no tratamento de infeções virais - Google Patents

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PT2627334E
PT2627334E PT118335157T PT11833515T PT2627334E PT 2627334 E PT2627334 E PT 2627334E PT 118335157 T PT118335157 T PT 118335157T PT 11833515 T PT11833515 T PT 11833515T PT 2627334 E PT2627334 E PT 2627334E
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virus
influenza
viral
fever
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Pravin L Kotian
Shanta Bantia
Yarlagadda S Babu
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Biocryst Pharm Inc
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Description

DESCRIÇÃO
"COMPOSIÇÕES PARA UTILIZAÇÃO NO TRATAMENTO DE INFEÇÕES VIRAIS"
Este pedido reivindica prioridade para o Pedido Provisório U.S. No. 61/393,522, registado em 15 de outubro, 2010, e Pedido Provisório U.S. No. 61/492,054, registado em 1 de junho, 2011.
Esta invenção está limitada ao assunto definido nas reivindicações; a seguinte descrição está sujeita a esta limitação.
ANTECEDENTES
As doenças virais são responsáveis por pandemias globais e epidemias sazonais anuais, tais como influenza. Os surtos podem ser caracterizados por virulência potenciada e podem ocorrer subitamente, resultando em números graves de mortalidade. É importante notar que as doenças virais não estão limitadas a humanos. Por exemplo, influenza também afeta gado e pássaros, o que pode ter um impacto significativo no fornecimento alimentar para além de aumentar o risco de transmissão a humanos. Estados clínicos exemplificativos relacionados com infeção virai incluem, por exemplo, influenza, varíola, encefalite, doença do Nilo Ocidental, febre-amarela, febre de Dengue, hepatite, imunodeficiência humana, poliomielite e Coxsackie. O genoma do vírus influenza A tem uma RNA polimerase dependente de RNA, que é um complexo heterotrimérico de três subunidades (PA, PB1 e PB2). A RNA polimerase catalisa a transcrição e replicação de RNA viral. Uma vez que a transcrição e replicação do vírus dependem da atividade de RNA polimerase, esta enzima tornou-se interessante como alvo para o desenvolvimento de novos compostos antivirais, especialmente na aurora da emergência recente de vírus resistentes a fármacos. 0 documento US 7,560,434 divulga nucleósidos aza para utilização no tratamento de infeções virais. Este documento também divulga o exemplo 1 (em que A=OH e B=H) e exemplo 18 (em que A=OH e B=NH2), no entanto, a reivindicação 1 (bem como a fórmula no resumo ou nas colunas 3-4) exclui os exemplos 1 e 18 uma vez que, na fórmula deste documento, pelo menos um R2, R3, R4 tem de ser diferente de H quando o anel pirrolidina está ligado a uma pirrolopirimidina. Adicionalmente, nenhuma atividade antiviral dos exemplos 1 e 18 é clara e inequivocamente revelada no referido documento. O documento WO 03/100009 divulga Ib e Ic (compostos em que A=OH e B=H ou NH2) como intensificadores da eficácia de fármacos antivirais.
RESUMO DA INVENÇÃO A invenção proporciona métodos e composições para inibição de ácido nucleico polimerases virais, e métodos e composições que são úteis para o tratamento, supressão e/ou prevenção de infeções virais em sujeitos. Os métodos compreendem administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de fórmula I, ou um respetivo sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato, ou uma composição compreendendo um composto de fórmula I, ou um respetivo sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato, e um transportador farmaceuticamente aceitável. A composição ou método pode opcionalmente compreender um ou mais agentes antivirais adicionais. Os métodos e composições são úteis para o tratamento, supressão e/ou prevenção de infeções virais em sujeitos que podem surgir de infeção por um ou mais tipos de vírus. Assim, os métodos e composições são úteis para tratamento, supressão e/ou prevenção antivirais de largo espetro. A presente invenção é baseada, em parte, em certas descobertas que são descritas mais completamente na secção Exemplos do presente pedido. Por exemplo, a presente invenção é baseada, em parte, na descoberta de que níveis de títulos virais em células foram acentuadamente reduzidos por tratamento com um composto de fórmula I. Assim, a presente invenção também proporciona métodos para redução do título virai num fluido corporal ou célula, que compreendem contactar o referido fluido ou célula com um composto de fórmula I. A presente invenção é adicionalmente baseada, em parte, na descoberta de que níveis de títulos virais em células para vários vírus foram acentuadamente reduzidos por tratamento com um composto de fórmula I, indicando atividade antiviral de largo espetro para o composto de fórmula I contra uma variedade de estirpes virais. Assim, a presente invenção também proporciona métodos para redução do título virai para vários tipos, subtipos e/ou estirpes de vírus num fluido corporal ou célula, que compreendem contactar o referido fluido ou célula com um composto de fórmula I.
Nalgumas formas de realização, a presente invenção proporciona um método para inibição de uma RNA ou DNA polimerase viral, que compreende contactar a polimerase com uma quantidade inibidora eficaz do composto de fórmula I, ou um respetivo sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato.
Nalgumas formas de realização, o método é realizado em vi vo.
Nalgumas formas de realização, a presente invenção proporciona um método para o tratamento de um sujeito que sofre de uma infeção virai de RNA, que compreende administrar ao referido sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de fórmula I, ou respetivo sal farmaceuticamente aceitável.
Nalgumas formas de realização, o fluido corporal é sangue. Nalgumas formas de realização, o fluido corporal é plasma. Nalgumas formas de realização, o fluido corporal é soro sanguíneo.
Nalgumas formas de realização, o sujeito é um mamífero. Nalgumas formas de realização o sujeito é um humano. Nalgumas formas de realização, o sujeito é aviário. Nalgumas formas de realização, o sujeito é um suíno ou porco.
Estas e outras formas de realização da invenção são adicionalmente descritas nas secções seguintes do pedido, incluindo a Descrição Pormenorizada, Exemplos e Reivindicações.
Ainda outros objetivos e vantagens da invenção tornar-se-ão claros para os peritos na técnica a partir da revelação apresentada no presente documento, que é simplesmente ilustrativa e não restritiva.
RESUMO DAS FIGURAS A FIG. 1 mostra a fosforilação do composto 1 em células de carcinoma hepatocelular humano (Huh-7). A FIG. 2 mostra a fosforilação de 3H adenosina em células Huh-7. A FIG. 3 mostra a fosforilação de 3H composto 1 em células Huh-7. A FIG. 4 mostra a incorporação por RNA total e DNA genómico de 3H composto 1 e 3H adenosina em células Huh-7 após 24 horas. A FIG. 5 mostra os efeitos de combinação do composto 1 e peramivir (um inibidor de neuraminidase) em influenza in vitro. A FIG. 6 mostra o efeito do composto 1 (intramuscular) na perda de peso em ratinhos infetados com virus influenza H3N2 A/Victoria/3/75. A FIG. 7 mostra o efeito do composto 1 (oral) na perda de peso em ratinhos infetados com virus influenza H3N2 A/Victoria/3/75. A FIG. 8 mostra o efeito do composto 1 (intraperitoneal, intramuscular e oral) na sobrevivência de ratinhos com o vírus Ébola. A FIG. 9 mostra o efeito do composto 1 (intraperitoneal, intramuscular e oral) na perda de peso em ratinhos infetados com o vírus Ébola. A FIG. 10 mostra o efeito do composto 1 (intramuscular e oral) na sobrevivência de ratinhos infetados com o vírus Ébola. FIG. 11 mostra o efeito do composto 1 (intramuscular e oral) na perda de peso em ratinhos infetados com o vírus Ébola. FIG. 12 mostra o efeito do composto 1 na sobrevivência de hamsters infetados com o vírus da Febre-Amarela. FIG. 13 mostra o efeito do composto 1 na perda de peso em hamsters infetados com o vírus da Febre-Amarela. FIG. 14 mostra a curva farmacocinética oral do composto 1 doseado a 10 mg/kg medida em ratos.
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA A invenção proporciona métodos e composições para inibição de ácido nucleico polimerases virais, tais como RNA e DNA polimerases, e métodos e composições que são úteis para o tratamento de infeções virais em sujeitos. Os métodos compreendem administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de fórmula I, ou um respetivo sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato, ou uma composição compreendendo um composto de fórmula I, ou um respetivo sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato, e um transportador farmaceuticamente aceitável. A composição ou método pode opcionalmente compreender um ou mais agentes antivirais adicionais. Os métodos e composições são úteis para o tratamento, supressão e/ou prevenção de infeções virais em sujeitos que podem surgir de infeção com um ou mais tipos de vírus. Assim, os métodos e composições são úteis para o tratamento, supressão e/ou prevenção antivirais de largo espetro.
Em particular, a presente invenção refere-se a métodos de tratamento, supressão ou e/ou prevenção de doenças ou estados clínicos relacionados com infeção virai, que compreendem a administração de um composto de fórmula I, ou respetivo sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato.
Os compostos de fórmula (I) são os seguintes:
em que A é OH ou NH2, e B é H ou NH2.
Assim, nalgumas formas de realização do composto de fórmula (I) , A é NH2.
Nalgumas formas de realização do composto de fórmula (I), B é NH2.
Nalgumas formas de realização do composto de fórmula (I), A é OH.
Ainda nalgumas formas de realização do composto de fórmula (I), B é H.
Ainda nalgumas formas de realização do composto de fórmula (I) , A é NH2 e B é H.
Ainda nalgumas formas de realização do composto de fórmula (I) , A é OH e B é NH2.
Ainda nalgumas formas de realização do composto de fórmula (I) , A é NH2 e B é NH2.
Ainda nalgumas formas de realização do composto de fórmula (I), AéOHeBéH. A presente invenção é baseada, em parte, em certas descobertas que são descritas mais completamente na secção Exemplos do presente pedido. Por exemplo, a presente invenção é baseada, em parte, na descoberta de que níveis de títulos virais em células foram acentuadamente reduzidos por tratamento com um composto de fórmula I. Assim, nalgumas formas de realização, a presente invenção
proporciona métodos para redução do título virai num fluido corporal ou célula, que compreendem contactar o referido fluido ou célula com um composto de fórmula I. A presente invenção é adicionalmente baseada, em parte, na descoberta de que níveis de títulos virais em células para vários vírus foram acentuadamente reduzidos por tratamento com um composto de fórmula I, desse modo indicando atividade antiviral de largo espetro para o composto de fórmula I contra uma variedade de estirpes virais. Assim, a presente invenção também proporciona métodos para redução do titulo virai para vários tipos, subtipos e/ou estirpes de vírus num fluido corporal ou célula, que compreendem contactar o referido fluido ou célula com um composto de fórmula I.
Os compostos da presente invenção são preparados em diferentes formas, tais como sais, hidratos, solvatos ou complexos, e a invenção inclui composições e métodos que abrangem todas as formas variantes dos compostos. Nalgumas formas de realização, os compostos são preparados como hidratos de sais.
Abreviaturas e Definições A abreviatura "PNP" refere-se a purina nucleósido fosforilase. 0 termo "composto(s) da invenção", como usado no presente documento, significa um composto de fórmula I, e pode incluir respetivos sais, formas tautoméricas, hidratos e/ou solvatos. Compostos de fórmula I também podem incluir respetivos solvatos ou hidratos de sais. 0 termo "solvato", como usado no presente documento, significa um composto de fórmula I, ou um respetivo sal farmaceuticamente aceitável, em que moléculas de um solvente adequado são incorporadas na rede cristalina. Um solvente adequado é fisiologicamente tolerável à dosagem administrada. Exemplos de solventes adequados são etanol, água e semelhantes. Quando água é o solvente, a molécula é referida como um "hidrato".
Uma "composição farmacêutica" refere-se a uma mistura de um ou mais dos compostos descritos no presente documento, ou respetivos sais farmaceuticamente aceitáveis, ou hidratos, com outros componentes químicos, tais como transportadores e excipientes fisiologicamente aceitáveis. A finalidade da composição farmacêutica é facilitar a administração de um composto num organismo. É pretendido que o termo "sal farmaceuticamente aceitável" inclua sais derivados de ácidos inorgânicos ou orgânicos, incluindo, por exemplo, ácido clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, perclórico, fosfórico, fórmico, acético, láctico, maleico, fumárico, succínico, tartárico, glicólico, salicilico, cítrico, metanossulfónico, benzenossulfónico, benzoico, malónico, trifluoroacético, tricloroacético, naftaleno-2-sulfónico e outros ácidos. Formas de sais farmaceuticamente aceitáveis também podem incluir formas em que a proporção de moléculas compreendendo o sal não é 1:1. Por exemplo, o sal pode compreender mais do que uma molécula de ácido inorgânico ou orgânico por molécula de base, tais como duas moléculas de ácido clorídrico por molécula de composto de fórmula (I) . Como outro exemplo, o sal pode compreender menos do que uma molécula de ácido inorgânico ou orgânico por molécula de base, tais como duas moléculas de composto de fórmula (I) por molécula de ácido tartárico. Sais também podem existir como solvatos ou hidratos. 0 termo "ácido" contempla todos os ácidos inorgânicos ou orgânicos farmaceuticamente aceitáveis. Ácidos inorgânicos incluem ácidos minerais, tais como ácidos hidro-hálicos, tais como os ácidos bromídrico e clorídrico, ácidos sulfúricos, ácidos fosfóricos e ácidos nítricos. Ácidos orgânicos incluem todos os ácidos carboxilicos alifáticos, aliciclicos e aromáticos farmaceuticamente aceitáveis, ácidos dicarboxilicos, ácidos tricarboxílicos e ácidos gordos. Ácidos preferenciais são ácidos C1-C20 carboxilicos alifáticos de cadeia linear ou ramificada, saturados ou insaturados, que estão opcionalmente substituídos com halogénio ou com grupos hidroxilo, ou ácidos C6-C12 carboxilicos aromáticos. Exemplos de tais ácidos são ácido carbónico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido acético, ácido propiónico, ácido isopropiónico, ácido valérico, alfa-hidroxiácidos, tais como ácido glicólico e ácido láctico, ácido cloroacético, ácido benzoico, ácido metanossulfónico e ácido salicílico. Exemplos de ácidos dicarboxilicos incluem ácido oxálico, ácido málico, ácido succínico, ácido tartárico e ácido maleico. Um exemplo de um ácido tricarboxílico é ácido cítrico. Ácidos gordos incluem todos os ácidos carboxilicos alifáticos ou aromáticos, saturados ou insaturados farmaceuticamente aceitáveis tendo 4 até 24 átomos de carbono. Exemplos incluem ácido butírico, ácido isobutírico, ácido sec-butirico, ácido láurico, ácido palmitico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico e ácido fenilesteárico. Outros ácidos incluem ácido glucónico, ácido glico-heptónico e ácido lactobiónico.
Como usado no presente documento, o termo "cerca de" é usado aqui de modo a significar aproximadamente, grosseiramente, em redor de ou na região de. Quando o termo "cerca de" é usado em conjunção com um intervalo numérico, modifica esse intervalo por extensão das fronteiras acima e abaixo dos valores numéricos apresentados. Em geral, o termo "cerca de" é usado no presente documento de modo a modificar um valor numérico acima e abaixo do valor apresentado por uma variância de 20 por cento para cima ou para baixo (maior ou menor).
Uma "quantidade eficaz", "quantidade suficiente" ou "quantidade terapeuticamente eficaz", como usado no presente documento, é uma quantidade de um composto que é suficiente para conferir resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clínicos. Como tal, a quantidade eficaz pode ser suficiente, por exemplo, para reduzir ou melhorar a gravidade e/ou duração da infeção viral, ou um ou mais sintomas respetivos, prevenir a progressão da infeção virai, prevenir a recorrência, desenvolvimento ou surgimento de um ou mais sintomas associados à infeção virai, prevenir ou reduzir a replicação ou multiplicação de um vírus, prevenir ou reduzir a produção e/ou libertação de uma partícula virai, intensificar ou melhorar de outro modo o(s) efeito(s) profilático(s) ou terapêutico(s) de outra terapia. Uma quantidade eficaz também inclui a quantidade do composto de fórmula I que evita ou atenua substancialmente efeitos secundários indesejáveis.
