CN107810192A - 非天然的脑信号蛋白3及其医药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及非天然存在的突变的脑信号蛋白3分子。具体地，本发明涉及例如在血管生成性疾病和癌症的治疗中显示出改善的特性和药理效应的突变的脑信号蛋白3或者其功能片段。此外，本发明涉及编码此类多肽的核酸分子以及包含此类核酸的载体和宿主。本发明还涉及产生本发明的多肽的方法以及将其用于疾病的治疗，特别是用于血管生成性疾病、肿瘤和/或癌症的医疗干预的方法。

Description

非天然的脑信号蛋白3及其医药用途
本发明涉及非天然存在的突变的脑信号蛋白(semaphorin)3分子。具体地，本发明涉及例如在血管生成性疾病和癌症的治疗中显示出改善的特性和药理效应的突变的脑信号蛋白3或者其功能片段。此外，本发明涉及编码此类多肽的核酸分子以及包含此类核酸的载体和宿主。本发明还涉及产生本发明的多肽的方法以及将其用于疾病的治疗，特别是用于血管生成性疾病、肿瘤和/或癌症的医疗干预的方法。
癌症的发生、发展和转移主要取决于血管生成，即新血管的形成。但是，由于异常情况，如弯曲、覆盖血管壁的血管上皮细胞(EC)之间弱的细胞-细胞接触导致的渗漏以及鞘壁周细胞(ensheathing mural pericyte)的缺乏，癌血管在结构上和功能上是异常的(Goel等人，2011)。因此，癌组织中的血管通透性通常会增加，蛋白质和流体在间隙压力显著增加的血管外室中累积，最终损害抗癌药物的递送(Goel等人，2011)。此外，长期的氧气不足上调肝细胞生长因子/Met酪氨酸激酶信号转导(Michieli,2009)，这与血管通透性异常偶联，强有利于癌细胞内渗、通过血流扩散以及转移。癌血管结构和功能的正常化可以导致标准抗癌疗法的有效性的大幅增加，这反而可以通过与标准抗血管生成治疗相关的不当的血管修剪而受损(Van der Veldt等人，2012)。显著地，越来越多的证据表明，血管正常化疗法最有效的益处如何来自癌症中不同缺氧驱使的现象如癌症干细胞的显著增加(Conley等人，2012)，癌细胞脱分化的诱导(Michieli,2009)以及癌症侵袭和转移的刺激(Michieli,2009；Sennino和McDonald,2012)的减轻。因此，为了获得转变准正规血管网中的异常癌血管的能力，需要鉴定支撑生理学血管形态发生，并且因此在例如异常血管形态发生出现和/或正常的血管形态发生被扰乱的病症，如(实体)癌的治疗中具有医药用途的分子。
脑信号蛋白3A(在小鼠中也被称为Sema3A，并且在人体中也被称为SEMA3A)是生理学血管正常化分子。现有技术的研究鉴定了可以原则上在药理学上开发用于旨在使癌脉管***/癌症中异常的血管发生正常化的疗法中的分子(Goel等人，2011)。诸如血管内皮生长因子(VEGF)的促血管生成因子的抑制可使癌脉管***正常化。但是，这类临床干预的主要障碍表现为这样的事实：这些促血管生成因子显示出有限的时间效力(Goel等人，2011)。此外，血管网受促血管生成因子和抗血管生成因子(这两者的功能在癌组织中发生改变)的同时和平衡的控制(Maione等人，2012；Maione等人，2009)。
在胚胎血管发育期间，EC产生分泌性3类脑信号蛋白(也被称为Sema3)的自分泌化学排斥信号，其通过抑制整合蛋白(其为多细胞生物体中主要的细胞外基质(ECM)受体类别)赋予血管***重塑所需的可塑性(Serini等人，2003)。不同的转基因小鼠癌症模型揭示，在癌血管生成期间，脑信号蛋白3A也在EC中表达，在这里其作为存在于癌前损伤中的内源抑制因子，但是其在癌症发展中丧失(Maione等人，2009)。重要的是，明显癌症损伤中脑信号蛋白3A的缺乏显然与EC中整合蛋白激活的急剧增加相关(Maione等人，2009)。通过体细胞基因转移将脑信号蛋白3A再引入癌症恢复了生理量的活性内皮整合蛋白，最终导致血管密度降低、结构和功能上的血管正常化，癌症生长和转移的抑制以及显著的存活延长(Maione等人，2012；Maione等人，2009)。因此，脑信号蛋白3A可能是生理学血管正常化试剂(Serini等人，2012)。
脑信号蛋白3A属于脑信号蛋白(命名为Sema)家族，其在七个不同类别中的分类依赖于位于其C-末端的独特结构域的相似性(Tran等人，2007)。它们的N-末端包含“sema结构域”、7叶β螺旋桨结构(seven-bladeβ-propeller)(Gherardi等人，2004)，之后是丛状蛋白-脑信号蛋白-整合蛋白(Plexin-Semaphorin-integrin)(PSI)结构域。
脑信号蛋白是同源-二聚配体，其通过丛状蛋白传递信号(Kumanogoh和Kikutani,2013；Tamagnone等人，1999)，丛状蛋白为一类赋予了细胞外sema结构域以及抑制R-Ras(Kumanogoh和Kikutani,2013；Tran等人，2007)和Rap1(Bos和Pannekoek,2012，Wang等人，2012)的细胞溶质GTP酶-激活蛋白(GAP)活性的包含sema结构域的受体，R-Ras和Rap1这两种小GTP酶因其促进整合蛋白介导的细胞对ECM蛋白的粘附而著名(Kinbara等人，2003；Shattil等人，2010)。脑信号蛋白3A通过细胞外信号-调控的激酶1和2(ERK 1/2)的激活和磷酸化传递信号(Kruger等人，2005)。膜结合脑信号蛋白的Sema结构域同源-二聚体以高亲和力直接结合丛状蛋白的sema结构域。这引发丛状蛋白的二聚化和激活(Janssen等人，2010；Nogi等人，2010)。在一些脑信号蛋白，如脑信号蛋白3A中，通过神经纤毛蛋白1(Nrp1)与A型丛状蛋白(Plexin A)的结合形成受体复合物(Tamagnone等人，1999)，所述A型丛状蛋白代表了配体结合和信号转导亚基(Kumanogoh和Kikutani,2013)。一致地，sema-PSI以及免疫球蛋白(Ig)样结构域下游的脑信号蛋白3A和其它分泌性脑信号蛋白包含C-末端碱性氨基酸区段。尽管二硫化物结合的Ig样结构域可物理上稳定sema结构域同源-二聚化，但是C-末端碱性区段是脑信号蛋白3A与Nrp1细胞外部分的b1亚结构域的高亲和力结合所需的(图1)(Kumanogoh和Kikutani,2013)。
脑信号蛋白3A包含多个弗林蛋白酶识别基序，其一旦被切割，可以导致分子的该C-末端部分的释放。这导致脑信号蛋白3A与Nrp1的结合以及脑信号蛋白3A同源-二聚体的稳定受损(Adams等人，1997；Koppel和Raper,1998；Parker等人，2010；Parker等人，2012)。由于脑信号蛋白3A不以高亲和力直接结合丛状蛋白(Tamagnone等人，1999)，因此发现其弗林蛋白酶依赖的切割以及Nrp1结合的缺乏导致在一些生物环境中，特别是在神经元生长锥崩溃中活性的急剧丧失(Koppel和Raper,1998)。值得注意的是，弗林蛋白酶广泛存在于组织中，其为脑信号蛋白3A提供了内置调控机制。但是，这些蛋白酶也可导致脑信号蛋白3A的短期活性。
脑信号蛋白3A与Nrp1的结合负责脑信号蛋白3A诱导的巨噬细胞进入无血管癌症区域，从而促进癌症发展(Casazza等人，2013)。因此，野生型脑信号蛋白3A与Nrp1之间的高亲和力相互作用限制了其作为有效抗癌药物的可利用性，甚至可能有利于癌症发展。
本发明潜在的技术问题是提供血管生成性病症、肿瘤性疾病和/或癌症的改善疗法的手段和方法。
通过提供本文在以下所提供的以及如所附权利要求所表征的实施方案解决该技术问题。
本发明涉及非天然存在的/遗传修饰的/突变的3类脑信号蛋白，特别是选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D的非天然存在的/遗传修饰的/突变的脑信号蛋白，最优选非天然存在的/遗传修饰的/突变的脑信号蛋白3A。
因此，本发明涉及突变的脑信号蛋白3(或其作为血管生成的抑制剂发挥功能的功能片段或者包含所述突变的脑信号蛋白或所述功能片段的融合蛋白/多肽)，其
(a)包含取代对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位丙氨酸的亲水氨基酸；或
(b)包含取代位于其它脑信号蛋白3蛋白中通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的丙氨酸的亲水氨基酸；以及
(c)其中所述脑信号蛋白3选自：脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D，其中优选地，所述脑信号蛋白3是脑信号蛋白3A。
因此，一般而言，本发明提供这样的脑信号蛋白3A、3B、3C和3D：其为非天然存在的，并且包含取代位于如SEQ ID NO:2所示的示例性脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸的亲水氨基酸。
下文示例了该突变在除脑信号蛋白3A之外的其它脑信号蛋白3蛋白，即脑信号蛋白3B、C和D中的对应位点。
这些突变的脑信号蛋白3的实例是这样的脑信号蛋白：其包含取代对应于如SEQID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸的所述亲水氨基酸；取代对应于如SEQID NO:6所示的野生型脑信号蛋白3B 105位的丙氨酸的所述亲水氨基酸；取代对应于如SEQID NO:10所示的野生型脑信号蛋白3C 104位的丙氨酸的所述亲水氨基酸；或者取代对应于如SEQ ID NO:14所示的野生型脑信号蛋白3D 120位的丙氨酸的所述亲水氨基酸。
换言之，本发明提供非天然存在的/遗传修饰的脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和/或脑信号蛋白3D，其中所述脑信号蛋白3、所述其功能片段和/或所述融合蛋白/多肽包含氨基酸序列CX1X2A3GKD，其中：
X1是K或N；
X2是选自W、M和L的氨基酸；并且
A3是取代所述丙氨酸的所述亲水氨基酸。
本文提供的共有基序CX1X2A3GKD在本发明中首次被鉴定。
本发明还涉及核酸分子，其编码本发明的非天然存在的多肽，即突变的脑信号蛋白3，所述突变的脑信号蛋白3选自如本文所表征及所描述的突变的脑信号蛋白3A、突变的脑信号蛋白3B、突变的脑信号蛋白3C和/或突变的脑信号蛋白3D。还提供编码本文所限定的非天然存在的脑信号蛋白3的功能片段的核酸分子以及编码包含本发明的非天然存在的脑信号蛋白3或所述功能片段的融合蛋白/多肽的核酸分子。如本文所述，本发明的功能片段以及融合多肽/蛋白保留了对血管生成出人意料地高度抑制和/或能够使疾病组织(如癌组织和/或肿瘤中)出人意料地高度血管正常化。因此，本发明提供编码本发明的多肽的核酸分子。本发明的多肽是如本文所限定的突变的脑信号蛋白3或其功能片段。本发明的多肽还包含含有突变的脑信号蛋白3(或如本文所限定的此突变的脑信号蛋白3的功能片段)的融合蛋白。本发明的多肽，特别是如本文所限定的融合蛋白，作为血管生成的抑制剂和/或作为血管正常化试剂发挥功能，并且其中对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A106位的丙氨酸或者位于其它脑信号蛋白3蛋白中通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A106位的位点的丙氨酸被亲水氨基酸取代，其中所述脑信号蛋白3选自：脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D。
具体地，本发明涉及核酸分子，其中所编码的突变的脑信号蛋白3(或所述其功能片段或所述融合多肽/蛋白)包含氨基酸序列共有基序CX1X2A3GKD，其中
X1是氨基酸，其是K或N，
X2是选自W、M和L的氨基酸
并且其中丙氨酸(A3)被所述亲水氨基酸，特别是赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或组氨酸，更优选赖氨酸或精氨酸，最优选赖氨酸取代。
本文提供的非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白(或本文所述的其功能片段和/或包含所述非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白或所述脑信号蛋白的所述非天然存在的/人工的/突变的功能片段的融合蛋白)具有高医药潜力。如所附实施例中所阐明的，本文提供的本发明的分子的医药用途是在体内癌症模型中出人意料地降低癌症发展和转移。该体内效果出人意料地优于天然存在的脑信号蛋白如野生型脑信号蛋白3A中所记载或所见的任何效果。该出人意料的效果在本文通过某些所选脑信号蛋白(选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D的3类脑信号蛋白)所例证，所述脑信号蛋白包含在如本文所限定的脑信号蛋白3的本文所鉴定的共有基序CX1X2A3GKD内由亲水氨基酸对(天然存在的)丙氨酸(A3)的人工取代。所述脑信号蛋白内(或包含所述基序的其功能片段内)的这一取代导致与所述脑信号蛋白的非修饰的、天然存在的野生型形式(选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D)相比，与其丛状蛋白受体的亲和力出人意料地增加。换言之，本发明提供非天然存在的突变的3类脑信号蛋白，并且其选自突变的脑信号蛋白3A、突变的脑信号蛋白3B、突变的脑信号蛋白3C和突变的脑信号蛋白3D。因此，本发明提供选自突变的脑信号蛋白3A、突变的脑信号蛋白3B、突变的脑信号蛋白3C和突变的脑信号蛋白3D的非天然存在的突变的3类脑信号蛋白。本文所述的突变的脑信号蛋白3(或本发明这些突变的脑信号蛋白的功能片段以及包含本文所述的突变的非天然存在的脑信号蛋白或其功能片段的融合蛋白)以出人意料地高的亲和力结合丛状蛋白受体。结合亲和力增加规避了对立的Nrp1蛋白参与的需求。此外，突变的脑信号蛋白3(或本文所述的其功能片段或本文所述的融合蛋白)与丛状蛋白受体之间的高亲和力结合有效引发了其下游通路，导致期望的血管正常化和/或生理性非疾病性血管生成。在不受理论束缚的情况下，本发明的突变的脑信号蛋白3(或功能变体或者包含所述突变的脑信号蛋白3或所述功能变体的本发明的融合蛋白)使得其与其丛状蛋白受体之间的高亲和力结合不依赖于包含多个弗林蛋白酶识别基序的Ig样结构域/碱性区段区域。在某些实施方案中，本发明涉及突变的脑信号蛋白3或其片段，其中Ig样结构域/碱性区段区域缺失。由于缺乏如上文所述以及如附图2所示的蛋白酶(弗林蛋白酶)切割位点，本发明的蛋白的保留时间可以增加。