Como usado no presente documento e bem compreendido na área, "tratamento" é uma abordagem para se obterem resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clínicos. Resultados clínicos benéficos ou desejados podem incluir mas não se limitam a alívio ou melhoria de um ou mais sintomas ou estados clínicos, diminuição da extensão da doença, um estado de doença estabilizado (isto é, que não piora), prevenção da disseminação da doença, retardamento ou abrandamento da progressão da doença, melhoria ou paliação do estado de doença e remissão (parcial ou total), seja detetável ou indetetável. "Tratamento" também pode significar prolongamento da sobrevivência em comparação com a sobrevivência esperada se não for recebido tratamento. 0 termo "transportador" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veiculo com o qual um composto é administrado. Exemplos não limitadores de tais transportadores farmacêuticos incluem líquidos, tais como água e óleos, incluindo os de petróleo, de origem animal, vegetal ou sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo e semelhantes. Os transportadores farmacêuticos também podem ser solução salina, goma acácia, gelatina, pasta de amido, talco, queratina, sílica coloidal, ureia e semelhantes.
Adicionalmente, podem ser utilizados agentes auxiliares, estabilizadores, espessantes, lubrificantes e corantes. Outros exemplos de transportadores farmacêuticos adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin; incorporado no presente documento a título de referência na sua totalidade.
Os termos "animal", "sujeito" e "paciente", como usados no presente documento, incluem todos os membros do reino animal, incluindo mas não se limitando a mamíferos, animais (por exemplo, gatos, cães, cavalos, suínos, etc.) e humanos.
Descrição A presente invenção proporciona métodos e composições para inibição de ácido nucleico polimerases virais, tais como DNA e/ou RN A polimerases virais, e métodos e composições que são úteis para o tratamento de infeções virais em sujeitos. Os métodos compreendem administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de fórmula I, ou um respetivo sal farmaceuticamente aceitável, ou uma composição compreendendo um composto de fórmula I, ou um respetivo sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato, e um transportador farmaceuticamente aceitável. A composição ou método pode opcionalmente compreender um ou mais agentes antivirais adicionais. Os métodos e composições são úteis para o tratamento, supressão e/ou prevenção de infeções virais em sujeitos que podem surgir de infeção por uma ou mais familias, géneros, subtipos, serótipos ou estirpes de vírus.
Os compostos de fórmula I são derivados 9-desaza-adenina genericamente conhecidos como imucilinas, cujas sínteses são descritas, por exemplo, em WO 03/80620, e por Evans et al. , em Tetrahedron 2000, 56, 3053 e J. Org. Chem. 2001, 66(17), 5723. Sínteses de estruturas semelhantes são discutidas, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 5,985,848; 6,066,722; 6,228,741, e publicações PCT WO 2003/080620 e 2008/030119. Derivados imucilina foram estudados como inibidores de PNP (Ver Kicska et al., J. Biol. Chem. 2002, 277, 3219-3225, e Kicska et al., J. Biol. Chem. 2002, 277, 3226-3231). Algumas imucilinas também foram estudadas como inibidores de 5'-metiltioadenosina fosforilase (MTAP) ou 5'-metiltioadenosina nucleosidase (MTAN). Tais mecanismos foram implicados no tratamento de cancro e infeções bacterianas (Ver WO 03/080620).
Os compostos de fórmula I podem exibir propriedades tautoméricas. Assim, a presente invenção também abrange formas tautoméricas de compostos de fórmula I, e respetivas misturas. Será adicionalmente apreciado que alguns compostos existem como sais farmaceuticamente aceitáveis, solvatos e/ou hidratos, cada um dos quais pertence também às formas de realização da invenção.
Nalgumas formas de realização, o composto de fórmula I existe como um sal farmaceuticamente aceitável. Nalgumas formas de realização, a forma de sal consiste numa proporção de cerca de 1:1 de ácido e composto de fórmula I. Nalgumas formas de realização, a forma de sal consiste numa proporção maior do que cerca de 1:1 de ácido e composto de fórmula I. Nalgumas formas de realização, a forma de sal consiste numa proporção de cerca de 2:1 de ácido e composto de fórmula I. Nalgumas formas de realização, a forma de sal existe como um hidrato.
Nalgumas formas de realização, o composto de fórmula I existe como um hidrato ou solvato.
Os compostos da revelação são consequentemente úteis no tratamento e/ou prevenção de infeções virais num hospedeiro ou sujeito. Os métodos da invenção podem ser utilizados no tratamento e/ou prevenção de estados de doença ou estados clínicos causados e/ou relacionados com tais infeções virais. Exemplos de tais infeções virais incluem mas não se limitam a adenovirus, rinovírus, hepatite, vírus da imunodeficiência, poliomielite, sarampo, Ébola, Coxsackie, Rino, Nilo Ocidental, varíola, encefalite, febre-amarela, febre de Dengue, influenza (incluindo humana, aviária e suína), Lassa, coriomeningite linfocitica, Junin, Machuppo, Guanarito, hantavirus, Febre do Vale do Rift, La Crosse, encefalite da Califórnia, Crimeia-Congo, Marburg, Encefalite Japonesa, Floresta de Kyasanur, encefalite equina Venezuelana, encefalite equina Oriental, encefalite equina Ocidental, síndroma respiratória aguda grave (SARS), parainfluenza, respiratório sincicial, Punta Toro, Tacaribe e Pachindae.
Nalgumas formas de realização, os compostos da invenção são utilizados no tratamento ou prevenção de uma infeção virai associada a um vírus. Nalgumas formas de realização, a infeção virai compreende infeção com um ou mais tipos de vírus. Nalgumas formas de realização, a infeção virai compreende infeção por um ou mais vírus selecionados do grupo que consiste em vírus orthmyxoviridae, paramyxoviridae, arenaviridae, bunyaviridae, flaviviridae, filoviridae, togaviridae, picornaviridae e coronaviridae. Nalgumas formas de realização, a infeção virai compreende infeção por um ou mais vírus selecionados do grupo que consiste em adenovirus, rinovírus, vírus da hepatite, vírus da imunodeficiência, poliomielite, sarampo, Ébola, Coxsackie, Rino, Nilo Ocidental, varíola, encefalite, febre-amarela, febre de Dengue, influenza (incluindo humana, aviária e suína), Lassa, coriomeningite linfocítica, Junin, Machuppo, Guanarito, hantavirus, Febre do Vale do Rift, La Crosse, encefalite da Califórnia, Crimeia-Congo, Marburg, Encefalite Japonesa, Floresta de Kyasanur, encefalite equina Venezuelana, encefalite equina Oriental, encefalite equina Ocidental, síndroma respiratória aguda grave (SARS), parainfluenza, respiratório sincicial, Punta Toro, Tacaribe e Pachindae.
Nalgumas formas de realização, a infeção virai compreende infeção por um ou mais vírus selecionados do grupo que consiste em adenovirus, vírus da febre de Dengue, influenza A e influenza B (incluindo humana, aviária e suína), Junin, sarampo, parainfluenza, Pichinde, Punta Toro, respiratório sincicial, rinovírus, Febre do Vale do Rift, síndroma respiratória aguda grave (SARS), Tacaribe, encefalite equina Venezuelana, Nilo Ocidental e febre-amarela.
Nalgumas formas de realização, o vírus é Ébola, Marburg, febre-amarela, influenza A ou influenza B. Nalgumas formas de realização, o vírus é Ébola. Nalgumas formas de realização, o vírus é Marburg. Nalgumas formas de realização, o vírus é febre-amarela. Nalgumas formas de realização, o vírus é influenza A ou influenza B.
Nalgumas formas de realização, o vírus é Nilo Ocidental ou febre de Dengue. Nalgumas formas de realização o virus é Nilo Ocidental. Nalgumas formas de realização, o virus é febre de Dengue.
Nalgumas formas de realização, os compostos da invenção são utilizados para inibir a replicação ou infetividade de um vírus. Nalgumas formas de realização, os compostos da invenção são utilizados para inibir o crescimento de uma célula infetada com um vírus. Exemplos dos referidos vírus incluem mas não se limitam a vírus das famílias orthmyxoviridae, paramyxoviridae, arenaviridae, bunyaviridae, flaviviridae, filoviridae, togaviridae, picornaviridae e coronaviridae. Exemplos específicos de vírus incluem mas não se limitam a adenovirus, rinovírus, hepatite, vírus da imunodeficiência, poliomielite, sarampo, Ébola, Coxsackie, Rino, Nilo Ocidental, varíola, encefalite, febre-amarela, febre de Dengue, influenza (incluindo humana, aviária e suína), Lassa, coriomeningite linfocítica, Junin, Machuppo, Guanarito, hantavirus, Febre do Vale do Rift, La Crosse, encefalite da Califórnia, Crimeia-Congo, Marburg, Encefalite Japonesa, Floresta de Kyasanur, encefalite equina Venezuelana, encefalite equina
Oriental, encefalite equina Ocidental, síndroma respiratória aguda grave (SARS), parainfluenza, respiratório sincicial, Punta Toro, Tacaribe e Pachindae.
Assim, nalgumas formas de realização, o vírus é selecionado do grupo que consiste em vírus das famílias orthmyxoviridae, paramyxoviridae, arenaviridae, bunyaviridae, flaviviridae, filoviridae, togaviridae, picornaviridae e coronaviridae. Nalgumas formas de realização, a infeção virai compreende um vírus selecionado do grupo que consiste em vírus da hepatite, vírus da imunodeficiência, poliomielite, sarampo, Ébola, Coxsackie, Rino, Nilo Ocidental, varíola, encefalite, febre-amarela, febre de Dengue, influenza (incluindo humana, aviária e suína), Lassa, coriomeningite linfocítica, Junin, Machuppo, Guanarito, hantavirus, Febre do Vale do Rift, La Crosse, encefalite da Califórnia, Crimeia-Congo, Marburg, Encefalite Japonesa, Floresta de Kyasanur, encefalite equina Venezuelana, encefalite equina Oriental, encefalite equina Ocidental, síndroma respiratória aguda grave (SARS), parainfluenza, respiratório sincicial, Punta Toro, Tacaribe e Pachindae.
Nalgumas formas de realização, a infeção virai compreende um vírus selecionado do grupo que consiste em adenovirus, vírus da febre de Dengue, influenza A e influenza B (incluindo humana, aviária e suína), Junin, sarampo, parainfluenza, Pichinde, Punta Toro, respiratório sincicial, rinovírus, Febre do Vale do Rift, síndroma respiratória aguda grave (SARS), Tacaribe, encefalite equina Venezuelana, Nilo Ocidental e febre-amarela.
Nalgumas formas de realização, o vírus é Ébola, Marburg, febre-amarela, influenza A ou influenza B. Nalgumas formas de realização, o vírus é Ébola. Nalgumas formas de realização, o vírus é Marburg. Nalgumas formas de realização, o vírus é febre-amarela. Nalgumas formas de realização, o vírus é influenza A ou influenza B.
Nalgumas formas de realização, o vírus é Nilo Ocidental ou febre de Dengue. Nalgumas formas de realização, o vírus é Nilo Ocidental. Nalgumas formas de realização, o vírus é febre de Dengue.
Nalgumas formas de realização, a presente invenção proporciona um método para inibição de uma RNA ou DNA polimerase virai num sujeito, que compreende administrar ao referido sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de fórmula I, ou um respetivo sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato.
De acordo com o sistema de classificação de Baltimore, os vírus de RNA polimerase podem ser classificados em grupos, tais como, por exemplo, vírus de filamentação dupla, vírus de filamentação simples de sentido positivo e vírus de filamentação simples de sentido negativo. Famílias de filamentação simples de sentido positivo incluem, por exemplo, coronaviridae, picornaviridae, togaviridae, flaviviridae e semelhantes. Famílias de filamentação simples de sentido negativo incluem, por exemplo, paramyxoviridae, arenaviridae, bunyaviridae, orthomyxoviridae, filoviridae e semelhantes. Cada uma das famílias de vírus pode ser adicionalmente classificada em género, espécie e serótipo (ou subtipo). Outras designações para designações taxonómicas de vírus são apresentadas pelas diretrizes de classificação de acordo com o Comité Internacional de Taxonomia de Vírus.
Nalgumas formas de realização, a RNA polimerase é de filamentação dupla. Nalgumas formas de realização, a RNA polimerase é de filamentação simples. Nalgumas formas de realização, a RNA polimerase é de filamentação simples de sentido positivo. Nalgumas formas de realização, a RNA polimerase é de filamentação simples de sentido negativo.
Nalgumas formas de realização, os métodos da presente invenção proporcionam inibição de largo espetro de vírus e/ou RNA polimerases de uma ou mais famílias, géneros, subtipos, estirpes e/ou serótipos de vírus. Nalgumas formas de realização, os métodos proporcionam tratamento, supressão, ou prevenção de infeção de largo espetro de uma ou mais famílias, géneros, subtipos, estirpes ou serótipos de vírus. Nalgumas formas de realização, o espetro largo abrange mais do que duas famílias, géneros, subtipos, estirpes e/ou serótipos de vírus.
Nalgumas formas de realização, a presente invenção proporciona um método para inibição de polimerases virais de uma ou mais famílias, géneros, subtipos, serótipos ou estirpes de vírus. Nalgumas formas de realização, a presente invenção proporciona um método de tratamento, supressão e/ou prevenção de uma infeção virai, em que a infeção virai resulta de infeção com uma ou mais famílias, géneros, subtipos, serótipos ou estirpes de vírus.
Nalgumas formas de realização, as polimerases virais ou vírus provêm de um ou mais géneros de vírus. Nalgumas formas de realização, as polimerases virais ou vírus provêm de uma ou mais espécies de vírus. Nalgumas formas de realização, as polimerases virais ou vírus são selecionados de um ou mais subtipos ou serótipos. Nalgumas formas de realização, as polimerases virais ou vírus são selecionados de uma ou mais estirpes.
Nalgumas formas de realização, a RNA polimerase virai é selecionada do grupo que consiste em polimerases das famílias orthmyxoviridae, paramyxoviridae, arenaviridae, bunyaviridae, flaviviridae, filoviridae, togaviridae, picornaviridae e coronaviridae. Nalgumas formas de realização, a RNA polimerase virai é selecionada do grupo que consiste em polimerases das famílias orthmyxoviridae, paramyxoviridae, arenaviridae, bunyaviridae, flaviviridae e coronaviridae. Nalgumas formas de realização, a RNA polimerase virai compreende uma polimerase selecionada do grupo que consiste em polimerase virai de hepatite, vírus da imunodeficiência, poliomielite, sarampo, Ébola, Coxsackie, Rino, Nilo Ocidental, varíola, encefalite, febre-amarela, febre de Dengue, influenza (incluindo humana, aviária e suína), Lassa, coriomeningite linfocítica, Junin, Machuppo, Guanarito, hantavirus, Febre do Vale do Rift, La Crosse, encefalite da Califórnia, Crimeia-Congo, Marburg, Encefalite Japonesa, Floresta de Kyasanur, encefalite equina Venezuelana, encefalite equina Oriental, encefalite equina Ocidental, síndroma respiratória aguda grave (SARS), parainfluenza, respiratório sincicial, Punta Toro, Tacaribe e Pachindae.
Nalgumas formas de realização, a RNA polimerase virai é selecionada do grupo que consiste em polimerase virai de adenovirus, febre de Dengue, influenza A e influenza B (incluindo humana, aviária e suína), Junin, sarampo, parainfluenza, Pichinde, Punta Toro, respiratório sincicial, rinovirus, Febre do Vale do Rift, síndroma respiratória aguda grave (SARS), Tacaribe, encefalite equina Venezuelana, Nilo Ocidental e febre-amarela.