如下文所附的体外和体内实施例所记载的，出人意料地发现，选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D的脑信号蛋白3(或其功能片段)共有基序CX1X2A3GKD内亲水氨基酸对丙氨酸A3的取代导致与其丛状蛋白受体之间的结合增加。因此，本发明的非天然存在的突变的脑信号蛋白3(或其功能片段或者包含所述脑信号蛋白3或其功能变体的融合多肽/蛋白)以高亲和力不依赖于Nrp1结合其丛状蛋白受体。本文还记载了，脑信号蛋白3的共有基序CX1X2A3GKD内(或所述脑信号蛋白3的包含所述共有基序(含有其突变/修饰)的功能片段内)亲水氨基酸对丙氨酸的取代导致丛状蛋白受体激活的出人意料地增加以及人EC趋触性迁移的抑制的出人意料地增加。丛状蛋白受体结合和激活是控制整合蛋白激活、细胞粘附和ECM蛋白上迁移的重要步骤。在不受理论束缚的情况下，丛状蛋白受体通过脑信号蛋白的激活使整合蛋白失活，从而损害细胞在ECM内的运动性。细胞迁移对于癌细胞发展和转移扩散是重要的。因此，可将本发明的突变的脑信号蛋白3(及其功能片段)用于有效抑制癌症发展和转移。在不受理论束缚的情况下，本发明的突变的脑信号蛋白3(和/或其功能片段和/或包含所述突变的脑信号蛋白或本文限定的功能片段的融合蛋白/多肽)以高亲和力结合对应的丛状蛋白受体，有效激活对应的下游通路，并有效抑制细胞运动性。如实例中所示和记载的，某些3类脑信号蛋白(脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D)中的本文所限定的人工引入的修饰导致出人意料有效的分子，其甚至在体内显示出癌症发展和/或转移的降低增加。当与天然存在的脑信号蛋白3相比时，本文所述的突变的/非天然存在的脑信号蛋白样分子显示出出人意料的更优的体内和/或体外特性。本文记载并在所附实施例中显示，脑信号蛋白3的共有基序CX1X2A3GKD内(或其功能片段内或者包含本文所限定的非天然存在的脑信号蛋白3或包含本文所限定的具有所述突变基序的功能片段的融合多肽/蛋白内)的丙氨酸的取代导致癌症发展和转移的降低增加。所述丙氨酸(A3)的取代者优选亲水氨基酸，最优选赖氨酸。这导致的非天然存在的突变的脑信号蛋白3中癌症发展和转移的降低出人意料地优于使用诸如野生型脑信号蛋白3A的常规或天然存在的脑信号蛋白所观察到的效果。具体地，本文提供的体内数据证实了癌症生长和转移体积的抑制的出人意料地增加。人癌症的两种小鼠模型证实了有益的药理学效果。
因此，如所附实施例中记载以及如本文所解释的，在血管生成性病症和/或肿瘤性疾病的疗法中，与常规或天然存在的脑信号蛋白相比，本发明的脑信号蛋白(和/或其功能片段和/或本文所述的融合多肽/蛋白)更优。
本发明的脑信号蛋白(或其功能片段或者包含本发明的非天然存在的脑信号蛋白或包含所述功能片段的融合多肽/蛋白)的更优的效果是由于共有基序CX1X2A3GKD中亲水氨基酸对丙氨酸(A3)的取代，如例如所附实施例中脑信号蛋白3A A106K(位于106位的丙氨酸突变为赖氨酸)(例如，如SEQ ID NO:18或20所示的脑信号蛋白3A A106K ΔIg-b)；参见附图3。如所附实施例中所示，与脑信号蛋白3A A106K具有相同结构，除了缺乏保守基序CX1X2A3GKD中的点突变之外的脑信号蛋白3构建体(脑信号蛋白3A ΔIg-b，例如如SEQ IDNO:43或44中所示的编码核酸序列)(参见附图2)未显示出有益的药理学效果。因此，如本发明中所记载的，出人意料的有益效果可以归因于小鼠和/或人Sema3A、Sema3B、Sema3C和Sema3D的CX1X2A3GKD中的本文所述的突变。优选地，本发明涉及包含本文所限定的丙氨酸(A3)突变的选自Sema 3A、Sema 3B、Sema 3C和Sema 3D的人脑信号蛋白3(或包含本文所限定的共有基序的这些人脑信号蛋白的功能片段)。更优选地，本发明涉及突变的人Sema 3A(或所述人Sema 3A的功能片段)，其包含在序列基序CX1X2A3GKD中含有本文所述的丙氨酸(A3)取代的本文所限定的基序。所述取代是用亲水氨基酸进行的取代，更优选用赖氨酸(K)进行的取代。突变的丙氨酸(A3)是可见于小鼠以及人Sema3A、Sema3B、Sema3C和Sema3D中的高度保守的序列基序CX1X2A3GKD的一部分；参见附图3。一致地，在所附实施例中显示的等同的有益效果被设想可能来自于(人)Sema3B、Sema3C和/或Sema3D中亲水氨基酸(如K)对所述丙氨酸的取代。
人和小鼠Sema3E、Sema3G和Sema3F含有天然存在的亲水氨基酸，其中丙氨酸A3存在于共有序列CX1X2A3GK中。因此，它们在对应于如SEQ ID NO:2所示的脑信号蛋白3A 106位的位点处含有亲水氨基酸。Sema3E和Sema3G在该位点均包含赖氨酸，并且Sema3F在该位点包含丝氨酸。但是，如下述所解释的以及如所附实施例中记载的，Sema 3E和Sema 3F未显示出如本发明的脑信号蛋白3所证实的本发明的特性。在Sema3F 107位赖氨酸对丝氨酸的取代未增加与丛状蛋白A、B、C或D受体的结合。此外，与在107位显示为丝氨酸的野生型对应物相比，该突变体未更有效地抑制EC迁移，这在本文针对本发明的突变的脑信号蛋白3或功能片段而记载，参见所附实施例2和图12。此外，Fc-标记的脑信号蛋白3E和脑信号蛋白3F未与包含本发明的亲水氨基酸对丙氨酸的取代的示例性的突变的脑信号蛋白3A同样强烈地抑制EC迁移；参见示意图13。因此，与在对应于SEQ ID NO:2给出的脑信号蛋白3A 106位的位点处包含天然存在的亲水氨基酸的脑信号蛋白3相比，本文提供的本发明的突变的脑信号蛋白，即突变的脑信号蛋白3A、突变的脑信号蛋白3B、突变的脑信号蛋白3C和突变的脑信号蛋白3D出人意料地是更优的EC细胞运动性抑制剂。证实的对细胞运动性的强烈抑制指示，与天然存在的脑信号蛋白3相比，本发明的突变的脑信号蛋白3蛋白在血管生成性病症和/或肿瘤性疾病疗法中更优(也参见下文)。
因此，本发明不涉及(人)Sema 3E、Sema 3F和/或Sema 3G。
Sema 3A/3B/3C或3D(或其功能片段中)的共有基序CX1X2A3GKD内例如赖氨酸对丙氨酸的取代(特别是如在Sema3A中A106K的改变)导致两种不同的转基因小鼠模型中对癌症生长和转移形成的抑制增加，所述两种不同的转基因小鼠模型即自发性胰腺神经内分泌癌(RipTag2)和胰腺导管腺癌(PDAC)，参见实施例2。PDAC小鼠是常用且致死的人胰腺癌组织型模型。最重要且出人意料地，与AAV8-野生型Sema3A蛋白相比，肠胃外递送的Sema3AA106K在PDAC小鼠中显示出更优的药理学效果。具体地，Sema3A A106K抑制64％的癌症生长，参见附图11A；抑制81％的肝脏转移发生率，参见附图11B；以及使转移体积减小了缩小了78％。AAV-8-递送的野生型Sema3A仅抑制52％的癌症生长，参见附图10A；并抑制59％的肝脏转移发生率。此外，在重塑人癌症的小鼠模型中，Sema3A A106K通过提高周细胞覆盖率、增加血管灌注和抑制癌缺氧而减少了血管面积，并促进了癌血管正常化，参见附图11C。
因此，与常规的非修饰的脑信号蛋白相比，本发明的突变的/非天然存在的脑信号蛋白，如Sema3A A106K在降低癌症发展和转移扩散方面发挥更优的效果。
此外，与腺相关病毒-8(AAV8)递送的全长Sema3A相似，肠胃外施用Sema3A A106K延长了RIP-Tag2小鼠的存活。Sema3A A106K i)诱导了癌体积减小67％；ii)使癌血管面积有效降低了51％，参见附图9A；iii)在增加周细胞覆盖率方面，有利于癌血管的正常化，参见附图9B；iv)增强了灌注，参见附图9C，以及降低了组织缺氧，参见附图9D。因此，本发明证实了其不依赖于Nrp1结合的出人意料的治疗效果。
此外，在体外实验中也证实了突变的脑信号蛋白3蛋白(和/或其功能片段和/或包含所述突变的脑信号蛋白或其中所限定的片段的融合蛋白/多肽)的更优的效果，参见所附实施例。与野生型Sema3A和Sema3A ΔIg-b相比，脑信号蛋白3或其功能片段的共有基序CX1X2A3GKD内亲水氨基酸对丙氨酸(A3)的取代，如存在于突变的脑信号蛋白3A A106K中的取代导致高亲和力地结合丛状蛋白A4，参见所附实施例。此外，与常规脑信号蛋白相比，突变的脑信号蛋白3或其功能片段，例如Sema3A A106K显示出对Rap1小GTP酶的GTP负载的抑制增加，参见附图8A；以及ERK 1/2激酶的磷酸化增加，参见附图8B。因此，与常规脑信号蛋白，如天然人Sema3A相比，突变的脑信号蛋白3(或其功能片段或者包含所述突变的脑信号蛋白3或其功能片段的融合多肽/蛋白)以格外高的亲和力结合丛状蛋白亚基，并有效引发其下游通路，导致癌血管正常化。
此外，脑信号蛋白3蛋白经整合蛋白控制细胞运动性，如EC朝ECM蛋白的趋触性迁移。整合蛋白介导的ECM蛋白上的以及至ECM蛋白的细胞运动性在诸如血管形成(血管生成)和癌细胞在身体的扩散(转移)的一些生理和病理环境中发挥重要作用(Desgrosellier和Cheresh,2010)。因此，对响应常规或非天然存在的脑信号蛋白3或其功能片段的细胞的迁移进行分析。出人意料地，与常规脑信号蛋白相比，脑信号蛋白3或其功能片段的共有基序CX1X2A3GKD内亲水氨基酸对丙氨酸(A3)的取代导致对人脐静脉内皮细胞(EC)的定向迁移的抑制增加，参见附图6A-C。商购的人野生型脑信号蛋白3A和小鼠脑信号蛋白3A ΔIg-b仅损害了EC 19-25％的运动性(表3)。重要的是，诸如Sema3A A106K的突变的脑信号蛋白3蛋白(和/或其功能片段和/或包含所述突变的脑信号蛋白或其中限定的片段的融合蛋白/多肽)是EC运动性的最有效的抑制剂。具体地，尽管最大剂量(3.5nM)的商购的人SEMA3A WT抑制20％的EC定向迁移，但低17.5倍的剂量(0.2nM)的人SEMA3A A106K(例如SEQ ID NO:18)抑制46％的EC运动性(表4)。
因此，与常规脑信号蛋白相比，本发明的突变的脑信号蛋白3(或其功能片段和/或包含所述突变的非天然存在的脑信号蛋白或其功能片段的本发明的融合多肽/蛋白)是更优的细胞运动性抑制剂。对细胞运动性的抑制也损害了癌细胞的转移扩散。因此，与常规脑信号蛋白相比，本发明的突变的脑信号蛋白3(或其功能片段和/或包含所述突变的非天然存在的脑信号蛋白或其功能片段的本发明的融合多肽/蛋白)是更优的癌细胞形成和转移扩散的抑制剂。
因此，所附实施例中的实验数据提供了将本发明的突变的脑信号蛋白3(或其功能片段或者包含所述突变的脑信号蛋白3或其功能片段的融合蛋白/多肽)用于血管生成性病症和/或肿瘤性疾病/癌症的改善疗法的明确理由。
相对于常规的抗血管生成剂，本发明尤其具有下述优势：本发明的一个优势是这一事实，本发明的化合物，即如本文所述的突变的脑信号蛋白/其功能片段/融合蛋白/多肽以高亲和力结合丛状蛋白受体，但是却规避了能促进癌症发展的Nrp-1依赖的脑信号蛋白诱导的巨噬细胞进入无血管肿瘤区域。作为又一优势，本发明的化合物有效引发丛状蛋白受体信号转导。作为又一有利特性，本发明的化合物不依赖于Nrp1而激活丛状蛋白受体。此外，与常规脑信号蛋白3蛋白相比，本发明的化合物更有效地抑制EC迁移。本发明的化合物不被蛋白酶切割，导致保留时间增加。作为又一优势，可以肠胃外递送本发明的化合物(蛋白以及编码所述蛋白的核酸分子)。本发明的化合物在预防新血管的形成，从而终止或减缓肿瘤的生长或扩散方面更优。本发明的化合物在下述方面更优：降低血管面积，使癌血管正常化，增强癌血管的灌注和/或降低组织缺氧。本发明的该发明性化合物可用作血管正常化试剂，即使癌血管正常化，增强癌血管的灌注和/或降低组织缺氧。本发明的又一优势是癌生长被更有效地抑制。作为又一有利特性，本发明的蛋白和/或核酸分子降低了转移发生率并减少了转移体积。因此，本发明在抑制癌症发展和转移扩散方面具有更优的效果。
根据本发明，本文使用的术语“突变的脑信号蛋白3”、“遗传修饰的脑信号蛋白3”、“非天然存在的脑信号蛋白3”或“非天然的脑信号蛋白3”指如本文所限定的脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C或脑信号蛋白3D的突变形式。突变的脑信号蛋白3与野生型脑信号蛋白3或其功能片段区别于选自下述的至少一种突变：氨基酸置换、添加、缺失和重复。具体地，脑信号蛋白3的突变形式包括位于通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的亲水氨基酸对丙氨酸的取代。换言之，脑信号蛋白3蛋白的共有基序CX1X2A3GKD(也在SEQ ID NO:73中显示)中的丙氨酸(A3)突变为亲水氨基酸(表1)。因此，突变的脑信号蛋白3A包含氨基酸序列，其中位于如SEQ ID NO:2或4所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸被亲水氨基酸取代。突变的脑信号蛋白3B包含氨基酸序列，其中位于如SEQ ID NO:6或8所示的野生型脑信号蛋白3B 105位的丙氨酸被亲水氨基酸取代。突变的脑信号蛋白3C包含氨基酸序列，其中位于如SEQ ID NO:10或12所示的野生型脑信号蛋白3C 104位的丙氨酸被亲水氨基酸取代。突变的脑信号蛋白3D包含氨基酸序列，其中位于如SEQ ID NO:14或16所示的野生型脑信号蛋白3D 120位的丙氨酸被亲水氨基酸取代。所述亲水氨基酸可以是，例如赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或组氨酸，更优选赖氨酸或精氨酸，最优选赖氨酸。本文还设想，亲水氨基酸可以是非蛋白原性的或非标准的α-氨基酸(如例如，鸟氨酸和瓜氨酸)。上文以及所附实施例显示，亲水氨基酸对丙氨酸的取代导致对癌生长和转移形成的抑制增加。总之，脑信号蛋白3中突变为亲水氨基酸导致与丛状蛋白受体的高结合亲和力。突变的脑信号蛋白3的结合增加导致丛状蛋白受体及其下游信号转导的激活增加。丛状蛋白受体在控制整合蛋白激活、细胞粘附和在ECM蛋白之上或至ECM蛋白的迁移(其是癌症发展和转移的关键方面)中是重要的。因此，本发明的突变的脑信号蛋白3可被用作血管生成抑制剂以及用作血管正常化试剂。
表1.突变的脑信号蛋白3包含氨基酸序列CX1X2A3GKD，其中丙氨酸A3被亲水氨基酸取代。指示了对应于X1和X2的氨基酸。指示了如SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14和16所示的野生型脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D的氨基酸的位点。
具体地，本发明涉及突变的脑信号蛋白3蛋白，这意味着所述突变的脑信号蛋白选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D。同样地，如果在本发明的背景下提及突变的脑信号蛋白3或突变的脑信号蛋白3蛋白，这意图指突变的脑信号蛋白3A、突变的脑信号蛋白3B、突变的脑信号蛋白3C和突变的脑信号蛋白3D。在本发明的最优选方面，突变的脑信号蛋白3是突变的脑信号蛋白3A。在本文中应理解，突变的脑信号蛋白3不是脑信号蛋白3E、脑信号蛋白3F或脑信号蛋白3G。此外，在本文中应理解，根据本发明的突变的脑信号蛋白3不包括脑信号蛋白3B同种型X2如来自普氏野马(Equus przewalskii)的脑信号蛋白3B同种型X2，或脑信号蛋白3B同种型X6如来自西伯利亚虎(Panthera tigrisaltaica)的脑信号蛋白3B同种型X6。此类脑信号蛋白不包含氨基酸序列CX1X2A3GKD，其中丙氨酸A3被亲水氨基酸取代。此外，根据本发明的突变的脑信号蛋白3作为血管生成的抑制剂和/或作为血管正常化试剂发挥功能。
本文使用的术语“脑信号蛋白3A”、“脑信号蛋白3B”、“脑信号蛋白3C”和“脑信号蛋白3D”、“Sema3A”、“Sema3B”、“Sema3C”和“Sema3D”、SEMA3A”、“SEMA3B”、“SEMA3C”以及“SEMA3D”主要指蛋白。本文限定的以及根据本发明使用的“Sema3A”、“Sema3B”、“Sema3C”和“Sema3D”优选为人“Sema3A”、“Sema3B”、“Sema3C”和“Sema3D”。本文限定的以及根据本发明使用的“脑信号蛋白3A”、“脑信号蛋白3B”、“脑信号蛋白3C”和“脑信号蛋白3D”优选为人“Sema3A”、“Sema3B”、“Sema3C”和“Sema3D”。本文限定的以及根据本发明使用的“SEMA3A”、“SEMA3B”、“SEMA3C”和“SEMA3D”优选为人“Sema3A”、“Sema3B”、“Sema3C”和“Sema3D”。
本文还指定了Sema3AA106K或脑信号蛋白3A A106K，并且在所附实施例中指定为Fc-标记的Sema3A A106K ΔIg-b。
野生型脑信号蛋白3的氨基酸序列和编码核苷酸序列在本领域众所周知。可以利用下述登录号在公共数据库如NCBI中检索核酸序列(下述序列检索自NCBI数据库)：
智人(Homo sapiens)SEMA3A,>gi|100913215|ref|NM_006080.2|，对应于SEQ IDNO:1；小家鼠(Mus musculus)Sema3A,>gi|340523098|ref|NM_009152.4|)，对应于SEQ IDNO:3；智人SEMA3B,>gi|586798179|ref|NM_001290060.1|，对应于SEQ ID NO:5；小家鼠Sema3B,>gi|615276319|ref|NM_001042779.2|，对应于SEQ ID NO:7；智人SEMA3C>gi|335057525|ref|NM_006379.3|，对应于SEQ ID NO:9；小家鼠Sema3C,>gi|118130842|ref|NM_013657.5|，对应于SEQ ID NO:11；智人SEMA3D,>gi|41406085|ref|NM_152754.2|，对应于SEQ ID NO:13；或者小家鼠Sema3D>gi|282847343|ref|NM_028882.4|，对应于SEQ IDNO:15。
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15编码野生型全长脑信号蛋白3蛋白。
对应的氨基酸序列可在公共数据库如NCBI中进行检索。下述序列检索自NCBI数据库。
智人SEMA3A,|ref|NP_006071.1|，对应于SEQ ID NO:2；
小家鼠Sema3A,|ref|NP_033178.2|，对应于SEQ ID NO:4；
智人SEMA3B,|ref|NP_001276989.1|，对应于SEQ ID NO:6；
小家鼠Sema3B,|ref|NP_001036244.1|，对应于SEQ ID NO:8；
智人SEMA3C|ref|NP_006370.1|，对应于SEQ ID NO:10；
小家鼠Sema3C,|ref|NP_038685.3|，对应于SEQ ID NO:12；
智人SEMA3D,|ref|NP_689967.2|，对应于SEQ ID NO:14；或
小家鼠Sema3D,|ref|NP_083158.3|，对应于SEQ ID NO:16。
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16包含野生型全长脑信号蛋白3蛋白的氨基酸序列。
本发明的脑信号蛋白3的氨基酸序列也可获自Uniprot，例如对于小鼠和人脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C以及脑信号蛋白3D而言。
在一个实施方案中，本发明涉及编码多肽的核酸分子，所述多肽包含突变的脑信号蛋白3的氨基酸序列，其中对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸或者位于其它脑信号蛋白3蛋白中通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A106位的位点的丙氨酸被亲水氨基酸取代，其中所述脑信号蛋白3选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D。
在又一实施方案中，本发明涉及突变的脑信号蛋白3，其中所述突变的脑信号蛋白3包含这样的氨基酸序列，其中对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸或者位于其它脑信号蛋白3蛋白中通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的丙氨酸被亲水氨基酸取代，其中所述脑信号蛋白3选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D。
在又一实施方案中，本发明涉及编码多肽的核酸分子，所述多肽包含突变的脑信号蛋白3或其片段的氨基酸序列，其中对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A106位的丙氨酸或者位于其它脑信号蛋白3蛋白中通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的丙氨酸被亲水氨基酸取代，其中所述脑信号蛋白3选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D。
在又一实施方案中，本发明涉及突变的脑信号蛋白3或其片段，其中所述突变的脑信号蛋白3或所述其片段包含这样的氨基酸序列，其中对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸或者位于脑信号蛋白3蛋白的其它脑信号蛋白中通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的丙氨酸被亲水氨基酸取代，其中所述脑信号蛋白3选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D。
如上所解释的，突变的脑信号蛋白3或其功能片段包含取代对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸的亲水氨基酸，或者包含取代位于其它脑信号蛋白3蛋白中通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的丙氨酸的亲水氨基酸，并且其中所述脑信号蛋白3选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D。
如上所解释以及如表1所阐明的，对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸指，位于SEQ ID NO:2 106位的脑信号蛋白3A的特定丙氨酸或者脑信号蛋白3A、3B、3C或3D，优选脑信号蛋白3A的已知的野生型序列中的特定丙氨酸氨基酸残基(其对应于SEQ ID NO:2 106位的脑信号蛋白3A的所述特定丙氨酸)。这也意为与位于SEQID NO:2 106位、位于SEQ ID NO:6 105位、位于SEQ ID NO:10 104位或者位于SEQ ID NO:14 120位的所述特定丙氨酸同源的已知野生型序列(例如脑信号蛋白3A、3B、3C或3D)中的特定氨基酸残基。示例性的同源氨基酸残基可以是丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。更优选地，特定的氨基酸残基是丙氨酸。
可以如下所述通过相关序列的标准同源筛选或PCR介导的筛选技术优选选择其它野生型序列中对应位点处对应的氨基酸残基。在根据本发明的突变的脑信号蛋白3中，丙氨酸或对应的丙氨酸被亲水氨基酸取代或者变为亲水氨基酸。
如本文所提及以及解释的，位于其它脑信号蛋白3蛋白中通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的丙氨酸指，已知野生型脑信号蛋白3B、3C或3D序列中特定的丙氨酸氨基酸残基，其对应于位于SEQ ID NO:2给出的106位的所述脑信号蛋白3A的所述特定丙氨酸。在突变的脑信号蛋白3B、3C或3D中，对应的丙氨酸被亲水氨基酸取代。换言之，对应于如SEQ ID NO:6所示的野生型脑信号蛋白3B 105位的丙氨酸，对应于如SEQ ID NO:10所示的野生型脑信号蛋白3C 104位的丙氨酸；或者对应于如SEQ ID NO:14所示的野生型脑信号蛋白3D 120位的丙氨酸被亲水氨基酸取代。
对应于如SEQ ID NO:6所示的野生型脑信号蛋白3B 105位的丙氨酸指，位于SEQID NO:6 105位的脑信号蛋白3B的特定丙氨酸，或者对应于SEQ ID NO:6 105位脑信号蛋白3B的所述特定丙氨酸的已知野生型脑信号蛋白3B序列中的特定丙氨酸氨基酸残基。
对应于如SEQ ID NO:10所示的野生型脑信号蛋白3C 104位的丙氨酸指，位于SEQID NO:10 104位的脑信号蛋白3C的特定丙氨酸，或者对应于SEQ ID NO:10 104位脑信号蛋白3C的所述特定丙氨酸的已知野生型脑信号蛋白3C序列中的特定丙氨酸氨基酸残基。
对应于如SEQ ID NO:14所示的野生型脑信号蛋白3D 120位的丙氨酸指，位于SEQID NO:14 120位的脑信号蛋白3D的特定丙氨酸，或者对应于SEQ ID NO:14 120位的脑信号蛋白3D的所述特定丙氨酸的已知野生型脑信号蛋白3D序列中的特定丙氨酸氨基酸残基。
如本文所提及和详细描述的，可以通过同源性比较优选选择位于对应位点的对应的氨基酸残基。多肽或核苷酸序列之间的同源性通常由它们的序列相似性推断得出。在本文多序列比对可用于指示各序列的哪一区域或特定氨基酸是同源的。可将脑信号蛋白3A、B、C和D的氨基酸序列用作参考序列。同源性优选存在于一段氨基酸，例如10个，更优选20个，更优选30个，更优选50个或更优选100个氨基酸残基，或者最优选地，同源性存在于整个氨基酸区段。脑信号蛋白3蛋白的示例性氨基酸区段的说明性氨基酸序列比对显示于表1中。对应的丙氨酸最优选为突变的脑信号蛋白3中包含的氨基酸序列CX1X2A3GKD中的A3。因此，也可在氨基酸序列CX1X2A3GKD的帮助下鉴定本发明的突变。
如本文所述，本发明涉及突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其包含取代对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸的亲水氨基酸，或者包含取代位于其它脑信号蛋白3蛋白中通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的丙氨酸的亲水氨基酸，并且其中所述脑信号蛋白3选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D。
换言之，突变的脑信号蛋白3或其功能片段包含取代对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸的亲水氨基酸，或者包含取代位于脑信号蛋白3B、C或D中通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的丙氨酸的亲水氨基酸；并且其中所述脑信号蛋白3选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D。换言之，其它脑信号蛋白是脑信号蛋白3B、3C和3D。
换言之，突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述脑信号蛋白3选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D，并且其中所述突变的信号蛋白3包含：
取代对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸的亲水氨基酸；
取代对应于如SEQ ID NO:6所示的野生型脑信号蛋白3B 105位的丙氨酸的亲水氨基酸；
取代对应于如SEQ ID NO:10所示的野生型脑信号蛋白3C 104位的丙氨酸的亲水氨基酸；或者
取代对应于如SEQ ID NO:14所示的野生型脑信号蛋白3D 120位的丙氨酸的亲水氨基酸。
在本发明最优选的实施方案中，突变的脑信号蛋白3或其功能片段包含取代对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸的亲水氨基酸，并且其中所述脑信号蛋白3是脑信号蛋白3A。换言之，本发明涉及突变的脑信号蛋白3A或其功能片段，其中所述突变的脑信号蛋白3A包含取代对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A的丙氨酸的亲水氨基酸。
如上所概述以及所附实施例中所证实的，氨基酸序列CX1X2A3GKD中丙氨酸(A3)的取代使脑信号蛋白3A、B、C或D多肽成为强血管生成抑制剂。因此，在突变的脑信号蛋白包含的氨基酸序列CX1X2A3GKD中，丙氨酸(A3)突变为亲水氨基酸，即本发明涉及突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述突变的脑信号蛋白3选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D，并且其中所述突变的脑信号蛋白3或其所述功能片段包含：
取代对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸的亲水氨基酸；
取代对应于如SEQ ID NO:6所示的野生型脑信号蛋白3B 105位的丙氨酸的亲水氨基酸；
取代对应于如SEQ ID NO:10所示的野生型脑信号蛋白3C 104位的丙氨酸的亲水氨基酸；或者
取代对应于如SEQ ID NO:14所示的野生型脑信号蛋白3D 120位的丙氨酸的亲水氨基酸；并且其中
所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段包含氨基酸序列CX1X2A3GKD，其中
X1是氨基酸，其为K或N，
X2是选自W、M和L的氨基酸，
并且其中丙氨酸(A3)被所述亲水氨基酸取代。