Nalgumas formas de realização, a RNA polimerase virai é polimerase virai de Ébola, Marburg, febre-amarela, influenza A ou influenza B. Nalgumas formas de realização, a RNA polimerase virai é polimerase virai de Ébola. Nalgumas formas de realização, a RNA polimerase virai é polimerase viral de Marburg. Nalgumas formas de realização, a RNA polimerase virai é polimerase virai de febre-amarela. Nalgumas formas de realização, a RNA polimerase virai é polimerase viral de influenza A ou polimerase virai de influenza B. Nalgumas formas de realização, a polimerase virai é polimerase virai de Nilo Ocidental ou febre de Dengue. Nalgumas formas de realização, a polimerase virai é polimerase virai de Nilo Ocidental. Nalgumas formas de realização, a polimerase virai é polimerase virai de febre de Dengue.
Nalgumas formas de realização, os vírus são selecionados do grupo que consiste nas famílias orthmyxoviridae, paramyxoviridae, arenaviridae, bunyaviridae, flaviviridae, filoviridae, togaviridae, picornaviridae e coronaviridae. Nalgumas formas de realização, os vírus são selecionados do grupo que consiste em hepatite, vírus da imunodeficiência, poliomielite, sarampo, Ébola, Coxsackie, Rino, Nilo Ocidental, varíola, encefalite, febre-amarela, febre de Dengue, influenza (incluindo humana, aviária e suína), Lassa, coriomeningite linfocítica, Junin, Machuppo, Guanarito, hantavirus, Febre do Vale do Rift, La Crosse, encefalite da Califórnia, Crimeia-Congo, Marburg,
Encefalite Japonesa, Floresta de Kyasanur, encefalite equina Venezuelana, encefalite equina Oriental, encefalite equina Ocidental, síndroma respiratória aguda grave (SARS), parainfluenza, respiratório sincicial, Punta Toro, Tacaribe e Pachindae.
Nalgumas formas de realização, os vírus são selecionados do grupo que consiste em adenovirus, vírus de febre de Dengue, influenza A e influenza B (incluindo humana, aviária e suína), Junin, sarampo, parainfluenza, Pichinde, Punta Toro, respiratório sincicial, rinovírus, Febre do Vale do Rift, síndroma respiratória aguda grave (SARS), Tacaribe, encefalite equina Venezuelana, Nilo Ocidental e febre-amarela .
Nalgumas formas de realização, o vírus é Ébola, Marburg, febre-amarela, influenza A ou influenza B. Nalgumas formas de realização, o vírus é Ébola. Nalgumas formas de realização, o vírus é Marburg. Nalgumas formas de realização, o vírus é febre-amarela. Nalgumas formas de realização, o vírus é influenza A ou influenza B.
Nalgumas formas de realização, o vírus é Nilo Ocidental ou febre de Dengue. Nalgumas formas de realização, o vírus é Nilo Ocidental. Nalgumas formas de realização, o vírus é febre de Dengue. 0 genoma do virus de influenza A tem uma RNA polimerase dependente de RNA, que catalisa a transcrição e replicação de RNA virai. Uma vez que a transcrição e replicação do vírus dependem da atividade da RNA polimerase, esta enzima tornou-se interessante como alvo para o desenvolvimento de novos compostos antivirais na aurora da emergência recente de vírus resistentes a fármacos. Vírus podem desenvolver resistência a um fármaco por tratamento, desse modo diminuindo a eficácia do fármaco e fazendo com que o sujeito tenha de ser tratado com outro fármaco antiviral. Assim, seria útil um fármaco ou tratamento exibindo eficácia simultânea contra um espetro largo de estirpes virais.
Além disso, a composição ou método pode compreender adicionalmente um ou mais agentes antivirais adicionais em combinação com um composto de fórmula I. Exemplos de tais agentes antivirais incluem mas não se limitam a Cytovene, Ganciclovir, fosfonoformato trissódico, Ribavirin, interferão, d4T, ddl, AZT, e Amantadina, Rimandatina e outros agentes anti-influenza; Aciclovir e agentes relacionados, Foscarnet e outros agentes anti-virus herpes. Exemplos não limitadores de inibidores de neuraminidase incluem laninamivir, oseltamivir, zanamivir e peramivir.
Compostos relacionados com a inibição de influenza polimerase são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 7,388,002; 7,560,434, e nos Pedidos de Patentes U.S. Nos. 12/440,697 (publicada como U.S. Publicação de Patente U.S. No. 20100129317), e 12/398,866 (publicada como Publicação de Patente U.S. No. 20090227524) . Presentemente há um inibidor de influenza polimerase em ensaios clínicos, conhecido como T-705 (favipiravir; 6-fluoro-3-hidroxi-2-pirazinocarboxamida) . O T-705 possui atividade antiviral potente e de largo espetro contra múltiplas estirpes de vírus influenza infecioso in vitro e in vivo (Kiso et ai., PNAS 2010, 107, 882-887) . O T-705 é caracterizado por um mecanismo de ação que é diferente da maior parte dos fármacos anti-virus influenza.
Outra classe de compostos utilizados como antivirais consiste em inibidores de M2 (Ver, Pielak, R., Schnell, J., & Chou, J. (2009) Proceedings of the National Academy of Sciences, 106 (18), 7379-7384). Membros exemplificativos desta classe incluem amantadina e rimantadina.
Assim, nalgumas formas de realização, os métodos da invenção também compreendem a administração de um ou mais agentes antivirais adicionais.
Nalgumas formas de realização, um agente antiviral adicional é selecionado do grupo que consiste em Cytovene, Ganciclovir, fosfonoformato trissódico, Ribavirin, interferão, d4T, ddl, AZT, e amantadina, rimandatina, T-705 e outros agentes anti-influenza; Aciclovir e agentes relacionados, Foscarnet e outros agentes anti-virus herpes.
Nalgumas formas de realização, um agente antiviral adicional é um agente anti-influenza. Nalgumas formas de realização, um agente antiviral adicional é um inibidor de neuraminidase. Nalgumas formas de realização, um agente antiviral adicional é selecionado do grupo que consiste em laninamivir, oseltamivir, zanamivir e peramivir. Nalgumas formas de realização, um agente antiviral adicional é paramivir. Nalgumas formas de realização, um agente antiviral adicional é laninamivir. Nalgumas formas de realização, um agente antiviral adicional é oseltamivir. Nalgumas formas de realização, um agente antiviral adicional é zanamivir.
Nalgumas formas de realização, um agente antiviral adicional é um inibidor de M2. Nalgumas formas de realização, um agente antiviral adicional é selecionado do grupo que consiste em amantadina e rimandatina.
Nalgumas formas de realização, os métodos da invenção compreendem a administração de dois agentes antivirais adicionais. Nalgumas formas de realização, os agentes antivirais adicionais são um inibidor de neuraminidase e um inibidor de M2. Nalgumas formas de realização, os agentes antivirais adicionais são selecionados dos grupos que consistem em 1) laninamivir, oseltamivir, zanamivir e peramivir, e 2) amantadina e rimandatina. Nalgumas formas de realização, os agentes antivirais adicionais são peramivir e amantadina. Nalgumas formas de realização, os agentes antivirais adicionais são peramivir e rimantadina. A presente invenção proporciona métodos para inibição de uma RN A ou DNA polimerase virai, que compreendem contactar a polimerase com uma quantidade inibidora eficaz do composto de fórmula I, ou um respetivo sal farmaceuticamente aceitável ou solvato.
Nalgumas formas de realização, a presente invenção proporciona um método para o tratamento de um sujeito que sofre de uma infeção virai, que compreende administrar ao referido sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de fórmula I, ou respetivo sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato.
Nalgumas formas de realização, a presente invenção proporciona um método para supressão de uma infeção virai num sujeito, que compreende administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de fórmula I, ou respetivo sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato.
Nalgumas formas de realização, a presente invenção proporciona um método para o tratamento de um sujeito que sofre de uma infeção por RNA virai, que compreende administrar ao referido sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de fórmula I, ou respetivo sal farmaceuticamente aceitável ou solvato.
Nalgumas formas de realização, a infeção virai compreende infeção por um ou mais vírus.
Nalgumas formas de realização, as infeções virais são infeções selecionadas de vírus das famílias orthmyxoviridae, paramyxoviridae, arenaviridae, bunyaviridae, flaviviridae, filoviridae, togaviridae, picornaviridae ou coronaviridae, ou qualquer combinação respetiva. Nalgumas formas de realização, as infeções virais são infeções selecionadas de vírus de hepatite, vírus da imunodeficiência, poliomielite, sarampo, Ébola, Coxsackie, Rino, Nilo Ocidental, varíola, encefalite, febre-amarela, febre de Dengue, influenza (incluindo humana, aviária e suína), Lassa, coriomeningite linfocítica, Junin, Machuppo, Guanarito, hantavirus, Febre do Vale do Rift, La Crosse, encefalite da Califórnia, Crimeia-Congo, Marburg, Encefalite Japonesa, Floresta de Kyasanur, encefalite equina Venezuelana, encefalite equina Oriental, encefalite equina Ocidental, síndroma respiratória aguda grave (SARS), parainfluenza, respiratório sincicial, Punta Toro, Tacaribe e Pachindae, ou qualquer combinação respetiva.
Nalgumas formas de realização, a infeção virai compreende infeção por um ou mais vírus selecionados do grupo que consiste em adenovirus, vírus de febre de Dengue, influenza A e influenza B (incluindo humana, aviária e suína), Junin, sarampo, parainfluenza, Pichinde, Punta Toro, respiratório sincicial, rinovírus, Febre do Vale do Rift, síndroma respiratória aguda grave (SARS), Tacaribe, encefalite equina Venezuelana, Nilo Ocidental e febre-amarela.
Nalgumas formas de realização, o vírus é Ébola, Marburg, febre-amarela, influenza A ou influenza B. Nalgumas formas de realização, o vírus é Ébola. Nalgumas formas de realização, o vírus é Marburg. Nalgumas formas de realização, o vírus é febre-amarela. Nalgumas formas de realização, o vírus é influenza A ou influenza B.
Nalgumas formas de realização, o vírus é Nilo Ocidental ou febre de Dengue. Nalgumas formas de realização, o vírus é Nilo Ocidental. Nalgumas formas de realização, o vírus é febre de Dengue.
Nalgumas formas de realização, as infeções virais são infeções selecionadas de vírus de influenza A, influenza B, PIV, RSV, Junin, Pichinde, Febre do Vale do Rift, Febre de Dengue, sarampo, Febre-Amarela e SARS-CoV, ou qualquer combinação respetiva. Nalgumas formas de realização, as infeções virais são infeções selecionadas de influenza A e B, respetivos subtipos, respetivas estirpes, ou qualquer combinação respetiva. Nalgumas formas de realização, as infeções virais são infeções selecionadas de Ébola, Marburg ou febre-amarela. Nalgumas formas de realização, a infeção virai é Ébola. Nalgumas formas de realização, a infeção virai é Marburg. Nalgumas formas de realização, a infeção viral é febre-amarela. Nalgumas formas de realização, a infeção virai é Nilo Ocidental ou febre de Dengue. Nalgumas formas de realização, a infeção virai é Nilo Ocidental. Nalgumas formas de realização, a infeção virai é febre de Dengue.
Nalgumas formas de realização, a revelação proporciona a utilização de composições farmacêuticas e/ou medicamentos que compreendem o composto de fórmula I, ou um respetivo sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato, num método de tratamento de uma infeção virai e/ou estado de doença e/ou estado clinico causado ou relacionado com tal infeção virai .
Nalgumas formas de realização, o método de tratamento compreende os passos seguintes: i) identificar um sujeito necessitado de tal tratamento; (ii) proporcionar um composto de fórmula I, ou um respetivo sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato, ou uma composição compreendendo um composto de fórmula I, ou um respetivo sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato, e (iii) administrar o referido composto ou composição numa quantidade terapeuticamente eficaz para tratar a infeção virai no sujeito ou para inibir a atividade de DNA ou RNA polimerase virai num sujeito necessitado de tal tratamento.
Nalgumas formas de realização, a eficácia do tratamento resulta da inibição de uma DNA ou RNA polimerase virai. Nalgumas formas de realização, a eficácia do tratamento resulta da inibição de polimerases virais de uma ou mais famílias de vírus.
Nalgumas formas de realização, as polimerases virais ou vírus provêm de um ou mais géneros de vírus. Nalgumas formas de realização, as polimerases virais ou vírus provêm de uma ou mais espécies de vírus. Nalgumas formas de realização, as polimerases virais ou vírus são selecionadas de um ou mais subtipos, serótipos ou estirpes.
Nalgumas formas de realização, o método é realizado in vi vo.
Nalgumas formas de realização, o sujeito é um mamífero.
Nalgumas formas de realização, o sujeito é um humano. Nalgumas formas de realização, o sujeito é aviário.
Nalgumas formas de realização, o sujeito é um suíno ou porco.
Nalgumas formas de realização, o fluido corporal é sangue. Nalgumas formas de realização, o fluido corporal é plasma. Nalgumas formas de realização, o fluido corporal é soro sanguíneo.
Nalgumas formas de realização, o composto ou composição é administrado intravenosamente, interperitonealmente, intramuscularmente ou oralmente.
Nalgumas formas de realização, o composto ou composição é administrado intravenosamente.
Nalgumas formas de realização, o composto ou composição é administrado intraperitonealmente.
Nalgumas formas de realização, o composto ou composição é administrado intramuscularmente.
Nalgumas formas de realização, o composto ou composição é administrado oralmente.
Os métodos compreendem administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de fórmula I, ou um respetivo sal farmaceuticamente aceitável, ou uma composição compreendendo um composto de fórmula I, ou um respetivo sal farmaceuticamente aceitável, e um transportador farmaceuticamente aceitável. Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos dos peritos na técnica e incluem, por exemplo, adjuvantes, diluentes, excipientes, agentes de enchimento, lubrificantes e veículos. Muitas vezes, o transportador farmaceuticamente aceitável é quimicamente inerte para os compostos ativos e não é tóxico nas condições de utilização. Exemplos de transportadores farmaceuticamente aceitáveis podem incluir, por exemplo, água ou solução salina, polímeros, tais como polietileno glicol, hidratos de carbono e respetivos derivados, óleos, ácidos gordos ou álcoois. Nalgumas formas de realização, o transportador é solução salina ou água. Nalgumas formas de realização, o transportador é solução salina. Nalgumas formas de realização, o transportador é água.
Nalgumas formas de realização, o método de prevenção ou supressão da infeção ou estado de doença virai compreende os passos seguintes: i) identificar um sujeito necessitado de tal tratamento; (ii) proporcionar um composto de fórmula I, ou um respetivo sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato, ou uma composição compreendendo um composto de fórmula I, ou um respetivo sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato, e (iii) administrar o referido composto ou composição numa quantidade terapeuticamente eficaz para prevenir ou suprimir a infeção ou estado de doença virai no sujeito ou para inibir a atividade de DNA ou RNA polimerase virai num sujeito necessitado de tal tratamento.
Os compostos da presente invenção são preparados em diferentes formas, tais como sais, hidratos, solvatos, tautómeros ou complexos, e a invenção inclui métodos abrangendo todas as formas variantes dos compostos.
Nalgumas formas de realização, os métodos da invenção compreendem sais farmaceuticamente aceitáveis do composto de fórmula I. Um composto de fórmula I também pode ser formulado como um sal farmaceuticamente aceitável, por exemplo, sal de adição de ácido, e respetivos complexos. A preparação de tais sais pode facilitar a utilização farmacológica por alteração das caracteristicas fisicas do agente sem prevenir o seu efeito fisiológico. Exemplos de alterações úteis de propriedades fisicas incluem mas não se limitam a diminuição do ponto de fusão, para facilitar a administração transmucosa, e aumento da solubilidade, para facilitar a administração de concentrações mais elevadas do fármaco.
Os temas da invenção são sistemas in vitro e in vivo, incluindo, por exemplo, células ou tecidos isolados ou cultivados, sistemas de ensaio in vitro não celulares e animais (por exemplo, um anfíbio, um pássaro, um peixe, um mamífero, um marsupial, um humano, um animal doméstico, tal como, por exemplo, um gato, cão, macaco, ratinho ou rato, ou um animal comercial, tal como, por exemplo, uma vaca ou porco).