换言之，本发明涉及突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述突变的脑信号蛋白3选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D，并且
其中所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段包含氨基酸序列CX1X2A3GKD，其中
X1是氨基酸，其为K或N，
X2是选自W、M和L的氨基酸，
并且其中丙氨酸(A3)被亲水氨基酸取代；并且其中所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段包含：
取代对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸的所述亲水氨基酸；
取代对应于如SEQ ID NO:6所示的野生型脑信号蛋白3B 105位的丙氨酸的所述亲水氨基酸；
取代对应于如SEQ ID NO:10所示的野生型脑信号蛋白3C 104位的丙氨酸的所述亲水氨基酸；或者
取代对应于如SEQ ID NO:14所示的野生型脑信号蛋白3D 120位的丙氨酸的所述亲水氨基酸。
下述描述包括所有不同的实施方案。下述涉及主要具有作为血管生成的抑制剂发挥功能的活性的本文提供的非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3蛋白或本文所述的其功能片段或本文所述的功能性sema结构域和/或包含所述非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3蛋白或者所述脑信号蛋白3的所述非天然存在的/人工的/突变的功能片段或所述功能性sema结构域的融合蛋白/多肽。换言之，本发明的化合物，即如本文所述的突变的脑信号蛋白3蛋白/其功能片段/功能性sema结构域/融合蛋白/多肽主要具有作为血管生成的抑制剂发挥功能的活性。通常，血管生成的抑制剂阻止新血管的形成，从而终止或减缓肿瘤的生长或扩散。如本文所示，本发明的化合物减少了血管面积，使得癌血管正常化，即增加了周细胞覆盖率，增加了癌血管的灌注和/或降低了组织缺氧。因此，本发明的氨基酸序列和/或核酸序列涉及血管生成的直接和/或间接抑制剂。通常，血管生成的抑制剂也结合细胞(如EC)表面的受体和/或结合下游信号转导通路中的其它蛋白，封阻它们的活性。如所附实施例中所示，本发明的突变的脑信号蛋白3、其功能片段、功能性sema结构域、融合蛋白或多肽以高亲和力(即展示处于非常低的纳摩尔/次纳摩尔范围的解离常数KD)结合其丛状蛋白受体，例如A型丛状蛋白，如丛状蛋白A4或丛状蛋白A2。因此，本发明的氨基酸序列和/或核酸序列直接和/或间接抑制血管生成。具体地，本发明的突变的脑信号蛋白3、其功能片段或融合蛋白/多肽与其丛状蛋白受体具有解离常数KD低于6nM的亲和力。在优选方面，本发明的突变的脑信号蛋白3、其功能片段或融合蛋白/多肽与其丛状蛋白受体具有解离常数KD低于4nM的亲和力。在甚至更优选的方面，本发明的突变的脑信号蛋白3、其功能片段或融合蛋白/多肽与其丛状蛋白受体具有解离常数KD低于2nM的亲和力。在最优选的方面，本发明的突变的脑信号蛋白3、其功能片段或融合蛋白/多肽与其丛状蛋白受体具有解离常数KD低于1nM的亲和力。可以通过本领域已知的标准方法测量解离常数KD，如根据所附实施例显而易见的分析。在所附实施例中记载了，突变的脑信号蛋白3A以高亲和力，即展示处于非常低的纳摩尔/次纳摩尔范围的解离常数KD，结合丛状蛋白A4受体。此外，记载了突变的脑信号蛋白3B以高亲和力，即展示处于非常低的纳摩尔/次纳摩尔范围的解离常数KD，结合丛状蛋白A2受体。
此外，本发明的突变的脑信号蛋白3、其功能片段、功能性sema结构域或融合蛋白/多肽抑制Rap1GTP负载(65％)。因此，本发明的氨基酸序列和/或核酸序列介导血管生成中相关的下游信号转导通路。因此，如所附实施例中所示，本发明的突变的脑信号蛋白3、其功能片段或融合蛋白/多肽直接和/或间接抑制血管生成。具体地，本发明的突变的脑信号蛋白3、其功能片段或融合蛋白/多肽抑制至少50％的Rap1GTP负载。在优选方面，本发明的突变的脑信号蛋白3、其功能片段或融合蛋白/多肽抑制至少的55％的Rap1GTP负载。在甚至更优选的方面，本发明的突变的脑信号蛋白3、其功能片段或融合蛋白/多肽抑制至少55％的Rap1GTP负载。在最优选的方面，本发明的突变的脑信号蛋白3、其功能片段或融合蛋白/多肽抑制至少65％的Rap1GTP负载。可以通过本领域已知的标准方法测量Rap1GTP负载的抑制，如根据所附实施例显而易见的分析。此外，本发明的突变的脑信号蛋白3、其功能片段、功能性sema结构域或融合蛋白/多肽激活ERK 1/2磷酸化(3.9倍)。具体地，本发明的突变的脑信号蛋白3、其功能片段或融合蛋白/多肽激活至少2.5倍的ERK 1/2磷酸化。在优选方面，本发明的突变的脑信号蛋白3、其功能片段或融合蛋白/多肽激活至少3.0倍的ERK 1/2磷酸化。在甚至更优选的方面，本发明的突变的脑信号蛋白3、其功能片段或融合蛋白/多肽激活至少3.5倍的ERK 1/2磷酸化。在最优选的方面，本发明的突变的脑信号蛋白3、其功能片段或融合蛋白/多肽激活至少4.9倍的ERK 1/2磷酸化。可以通过本领域已知的标准方法测量ERK 1/2磷酸化的激活，如根据所附实施例显而易见的分析。
此外，本发明的突变的脑信号蛋白3、其功能片段、功能性sema结构域、融合蛋白或多肽抑制细胞如EC的运动性(46％)。因此，本发明的突变的脑信号蛋白3、其功能片段和融合蛋白/多肽是细胞运动性的(更优的)抑制剂和/或癌细胞转移扩散的抑制剂。因此，本发明的突变的脑信号蛋白3、其功能片段或融合蛋白/多肽抑制癌细胞的转移扩散。具体地，本发明的突变的脑信号蛋白3、其功能片段或融合蛋白/多肽抑制细胞(如内皮细胞)至少30％的运动性。在优选方面，本发明的突变的脑信号蛋白3、其功能片段或融合蛋白/多肽抑制细胞(如内皮细胞)至少35％的运动性。在甚至更优选的方面，本发明的突变的脑信号蛋白3、其功能片段或融合蛋白/多肽抑制细胞(如内皮细胞)至少40％的运动性。在最优选的方面，本发明的突变的脑信号蛋白3、其功能片段或融合蛋白/多肽抑制细胞(内皮细胞)至少45％的运动性。可以通过本领域已知的标准方法测量细胞的运动性，如根据所附实施例显而易见的分析。
在又一实施方案中，本发明涉及编码多肽的核酸分子，所述多肽包含作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3或其功能片段的氨基酸序列，其中对应于如SEQID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A106位的丙氨酸或者位于其它脑信号蛋白3蛋白中通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A106位的位点的丙氨酸被亲水氨基酸取代，其中所述脑信号蛋白3选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D。
在又一实施方案中，本发明涉及突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中作为血管生成的抑制剂发挥功能的所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段包含氨基酸序列，其中对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A106位的丙氨酸或者位于其它脑信号蛋白3蛋白中通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的丙氨酸被亲水氨基酸取代，其中所述脑信号蛋白3选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D。
在又一实施方案中，本发明涉及编码多肽的核酸分子，所述多肽包含作为血管生成的抑制剂发挥功能的遗传修饰的脑信号蛋白3或其功能片段的氨基酸序列，其中对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸或者位于其它脑信号蛋白3蛋白中通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的丙氨酸被亲水氨基酸取代，其中所述脑信号蛋白3选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D。
在又一实施方案中，本发明涉及遗传修饰的脑信号蛋白3或其功能片段，其中作为血管生成的抑制剂发挥功能的所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段包含氨基酸序列，其中对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸或者位于其它脑信号蛋白3蛋白中通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A106位的位点的丙氨酸被亲水氨基酸取代，其中所述脑信号蛋白3选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D。
在又一实施方案中，本文提供的非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3蛋白或本文所述的其功能片段和/或包含所述非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3蛋白或所述非天然存在的/人工的/突变的功能片段或所述脑信号蛋白3蛋白的所述功能性sema结构域的融合蛋白/多肽或本文提供的多肽具有作为血管正常化试剂发挥功能的活性。换言之，本发明的化合物，即如本文所述的突变的脑信号蛋白3蛋白/其功能片段/功能性sema结构域/融合多肽/蛋白具有作为血管正常化试剂发挥功能的活性，其中血管正常化试剂使癌血管正常化，即增加了周细胞覆盖率，增加了癌血管灌注，降低了组织缺氧和/或提高了向癌的药物递送。因此，本发明的氨基酸序列和/或核酸序列涉及直接和/或间接的血管正常化试剂。
因此，本发明涉及编码多肽的核酸分子，所述多肽包含作为血管正常化试剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3或其功能片段的氨基酸序列，其中对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸或者位于其它脑信号蛋白3蛋白中通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的丙氨酸被亲水氨基酸取代，其中所述脑信号蛋白3选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D。
此外，本发明涉及突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中作为血管正常化试剂发挥功能的所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段包含氨基酸序列，其中对应于如SEQID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A106位的丙氨酸或者位于其它脑信号蛋白3蛋白中通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的丙氨酸被亲水氨基酸取代，其中所述脑信号蛋白3选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D。
下述描述涉及上文所述的本发明的各个实施方案，除非另外明确指明。
突变的脑信号蛋白3蛋白、遗传修饰的脑信号蛋白3蛋白或相关多肽(其功能片段和/或包含所述突变的脑信号蛋白3蛋白或与本文提供并限定的特定脑信号蛋白3蛋白具有至少55％的同一性的所述脑信号蛋白3蛋白的所述突变的功能片段的融合蛋白等)主要具有作为血管生成抑制剂的活性。
此外，突变的脑信号蛋白3蛋白、遗传修饰的脑信号蛋白3蛋白或相关多肽(其功能片段和/或包含所述突变的脑信号蛋白3蛋白或与本文提供且限定的特定脑信号蛋白3蛋白具有至少55％的同一性的所述脑信号蛋白3蛋白的所述突变的功能片段的融合蛋白等)主要具有作为血管正常化试剂的活性。
在优选方面，编码本文提供的突变的脑信号蛋白3的核酸分子优选与SEQ ID NO:1所示的核酸序列至少50％同源/相同。应当理解，此类核酸序列还可以包含直系同源的/同源的/相同的(从而相关的)序列。更优选地，编码本文提供的突变的脑信号蛋白3的核酸序列与SEQ ID NO:1中任一项所示的核酸序列至少52％、53％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同源/相同。其中优选较高的序列同一性数值。
在某些方面，编码本文提供的突变的脑信号蛋白3的核酸分子优选与SEQ ID NO:5所示的核酸序列至少48％同源/相同。应当理解，此类核酸序列还可以包含直系同源的/同源的/相同的(从而相关的)序列。更优选地，编码本文提供的突变的脑信号蛋白3的核酸序列与SEQ ID NO:5中任一项所示的核酸序列至少50％、52％、53％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同源/相同，其中优选较高的序列同一性数值。
在某些方面，编码本文提供的突变的脑信号蛋白3的核酸分子优选与SEQ ID NO:9所示的核酸序列至少55％同源/相同。应当理解，此类核酸序列还可以包含直系同源的/同源的/相同的(从而相关的)序列。更优选地，编码本文提供的突变的脑信号蛋白3的核酸序列与SEQ ID NO:9中任一项所示的核酸序列至少57％、60％、63％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同源/相同，其中优选较高的序列同一性数值。
在某些方面，编码本文提供的突变的脑信号蛋白3的核酸分子优选与SEQ ID NO:13所示的核酸序列至少45％同源/相同。应当理解，此类核酸序列还可以包含直系同源的/同源的/相同的(从而相关的)序列。更优选地，编码本文提供的突变的脑信号蛋白3的核酸序列与SEQ ID NO:13中任一项所示的核酸序列至少48％、50％、53％、、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同源/相同，其中优选较高的序列同一性数值。
在某些方面，编码本文提供的突变的脑信号蛋白3的核酸分子优选与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、57、59、61、63、65、67、69或71中任一项所示的核酸序列至少55％同源/相同。应当理解，此类核酸序列还可以包含直系同源的/同源的/相同的(从而相关的)序列。更优选地，编码本文提供的突变的脑信号蛋白3的核酸序列与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、57、59、61、63、65、67、69或71中任一项所示的核酸序列至少56％、58％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同源/相同，其中优选较高的序列同一性数值。更优选地，编码本文提供的突变的脑信号蛋白3的所有方面的核酸序列与SEQ ID NO:NO:1、3、5、7、9、11、13、15、57、59、61、63、65、67、69或71中任一项所示的核酸序列至少60％同源/相同。更优选地，编码本文提供的突变的脑信号蛋白3的核酸序列与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、57、59、61、63、65、67、69或71中任一项所示的核酸序列至少70％同源/相同。甚至更优选地，编码本文提供的突变的脑信号蛋白3的核酸序列与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、57、59、61、63、65、67、69或71中任一项所示的核酸序列至少80％同源/相同。最优选地，编码本文提供的突变的脑信号蛋白3的核酸序列与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、57、59、61、63、65、67、69或71中任一项所示的核酸序列至少90％同源/相同。以上限定的直系同源的/同源的/相同的序列还可以包含于更长或更短的同种型、剪接变体以及融合转录本中。本文使用的术语“直系同源蛋白”或“直系同源基因”分别指在不同物种中，由于它们来源于共同的祖先而彼此相似的蛋白和基因。
用于表征已知核酸序列的直系同源序列或其它相关序列的杂交分析在本领域众所周知；参见例如Sambrook,Russell"Molecular Cloning,A Laboratory Manual",ColdSpring Harbor Laboratory,N.Y.(2001)；Ausubel,"Current Protocols in MolecularBiology",Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1989)。
本文结合核酸使用的术语“杂交(hybridization)”或“杂交(hybridizing)”涉及在任何严紧程度的条件下的杂交。通常，可在不同严紧程度的实验条件下进行核酸的杂交，如Southern或Northern杂交。通常在合适的缓冲液和温度条件下，使固定化于固体支持物如膜上的核酸与含有另一相似核酸(被称为探针)的液体接触，以选择性地允许探针与固定化的核酸的相互作用，其中探针与待测试的固定化的核酸具有一定程度的序列同一性。通常，用于杂交，特别是杂交之后的洗涤步骤的缓冲液是标准柠檬酸钠缓冲液(SSC；也被称为柠檬酸钠缓冲盐水)。20倍浓缩的SSC缓冲液含有3M NaCl和0.3M柠檬酸钠，利用HCl调节至pH 7.0，并且其可商购自例如Sigma Aldrich。对应的20倍SSC缓冲液中Na+的浓度为3.3M(即3.3mol/L)；以及对于10倍SSC缓冲液，其为1.65M；对于5倍SSC缓冲液，其为0.825M；对于2倍SSC缓冲液，其为0.33M；对于1倍SSC缓冲液，其为0.165M；以及对于0.1倍SSC缓冲液，其为0.0165M。可向SSC缓冲液中添加甲酰胺或十二烷基硫酸钠(SDS)，以降低探针的非特异性结合。杂交的严紧性取决于探针序列中存在的核苷酸G和C的百分比(％G+C)以及杂交条件，特别是温度、Na+的浓度和甲酰胺或SDS(如果存在)的浓度。通常，杂交温度越高，钠(Na+)浓度越低，严紧性越高。因此，可以通过适当选择杂交的温度、SSC缓冲液的浓度(从而选择钠的浓度)以及任选地添加至SSC缓冲液中的甲酰胺(或SDS)的浓度来控制杂交的严紧性。如果在杂交程序的不同步骤中使用不同浓度的SSC缓冲液，则浓缩度最高的SSC缓冲液(其通常是用于最终的洗涤步骤的缓冲液)中钠和甲酰胺的浓度是决定性的。
因此，在给定的探针GC含量下以及在杂交之后用于洗涤的浓缩度最高的缓冲液(通常为用于最终洗涤步骤的缓冲液)中特定的钠和甲酰胺(如果存在)浓度下，可以通过将杂交温度调节至低于有效解链温度(Tm)的特定摄氏度数(例如25℃或更低)来控制杂交的严紧性，所述解链温度可用下述公式进行计算(对于DNA-DNA杂交)：
Tm＝81.5+16.6(log M[Na+])+0.41(％G+C)–0.72(％甲酰胺)
在以上公式中，“Tm”是这样的温度：在该温度下，待测试的固定化的核酸序列需要100％匹配探针序列，以使两个序列互相杂交；“log M[Na+]”是缓冲液中以mol/L计的钠(Na+)浓度的以10为底的对数(log10)；“％G+C”是探针序列中核苷酸G和C的百分比(GC含量)；以及“％甲酰胺”是缓冲液中以％(体积/体积)计的甲酰胺的浓度。众所周知，待测定的探针的长度构成杂交条件的额外参数。
杂交温度低于Tm越远，杂交的严紧性越低。具体地，对于杂交温度低于计算的Tm的每个1.4℃而言，在1％序列错配的存在下，杂交仍将发生，即如果杂交温度低于计算的Tm至少x·1.4℃，探针序列与待测试的固定化的核酸的x％错配仍将导致杂交。例如，如果计算的Tm是90℃，并且在55℃(即低于Tm 35℃)下进行杂交实验，则与探针序列至少82.1％匹配的核酸序列将与探针杂交(即，35℃/1.4℃＝25.0，意为100％–25.0％＝75.0％)。
如本文所使用的，在“严紧条件”下的杂交优选意为，杂交温度低于Tm(利用以上所述的公式进行计算)约35℃或者更低，这对应于杂交发生所需的约75.0％的最低序列同一性(即，100％–(35℃/1.4℃)％)。更优选地，在严紧条件下的杂交意为，杂交温度为低于Tm约30℃或更低(对应于杂交所需的约78.6％的最低序列同一性)；甚至更优选地，在严紧条件下的杂交意为，杂交温度为低于Tm约25℃或更低(对应于杂交所需的约82.1％的最低序列同一性)；甚至更优选地，在严紧条件下的杂交意为，杂交温度为低于Tm约20℃或更低(对应于杂交所需的约85.7％的最低序列同一性)；甚至更优选地，低于Tm约15℃或更低(对应于杂交所需的约89.3％的最低序列同一性)；甚至更优选地，低于Tm约10℃或更低(对应于杂交所需的约92.9％的最低序列同一性)；甚至更优选地，低于Tm约7℃或更低(对应于杂交所需的约95.0％的最低序列同一性)；甚至更优选地，低于Tm约5℃或更低(对应于杂交所需的约96.4％的最低序列同一性)；以及仍然更优选地，低于Tm约3℃或更低(对应于杂交所需的约97.9％的最低序列同一性)。相反地，在“非严紧条件”下的杂交意为，杂交温度低于严紧杂交所需的以上所限定的温度。如果未进一步指定，则条件优选是非严紧的。可以根据例如Sambrook(2001)loc.cit.；Ausubel(1989)loc.cit.,或Higgins and Hames(Eds.)"Nucleic acid hybridization,a practical approach"IRL Press Oxford,WashingtonDC,(1985)中所述的常规方案建立所述杂交条件。条件的设置显然在技术人员的技术内，并且可以根据本领域所述的方案来确定。
根据本发明，在两条或更多条核酸序列背景下的术语“同源性”或“同源性百分比”或“相同的”或“同一性百分比”或“序列同一性”指，如利用本领域已知的序列比较算法或者通过手动比对或目测所测量的，当为了最大一致性在比较窗(优选在全长中)或者在指定的区域(例如功能性sema结构域)内进行比较或比对时，相同或者具有指定的相同核苷酸百分比的两条或更多条序列或子序列。具有例如70％至90％或更高的序列同一性的序列可被认为基本相同。此定义也适用于测试序列的互补物。优选地，所述同一性存在于长度为至少约15至约25个核苷酸的区域内，更优选地，长度为至少约50至约100个核苷酸的区域内，甚至更优选地，长度为至少约800至约1200个核苷酸的区域内，并且最优选地，全长内。如本领域所知的，本领域技术人员将了解如何利用例如诸如那些基于CLUSTALW计算机程序(Thompson Nucl.Acids Res.2(1994),4673-4680)或FASTDB(Brutlag Comp.App.Biosci.6(1990),237-245)的算法确定序列之间/间的同一性百分比。
尽管FASTDB算法在其计算中通常不考虑序列内的非匹配缺失或添加，即空位，但是这可以手动修正以避免过高估计％同一性。然而，CLUSTALW在其同一性计算中不考虑序列空位。本领域技术人员还可使用BLAST和BLAST 2.0算法(Altschul,(1997)Nucl.AcidsRes.25:3389-3402；Altschul(1993)J.Mol.Evol.36:290-300；Altschul(1990)J.Mol.Biol.215:403-410)。用于核酸序列的BLASTN程序使用下述作为缺省值：字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝4，和两条链的比较。BLOSUM62评分矩阵(Henikoff(1989)PNAS89:10915)使用比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝4，和两条链的比较。
为了确定核酸序列中的核苷酸是否分别对应于例如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、57、59、61、63、65、67、69或71的核苷酸中的某一位点，技术人员可以使用本领域众所周知的手段和方法，例如手动或者通过利用诸如本文提及的那些计算机程序进行比对。例如，可以使用代表基本局部比对检索工具BLAST的BLAST 2.0(Altschul(1997),loc.cit.；Altschul(1993),loc.cit.；Altschul(1990),loc.cit.)来检索局部序列比对。如以上所讨论的，BLAST产生核苷酸序列的比对以确定序列相似性。由于比对的局部性质，BLAST特别适用于确定准确匹配或鉴定相似序列。BLAST算法输出的基本单位是高评分片段对(HSP)。HSP由任意的但是长度相同的两个序列片段组成，所述序列片段的比对局部最大化，并且其比对评分满足或者超过用户设定的阈值或截止评分。BLAST方法寻找查询序列与数据库序列之间的HSP，以评估存在的任何匹配的统计学显著性，以及仅报道满足用户所选的显著阈值的那些匹配。参数E建立了用于报道数据库序列匹配的统计学显著的阈值。E被解释为在整个数据库检索的背景下，HSP(或一组HSP)偶发事件的期望频数的上限。在程序输出中报道了匹配满足E的任何数据库序列。
将利用BLAST的相似计算机技术(Altschul(1997),loc.cit.；Altschul(1993),loc.cit.；Altschul(1990),loc.cit.)用于检索诸如GenBank或EMBL的核苷酸数据库中相同或相关的分子。该分析比多种基于膜的杂交更快速。此外，可以改进计算机检索的敏感性以确定任何具体匹配是被归类为准确的还是相似的。检索的基础是产物评分，其被定义为：
并且其既考虑两条序列之间的相似性程度又考虑序列匹配的长度。例如，伴随着40的产物评分，匹配在1-2％误差内将是准确的；以及在70的产物评分下，匹配将是准确的。通常通过选择显示出15至40的产物评分的那些分子来鉴定相似的分子，尽管较低的评分可能鉴定出相关的分子。如本领域所知的，能够产生序列比对的程序的另一实例是CLUSTALW计算机程序(Thompson(1994)Nucl.Acids Res.2:4673-4680)或FASTDB(Brutlag(1990)Comp.App.Biosci.6:237-245)。
上文给出的关于“核酸序列的同源性/同一性”的解释和定义，加上必要的修改，适用于突变的脑信号蛋白3或其功能片段或者多肽中的成员的“氨基酸序列”，特别是如SEQID NO:2(智人SEMA3A)、SEQ ID NO:6(智人SEMA3B)、SEQ ID NO:10(智人SEMA3C)、SEQ IDNO:14(智人SEMA3D)、SEQ ID NO:4(小家鼠Sema3A)、SEQ ID NO:8(小家鼠Sema3B)、SEQ IDNO:12(小家鼠Sema3C)和SEQ ID NO:16(小家鼠Sema3D)所述的氨基酸序列。包含位于通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型人脑信号蛋白3A 106位的位点的赖氨酸的脑信号蛋白3蛋白的示例性序列在SEQ ID NO:58、60、62、64、66、68、70或72中给出。
突变的脑信号蛋白3蛋白或遗传修饰的脑信号蛋白3蛋白与野生型脑信号蛋白3蛋白/多肽具有至少55％的同源性/同一性，所述野生型脑信号蛋白3蛋白/多肽具有如例如SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16中所述的氨基酸序列并作为血管生成的抑制剂发挥功能。
在优选方面，提供的本发明的突变的脑信号蛋白3优选与如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列至少50％同源/相同。应当理解，此类氨基酸序列还可以包含直系同源的/同源的/相同的(从而相关的)序列。更优选地，编码本文提供的突变的脑信号蛋白3的氨基酸序列与如SEQ ID NO:2中任一项所示的氨基酸序列至少52％、53％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同源/相同，其中优选较高的序列同一性数值。
在某些方面，本文提供的本发明的突变的脑信号蛋白3优选与如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列至少48％同源/相同。应当理解，此类氨基酸序列还可以包含直系同源的/同源的/相同的(从而相关的)序列。更优选地，编码本文提供的突变的脑信号蛋白3的氨基酸序列与如SEQ ID NO:6中任一项所示的氨基酸序列至少50％、52％、53％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同源/相同，其中优选较高的序列同一性数值。
在某些方面，本文提供的本发明的突变的脑信号蛋白3优选与如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列至少55％同源/相同。应当理解，此类氨基酸序列还可以包含直系同源的/同源的/相同的(从而相关的)序列。更优选地，编码本文提供的突变的脑信号蛋白3的氨基酸序列与如SEQ ID NO:10中任一项所示的氨基酸序列至少57％、60％、63％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同源/相同，其中优选较高的序列同一性数值。