Os compostos da invenção podem ser formulados em composições farmacêuticas para administração a sujeitos numa forma biologicamente compatível adequada para administração in vivo. De acordo com outro aspeto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo compostos de fórmula I em mistura com um diluente e/ou transportador farmaceuticamente aceitável. 0 transportador farmaceuticamente aceitável deve ser "aceitável" no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da composição e não ser prejudicial para o respetivo recetor. Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis empregues aqui podem ser selecionados de vários materiais orgânicos ou inorgânicos que são utilizados como materiais para formulações farmacêuticas e que são incorporados como agentes analgésicos, tampões, aglutinantes, desintegrantes, diluentes, emulsificadores, excipientes, agentes de extensão, agentes deslizantes, solubilizadores, estabilizadores, agentes de suspensão, agentes de tonicidade, veículos e agentes para aumento da viscosidade. Também podem ser adicionados aditivos farmacêuticos, tais como antioxidantes, aromáticos, corantes, agentes de melhoria do sabor, conservantes e edulcorantes. Exemplos de transportadores farmacêuticos aceitáveis incluem carboxi-metilcelulose, celulose cristalina, glicerina, goma arábica, lactose, estearato de magnésio, metilcelulose, pós, solução salina, alginato de sódio, sucrose, amido, talco e água, entre outros. Nalgumas formas de realização, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência regulamentadora do estado Federal ou do governo de um estado ou listado na Farmacopeia dos E.U.A. ou outra farmacopeia genericamente reconhecida para utilização em animais, e mais particularmente em humanos.
Surfactantes, tais como, por exemplo, detergentes, também são adequados para utilização nas formulações. Exemplos específicos de surfactantes incluem polivinilpirrolidona, álcoois polivinílicos, copolímeros de acetato de vinilo e de vinilpirrolidona, polietilenoglicóis, álcool benzílico, manitol, glicerol, sorbitol ou ésteres polioxietilenados de sorbitano; lecitina ou carboximetilcelulose sódica, ou derivados acrílicos, tais como metacrilatos e outros, surfactantes aniónicos, tais como estearatos alcalinos, em particular estearato de sódio, potássio ou amónio; estearato de cálcio ou estearato de trietanolamina; alquilsulfatos, em particular laurilsulfato de sódio e cetilsulfato de sódio; dodecilbenzenossulfonato de sódio ou dioctilsulfossuccinato de sódio, ou ácidos gordos, em particular os derivados de óleo de coco, surfactantes catiónicos, tais como sais de amónio quaternário solúveis em água de fórmula N+R'R"R"'R""Y~, em que os radicais R são radicais hidrocarbonados opcionalmente hidroxilados idênticos ou diferentes e Y~ é um anião de um ácido forte, como aniões halogeneto, sulfato e sulfonato; brometo de cetiltrimetilamónio é um dos surfactantes catiónicos que podem ser utilizados, sais de amina de fórmula N+R'R"R"', em os radicais R são radicais hidrocarbonados opcionalmente hidroxilados idênticos ou diferentes; cloridrato de octadecilamina é um dos surfactantes catiónicos que podem ser utilizados, surfactantes não iónicos, tais como ésteres de sorbitano opcionalmente polioxietilenados, em particular Polissorbato 80, ou éteres de alquilo polioxietilenados; estearato de polietilenoglicol, derivados polioxietilenados de óleo de rícino, ésteres de poliglicerol, álcoois gordos polioxietilenados, ácidos gordos polioxietilenados ou copolímeros de óxido de etileno e de óxido de propileno, surfactantes anfotéricos, tais como compostos laurilo de betaína substituídos.
Quando administrados a um sujeito, os compostos de fórmula I e transportadores farmaceuticamente aceitáveis podem ser esterilizados. Nalgumas formas de realização, água é um transportador quando o composto de fórmula I é administrado intravenosamente. Nalgumas formas de realização, o transportador é uma solução salina quando o composto de fórmula I é administrado intravenosamente. Soluções aquosas de dextrose e glicerol também podem ser empregues como transportadores líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Transportadores farmacêuticos adequados também podem incluir excipientes tais como amido, glucose, lactose, sucrose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite em pó desnatado, glicerol, propileno, glicol, polietilenoglicol 300, água, etanol, polissorbato 20 e semelhantes. As presentes composições, se desejado, também podem conter quantidades muito pequenas de agentes humedecedores ou emulsificadores, ou agentes de tamponamento do pH.
As formulações farmacêuticas da presente invenção são preparadas por métodos bem conhecidos na área farmacêutica. Por exemplo, os compostos de fórmula I são associados a um transportador e/ou diluente, na forma de uma suspensão ou solução. Opcionalmente também são adicionados um ou mais ingredientes acessórios (por exemplo, tampões, agentes aromatizantes, agentes com atividade de superfície e semelhantes). A escolha do transportador é determinada pela solubilidade e natureza química dos compostos, via de administração escolhida e prática farmacêutica comum.
Nalgumas formas de realização, a formulação compreende um composto de fórmula I e água. Nalgumas formas de realização, a formulação compreende um composto de fórmula I e solução salina.
Adicionalmente, os compostos da presente invenção são administrados a um sujeito humano ou animal por procedimentos conhecidos, incluindo, sem limitação, administração oral, administração sublingual ou bucal, administração parentérica, administração transdérmica, via inalação ou intranasalmente, vaginalmente, retalmente e intramuscularmente. Os compostos da invenção são administrados parentericamente, por injeção epifascial, intracapsular, intracraniana, intracutânea, intratecal, intramuscular, intraorbital, intraperitoneal, intraespinal, intraesterno, intravascular, intravenosa, parenquimatosa, subcutânea ou sublingual, ou através de cateter. Nalgumas formas de realização, o composto é administrado ao sujeito por distribuição intramuscular. Nalgumas formas de realização, o composto é administrado ao sujeito por distribuição intraperitoneal. Nalgumas formas de realização, o composto é administrado ao sujeito por distribuição intravenosa. Nalgumas formas de realização, o composto é administrado oralmente.
Para administração oral, uma formulação dos compostos da invenção pode ser apresentada como cápsulas, comprimidos, pós, grânulos ou como uma suspensão ou solução. Formulações de cápsulas podem ser de gelatina, moles ou sólidas. Comprimidos e formulações de cápsulas podem conter adicionalmente um ou mais adjuvantes, aglutinantes, diluentes, desintegrantes, excipientes, agentes de enchimento ou lubrificantes, cada um dos quais é conhecido na técnica. Exemplos de tais incluem hidratos de carbono, tais como lactose ou sucrose, fosfato de cálcio dibásico anidro, amido de milho, manitol, xilitol, celulose ou respetivos derivados, celulose microcristalina, gelatina, estearatos, dióxido de silício, talco, glicolato de amido sódico, acácia, agentes aromatizantes, conservantes, agentes de tamponamento, desintegrantes e corantes. Composições administradas oralmente podem conter um ou mais agentes opcionais, tais como, por exemplo, agentes edulcorantes, tais como frutose, aspartame ou sacarina; agentes aromatizantes, tais como hortelã-pimenta, óleo de gaultéria, ou cereja; agentes corantes, e agentes conservantes, para proporcionar uma preparação farmaceuticamente agradável ao palato.
Para administração parentérica (isto é, administração por injeção através de uma via diferente do canal alimentar), os compostos da invenção podem ser combinados com uma solução aquosa esterilizada que é isotónica com o sangue do sujeito. Tal formulação é preparada dissolvendo um ingrediente ativo sólido em água contendo substâncias fisiologicamente compatíveis, tais como cloreto de sódio, glicina e semelhantes, e tendo um pH tamponado compatível com condições fisiológicas, de modo a produzir uma solução aquosa, depois esterilizando a referida solução. A formulação pode ser apresentada em recipientes de dose unitária ou múltiplas doses, tais como ampolas ou frascos selados. A formulação pode ser administrada no corpo do sujeito por qualquer modo de injeção, incluindo, sem limitação, epifascial, intracapsular, intracraniana, intracutânea, intratecal, intramuscular, intraorbital, intraperitoneal, intraespinal, intraesterno, intravascular, intravenosa, parenquimatosa, subcutânea ou sublingual ou através de cateter.
Administração parentérica inclui soluções de base aquosa e não aquosa. Exemplos respetivos incluem, por exemplo, água, solução salina, soluções aquosas de açúcares ou soluções alcoólicas de açúcares, soluções alcoólicas (tais como álcool etílico, isopropanol, glicóis), éteres, óleos, glicéridos, ácidos gordos e ésteres de ácidos gordos. Nalgumas formas de realização utiliza-se água para administração parentérica. Nalgumas formas de realização utiliza-se solução salina para administração parentérica. Óleos para injeção parentérica incluem óleos de base animal, vegetal, sintéticos ou de petróleo. Exemplos de açúcares para solução incluem sucrose, lactose, dextrose, manose e semelhantes. Exemplos de óleos incluem óleo mineral, petrolato, de soja, milho, sementes de algodão, amendoim e semelhantes. Exemplos de ácidos e ésteres gordos incluem ácido oleico, ácido mirístico, ácido esteárico, ácido isoesteárico e respetivos ésteres.
Para administração transdérmica, os compostos da invenção são combinados com intensificadores da penetração na pele, tais como propilenoglicol, polietilenoglicol, isopropanol, etanol, ácido oleico, JV-metilpirrolidona e semelhantes, que aumentam a permeabilidade da pele aos compostos da invenção e permitem que os compostos penetrem através da pele e para a corrente sanguínea. As composições de composto/ intensificador também podem ser adicionalmente combinadas com uma substância polimérica, tal como etilcelulose, hidroxipropilcelulose, etileno/acetato de vinilo, polivinil-pirrolidona e semelhantes, para proporcionar a composição em forma de gel, que são dissolvidas num solvente, tal como cloreto de metileno, evaporadas até à viscosidade desejada e depois aplicadas num material de suporte para proporcionar um penso.
Nalgumas formas de realização, a composição está em forma galénica unitária, tal como um comprimido, cápsula ou frasco de dose unitária. Doses unitárias adequadas, isto é, quantidade terapeuticamente eficazes, podem ser determinadas durante ensaios clínicos concebidos apropriadamente para cada um dos estados clínicos para os quais é indicada a administração de um composto escolhido e irão, obviamente, variar dependendo do desfecho clínico desejado. A presente invenção também proporciona artigos fabricados para o tratamento e prevenção de distúrbios, tais como distúrbios virais, num sujeito. Os artigos fabricados compreendem uma composição farmacêutica dos compostos de fórmula I, opcionalmente também contendo pelo menos um composto antiviral adicional, como descrito no presente documento. Os artigos fabricados são embalados com indicações para vários distúrbios que as composições farmacêuticas são capazes de tratar e/ou prevenir. Por exemplo, os artigos fabricados compreendem uma dose unitária de um composto revelado no presente documento que é capaz de tratar ou prevenir um determinado distúrbio, e uma indicação de que a dose unitária é capaz de tratar ou prevenir um determinado distúrbio, por exemplo, uma infeção virai.
De acordo com um método da presente invenção, os compostos de fórmula I são administrados ao sujeito (ou são contactados com células do sujeito) numa quantidade eficaz para limitar ou prevenir uma diminuição do nível de vírus no sujeito, particularmente em células do sujeito. Esta quantidade é facilmente determinada pelo profissional com base em procedimentos conhecidos, incluindo análise de curvas de titulação estabelecidas in vivo e métodos e ensaios revelados no presente documento. Nalgumas formas de realização, uma quantidade adequada dos compostos da invenção eficaz para limitar ou prevenir um aumento do nível de partículas virais no sujeito varia desde cerca de 0,01 mg/kg/dia até cerca de 1000 mg/kg/dia, e/ou é uma quantidade suficiente para atingir níveis no plasma que variam desde cerca de 300 ng/mL até cerca de 1000 ng/mL ou mais. Nalgumas formas de realização, a quantidade de compostos da invenção varia desde cerca de 5 mg/kg/dia até cerca de 1000 mg/kg/dia. Nalgumas formas de realização são administrados desde cerca de 0,01 mg/kg/dia até cerca de 500 mg/kg/dia. Nalgumas formas de realização são administrados desde cerca de 0,01 mg/kg/dia até cerca de 300 mg/kg/dia. Nalgumas formas de realização são administrados desde cerca de 0,01 mg/kg/dia até cerca de 200 mg/kg/dia. Nalgumas formas de realização são administrados desde cerca de 0,05 mg/kg/dia até cerca de 100 mg/kg/dia. Nalgumas formas de realização são administrados desde cerca de 0,05 mg/kg/dia até cerca de 50 mg/kg/dia. Nalgumas formas de realização são administrados desde cerca de 0,05 mg/kg/dia até cerca de 30 mg/kg/dia. Nalgumas formas de realização são administrados desde cerca de 0,05 mg/kg/dia até cerca de 10 mg/kg/dia. A dose precisa a ser empregue nas composições também dependerá da via de administração e da gravidade da infeção ou distúrbio, e deve ser decidida de acordo com a avaliação do profissional e as circunstâncias de cada paciente. No entanto, intervalos adequados de dosagens eficazes para administração intramuscular são geralmente cerca de 0,5 até cerca de 1000 mg do composto de fórmula I por quilograma de peso do corpo. Em formas de realização especificas, a dose i.m. é cerca de 500 até cerca de 1000 mg/kg, cerca de 300 até cerca de 500 mg/kg, cerca de 200 até cerca de 300 mg/kg, cerca de 100 até cerca de 200 mg/kg, cerca de 50 até cerca de 100 mg/kg, cerca de 10 até cerca de 50 mg/kg ou cerca de 5 até cerca de 10 mg/kg (ou as doses equivalentes expressas por metro quadrado de área superficial do corpo). Alternativamente, pode obter-se um intervalo adequado de doses para administração i.v. utilizando doses de cerca de 5 até cerca de 1000 mg, sem ajustamento ao peso do corpo do paciente ou área superficial corporal. Alternativamente, um intervalo adequado de doses para administração i.p. pode ser obtido utilizando doses de cerca de 5 até cerca de 1000 mg, sem ajustamento ao peso do corpo do paciente ou área superficial corporal. Composições orais podem conter cerca de 10 % até cerca de 95 % por peso de um ou mais compostos de fórmula I isoladamente ou em combinação com outro agente terapêutico. Nalgumas formas de realização da invenção, intervalos adequados de doses para administração oral, i.p. ou i.m. são geralmente cerca de 5 até cerca de 1000 mg, preferencialmente cerca de 5 até cerca de 500 mg de composto por quilograma de peso do corpo ou suas doses equivalentes expressas por metro quadrado de área superficial do corpo. Nalgumas formas de realização a dose oral, i.p. ou i.m. é cerca de 5 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 50 até cerca de 80 mg/kg, cerca de 80 até cerca de 150 mg/kg, cerca de 150 até cerca de 250 mg/kg, cerca de 250 até cerca de 350 mg/kg, cerca de 350 até cerca de 450 mg/kg, cerca de 450 até cerca de 550 mg/kg, cerca de 550 até cerca de 700 mg/kg, cerca de 700 até cerca de 1000 mg/kg (ou as doses equivalentes expressas por metro quadrado de área superficial do corpo). Nalgumas formas de realização, um intervalo adequado de doses para administração oral, i.p. ou i.m. é desde cerca de 5 até cerca de 2000 mg, sem ajustamento ao peso do corpo do paciente ou área superficial corporal. Outras doses eficazes podem ser extrapoladas de curvas de resposta à dose derivadas de sistemas de teste in vitro ou de modelos animais. Tais modelos de animais e sistemas são bem conhecidos na técnica.
Em certos aspetos, uma "quantidade eficaz" de um composto no contexto de uma infeção virai é uma quantidade suficiente para reduzir um ou mais dos seguintes passos de um ciclo de vida de um virus: a ancoragem da partícula de vírus a uma célula, a introdução de informação genética virai numa célula, a expressão de proteínas virais, a produção de novas partículas de vírus e a libertação de partículas de vírus de uma célula por pelo menos 5 %, preferencialmente pelo menos 10 %, pelo menos 15 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 %. Nalgumas formas de realização, uma quantidade eficaz de um composto no contexto de uma infeção virai reduz a replicação, multiplicação ou disseminação de um vírus por pelo menos 5 %, preferencialmente pelo menos 10 %, pelo menos 15 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 %. Nalgumas formas de realização, uma quantidade eficaz de um composto no contexto de uma infeção virai aumenta a taxa de sobrevivência de sujeitos infetados por pelo menos 5 %, preferencialmente pelo menos 10 %, pelo menos 15 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 %.
Os peritos na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar utilizando apenas experimentação de rotina, muitos equivalentes das formas de realização específicas da invenção descritas no presente documento. É pretendido que tais equivalentes pertençam ao âmbito da presente invenção. A invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes Exemplos não limitadores.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Síntese de (2S, 3S, 4J?, 5R) -2- (4-Amino-5H- pirrolo[3,2-d]pirimidin-7-il)-5-(hidroximetil)pirrolidino-3,4-diol [composto 1 (fórmula I, em que A = NH2 e B = H) na forma do sal de HC1].
Passo 1: A uma solução de 7-((2S,3S,4R,5R)-3,4-di-hidroxi-5-(hidroxi-metil)pirrolidin-2-il)-3H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-4(5H)-ona (1-1) [(preparado de acordo com o procedimento relatado por Evans, Gary B.; Furneaux, Richard H.; Hutchison, Tracy L.; Kezar, Hollis S.; Morris, Philip E., Jr.; Schramm, Vern L.; Tiler, Peter C em Journal of Organic Chemistry (2001), 66(17), 5723-5730) 115 g, 390 mmol] em água e metanol (1:1, 2,4 L) adicionou-se trietilamina (113 mL, 1,12 mol) à temperatura ambiente, seguido de (Boc)2O (227 g, 1,04 mol). A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. O produto sólido foi recolhido por filtração, foi lavado com água e seco sob vácuo, dando origem a 3,4-di-hidroxi-2-(hidroximetil)-5-(4-oxo-4,5-di-hidro-3H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-7-il)pirrolidino-l-carboxilato de (2R,3R,4S,5S)-tert-butilo (1-2) (100 %) na forma de um sólido branco. ΤΗ RMN (300 MHz, DMSO) δ 7,85 (s, 1H) , 7,35 (s, 1H) , 4,73 - 4,53 (m, 1H) , 4,29 (s, 1H) , 4,03 (s, 1H) , 3,97 (s, 1H) , 3,70-3,53 (m, 2H), 1,36 e 1,04 (s, 3H, 6H para rotómeros).
Passo 2: A uma solução de 3,4-di-hidroxi-2-(hidroximetil)-5-(4-oxo-4,5-di-hidro-3H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-7-il)pirrolidino-l-carboxilato de (2R,3R,4S,5S)-tert-butilo (1-2) em piridina (184 mmol, 2,26 mol) adicionou-se DMAP (0,79 g, 6,46 mmol) e anidrido acético (107 mL, 1131 mmol) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. A mistura reacional foi diluída com clorofórmio e lavada com água, HC1 aquoso, água e bicarbonato de sódio aquoso saturado. A camada orgânica foi seca, filtrada e concentrada sob vácuo, dando origem a diacetato de (2R,3R,4S,5S)-2-(acetoximetil)-1-(tert-butoxi-carbonil)-5-(4-oxo-4,5-di-hidro-3H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-7-il)pirrolidino-3,4-di-ilo (1-3) (150 g) , que estava suficientemente puro para ser utilizado como tal no passo seguinte. MS (ES + ) 493, 1 (M+l), 515,1 (M+Na) ; (ES“) 491,4 (M-l) .
Passo 3: A uma solução de diacetato de (2R,3R,4S,5S)-2-(acetoxi-metil)-1- (tert-butoxicarbonil)-5-(4-oxo-4,5-di-hidro-3H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-7-il)pirrolidino-3,4-di-ilo (1—3) (150 g, 300 mmol) em acetonitrilo (660 mL) adicionou-se cloreto de benziltrietilamónio (137 g, 600 mmol), dimetil-anilina (57 mL, 450 mmol), seguido de POCI3 (164 mL, 1800 mmol) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi aquecida a 80 °C durante 1 hora. A mistura reacional foi arrefecida para a temperatura ambiente e foi concentrada até à secura sob vácuo. O resíduo obtido foi dissolvido em clorofórmio e lavado com bicarbonato de sódio aquoso saturado, salmoura, foi seco, filtrado e concentrado até à secura. O resíduo de diacetato de (2R,3R,4S,5S)-2-(acetoxi-metil)-1- (tert-butoxicarbonil)-5-(4-cloro-5H-pirrolo[3,2-d] pirimidin-7-il)pirrolidino-3,4-di-ilo (1-4) foi utilizado como tal no passo seguinte sem purificação. ΤΗ RMN (300 MHz, DMSO) δ 12,54 (s, 1H) , 8,65 (s, 1H) , 7,92 (s, 1H) , 5,85 (m, 1H) , 5,45 (m, 1H) , 5,10 (m, 1H) , 4,49 (m, 2H) , 4,07 (m, 1H) , 2, 07 - 1, 99 (m, 9H) , 1,19 (2 s largo, 9H, rotómeros).
Passo 4: A uma solução de diacetato de (2R,3R,4S,5S)-2-(acetoxi-metil)-1- (tert-butoxicarbonil)-5-(4-cloro-5H-pirrolo[3,2-d] pirimidin-7-il)pirrolidino-3,4-di-ilo (1-4) (300 mmol) em DMF (540 mL) adicionou-se azida de sódio (97,5 g, 1500 mmol) e o sistema foi aquecido a 80 °C durante a noite. A mistura reacional foi concentrada sob vácuo e o resíduo obtido foi dissolvido em clorofórmio. A camada de clorofórmio foi lavada com água, foi seca, filtrada e concentrada sob vácuo. Purificação por cristalização a partir de (acetona: hexano = 1:2) deu origem a diacetato de (2R,3R,4S,5S)-2-(acetoxi-metil)-5-(4-azido-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-7-il)-1-(tert-butoxicarbonil)pirrolidino-3,4-di-ilo (1-5). !H RMN (300 MHz, DMSO) δ 13,56-13, 00 (s largo, 1H), 9,86 (s, 1H), 7,95 (s, 1H), 5,78 (m, 1H), 5,40 (m, 1H) , 5,26 - 5,14 (m, 1H) , 4,54 (m, 1H) , 4,42 (m, 1H) , 4,16 - 4,03 (m, 1H) , 2,06 (s, 3H) , 2,02 (s, 6H) , 1,14 (s largo, 9H) ; MS (ES+) 540,0 (M+l); (ES“) 515,9 (M-l).
Passo 5: A uma solução de diacetato de (2R,3R,4S,5S)-2-(acetoxi-metil ) -5-(4-azido-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-7-il)-1-(tert-butoxicarbonil) pirrolidino-3,4-di-ilo (1-5) (300 mmol) em metanol (1 L) adicionou-se Pd(OH)2 (30 g) . A mistura reacional foi hidrogenada a (160 psi) durante a noite e foi filtrada para remover catalisador através de celite. 0 filtrado foi concentrado sob vácuo, dando origem a diacetato de (2R,3R,4S,5S)-2-(acetoximetil)-5-(4-amino-5H-pirrolo [3,2-d]pirimidin-7-il)-1-(tert-
butoxicarbonil) pirrolidino-3, 4-di-ilo (1-6) (113 g). ΤΗ RMN (300 MHz, DMSO) δ 12,47 - 11, 92 (m, 1H) , 8, 84 - 8, 03 (m, 3H) , 7, 90 - 7, 68 (m, 1H) , 5,70 - 5,51 (m, 1H) , 5,38 (m, 1H), 5,12 (m, 1H), 4,42 (m, 2H), 4,17 - 4,00 (m, 1H), 2,07 (s, 3H) , 2,05 (s, 3H) , 2,00 (s, 3H) , 1,14 (s, 9H) ; MS (ES+) 492,1 (M+l), (ES-) 490, 0 (M-l).
Passo 6: A uma solução de diacetato de (2R,3R,4S,5S)-2-(acetoxi-metil ) -5-(4-amino-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-7-il)-1-(tert-butoxicarbonil) pirrolidino-3,4-di-ilo (1-6) (111 g, 22 6
mmol) em metanol (500 mL) adicionou-se NaOMe (25 % p/p em metanol, 4,88 g, 22,6 mmol) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 3 horas e foi concentrada sob vácuo, dando origem a 2-(4-amino-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-7-il)-3,4-di-hidroxi-5-(hidroxi-metil)pirrolidino-l-carboxilato de (2S,3S,4R,5R)-tert-butilo (1-7). ΤΗ RMN (300 MHz, DMSO) δ 11,40 - 10,73 (s largo, 1H) , 8,01 (s, 1H) , 7,39 (2s, 1H) , 6,90 (s, 2H) , 4,83 (m, 2H) , 4,45 (m, 2H) , 3,96 (s, 2H) , 3,58 (m, 3H) , 1,31 e 0,99 (s, 3H, 6H, rotómeros); MS (ES+) 366, 0 (M+l), 388,0 (M+Na) ; (ES“) 363, 8 (M-l).
Passo 7:
Uma solução de 2-(4-amino-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-7-il)-3,4-di-hidroxi-5-(hidroximetil)pirrolidino-l-carboxilato de (2S,3S,4R,5R)-tert-butilo (1-7) HC1 aquoso (160 mL de HC1 concentrado e 400 mL de água) foi agitada à temperatura ambiente durante 30 minutos e depois foi concentrada sob vácuo até à secura. O resíduo obtido foi dissolvido em água, foi tratado com carvão ativado e refluiu durante 30 minutos. A solução quente foi filtrada através de celite e concentrada sob vácuo, obtendo-se um produto semissólido que foi recristalizado a partir de água e etanol, dando origem a (2 S,3S,4R,5R)-2-(4-amino-5H-pirrolo[3,2- d]pirimidin-7-il)-5-(hidroximetil)pirrolidino-3,4-diol (1) (50 g, rendimento global para os 7 passos: 42,6 %) na forma de um cristal branco. ΤΗ RMN (300 MHz, D20) δ 8,41 (s, 1H), 8,02 (s, 1H) , 4,99 (d, J = 9 Hz, 1H) , 4,78 (m, 1H) , 4,45 (dd, J = 3, 1,5 Hz, 1H) , 3,97 (m, 2H) , 3,90 (m, 1H) ; MS (ES+) 266,2 (M+l), (ES~) 264,0 (M-l); Análise: Calculado para C11H15N5O3 · 2 HC1: C, 39, 07; H, 5,07; N, 20,71; Cl, 20,97; Experimental: C, 39,09; H, 5,10; N, 20,49; Cl, 20,84.
Exemplo 2: Síntese em larga escala de (2S, 3S, 4.R, 5R) -2- (4-
Amino-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-7-il)-5-(hidroximetil) pirrolidino-3,4-diol [composto 1 (fórmula I, em que A = NH2 e B = H) na forma do sal de HC1].
Passo 1: A uma suspensão de 7-( (2S,3S,4R,5R)-3,4-di-hidroxi-5-(hidroximetil)pirrolidin-2-il)-3H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-4(5H)-ona (1-1) [(preparado de acordo com o procedimento relatado por Evans, Gary B.; Furneaux, Richard H.;
Hutchison, Tracy L.; Kezar, Hollis S.; Morris, Philip E., Jr.; Schramm, Vern L.; Tiler, Peter C em Journal of Organic Chemistry (2001), 66(17), 5723-5730), 500,0 g, 1,474 mol, 1 eq)] numa mistura de água : metanol (1:1, 10,4 L) adicionou-se trietilamina (621 mL, 4,422 mol, 3,0 eq) à temperatura ambiente, seguido de (Boc) 2O (987 g, 4,53 mol, 3,1 eq) . A mistura reacional tornou-se numa solução colorida límpida após a adição de (Boc)2O, com um aumento ligeiro da temperatura interna de 28 °C para 33 °C. A solução começou a exibir alguma turvação após 1 hora de agitação. A solução foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. O produto sólido foi recolhido por filtração e lavado com água (5,0 L), foi seco em alto vácuo a 50 °C, dando origem a 3,4-di-hidroxi-2-(hidroximetil)-5-(4-oxo-4,5-di-hidro-3H-pirrolo [3,2-d]pirimidin-7- il)pirrolidino-l-carboxilato de (2R,3R,4S,5S)-tert-butilo (1-2) (482 g, 89 %) . ΤΗ RMN (300 MHz, DMSO) δ 11,92 (s, 2H), 7,81 (s, 1H), 7,32 (d, J = 22,7 Hz, 1 H) , 5,73 - 5,20 (m, 1H) , 5,05 - 4,91 (m, 1H), 4,87 - 4,76 (m, 1H), 4,74 - 4,49 (m, 1H), 4,33 - 4,17 (m, 1H) , 4, 09 - 3, 86 (m, 2H) , 3, 64 - 3,48 (m, 2H) , 1,39 - 1,00 (m, 9H) ; MS (ES+) 755, 1 (2M+Na) , (ES“) 731,7 (2M-1);
Análise; Calculado para C16H22N4O6: C, 52,45; H, 6,05; N, 15,29; Experimental: C, 52,24; H, 6,02; N, 15,05.
Passo 2: A uma suspensão de 3,4-di-hidroxi-2-(hidroximetil)-5-(4-oxo-4,5-di-hidro-3H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-7-il)pirrolidino-l-carboxilato de (2R,3R,4S,5S)-tert-butilo (1-2) (482 g, 1,32 moles, 1,0 equiv.) em piridina (740 mL, 9,21 moles, 7 equiv.) adicionou-se DMAP (3,22 g, 26,32 mmol, 0,02 equiv.) e anidrido acético (435 mL, 4,61 mmol, 3,5 eq) à temperatura ambiente. A temperatura interna começou a aumentar por adição do anidrido acético, consequentemente efetuou-se arrefecimento num banho de água gelada. Após a adição total do anidrido, a temperatura subiu para 67 °C e depois diminuiu para a temperatura ambiente. Removeu-se o banho de água gelada depois de a reação ter atingido 25 °C. A suspensão não originou uma solução límpida, mas observou-se uma suspensão mais clara. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 14 horas, dando origem a uma solução não límpida. Uma alíquota processada mostrou que já não havia material de partida e duas manchas grandes por TLC (9:1 clorofórmio: metanol), MS mostra dois picos grandes a (493,0, M+l) para produto e produto tetra-acetilado (M+l = 535) . A mistura reacional foi diluída com 3,0 L de clorofórmio, foi agitada durante 10 minutos e depois adicionaram-se 2,0 L de água desionizada. Formou-se um produto branco ceroso na interface das fases aquosa orgânica. Este produto permaneceu na fase aquosa depois de efetuada a partição. A fase orgânica foi separada e lavada novamente com 2,0 L de água. As lavagens aquosas combinadas foram retroextraídas com 1,0 de clorofórmio. As fases orgânicas combinadas foram lavadas com HC1 aquoso a 2,0 N (2 x 1,0 L), água (2 x 1,0 L), bicarbonato de sódio saturado (2 x 1,0 L) e salmoura (2 x 1,0 L). A camada orgânica foi seca em MgSCt, foi filtrada e concentrada até à secura sob vácuo e banho de água a 50-55 °C. O vácuo foi mudado para uma bomba de óleo de alto vácuo até deixar de ser observado destilado, dando origem a um produto xaroposo denso. O produto foi deixado com bomba de óleo de alto vácuo durante 14 horas para minimizar a piridina residual. Obteve-se uma combinação de espuma sólida, que se transformou num bonito sólido branco, e um resíduo denso de diacetato de (2R,3R,4S,5S)-2-(acetoxi-metil)-1- (tert-butoxicarbonil)-5-(4-oxo-4,5-di-hidro-3H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-7-il)pirrolidino-3,4-di-ilo (1—3) (715, 110 % de rendimento) . Esta percentagem reflete a quantidade de composto tetra-acetilado. O produto estava suficientemente puro para ser utilizado como tal no passo seguinte. Preparou-se uma amostra analítica por purificação da mistura utilizando cromatografia em coluna "flash" [sílica gel, eluindo com 0-100 % (9:1) de acetato de etilo/ metanol em hexano], dando origem a diacetato de (2R,3R,4S,5S)-2- (acetoximetil)-1-(tertbutoxicarbonil)-5-(4-oxo-4,5-di-hidro-3H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-7-il) pirrolidino-3,4-di-ilo (1-3) na forma de um sólido branco; ΤΗ RMN (300 MHz, DMSO) δ 12,13 (s, 1H, D20 Permutável), 11,98 (s, 1H, D20 permutável), 7,82 (s, 1H), 7,29 (s, 1H), 5,76 (s, 1H) , 5,37 (t, J = 4,5 Hz, 1H) , 4,99 (s, 1H) , 4,55 (dd, J = 11,3, 6,6 Hz, 1H) , 4,34 (d, J = 8,3 Hz, 1H) , 4,03
(q, J = 7,1 Hz, 1H) , 2,01 (d, J = 12,6 Hz, 9H) , 1,23 (dd, J = 39, 9, 32,8 Hz, 9H) ; MS (ES +) 493, 0 (M+l); (ES-) 526,7 (M+Cl) ; Análise: Calculado para C22H28N4O9: C, 53, 65; H, 5,73; N, 11,38; Experimental: C, 53,18; H, 5,89; N, 11,10.