在某些方面，本文提供的本发明的突变的脑信号蛋白3优选与如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列至少45％同源/相同。应当理解，此类氨基酸序列还可以包含直系同源的/同源的/相同的(从而相关的)序列。更优选地，编码本文提供的突变的脑信号蛋白3的氨基酸序列与如SEQ ID NO:14中任一项所示的氨基酸序列至少48％、50％、53％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同源/相同，其中优选较高的序列同一性数值。
在某些方面，提供的本发明的突变的脑信号蛋白3优选与如SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16中任一项所示的氨基酸序列至少55％同源/相同。更优选地，突变的脑信号蛋白3与野生型脑信号蛋白3蛋白/多肽具有至少57％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％的同源性/同一性，其中优选较高的数值，所述野生型脑信号蛋白3蛋白/多肽分别具有如例如SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14和16中所述的氨基酸序列。最优选地，突变的脑信号蛋白3与野生型脑信号蛋白3蛋白/多肽具有至少99％的同源性，所述野生型脑信号蛋白3蛋白/多肽具有如例如SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16所述的氨基酸序列。
本发明还包括背离上文所述的野生型氨基酸序列的多肽，其中所述背离可以是，例如单独的或组合的核酸和/或核苷酸置换、缺失、添加、***、重复、倒位和/或重组的结果。那些背离可以是天然存在的或者是经本领域众所周知的重组DNA技术产生的，参见例如Sambrook(Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarbourLaboratory Press,Cold Spring Harbour,NY(1989))和Ausubel,"Current Protocols inMolecular Biology",Green Publishing Associates；以及Wiley Interscience,N.Y.(1989)中所述的技术。等位基因变异可以是天然存在的等位基因变体以及合成产生的或基因工程化的变体。由以上所述的编码突变的脑信号蛋白3和/或其片段的核酸分子的不同衍生物、等位基因变体、同源物或类似物编码的多肽、肽或蛋白片段可以共有特定的共同特征，如分子量、免疫反应性、构象等；以及物理特性，如电泳迁移率、色谱特性、沉降系数、最佳pH、稳定性、溶解度、光谱性质等。
本文提及的术语“互补物”、“反向互补物”以及“反向序列”描述于下述实例中：对于序列5’AGTGAAGT3’，互补物是3’TCACTTCA5’，反向互补物是3’ACTTCACT5’，并且反向序列是5’TGAAGTGA3’。
本发明涉及如本文所限定的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其可选自：
(a)多肽，其由选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:13的核酸序列编码，
其中位于SEQ ID NO:1 631至633位的核苷酸GCT被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，
其中位于SEQ ID NO:5 559至561位的核苷酸GCA被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，
其中位于SEQ ID NO:9 872至874位的核苷酸GCT被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，以及
其中位于SEQ ID NO:13 398至400位的核苷酸GCC被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代；
(b)多肽，其具有选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:14的氨基酸序列，其中位于SEQ ID NO:2 106位，位于SEQ ID NO:6 105位，位于SEQ ID NO:10104位或者位于SEQ ID NO:14120位的丙氨酸残基被所述亲水氨基酸取代；
(c)多肽，其由在严紧条件下与编码(a)或(b)所限定的多肽的核酸分子的互补链杂交的核酸序列编码；
(d)多肽，其作为血管生成的抑制剂发挥功能，并且与(b)中提及的多肽中的任一项具有至少55％的同一性。
在最优选的实施方案中，本发明涉及如本文所限定的突变的脑信号蛋白3A或其功能片段，其可以选自：
(a)多肽，其由如SEQ ID NO:1所示的核酸序列编码，
其中位于SEQ ID NO:1 631至633位的核苷酸GCT被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，
(b)多肽，其具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，其中位于SEQ ID NO:2 106位的丙氨酸残基被所述亲水氨基酸取代；
(c)多肽，其由在严紧条件下与编码如(a)或(b)中所限定的多肽的核酸分子的互补链杂交的核酸序列编码；
(d)多肽，其作为血管生成的抑制剂发挥功能，并且与(b)中提及的多肽中的任一项具有至少50％的同一性。
在某些方面，如本文所限定的突变的脑信号蛋白3或其功能片段可以选自：
(a)多肽，其包含由具有选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:13的核酸序列的核酸分子编码的氨基酸序列，
其中位于SEQ ID NO:1 631至633位的核苷酸GCT被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，
其中位于SEQ ID NO:5 559至561位的核苷酸GCA被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，
其中位于SEQ ID NO:9 872至874位的核苷酸GCT被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，以及
其中位于SEQ ID NO:13 398至400位的核苷酸GCC被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代；
(b)多肽，其具有选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:14的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO:2 106位，对应于SEQ ID NO:6 105位，对应于SEQ IDNO:10 104位或者对应于SEQ ID NO:14 120位的丙氨酸残基被所述亲水氨基酸取代；
(c)多肽，其由编码具有选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:14的氨基酸序列的多肽的核酸分子编码，其中对应于SEQ ID NO:2 106位，对应于SEQID NO:6 105位，对应于SEQ ID NO:10 104位或者对应于SEQ ID NO:14 120位的丙氨酸残基被所述亲水氨基酸取代；
(d)多肽，其由在严紧条件下与如(a)或(c)所限定的核酸分子的互补链杂交的核酸分子编码；
(e)多肽，其与(a)至(d)中任一项的多肽具有至少55％的同一性，并且作为血管生成的抑制剂发挥功能；以及
(f)多肽，其作为血管生成的抑制剂发挥功能，包含由核酸分子编码的氨基酸序列，所述核酸分子与如(a)、(c)和(d)中任一项所限定的核酸分子的核苷酸序列是由于遗传密码而简并的。
在某些方面，突变的脑信号蛋白3、其功能片段或多肽包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12以及SEQ ID NO:14，其中对应于SEQ ID NO:2 106位的丙氨酸残基，其中对应于SEQ ID NO:4 106位的丙氨酸残基，其中对应于SEQ ID NO:6 105位的丙氨酸残基，其中对应于SEQ IDNO:8 105位的丙氨酸残基，其中对应于SEQ ID NO:10 104位的丙氨酸残基，其中对应于SEQID NO:12 104位的丙氨酸残基，其中对应于SEQ ID NO:14 120位的丙氨酸残基，或者其中对应于SEQ ID NO:16 120位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代。
在最优选的实施方案中，突变的脑信号蛋白3A、其功能片段或多肽包含选自SEQID NO:2的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO:4 106位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代。
换言之，本发明涉及突变的脑信号蛋白3或其片段，其中对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸，对应于如SEQ ID NO:4所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸，对应于如SEQ ID NO:6所示的野生型脑信号蛋白3B 105位的丙氨酸，对应于如SEQ ID NO:8所示的野生型脑信号蛋白3B 105位的丙氨酸，对应于如SEQ ID NO:10所示的野生型脑信号蛋白3C 104位的丙氨酸，对应于如SEQ ID NO:12所示的野生型脑信号蛋白3C 104位的丙氨酸，对应于如SEQ ID NO:14所示的野生型脑信号蛋白3D 120位的丙氨酸，或者对应于如SEQ ID NO:16所示的野生型脑信号蛋白3D 120位的丙氨酸被亲水氨基酸取代。
因此，技术人员理解，如果本文通过具***点限定本发明的突变，例如位于如SEQID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸被取代，清楚的是，还可在其它脑信号蛋白3蛋白(如其它脑信号蛋白3A多肽或者脑信号蛋白3B、C或D多肽)中表示对应的氨基酸(位点)，其例如可以通过同源性比较找到。因此，在本文中应理解，对于其它野生型序列的鉴定和/或对于根据本发明突变的对应于野生型脑信号蛋白3A106位的丙氨酸的相关具体氨基酸残基的检测，可以使用标准同源性筛选(例如序列比对)或PCR介导的筛选技术。
在最优选的实施方案中，本发明涉及突变的脑信号蛋白3A或其功能片段，其中对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸被亲水氨基酸取代。
SEQ ID NO:58、60、62、64、66、68、70或72涉及全长人或小鼠突变的脑信号蛋白3A、B、C或D，其中赖氨酸位于通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点。因此，包含亲水氨基酸取代意为，存在于天然存在的脑信号蛋白3A、B、C或D中的特定的丙氨酸，例如对应于SEQ ID NO:2中所示106位的特定丙氨酸突变为或者变为突变的脑信号蛋白3A、B、C或D中的亲水氨基酸，优选赖氨酸。
包含人突变的脑信号蛋白3A的示例性多肽具有SEQ ID NO:58中给出的氨基酸序列，其中赖氨酸位于106位。
包含小鼠突变的脑信号蛋白3A的示例性多肽具有SEQ ID NO:60中给出的氨基酸序列，其中赖氨酸位于106位。
包含人突变的脑信号蛋白3B的示例性多肽具有SEQ ID NO:62中给出的氨基酸序列，其中赖氨酸位于105位。
包含小鼠突变的脑信号蛋白3B的示例性多肽具有SEQ ID NO:64中给出的氨基酸序列，其中赖氨酸位于105位。
包含人突变的脑信号蛋白3C的示例性多肽具有SEQ ID NO:66中给出的氨基酸序列，其中赖氨酸位于104位。
包含小鼠突变的脑信号蛋白3C的示例性多肽具有SEQ ID NO:68中给出的氨基酸序列，其中赖氨酸位于104位。
包含人突变的脑信号蛋白3D的示例性多肽具有SEQ ID NO:70中给出的氨基酸序列，其中赖氨酸位于120位。
包含小鼠突变的脑信号蛋白3D的示例性多肽具有SEQ ID NO:72中给出的氨基酸序列，其中赖氨酸位于120位。
因此，本发明涉及突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中突变的脑信号蛋白3包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70以及SEQ ID NO:72或其功能片段。在本发明的优选方面，本发明涉及突变的脑信号蛋白3A或其功能片段，其中突变的脑信号蛋白3A包含SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:60的氨基酸序列。在优选方面，功能片段是如下文详细描述的sema结构域。
此外，本发明涉及编码突变的脑信号蛋白3或其功能片段的核酸分子。本发明的核酸分子可以选自：
(a)核酸分子，其选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:13，
其中位于SEQ ID NO:1 631至633位的核苷酸GCT被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，
其中位于SEQ ID NO:5 559至561位的核苷酸GCA被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，
其中位于SEQ ID NO:9 872至874位的核苷酸GCT被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，以及
其中位于SEQ ID NO:13 398至400位的核苷酸GCC被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代；
(b)核酸分子，其编码选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:14的多肽，其中位于SEQ ID NO:2 106位，位于SEQ ID NO:6 105位，位于SEQ ID NO:10104位或者位于SEQ ID NO:14 120位的丙氨酸残基被所述亲水氨基酸取代；
(c)核酸分子，其在严紧条件下与如(a)或(b)中限定的核酸分子的互补链杂交；