Passo 3: A uma solução de diacetato de (2R,3R,4S,5S)-2-(acetoxi-metil)-1- (tert-butoxicarbonil)-5-(4-oxo-4,5-di-hidro-3H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-7-il)pirrolidino-3,4-di-ilo (1-3) (622 g, 1,26 mol, 1,0 eq) em acetonitrilo (2,75 L) adicionou-se cloreto de benziltrietilamónio (575 g, 2,5 mol, 2,0 eq) , dimetilanilina (240 mL, 1,9 mol, 1,5 eq) , seguido de POCI3 (706 mL, 7,58 mol, 6,0 eq) à temperatura ambiente. Obteve-se uma solução amarela clara límpida. A mistura reacional foi lentamente aquecida até 80 °C e foi mantida a esta temperatura durante 10 minutos. TLC em 9:1 clorofórmio: metanol mostra que a reação está > 98 % completada. A solução homogénea preta foi arrefecida para 50,0 °C e concentrada sob vácuo (banho de água a 70-73 °C) para remover POCI3, o resíduo foi colocado sob alto vácuo de bomba de óleo até deixar de ser observado destilado. O resíduo foi dissolvido em 3,0 L de clorofórmio e foi rapidamente lavado de modo cuidadoso com bicarbonato de sódio aquoso saturado até se obter um pH neutro. A camada orgânica foi separada, foi lavada com água (2 L), salmoura (2 L) , foi seca em MgSCt, filtrada e concentrada sob vácuo até à secura (banho de água a 50-53 °C). O produto preto de diacetato de (2R,3R,4S,5S)-2-(acetoximetil)-1-(tert- butoxicarbonil) -5- (4-cloro-5H-pirrolo[3,2—d]pirimidin-7-il)pirrolidino-3,4-di-ilo (1-4) foi utilizado como tal no passo seguinte sem purificação.
Passo 4: A uma solução de diacetato de (2R,3R,4S,5S)-2-(acetoximetil) -1- (tert-butoxicarbonil)-5-(4-cloro-5H-pirrolo[3,2-d] pirimidin-7-il)pirrolidino-3,4-di-ilo (1-4) (622 g, 1,26 mol, 1 eq) em DMF (1,5 L) adicionou-se azida de sódio (411 g, 6,32 mol, 5 equiv.) e o sistema foi aquecido com agitação a 60 °C durante 10 horas, altura em que a reação ficou completada (TLC em 9:1 clorofórmio metanol e 1:1 hexano: acetato de etilo). A reação foi arrefecida para 25 °C, foi derramada em gelo (2 L) e extraída com clorofórmio (2 x 1 L) . As camadas de clorofórmio foram combinadas, foram lavadas com água (2 x 2 L) , salmoura (2 L) , foram secas, filtradas e concentradas sob vácuo (banho de água a 70-80 °C) , dando origem a uma lama preta. A lama foi purificada por cromatograf ia em coluna (987 g de lama preta, coluna de 8x30 polegadas, meio cheia com sílica gel, perfil de eluição hexano:acetato de etilo; 9:1 (40,0 L) ; 7:3 (20,0 L) ; 6:4 (20,0 L) ; 1:1 (20 L) ; 4:6 (20,0 L) e 2:8 (20,0 L) . As frações apropriadas foram reunidas e concentradas sob vácuo (banho de água a 50,0 °C) , dando origem a diacetato de (2R,3R,4S,5S)-2-(acetoximetil)-5-(4-azido-5H-pirrolo[3,2-d] pirimidin-7-il)-1-(tert- butoxicarbonil)pirrolidino-3,4-di-ilo (1-5) (407,05 g, 62,3 % de rendimento para os dois passos) na forma de um produto do tipo mel avermelhado denso. Preparou-se uma amostra analítica purificando a mistura por cromatografia em coluna "flash" [0-100 % de acetato de etilo em hexano], dando origem a diacetato de (2R,3R,4S,5S)-2-(acetoximetil)-5-(4-azido-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-7-il)-1-(tert-butoxicarbonil)pirrolidino-3,4-di-ilo (1-5) na forma de um sólido laranja. ΤΗ RMN (300 MHz, DMSO) δ 13,08 (d, J = 155.6 Hz, 1H, D20 permutável), 9,86 (s, 1H), 7,61 (d, J = 76,8 Hz, 1H) , 5,78 (t, J = 4,5 Hz, 1H) , 5,41 (t, J = 4,3
Hz, 1 H) , 5,21 (s, 1H) , 4,55 (dd, J = 11,4, 6,4 Hz, 1H) , 4,41 (dd, J = 11,4, 3,9 Hz, 1H) , 4,07 (d, J = 16,5 Hz, 1H) , 2.06 (s, 3H) , 2,01 (d, J = 9,9 Hz, 6H) , 1,23 (dd, J = 39,8, 32,7 Hz, 9H) ; MS (ES+) 518,0 (M+l), 540 (M+23); (ES“) 516,4 (M-l); Análise: Calculado para C22H27N708: C, 51,06; H, 5,26; N, 18,95 Experimental: C, 50,97; H, 5,30; N, 18,62.
Passo 5:
Diacetato de (2R,3R,4S,5S)-2-(acetoximetil)-5-(4-azido-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-7-il)-1-(tert-butoxicarbonil) pirrolidino-3,4-di-ilo (1-5) foi reduzido em três lotes diferentes do modo seguinte.
Lote 1: A um hidrogenador Parr de 2,0 L, inserção de
Teflon, adicionou-se diacetato de (2R,3R,4S,5S)-2-(acetoximetil)-5-(4-azido-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-7-il)-1- (tert-butoxi-carbonil)pirrolidino-3,4-di-ilo (1-5) (108,01 g, 300 mmol em metanol, 800 mL), Pd(OH)2 (21,6 g, 20 % p/p).
Lote 2: A um hidrogenador Parr de 2,0 L, inserção de
Teflon, adicionou-se (1-5) (140,70 g, 271,9 mmol em metanol, 1,0 L), Pd(OH)2 (28,14 g, 20 % p/p).
Lote 3: A um hidrogenador Parr de 2,0 L, inserção de
Teflon, adicionou-se (1-5) (140,7 g, 271,9 mmol em metanol, 1,0 L) , Pd (OH) 2 (28,14 g, 20 % p/p).
As misturas reacionais foram hidrogenadas a 150 psi durante 15-18 horas. A mistura reacional foi filtrada para remover o catalisador através de celite. O filtrado foi concentrado sob vácuo (banho de água a 60-70 °C) até peso constante, dando origem a um produto escuro diacetato de (2R,3R,4S,5S)-2-(acetoximetil)-5-(4-amino-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-7-il)-1-(tert-butoxicarbonil)pirrolidino-3,4-di-ilo (1-6) (328,8 g, 89 %) . O produto estava suficientemente puro para ser utilizado como tal no passo seguinte. Preparou-se uma amostra analítica por purificação da mistura utilizando cromatografia em coluna "flash" (0-10 % de metanol em clorofórmio) . ΤΗ RMN (300 MHz, DMSO) δ 11,06 (s, 1H) , 8,12 (s, 1H) , 7,49 (s, 1H) , 6,94 (s, 2H) , 5,86 (s, 1H) , 5,44 (t, J = 4,2 Hz, 1H) , 5,02 (s, 1H) , 4,56 (dd, J = 11,3, 6,9 Hz, 1H) , 4,40 (dd, J = 11,3, 4,2 Hz, 1H) , 4,16 - 3,98 (m, 1H) , 2,09 - 1, 94 (m, 9H) , 1,48 - 1,14 (m, 9H); MS (ES+) 492,1 (M+l); (ES-) 526,4 (M+Cl); Análise:
Calculado para C22H29N5O8 · 1,25 H2O: C, 51,41; H, 6,18; N, 13,62; Experimental: C, 51,24; H, 5,92; N, 13,33
Passo 6:
Lote 1. A diacetato de (2R,3R,4S,5S)-2-(acetoximetil)-5-(4-amino-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-7-il)-1-(tert-butoxi-carbonil)pirrolidino-3,4-di-ilo (1-6) (81,5 g, 165,8 mmol) adicionou-se metanol anidro (370 mL) , seguido da adição de NaOMe (metóxido de sódio, solução a 25 % por peso em
metanol, 4,49 g, 20,76 mmol) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente até TLC (clorofórmio: metanol 9:1) mostrar que todo o material de partida tinha reagido.
Lote 2. A diacetato de (2R,3R,4S,5S)-2-(acetoximetil)-5-(4-amino-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-7-il)-1-(tert-butoxi-carbonil)pirrolidino-3,4-di-ilo (1-6) (117,8 g, 239,6 mmol) adicionou-se metanol anidro (530 mL), seguido da adição de NaOMe (metóxido de sódio, solução a 25 % por peso em
metanol, 6,58 g, 30,45 mmol) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente até TLC (clorofórmio: metanol 9:1) mostrar que todo o material de partida tinha reagido.
Lote 3. - A diacetato de (2R,3R,4S,5S)-2-(acetoximetil)-5-(4-amino-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-7-il)-1-(tert-butoxi-carbonil)pirrolidino-3,4-di-ilo (1-6) (129,5 g, 263,5 mmol) adicionou-se metanol anidro (584 mL), seguido da adição de NaOMe (metóxido de sódio, solução a 25 % por peso em metanol, 6,99 g, 32,35 mmol) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente até TLC (clorofórmio: metanol 9:1) mostrar que todo o material de partida tinha reagido (7-8 horas).
As soluções acima foram concentradas (banho de água a 65-75 °C) , dando origem a 2-(4-amino-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-7-il)-3,4-di-hidroxi-5-(hidroximetil)pirrolidino-1-carboxilato de (2S,3S,4R,5R)-tert-butilo (1-7), que estava suficientemente puro para ser utilizado como tal no passo seguinte. Preparou-se uma amostra analítica por purificação da mistura utilizando cromatografia em coluna "flash" (0-10 % de metanol em clorofórmio) . ΤΗ RMN (300 MHz, DMSO) δ 10,77 (s, 1H) , 8,01 (s, 1H) , 7,40 (s, 1H) , 6,82 (s, 3H) , 5,04 - 4,91 (m, 1H) , 4, 87 - 4,74 (m, 1H) , 4,56 - 4,35 (m, 2H) , 4,04 - 3, 90 (m, 2H) , 3,72 - 3, 63 (m, 1H) , 3,59 - 3,41 (m, 1H) , 1,15 (2s, 9H) ; MS (ES+) 366, 1 (M+l); (ES“) 400,3 (M+Cl) ; Análise: Calculado para C16H23N5O5 0,25 H2O: C, 51,33; H, 6,46; N, 18,71; Experimental: C, 51,04; H, 6,43; N, 18,48.
Passo 7: 2-(4-Amino-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-7-il)-3,4-di-hidroxi-5-(hidroximetil)pirrolidino-l-carboxilato de (2S,3S,4R,5R)-tert-butilo (1-7) foi tratado do modo seguinte em três lotes.
Lote 1. (1-7) foi dissolvido em HC1 aquoso (118 mL de HC1 concentrado e 293 mL de água);
Lote 2. (1-7) foi dissolvido em HC1 aquoso (169 mL de HC1 concentrado e 421 mL de água).
Lote 3. (1-7) foi dissolvido em HC1 aquoso (186 mL de HC1 concentrado e 468 mL de água).
As misturas reacionais foram agitadas à temperatura ambiente durante 30 minutos (libertação forte de CO2 gasoso) e depois cada lote foi concentrado sob vácuo até à secura (80-90 °C) . Os lotes 2 e 3 foram reunidos, dando origem a 226 g de produto amarelo límpido húmido. O lote 1 deu origem a 91,4 de um produto acinzentado escuro. A cristalização foi efetuada do modo seguinte: Para o produto húmido dos lotes 2&3: adicionaram-se 226 mL de água ao produto, depois o sistema foi aquecido para 50 °C, altura em que se adicionou lentamente etanol quente até a cristalização ter início. A mistura foi mantida a 50 °C durante 10 minutos, depois foi deixada atingir 25 °C com agitação forte antes de filtração, dando origem a um pó amarelo claro de (2S,3S,4R,5R)-2-(4-amino-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-7-il)-5-(hidroximetil) pirrolidino-3,4-diol (1) (88 g) . O lote um foi purificado do mesmo modo, dando origem a 33,0 g de produto acinzentado claro. O rendimento total é 121,0 g após secagem a 55 °C em alto vácuo. O licor-mãe da recristalização dos lotes 1 e 2 foi novamente processado, dando origem a 15,0 g de produto em pó amarelado claro (1). ΤΗ RMN (300 MHz, DMSO) δ 14,60 (s, 1H) , 13,25 (s, 1H) , 10,23 (s, 1H) , 9,13 (s, 2H) , 8,84 (s, 1H), 8,63 (s, 1H), 8,11 (d, J = 3,1 Hz, 1H), 5,55 (s, 2H), 4,78 (d, J = 4,4 Hz, 1H) , 4,44 (dd, J = 8,8, 5,0 Hz, 1H) , 4,14 - 4,02 (m, 1H) , 3,73 (d, J = 5,1 Hz, 2H) , 3,52 (s, 1H) ; !H RMN (300 MHz, D20) δ 8,33 (s, 1H) , 7,94 (s, 1H) , 4,90 (d, J = 8,9 Hz, 1H) , 4,65 (s, 1H) , 4,37 (dd, J = 4,8, 3.4 Hz, 1H) , 3,89 (s, 1H) , 3,88 (s, 1H) , 3,81 (dd, J = 8,1, 4.5 Hz, 1H) ; MS (ES+) 266, 3 (M+l); Rotação ótica -52, 69; (H20,C=l,15); MP: 238 °C; Análise: Calculado para C11H15N5O3 · 2 HC1 · 0,2 5 H20: C, 38,55; H, 5,15; Cl, 20,44; N, 20,69; Experimental: C, 38,67; H, 5,05; Cl, 20,45; N, 20,42 .
Exemplo 3: Fosforilação do composto 1 (fórmula I, em que A = NH2 e B = H) e Estudos de Incorporação em DNA/RNA. Células de carcinoma hepatocelular humano (Huh-7) foram incubadas com 3H-composto 1 durante 24 horas, seguido de extração com metanol e análise de HPLC utilizando uma coluna SAX e detetor radioativo. A FIG. 1 mostra a fosforilação do composto 1 em células Huh-7, indicando fosforilação eficiente em células.
As Figuras 2-4 mostram que o composto 1 é fosforilado mas não incorporado em RNA ou DNA de mamífero (DP designa difosfato e TP designa trifosfato) . A FIG. 2 mostra a fosforilação de adenosina em células Huh-7. A FIG. 3 mostra a fosforilação do composto 1 em células Huh-7. A FIG. 4 mostra a incorporação em RNA total e DNA genómico do composto 1 e adenosina em células Huh-7.
Exemplo 4: Efeitos de inibidor de RNA polimerase virai (fórmula I, em que A = NH2 e B = H: composto 1) na replicação de vírus do Sarampo em células de rim de macaco verde Africano.
Materiais e Métodos: Obtiveram-se células Vero 76 (células de rim de macaco verde Africano) da American Type culture Collection (ATCC, Manassas, VA) . As células foram rotineiramente passadas em meio essencial mínimo (MEM com 0,15 % de NaHCOs; Hyclone Laboratories, Logan, UT, EUA) suplementado com soro fetal de bovino a 5 % (FBS, Hyclone). Ao avaliar os compostos, o soro foi reduzido para uma concentração final de 2,5 % e adiciona-se gentamicina ao meio de teste para uma concentração final de 50 pg/mL. O vírus do Sarampo (MV), estirpe Chicago, foi obtido do Centers for Disease Control (Atlanta, GA) .
Procedimentos de Teste Antiviral:
Ensaio de Inibição do Efeito Citopático (Ensaio Visual) Células foram semeadas em placas de cultura de tecidos de fundo plano de 96 cavidades (Coming Glass Works, Corning, NY) , 0,2 mL/cavidade, à concentração celular apropriada, e foram incubadas durante a noite a 37 °C para estabelecer uma monocamada de células. Depois de estabelecida a monocamada, o meio de crescimento foi decantado e as várias diluições de composto de teste foram adicionadas a cada cavidade (3 cavidades/diluição, 0,1 mL/cavidade). Meio diluente do composto foi adicionado a cavidades de controlo de células e de vírus (0,1 mL/cavidade). Vírus, diluído em meio de teste, foi adicionado a cavidades de teste de composto (3 cavidades/ diluição de composto) e a cavidades de controlo de vírus (6 cavidades) a 0,1 mL/cavidade. Adicionou-se vírus (MOI virai = 0,001) aproximadamente 5 minutos após o composto. Adicionou-se meio de teste sem vírus a todas as cavidades de controlo da toxicidade (2 cavidades/diluição de cada composto de teste) e a cavidades de controlo de células (6 cavidades) a 0,1 mL/cavidade. As placas foram incubadas a 37 °C num incubador humidificado, com atmosfera de 5 % de CO2, 95 % de ar, até as cavidades de controlo de vírus exibirem leituras adequadas de efeito citopático (CPE) (80-100 % de destruição celular). Tal foi obtido aos 4-11 dias após a exposição de vírus a células, dependendo do vírus. As células foram depois examinadas microscopicamente quanto ao CPE, que foi pontuado desde 0 (células normais) até 4 (máximo, 100 %, CPE) . As células das cavidades de controlo da toxicidade foram observadas microscopicamente quanto a alterações morfológicas atribuídas à citotoxicidade. Esta citotoxicidade (destruição e/ou alteração da morfologia celular) foi também classificada a 100 % de toxicidade, 80 % de citotoxicidade), 60 % de citotoxicidade, 40 % de citotoxicidade, 20 % de citotoxicidade e 0 (células normais). A dose 50 % eficaz (EC50) e a dose 50 % citotóxica (IC50) foram calculadas por análise de regressão dos dados de CPE do vírus e dos dados de controlo da toxicidade, respetivamente. O índice seletivo (SI) para cada composto testado foi calculado utilizando a fórmula: SI = CC50 i EC50.
Ensaio de Inibição de CPE de Captação de Vermelho Neutro (NR)
Escolheu-se vermelho NR como método de quantificação por corante para avaliar fármacos antivirais com base nas descobertas de Smee et al. (J. Virol. Methods 2002, 106: 71-79). Este ensaio foi realizado nas mesmas placas de teste de inibição de CPE descritas acima para verificar a atividade inibidora e a citotoxicidade detetadas por observação visual. 0 ensaio de NR foi realizado utilizando um método modificado de Cavenaugh et al. (Invest. New Drugs 1990, 8:347-354) como descrito por Barnard et al. (Antiviral Chem. Chemother. 2001, 12:220-231). Em resumo, removeu-se meio de cada cavidade de uma placa pontuada quanto a CPE de um ensaio de inibição de CPE, adicionaram-se a cada cavidade da placa NR a 0,034 % e a placa foi incubada durante 2 horas a 37 °C no escuro. A solução de NR foi depois removida das cavidades. Após enxaguamento (por vezes, células separam-se da placa, causando um aumento lento erróneo de vermelho neutro) e aspiração até à secura, o corante remanescente foi extraído das células, durante 30 minutos à temperatura ambiente no escuro, utilizando etanol absoluto tamponado com tampão de citrato Sorenson. As absorvâncias a 540 nm/405 nm são lidas com um leitor de microplacas (Opsys MR™, Dynex Technologies, Chantilly, VA, EUA). Os valores da absorvância foram expressos como percentagens de controlos não tratados e os valores de EC50, CC50 e SI foram calculados como descrito acima.
Ensaio de Redução do Rendimento de Vírus
Realizaram-se ensaios de redução do rendimento de vírus utilizando o ensaio de dose 50 % infeciosa (CCID50) de cultura de células essencialmente como previamente descrito (Antimicrob. Agents Chemother. 1992, 3: 1837-1842) . Em resumo, sobrenadantes de cada cavidade foram diluídos em série em cavidades triplicadas de placas de 96 cavidades contendo células Vero-76. As placas foram incubadas durante 6 dias e depois foram verificadas quanto a CPE induzido por vírus. A quantificação dos títulos do rendimento de vírus foi efetuada pelo método de ponto final de Reed e Muench (Am. J. Hyg. 1938, 27: 493-498) . O valor EC90 foi calculado utilizando regressão linear para estimar a concentração necessária para inibir o rendimento do vírus em 90 % ou uma diminuição de um loglO do título do vírus.
Resultados e Discussão 0 vírus do sarampo foi inibido de modo potente pelo composto 1 (Tabela 1). Os valores de EC50 contra o vírus do sarampo foram 0,6 e 1,4 pg/mL por ensaio visual e ensaio de NR, respetivamente. O composto não exibiu nenhuma citotoxicidade em nenhum dos ensaios visual ou de NR (IC50 > 100). Em consequência, os índices seletivos por ambos os ensaios sugeriram que o composto 1 foi altamente ativo contra o vírus do sarampo (MV) . A atividade inibidora potente contra MV foi confirmada por um ensaio de redução do rendimento de vírus, com um EC90=0,36 pg/mL, representando uma diminuição de um loglO em vírus produzido em células infetadas.
Conclusões O composto 1 demonstrou atividade inibidora potente e seletiva. Pelo ensaio de redução do rendimento de vírus, o composto 1 também foi um inibidor potente de MV (EC90 = 0,37 pg/mL) . Assim, verificou-se que o composto 1 é um inibidor potente de muitos vírus RNA e sugere que o composto 1 assegura uma avaliação adicional in vitro e in vivo como inibidor de largo espetro de vírus RNA selecionados.
Exemplo 5: Efeitos de inibidor de RNA polimerase virai (fórmula I, em que A = NH2 e B = H: composto 1) na replicação de vários virus RNA.
Materiais e Métodos Células e vírus Células de rim de macaco verde Africano (MA-104) foram obtidas da Whitaker MA Bioproducts, Walkersville, MD, EUA. Todas as células Vero (células de rim de macaco verde Africano, células de carcinoma humano da laringe (A-549) e células de rim canino Madin-Darby) foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) . As células A-549 foram cultivadas em meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM) suplementado com 0,15 % de NaHC03 (Hyclone Laboratories, Logan, UT, EUA) e com soro fetal de bovino a 10 % (FBS, Hyclone) . As células remanescentes foram rotineiramente passadas em meio essencial mínimo (MEM com 0,15 % de NaHCCh; Hyclone Laboratories, Logan, UT, EUA) suplementado com soro fetal de bovino a 5 % (FBS, Hyclone).
Aquando da avaliação dos compostos, o soro foi reduzido para uma concentração final de 2,5 % e adiciona-se gentamicina ao meio de teste para uma concentração final de 50 pg/mL. O meio de teste para ensaios de influenza consistiu em MEM sem soro, 0,18 % de NaHC03, 20 pg de tripsina/mL, 2,0 pg de EDTA/mL e 50 pg de gentamicina/mL.
Para avaliação da toxicidade em células ativamente em crescimento, a citotoxicidade foi avaliada determinando o número total de células refletido por um ensaio de captação de NR após uma exposição durante 3 dias a várias concentrações de composto. Para quantificar o crescimento celular às 72 horas na presença ou ausência de fármaco, placas foram semeadas com 1 X 103 células MDCK e, após 4 horas (permitindo a ligação de todas as células a cavidades da placa), foram expostas a concentrações selecionadas de fármaco em MEM ou MEM. Passadas 72 horas, as placas foram tratadas como descrito acima para o ensaio de NR. Os valores da absorvância foram expressos como percentagem de controlos não tratados e calcularam-se valores CC50 por análise de regressão. Vírus Dengue 2 (DV-2), estirpe New Guinea C, Vírus sincicial respiratório (RSV) A2, Rinovírus 2 (RV-2), estirpe HGP, Tacaribe (TCV), estirpe TRVL 11573, vírus da encefalite equina Venezuelana (VEE) e vírus da Febre-amarela (YFV) , estirpe 17D, foram adquiridos à American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). Todos os virus influenza, Virus do sarampo (MV), estirpe Chicago, coronavírus de SARS (SARS-CoV), estirpe Urbani, e virus do Nilo Ocidental (WNV), isolado prototípico New York 1999 designado estirpe 996625, foram obtidos do Centers for Disease Control (Atlanta, GA) . 0 vírus Punta Toro (PTV), estirpe Adames, foi obtido de Dr. Dominique Pifat do U. S. Army Medical Research Institute for Infectious Diseases, Ft. Detrick (Frederick, MD) . A estirpe de vacina do virus da febre do Vale do Rift (RVFV) , MP- 12, e a estirpe de vacina do vírus Junin (JUNV), Candid 1, foram amavelmente fornecidas por Dr. Robert Tesh (World Reference Center for Emerging and Viruses and Arbovirus, University of Texas Medical Branch, Galveston, TX) . 0 vírus Pichinde (PICV), estirpe An 4763, foi fornecido por Dr. David Gangemi (Clemson University, Clemson, Carolina do Sul) . 0 virus
Parainfluenza de tipo 3 (PIV-3), estirpe 14702/5/95, foi obtido de Jacquelin Boivin (Hospitale St. Justin, Montreal, Canadá). Adenovirus (AV-1) tipo 1, estirpe Chicago/95, foi isolado das lavagens traqueais de um paciente pediátrico e foi fornecido por M.F. Smaron (Department of Medicine, University de Chicago, Chicago IL).
Procedimento de Teste Antiviral
Ensaio de inibição do Efeito Citopático (Ensaio Visual) Células foram semeadas em placas de cultura de tecidos de fundo plano de 96 cavidades (Coming Glass Works, Corning, NY) , 0,2 mL/cavidade, à concentração celular apropriada, e foram incubadas durante a noite a 37 °C para estabelecer uma monocamada de células. Depois de estabelecida a monocamada, o meio de crescimento foi decantado e as várias diluições de composto de teste foram adicionadas a cada cavidade (3 cavidades/diluição, 0,1 mL/cavidade). Meio diluente do composto foi adicionado a cavidades de controlo de células e de virus (0,1 mL/cavidade). Virus, diluido em meio de teste, foi adicionado a cavidades de teste de composto (3 cavidades/ diluição de composto) e a cavidades de controlo de vírus (6 cavidades) a 0,1 mL/cavidade. Adicionou-se vírus (MOI virai = 0,001) aproximadamente 5 minutos após o composto. Adicionou-se meio de teste sem vírus a todas as cavidades de controlo da toxicidade (2 cavidades/diluição de cada composto de teste) e a cavidades de controlo de células (6 cavidades) a 0,1 mL/cavidade. As placas foram incubadas a 37 °C num incubador humidificado, com atmosfera de 5 % de CO2, 95 % de ar, até as cavidades de controlo de vírus exibirem leituras adequadas de efeito citopático (CPE) (80-100 % de destruição celular). Tal foi obtido aos 4-11 dias após exposição de vírus a células, dependendo do vírus. As células foram depois examinadas microscopicamente quanto ao CPE, que foi pontuado desde 0 (células normais) até 4 (máximo, 100 %, CPE) . As células das cavidades de controlo da toxicidade foram observadas microscopicamente quanto a alterações morfológicas atribuídas à citotoxicidade. Esta citotoxicidade (destruição e/ou alteração da morfologia celular) foi também classificada a 100 % de toxicidade, 80 % de citotoxicidade), 60 % de citotoxicidade, 40 % de citotoxicidade, 20 % de citotoxicidade e 0 (células normais). A dose 50 % eficaz (EC50) e a dose 50 % citotóxica (IC50) foram calculadas por análise de regressão dos dados de CPE do vírus e dos dados de controlo da toxicidade, respetivamente. O índice seletivo (SI) para cada composto testado foi calculado utilizando a fórmula: SI = CC50 i EC50.
Ensaio de Captação de Vermelho Neutro (NR) de Inibição de CPE e Citotoxicidade de Composto
Escolheu-se vermelho NR como método de quantificação por corante para avaliar fármacos antivirais com base nas descobertas de Smee et al. (supra) . Este ensaio foi realizado nas mesmas placas de teste de inibição de CPE descritas acima para verificar a atividade inibidora e a citotoxicidade detetadas por observação visual. O ensaio de NR foi realizado utilizando um método modificado de Cavenaugh et al. (supra) como descrito por Barnard et al. (supra) . Em resumo, removeu-se meio de cada cavidade de uma placa pontuada quanto a CPE de um ensaio de inibição de CPE, adicionaram-se a cada cavidade da placa NR a 0,034 % e a placa foi incubada durante 2 horas a 37 °C no escuro. A solução de NR foi depois removida das cavidades. Após enxaguamento (por vezes, células separam-se da placa, causando um aumento lento erróneo de vermelho neutro) e aspiração até à secura, o corante remanescente foi extraído das células, durante 30 minutos à temperatura ambiente no escuro, utilizando etanol absoluto tamponado com tampão de citrato Sorenson. As absorvâncias a 540 nm/405 nm são lidas com um leitor de microplacas (Opsys MR™, Dynex Technologies, Chantilly, VA, EUA). Os valores da absorvância foram expressos como percentagens de controlos não tratados e os valores de EC50, CC50 e SI foram calculados como descrito acima.
Outros vírus que foi considerado serem significativamente inibidos pelo composto 1 (SI > 10) foram DV-2 (EC50 = 15, 13 pg/mL), JUNV (EC50 = 29, 16 pg/mL), YFV (EC50 = 8,3, 8,3 pg/mL) (Tabela 1) . Os seguintes vírus foram ligeiramente inibidos pelo composto 1 (10 < SI > 3): PIV-3 (EC50 = 7,1, 10 pg/mL), SARS-CoV (EC50 = 14, 16 pg/mL), PICV (EC50 = 61, 28 pg/mL) e RVFV (EC50 = 75, 64 pg/mL) . O composto 1 foi testado contra um subconjunto de estirpes virais de influenza (Tabela 2) e exibiu atividade anti-influenza de largo espetro contra múltiplas estirpes.
Conclusões 0 composto 1 demonstrou atividade potente contra todos os virus influenza testados. Verificou-se que o composto 1 é um inibidor potente da replicação de vírus influenza e sugere que o composto 1 é eficaz como inibidor de largo espetro de vírus RNA selecionados, incluindo todos os vírus influenza.
Exemplo 6: Atividade antiviral in vitro do Composto 1. A atividade antiviral do Composto 1 foi avaliada in vitro em vários vírus quanto à atividade antiviral. Os valores de EC50 variaram desde cerca de 10 pg/mL até cerca de > 300 pg/mL contra Marburg (filoviridae), Junin Candid 1 (arenaviridae), Pichinde (arenaviridae), Chikungunya 181/25 (togaviridae) e Vacínia NYCBH (poxviridae) .