(d)核酸分子，其编码作为血管生成的抑制剂发挥功能，并与(b)中提及的多肽中的任一项具有至少55％的同一性的多肽；以及
(e)核酸分子，其与如(a)至(d)中任一项所限定的核酸分子的核苷酸序列是由于遗传密码而简并的，其中简并的核酸分子编码作为血管生成的抑制剂发挥功能的多肽。
在某些方面，如本文所限定的编码的突变的脑信号蛋白3或其功能片段可以选自：
(a)核酸分子，其包含具有选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:13的DNA序列的核酸分子，
其中位于SEQ ID NO:1 631至633位的核苷酸GCT被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，
其中位于SEQ ID NO:5 559至561位的核苷酸GCA被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，
其中位于SEQ ID NO:9 872至874位的核苷酸GCT被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，以及
其中位于SEQ ID NO:13 398至400位的核苷酸GCC被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代；
(b)核酸分子，其包含编码多肽的核酸分子，所述多肽具有选自SEQ ID NO:2、SEQID NO:6、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:14的氨基酸序列，其中位于SEQ ID NO:2 106位，位于SEQ ID NO:6 105位，位于SEQ ID NO:10 104位或位于SEQ ID NO:14 120位的丙氨酸残基被所述亲水氨基酸取代；
(c)核酸分子，其在严紧条件下与如(a)或(b)中所限定的核酸分子的互补链杂交；
(d)核酸分子，其包含编码作为血管生成的抑制剂发挥功能并与(b)中提及的多肽中任一项具有至少55％的同一性的多肽的核酸分子；以及
(e)核酸分子，其与如(a)至(d)中任一项所限定的核酸分子的核苷酸序列是由于遗传密码而简并的，其中简并的核酸分子编码作为血管生成的抑制剂发挥功能的多肽。
在最优选的实施方案中，如本文所限定的编码的突变的脑信号蛋白3A或其功能片段可以选自：
(a)如SEQ ID NO:1中所示的核酸分子，其中位于SEQ ID NO:1 631至633位的核苷酸GCT被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，
(b)编码如SEQ ID NO:2所示的多肽的核酸分子，其中位于SEQ ID NO:2 106位的丙氨酸残基被所述亲水氨基酸取代；
(c)核酸分子，其在严紧条件下与如(a)或(b)中所限定的核酸分子的互补链杂交；
(d)核酸分子，其编码作为血管生成的抑制剂发挥功能，并与(b)中提及的多肽中任一项具有至少50％的同一性的多肽；以及
(e)核酸分子，其与(a)至(d)中任一项所限定的核酸分子的核苷酸序列是由于遗传密码而简并的，其中简并的核酸分子编码作为血管生成的抑制剂发挥功能的多肽。
在某些方面，如本文所限定的编码的突变的脑信号蛋白3或其功能片段可以选自：
包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQID NO:11、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15中所限定的核酸序列的核酸分子，
其中位于SEQ ID NO:1 631至633位的核苷酸GCT被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，
其中位于SEQ ID NO:3 965至967位的核苷酸GCT被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，
其中位于SEQ ID NO:5 559至561位的核苷酸GCA被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，
其中位于SEQ ID NO:7 712至714位的核苷酸GCT被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，
其中位于SEQ ID NO:9 872至874位的核苷酸GCT被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，
其中位于SEQ ID NO:11 498至500位的核苷酸GCT被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，
其中位于SEQ ID NO:13 398至400位的核苷酸GCC被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，或者
其中位于SEQ ID NO:15 904至906位的核苷酸GCT被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代。
SEQ ID NO:57、59、61、63、65、67、69或71涉及编码全长人或小鼠突变的脑信号蛋白3A、B、C或D的核酸序列，其中赖氨酸位于通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点。
编码突变的人脑信号蛋白3A的示例性核酸分子包含如SEQ ID NO:57所限定的核酸序列，其中位于SEQ ID NO:57 631至633位的核苷酸编码氨基酸赖氨酸。
编码突变的小鼠脑信号蛋白3A的示例性核酸分子包含如SEQ ID NO:59所限定的核酸序列，其中位于SEQ ID NO:59 965至967位的核苷酸编码氨基酸赖氨酸。
编码突变的人脑信号蛋白3B的示例性核酸分子包含如SEQ ID NO:61所限定的核酸序列，其中位于SEQ ID NO:61 559至561位的核苷酸编码氨基酸赖氨酸。
编码突变的小鼠脑信号蛋白3B的示例性核酸分子包含如SEQ ID NO:63所限定的核酸序列，其中位于SEQ ID NO:63 712至714位的核苷酸编码氨基酸赖氨酸。
编码突变的人脑信号蛋白3C的示例性核酸分子包含如SEQ ID NO:65所限定的核酸序列，其中位于SEQ ID NO:65 872至874位的核苷酸编码氨基酸赖氨酸。
编码突变的小鼠脑信号蛋白3C的示例性核酸分子包含如SEQ ID NO:67所限定的核酸序列，其中位于SEQ ID NO:67 498至500位的核苷酸编码氨基酸赖氨酸。
编码突变的人脑信号蛋白3D的示例性核酸分子包含如SEQ ID NO:69所限定的核酸序列，其中位于SEQ ID NO:69 398至400位的核苷酸编码氨基酸赖氨酸。
编码突变的小鼠脑信号蛋白3D的示例性核酸分子包含如SEQ ID NO:71所限定的核酸序列，其中位于SEQ ID NO:71 904至906位的核苷酸编码氨基酸赖氨酸。
SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQID NO:67、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:71中给出的核酸编码全长突变的脑信号蛋白3蛋白。因此，本发明涉及突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中突变的脑信号蛋白3由包含选自SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:71的核酸的核酸分子编码。在本发明的优选方面，突变的脑信号蛋白3或其功能片段是突变的脑信号蛋白3A或其功能片段，其中突变的脑信号蛋白3A由包含SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:59的核酸的核酸分子编码。在优选方面，功能片段是如下文所详细描述的sema结构域。
在某些方面，如本文所限定的编码的突变的脑信号蛋白3或其功能片段可以选自：
包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:13所限定的核酸序列的核酸分子，
其中位于SEQ ID NO:1核苷酸631至633位的密码子被编码所述亲水氨基酸的密码子取代，
其中位于SEQ ID NO:5核苷酸559至561位的密码子被编码所述亲水氨基酸的密码子取代，
其中位于SEQ ID NO:9核苷酸872至874位的密码子被编码所述亲水氨基酸的密码子取代，以及
其中位于SEQ ID NO:13核苷酸398至400位的密码子被编码所述亲水氨基酸的密码子取代。
根据本发明，编码亲水氨基酸的密码子意为，根据标准遗传密码(如特别是Stryer(1995),"Biochemistry",Freeman and Company,ISBN0-7167-2009-4中所阐明的)编码“亲水氨基酸”的密码子。在某些方面，K由编码K的密码子编码。在特别优选的方面，K由密码子AAG或AAA编码。遗传密码的简并性允许以许多不同的方式编码并翻译相同的氨基酸序列。例如，亮氨酸、丝氨酸和精氨酸各自由六种不同的密码子编码，而缬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、丙氨酸和甘氨酸各自由四种不同的密码子编码。然而，此类同义密码子的使用频率在真核生物和原核生物中随基因组而变化。例如，哺乳动物之间的同义密码子选择模式非常相似，而进化上较远的有机体如酵母(酿酒酵母(S.cerevisiae))、细菌(如大肠杆菌)和昆虫(如黑腹果蝇(D.melanogaster))显示出明显不同的基因组密码子使用频率模式。因此，可将密码子优化的基因用于本发明。密码子优化的基因的设计应考虑多种因素，包括有机体中密码子的使用频率、最近邻的频率、RNA稳定性、二级结构形成的可能性、合成途径以及该基因预期的未来DNA操作。
本文考虑，可以使用密码子优化的核酸序列。在所附实施例中使用此类密码子优化的基因(SEQ ID NO:17、19、43和44)。
如本文所示，共有基序CX1X2A3GKD中亲水氨基酸对丙氨酸的取代导致有益的药理学效果。
因此，本发明的氨基酸序列涉及突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段包含氨基酸序列CX1X2A3GKD，其中
X1是氨基酸，其为K或N，
X2是选自W、M和L的氨基酸，
并且其中丙氨酸(A3)被所述亲水氨基酸取代。
换言之，本发明涉及突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述突变的脑信号蛋白3选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D，其中优选地，所述突变的脑信号蛋白是脑信号蛋白3A，其中所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段包含氨基酸序列CX1X2A3GKD，其中
X1是氨基酸，其为K或N，
X2是选自W、M和L的氨基酸，
并且其中丙氨酸(A3)被所述亲水氨基酸取代。
在本文中应理解，A3指对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸；对应于如SEQ ID NO:6所示的野生型脑信号蛋白3B 105位的丙氨酸，对应于如SEQ ID NO:10所示的野生型脑信号蛋白3C 104位的丙氨酸，或者对应于如SEQ ID NO:14所示的野生型脑信号蛋白3D 120位的丙氨酸。“A3”通常指特定的丙氨酸；但是，“A3”也可以指与丙氨酸同源的氨基酸残基，如缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。最优选地，“A3”是丙氨酸。此外，由“C”、“X1”、“X2”、“G”、“K”和“D”所限定的氨基酸残基也可以指与所述分别限定的氨基酸残基同源的氨基酸残基，只要突变的脑信号蛋白3选自脑信号蛋白3A、B、C和D。根据本发明，突变的脑信号蛋白3不是脑信号蛋白3E、F或G。在本发明的优选方面，“X1”不是异亮氨酸或缬氨酸。
所述亲水氨基酸选自赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和组氨酸。更优选地，所述亲水氨基酸是赖氨酸或精氨酸，并且最优选地，所述亲水氨基酸是赖氨酸。
术语“亲水氨基酸”优选意为选自N、Q、S、T、E、D、K、R和H的氨基酸。根据标准的三字母氨基酸密码和单字母密码，精氨酸可以缩写为(Arg)或(R)。赖氨酸可以缩写为(Lys)或(K)。天冬氨酸可以缩写为(Asp)或(D)。谷氨酸可以缩写为(Glu)或(E)。谷氨酰胺可以缩写为(Gln)或(Q)。天冬酰胺可以缩写为(Asn)或(N)。组氨酸可以缩写为(His)或(H)。丝氨酸可以缩写为(Ser)或(S)。苏氨酸可以缩写为(Thr)或(T)。N、Q、S和T是亲水的不带电荷的氨基酸，并且E、D、K、R和H是亲水的带电氨基酸。本文还设想，所述亲水氨基酸可以是非蛋白原性的和/或非标准的α氨基酸(如例如鸟氨酸和瓜氨酸)。
本发明涉及包含突变的脑信号蛋白3或其功能片段的氨基酸序列，其中所述亲水氨基酸选自K、R、N、Q、S、T、E、D和H。在优选方面，本发明涉及包含突变的脑信号蛋白3或其功能片段的氨基酸序列，其中所述亲水氨基酸选自K、R、E、D和H。在甚至更优选的方面，本发明涉及包含突变的脑信号蛋白3或其功能片段的氨基酸序列，其中所述亲水氨基酸是K或R。在最优选的方面，本发明涉及包含突变的脑信号蛋白3或其功能片段的氨基酸序列，其中所述亲水氨基酸是K。
在某些方面，本发明涉及包含突变的脑信号蛋白3或其功能片段的氨基酸序列，其中氨基酸序列基序CX1X2A3GKD中的丙氨酸(A3)被选自K、R、N、Q、S、T、E、D和H的所述亲水氨基酸取代。在某些方面，本发明涉及突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中氨基酸序列基序CX1X2A3GKD中的丙氨酸(A3)被选自K、R、E、D和H的所述亲水氨基酸取代。在优选方面，本发明涉及突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中氨基酸序列基序CX1X2A3GKD中的丙氨酸(A3)被所述亲水氨基酸K或R取代。在特别优选的方面，本发明涉及突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中氨基酸序列基序CX1X2A3GKD中的丙氨酸(A3)被所述亲水氨基酸K取代。