Exemplo 7: Atividade antiviral sinergética do composto 1 e inibidor de neuraminidase em células MDCK. Células de Rim Canino Madin Darby (MDCK) foram infetadas com vírus influenza H3N2 (A/Victoria/3/75) e foram tratadas com várias combinações do composto 1 e peramivir durante 72 horas. Determinou-se o efeito citopático utilizando o ensaio de captação de corante vermelho neutro. Os dados estão apresentados na tabela 3.
Os dados experimentais foram avaliados por análise tridimensional utilizando o programa de "software" Mac Synergy II ™ (Prichard e Shipman, 1990). O "software" calcula as interações aditivas teóricas a partir das curvas de resposta à dose dos fármacos individuais. A superfície aditiva calculada, que representa as interações aditivas previstas, é depois subtraída da superfície experimental para revelar regiões de interações maiores (sinergia) ou menores (antagonismo) do que o esperado. A combinação de peramivir e composto 1 em estudos de cultura de células demonstrou um efeito antiviral sinergético, com um volume de sinergia igual a 92 uM2 % de unidades (FIG. 5).
Exemplo 8: Eficácia da injeção intramuscular (IM) do composto 1 num modelo murino de influenza.
Ratinhos Balb/C com 6-8 semanas de idade foram adaptados ao virus H3N2 (A/Victoria/3/75) . Doses de 0, 30, 100 e 300 mg/kg/d qd foram administradas por injeção intramuscular (IM) durante 5 dias começando 1 hora antes da infeção. N = 50 animais. Todos os animais foram seguidos durante 16 dias. Os pontos finais incluíram letalidade, média de dias até à morte e perda de peso. Os efeitos estão apresentados na Figura 6.
Os resultados do composto 1 (IM) no modelo de vírus de influenza de ratinho também estão apresentados na tabela 4. O composto 1 administrado IM melhora a sobrevivência e perda de peso em ratinhos infetados com virus influenza.
Exemplo 9: Eficácia da administração oral do composto 1 num modelo murino de influenza.
Ratinhos Balb/C com 6-8 semanas de idade foram adaptados ao virus H3N2 (A/Victoria/3/75) . Doses de 0, 30, 100, e 300 mg/kg/d qd e 100 mg/kg/d bid foram administradas oralmente. N = 60 animais. Todos os animais foram seguidos durante 16 dias. Os pontos finais incluíram letalidade, média de dias até à morte e perda de peso. Os efeitos do composto 1 administrado oralmente na perda de peso em ratinhos infetados com vírus influenza H3N2 A/Vic/3/75 estão apresentados na Figura 7.
Os resultados da administração oral do composto 1 no modelo de vírus de influenza de ratinho também estão apresentados na tabela 5. O composto 1 administrado oralmente melhora a sobrevivência e perda de peso em ratinhos infetados com vírus influenza.
Exemplo 10: Estudos farmacocinéticos em ratinhos.
Ratinhos Balb/c fêmeas (N = 30) foram doseados oralmente com composto 1 a 100 mg/kg. Os ratinhos foram sangrados através do seio retro-orbital às t = 0,17, 0,5, 1,0, 3, 6 e 24 horas (5 ratinhos cada por instante) , as amostras foram centrifugadas e o plasma foi armazenado a -80 °C. Mediram-se os níveis de fármaco no plasma via análise de LC/MS/MS.
Os níveis no plasma de ratinho para o composto 1 após administração oral estão apresentados na tabela 6.
Exemplo 11: Estudo de profilaxia em Ratinhos do virus Ébola. 0 composto 1 foi administrado i.p., i.m. e oralmente (300 mg/kg/dia, BID) a ratinhos C57B1/6 de 8-12 semanas de idade (N = 10 por grupo, 4 grupos - um grupo tratado com solução salina e 3 grupos tratados com fármaco) . Oito dias de tratamento, começando às 4 horas antes da infeção. A provocação com vírus Ébola (Zaire) adaptado a ratinhos foi administrada intraperitonealmente. A mortalidade e peso foram monitorizados durante 14 dias pós-infeção. A sobrevivência percentual dos ratinhos está indicada na Figura 8. Todos os ratinhos infetados com vírus Ébola tratados com solução salina morreram cerca do dia 8. Todos os ratinhos tratados intraperitonealmente ou intramuscularmente com composto 1 sobreviveram até ao ponto final do estudo (dia 14) . Oitenta por cento dos ratinhos tratados oralmente com composto 1 sobreviveram até ao ponto final do estudo (dia 14). A alteração do peso de ratinhos está indicada na Figura 9. Ratinhos infetados com vírus Ébola tratados com solução salina exibiram perda de peso global até ao dia 8 (todos os ratinhos de controlo estavam mortos cerca do dia 8) . Os ratinhos tratados intraperitonealmente ou intramuscularmente com composto 1 retiveram mais do que 95 % do peso de partida no dia 12. Os ratinhos tratados oralmente com composto 1 retiveram mais do que 80 % do peso de partida no dia 12. Todos os ratinhos tratados com fármaco continuaram a ganhar peso após o dia 12.
Exemplo 12: Estudo de profilaxia em Ratinhos do virus Ébola. O composto 1 foi administrado i.m. e oralmente a ratinhos C57B1/6 de 8-12 semanas de idade. Os sujeitos do estudo foram divididos em 6 grupos (N = 10 por grupo) . O grupo 1 foi um controlo de solução salina, o grupo 2 foi doseado com 150 mg/kg de composto 1 (PO, BID) ; o grupo 3 foi doseado com 250 mg/kg de composto 1 (PO, BID); o grupo 4 foi doseado com 150 mg/kg de composto 1 (IM, BID) . O grupo 5 consistiu em ratinhos não infetados tratados com solução salina (PO, BID) e o grupo 6 consistiu em ratinhos não infetados tratados com 250 mg/kg de composto 1 (PO, BID). O tratamento durou nove dias, começando às 4 horas antes da infeção. A provocação de vírus Ébola (Zaire) adaptado a ratinhos foi administrada intraperitonealmente (1 000 pfu). A mortalidade e peso foram monitorizados durante 14 dias pós-infeção. A sobrevivência percentual dos ratinhos está indicada na Figura 10. Todos os ratinhos infetados com vírus Ébola tratados com solução salina morreram cerca do dia 8. Todos os ratinhos tratados intramuscularmente com composto 1 sobreviveram até ao ponto final do estudo, indicando que a dosagem IM do composto 1 foi completamente protetora. Oitenta por cento ou mais dos ratinhos tratados oralmente com composto 1 sobreviveram até ao ponto final do estudo. A alteração do peso dos ratinhos está indicada na Figura 11. Os ratinhos infetados com vírus Ébola tratados com solução salina exibiram perda de peso global até ao dia 7 (todos os ratinhos de controlo estavam mortos cerca do dia 8) . Os ratinhos tratados intramuscularmente com composto 1 exibiram ganho de peso semelhante ao grupo de controlo não infetado no dia 11. Os ratinhos tratados oralmente com composto 1 exibiram perda de peso reversível e retiveram mais do que 100 % do peso de partida no dia 11.
Exemplo 13: Estudo em Hamsters Dourados de Janela Temporal do Vírus da Febre-Amarela (YFV). Vírus da febre-amarela (estirpe Jimenez) foi injetado IP em hamsters sírios dourados fêmeas (99 g) a 20 CCID50 por hamster (~ 6,25 x LD50) . Os grupos foram divididos do modo seguinte: 1) o composto 1 foi administrado começando às -4 horas (N = 15); 2) o composto 1 foi administrado começando a 1 dpi (dias pós-infeção) (N = 10); 3) o composto 1 foi administrado começando a 2 dpi (N = 10) ; 4) o composto 1 foi administrado a 3 dpi (N = 10) ; 5) o composto 1 foi administrado a 4 dpi (N = 10); 6) Ribavirin foi administrado começando às -4 horas (N = 10); 7) veiculo de solução salina começando às -4 h (N = 16); 8) a hamsters não infetados foi administrado composto 1 começando às -4 horas (N = 3); 9) a hamsters não infetados foi administrado veiculo de solução salina começando às -4 horas (N = 3) , e 10) controlos normais não infetados, não tratados (N = 3). A dose de tratamento foi 100 mg/kg IP, BID durante 7 dias. Os pontos finais do estudo foram mortalidade aos 21 dias, peso medido nos dias 0, 3, 5 e 6; títulos do vírus no soro e fígado (dia 4, composto 1 às -4 horas, e veículo às -4 h), e ALT e AST no dia 6. O estudo revelou sobrevivência aumentada para o composto 1 com tratamento retardado em comparação com placebo (Figura 12) . Está indicada a sobrevivência de hamsters infetados com YFV e tratados com composto 1 duas vezes por dia durante 7 dias, começando com vários instantes após a provocação com vírus (***p < 0,001, **P < 0,1, em comparação com placebo). A taxa de sobrevivência foi 100 % para o composto 1 começando na pré-infeção, e tratamento retardado até 3 dias pós-infeção. A taxa de sobrevivência foi 80 % para o composto 1 começando aos 4 dias pós-infeção, indicando uma melhoria significativa relativamente ao placebo em grupos com tratamento retardado. Em contraste, Ribavirin proporcionou 90 % de sobrevivência começando na pré-infeção e o veículo proporcionou 12,5 % de sobrevivência começando na pré-infeção. A maior parte das mortes ocorreu num período de 10 dias de infeção. Os animais sobreviventes serão novamente provocados com YFV aos 21 dias pós-infeção. A alteração de peso dos hamsters está indicada na Figura 13. Hamsters infetados com YFV e tratados com composto 1 desde a pré-infeção até 4 dias pós-infeção exibiram ganho de peso relativamente ao placebo e Ribavirin administrados pré-infeção. Apresenta-se a alteração percentual do peso de hamsters infetados com YFV e tratados com composto 1 duas vezes por dia durante 7 dias, começando em vários instantes antes e após a provocação com vírus.
Exemplo 14: Biodisponibilidade Oral do Composto 1 em Ratos. 0 composto 1 foi doseado a 10 mg/kg, PO em ratos. A curva farmacocinética que mede a concentração do composto 1 em plasma de rato até 6 horas está apresentada na Figura 14.
Exemplo 15: Estudo do Vírus Marburg para o Composto 1. 0 composto 1 foi doseado IM em ratinhos BALB/c com 10-12 semanas de idade provocados (interperitonealmente) com 1000 pfu de MARV-Ravn adaptado a ratinho. O estudo foi dividido em 10 grupos (N=10 por grupo). Os regimes de dosagem, vias e doses estão apresentados na Tabela 7. O composto 1 foi dissolvido em solução salina a 0,9 % antes da administração e monitorizaram-se a saúde e peso durante 14 dias pós-infeção.
Está incluída na Tabela 8 a sobrevivência percentual dos 10 grupos deste estudo até ao dia 12. A taxa de sobrevivência de ratinhos tratados só com veículo (solução salina a 0,9 %) foi 60 % no dia 7 e 30 % nos dias 8-12. Verificou-se que o composto 1 aumenta a sobrevivência até pelo menos 90 % no dia 7, e pelo menos 80 % nos dias 8-12 a todas as doses.

Claims (12)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Composto de fórmula I:
    em que A é NH2, e B é H; ou respetivo sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato, para utilização no tratamento, supressão ou prevenção de uma infeção virai.
  2. 2. Composto para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a referida infeção virai compreende infeção com um ou mais vírus.
  3. 3. Composto para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-2, em que a infeção virai compreende um vírus selecionado do grupo que consiste nas famílias orthmyxoviridae, paramyxoviridae, arenaviridae, bunyaviridae, flaviviridae, filoviridae, togaviridae, picornaviridae e coronaviridae·, ou em que a infeção virai é selecionada do grupo que consiste em adenovirus, rinovírus, vírus da hepatite, vírus da imunodeficiência, poliomielite, sarampo, Ébola, Coxsackie, Rino, Nilo Ocidental, varíola, encefalite, febre-amarela, febre de Dengue, influenza A, influenza B, Lassa, coriomeningite linfocitica, Junin, Machuppo, Guanarito, hantavirus, Febre do Vale do Rift, La Crosse, encefalite da Califórnia, Crimeia-Congo, Marburg, Encefalite Japonesa, Floresta de Kyasanur, encefalite equina Venezuelana, encefalite equina Oriental, encefalite equina Ocidental, síndroma respiratória aguda grave (SARS) , parainfluenza, respiratório sincicial, Punta Toro, Tacaribe e Pachindae; ou em que a infeção virai é selecionada do grupo que consiste em adenovirus, vírus da Febre de Dengue, influenza A, influenza B, Junin, sarampo, parainfluenza, Pichinde, Punta Toro, respiratório sincicial, rinovírus, Febre do Vale do Rift, SARS-CoV, tacaribe, encefalite equina Venezuelana, Nilo Ocidental, e febre-amarela; ou em que a infeção virai é selecionada do grupo que consiste em vírus Ébola, febre-amarela, Marburg, influenza A e influenza B.
  4. 4. Composto de fórmula I:
    em que A é NH2, e B é H; ou respetivo sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato, para utilização na inibição de uma RNA polimerase virai selecionada do grupo que consiste nas polimerases virais de orthmyxoviridae, paramyxoviridae, arenaviridae, bunyaviridae, flaviviridae, filoviridae, togaviridae, picornaviridae e coronaviridae.
  5. 5. Composto para utilização de acordo com a reivindicação 4, em que uma segunda RNA polimerase virai é inibida.
  6. 6. Composto para utilização de acordo com a reivindicação 5, em que a segunda RNA polimerase virai é selecionada do grupo que consiste nas polimerases virais de orthmyxoviridae, paramyxoviridae, arenaviridae, bunyaviridae, flaviviridae, filoviridae, togaviridae, picornaviridae e coronaviridae.
  7. 7. Composto para utilização de acordo com a reivindicação 5 ou 6, em que a segunda RNA polimerase virai é selecionada do grupo que consiste nas polimerases virais de adenovirus, influenza A, influenza B, parainfluenza, respiratório sincicial, rinovirus, Junin, Pichinde, Febre do Vale do Rift, Febre de Dengue, sarampo, Febre-Amarela, tacaribe, encefalite equina Venezuelana, Nilo Ocidental e SARS-CoV.
  8. 8. Composto para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 4-7, em que a RNA polimerase virai é selecionada do grupo que consiste nas polimerases virais de adenovirus, rinovirus, hepatite, vírus da imunodeficiência, poliomielite, sarampo, Ébola, Coxsackie, Rino, Nilo Ocidental, varíola, encefalite, febre-amarela, febre de Dengue, influenza A, influenza B, Lassa, coriomeningite linfocítica, Junin, Machuppo, Guanarito, hantavirus, Febre do Vale do Rift, La Crosse, encefalite da Califórnia, Crimeia-Congo, Marburg, Encefalite Japonesa, Floresta de Kyasanur, encefalite equina Venezuelana, encefalite equina Oriental, encefalite equina Ocidental, síndroma respiratória aguda grave (SARS), parainfluenza, respiratório sincicial, Punta Toro, Tacaribe e Pachindae; ou em que a RNA polimerase virai é uma polimerase selecionada do grupo que consiste nas polimerases virais de adenovirus, Febre de Dengue, influenza A, influenza B, Junin, sarampo, parainfluenza, Pichinde, Punto Toro, respiratório sincicial, rinovirus, Febre do Vale do Rift, SARS-CoV, tacaribe, encefalite equina Venezuelana, Nilo Ocidental e febre-amarela; ou em que a RNA polimerase virai é uma polimerase selecionada do grupo que consiste nas polimerases virais de Ébola, febre-amarela, Marburg, influenza A e influenza B.
  9. 9. Composto para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, que também compreende a administração de um agente antiviral adicional.
  10. 10. Composto para utilização de acordo com a reivindicação 9, em que o agente antiviral adicional é selecionado do grupo que consiste em laninamivir, oseltamivir, zanamivir e peramivir.
  11. 11. Composto para utilização de acordo com a reivindicação 9 ou 10, em que o agente antiviral adicional é peramivir.
  12. 12. Composto para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o composto se destina a administração intravenosa, interperitoneal, intramuscular ou oral.
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