此外，本发明涉及包含突变的脑信号蛋白3或其功能片段的多肽，其中所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段包含位于SEQ ID NO:2106位，位于SEQ ID NO:6 105位，位于SEQ ID NO:10 104位或者位于SEQ ID NO:14 120位的所述亲水氨基酸。在某些方面，本发明的多肽包含至少一种选自下述的另外的突变：氨基酸置换、添加、缺失、倒位和重复。最优选地，本发明涉及包含突变的脑信号蛋白3A或其功能片段的多肽，其中所述突变的脑信号蛋白3A或所述其功能片段包含位于SEQ ID NO:2 106位的所述亲水氨基酸，并且包含至少一种选自下述的另外的突变：氨基酸置换、添加、缺失、倒位和重复。
换言之，本发明的氨基酸序列涉及突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中突变的脑信号蛋白3或其功能片段包含位于SEQ ID NO:2 106位，位于SEQ ID NO:6 105位，位于SEQ ID NO:10 104位或者位于SEQ ID NO:14 120位的所述亲水氨基酸，并且包含至少一种选自下述的另外的突变：氨基酸置换、添加、缺失、倒位和重复。
在某些方面，本发明的氨基酸序列涉及突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段包含位于SEQ ID NO:2 106位，位于SEQ ID NO:4106位，位于SEQ ID NO:6 105位，位于SEQ ID NO:8 105位，位于SEQ ID NO:10 104位，位于SEQ ID NO:12 104位，位于SEQ ID NO:14 120位或者位于SEQ ID NO:16 120位的所述亲水氨基酸，并且包含至少一种选自下述的另外的突变：氨基酸置换、添加、缺失、倒位和重复。
下述涉及包含于融合蛋白/多肽中的突变的脑信号蛋白3蛋白。包含于融合蛋白/多肽中的突变的脑信号蛋白3蛋白还可以是突变的脑信号蛋白3蛋白的功能片段。换言之，下述涉及本文提供的非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3蛋白的功能片段，或者本文提供的融合蛋白/多肽中包含的非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3蛋白的功能片段。
在最优选的实施方案中，本文提供的本发明的突变的脑信号蛋白3的功能片段包含功能性sema结构域，其中sema结构域包含位于通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的亲水氨基酸，并且其中sema结构域具有突变的脑信号蛋白3A、B、C或D的特性。术语“sema结构域”指脑信号蛋白3蛋白的结构性结构域。通常，脑信号蛋白包含sema结构域折叠[NCBI位置特异性评分矩阵(PSSM)-ID:214747；保守结构域数据库(CDD)：smart00630和cl15693]，其在现有技术中被描述为所谓的β螺旋桨状拓扑结构的约500个氨基酸长度的变异(Chen等人，2011；Gherardi等人，2004)。更通常地，β-螺旋桨状蛋白是由在中央通道周围环状排列的结构模块(也被称为叶片)产生的盘状结构大家族。各叶片是四股反向平行的β片层。从各自的N末端开始，各股被指定为股A至D(Chen等人，2011；Gherardi等人，2004)。各叶片的内股(A)与位于螺旋桨中心的通道排成行，其中相同重复的的股B和C向外伸出，并且下一重复的股D形成叶片外缘。各片层的内股(股A)与中心轴平行而较外侧的股(股D)成垂直位置(将各β片层扭转为看上去像螺旋桨叶片)的事实组合在一起产生其外观类似螺旋桨的结构域。通常，如现有技术中所述的sema结构域是七叶片的β螺旋桨，并且是已知最大的β螺旋桨折叠的变体。sema结构域的大尺寸由嵌入一些叶片并产生一些大部分位于β螺旋桨的顶面的长环的其它二级结构元件的存在而导致，当Love及同事描述第一脑信号蛋白晶体结构时，将所述长环称为突出(Love等人，2003)。Sema结构域显示出两个名为突出1(在叶片1和叶片2之间)和突出2(在叶片5内部)的突出。sema结构域使用‘环和钩’***将第一叶片和最后的叶片之间封闭成环。通过片层内的疏水接触，以及在大部分结构中，通过‘维可牢(velcro)’型闭环稳定折叠，在所述‘维可牢(velcro)’型闭环中，N-末端β股通过提供第七(C-末端)叶片的最外侧的股(D)闭合成环。通过提供位于叶片6外缘的另外的第五β股的N末端的延伸进一步稳定β螺旋桨。例如，在脑信号蛋白3A中：i)叶片1具有另外的股和螺旋；ii)叶片4具有额外的螺旋；叶片5具有由三个螺旋和两股组成的最大***(Antipenko等人，2003)。可以通过一组保守的半胱氨酸残基对sema结构域进行表征，所述半胱氨酸残基形成四个二硫键以稳定结构：Cys 103-Cys 114、Cys 132-Cys 144、Cys 269-Cys 381以及Cys 293-Cys 341。因此，根据本发明的sema结构域可以包含Cys 103-Cys 114、Cys 132-Cys 144、Cys 269-Cys 381和Cys 293-Cys 341中的至少一种或全部。
在脑信号蛋白中，sema结构域叶片7C-末端的β股直接导致约50个氨基酸长度的丛状蛋白脑信号蛋白整合蛋白(PSI)结构域(NCBI PSSM-ID:214655；smart00423)，其紧贴sema结构域β螺旋桨叶片6的侧面(Love等人，2003)。PSI是由两股反向平行的β-片层形成的结构域，其中两个侧面短α螺旋通过三个二硫键相连，从而形成内部结构域核心。该重复基序发现于脑信号蛋白、数个不同的细胞外受体(包括丛状蛋白)以及αβ整合蛋白异源二聚体的β亚基中(Xiong等人，2004)。丛状蛋白、脑信号蛋白和整合蛋白PSI结构域之间的主要区别是丛状蛋白和脑信号蛋白中差别性的较短的股间AB环。丛状蛋白-、脑信号蛋白-和整合蛋白-PSI结构域的整体结构在结构域的C-末端一半是不同的，提示PSI该部分的功能如何被其特定的结构环境所限定。
脑信号蛋白的sema结构域与丛状蛋白受体的sema结构域之间的异源二聚体界面可以包含脑信号蛋白sema结构域中包含的三个基序/序列/共有基序。如上文所述，脑信号蛋白的sema结构域在其结构折叠中包含两个名为突出1(在叶片1与叶片2之间)和突出2(在叶片5内部)的突出。脑信号蛋白与丛状蛋白受体之间的界面中包含的三个共有基序/序列/基序定位于脑信号蛋白3A、B、C或D内的：i)本文称为基序-1的突出1(例如，SEQ ID NO:2的SEMA3A氨基酸104-113，其对应于SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:6的SEMA3B氨基酸103-112，其对应于SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:10的SEMA3C氨基酸102-111，对应于SEQ ID NO:31；SEQID NO:14的SEMA3D氨基酸118-127，其对应于SEQ ID NO:34)；ii)本文称为基序-2的叶片3(例如，SEQ ID NO:2的SEMA3A氨基酸214-221，其对应于SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:6的SEMA3B氨基酸213-220，其对应于SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:10的SEMA3C氨基酸211-218，其对应于SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:14的SEMA3D氨基酸231-238)，其对应于SEQ ID NO:35；以及iii)本文称为基序-3的叶片4(例如，SEQ ID NO:2的SEMA3A氨基酸274-287，其对应于SEQID NO:27；SEQ ID NO:6的SEMA3B氨基酸274-287，其对应于SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:10的SEMA3C氨基酸271-284，其对应于SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:14的SEMA3D氨基酸291-304，其对应于SEQ ID NO:36)中。因此，本发明的sema结构域可以包含基序-1、基序-2和/或基序-3。
如SEQ ID NO:25、28、31或34中所阐明的氨基酸序列(突出1/基序-1的氨基酸序列)(分别对应于脑信号蛋白A、B、C或D的氨基酸序列)对应于氨基酸序列CX1X2A3GKD(其中X1是K或N；X2是选自W、M和L的氨基酸)，其中SEQ ID NO:25、28、31或34缺乏N-末端半胱氨酸(C)，并且在C-末端包含其它氨基酸。如SEQ ID NO:25、28、31或34中所阐明氨基酸序列(突出1/基序-1的氨基酸序列)包含于本文所述的本发明的突变的脑信号蛋白3、其功能片段或者根据本发明的功能性sema结构域中，其中位于通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的丙氨酸被亲水氨基酸取代。因此，突变的脑信号蛋白3的功能片段包含选自SEQ ID NO:25、28、31和34的氨基酸序列，其中位于通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的丙氨酸被亲水氨基酸取代。在优选实施方案中，突变的脑信号蛋白3A的功能片段包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，其中对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A106位的丙氨酸被亲水氨基酸取代。
如SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56中所阐明的氨基酸序列(分别对应于突变的脑信号蛋白3A、B、C或D的氨基酸序列)分别对应于SEQ ID NO:25、28、31或34(基序-1)，其中区别为，如SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55或SEQID NO:56所示的氨基酸序列在位于通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点处含有赖氨酸。如SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列在本文被称为“基序-1*”。本文所述的本发明的突变的脑信号蛋白3、其功能片段或者功能性sema结构域包含选自SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQID NO:55和SEQ ID NO:56的氨基酸序列。在最优选的实施方案中，本发明的突变的脑信号蛋白3A的功能片段包含如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。
概括地说，本文所述的非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3的功能片段包含：
●氨基酸序列CX1X2A3GKD，其中X1是氨基酸，其为K或N，X2是选自W、M和L的氨基酸，并且其中丙氨酸(A3)被亲水氨基酸取代；
●选自SEQ ID NO:25、28、31和34的氨基酸序列，其中位于通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的丙氨酸被亲水氨基酸取代；或者
●氨基酸序列SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56，
以及其中所述功能片段具有突变的脑信号蛋白3A、B、C或D的特性/特征，并且不具有脑信号蛋白3E、F或G的特性/特征。
突变的脑信号蛋白3的功能片段还可以包含基序1*的氨基酸序列(SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56)、基序-2的氨基酸序列(SEQ ID NO:26、SEQID NO:29、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:35)和/或基序-3的氨基酸序列(SEQ ID NO:27、SEQID NO:30、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:36)。因此，除氨基酸序列CX1X2A3GKD之外，突变的脑信号蛋白3或本发明的突变的脑信号蛋白3的功能片段还包含下述中任一项所限定的氨基酸序列中的一种或多种：SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36，其中X1是氨基酸，其为K或N，X2是选自W、M和L的氨基酸，并且其中丙氨酸(A3)被亲水氨基酸取代，以及其中所述功能片段应该具有突变的脑信号蛋白3A、B、C或D的特征。在本文中应理解，本发明的突变的脑信号蛋白3的功能片段不应该具有脑信号蛋白3E、F或G的特征。在优选实施方案中，除氨基酸序列CX1X2A3GKD之外，突变的脑信号蛋白3A的功能片段还包含如SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27所限定的氨基酸序列中的一种或多种，其中X1是K，X2是W，并且其中丙氨酸(A3)被亲水氨基酸取代，以及其中所述功能片段应该具有突变的脑信号蛋白3A的特征。
PSI结构域稳定功能性sema结构域、突变的脑信号蛋白3的功能片段或融合蛋白/多肽的结构构象和/或结构完整性。突变的脑信号蛋白3的功能片段可以包含PSI结构域的片段，只要所述PSI结构域的片段具有稳定突变的脑信号蛋白3或其功能片段或者融合蛋白/多肽，更优选功能性sema结构域的功能。脑信号蛋白3A、B、C或D的PSI结构域共有分别如共有基序/序列/基序SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48中所阐明的保守性氨基酸序列。因此，本发明的PSI结构域包含下述序列中的一种或多种：SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48。人脑信号蛋白3A PSI结构域的示例性氨基酸序列跨越SEQ ID NO:2的氨基酸残基517至567。如所附实施例中所示，以及因此更优选地，缺乏弗林蛋白酶切割位点的较短PSI结构域的示例性氨基酸序列跨越SEQ ID NO:2的氨基酸残基517至548。示例性的PSI结构域在下述中给出：人脑信号蛋白3A PSI结构域的示例性氨基酸序列跨越SEQ ID NO:2的氨基酸残基517至548，人脑信号蛋白3B PSI结构域的示例性氨基酸序列跨越SEQ ID NO:6的氨基酸残基516至547，人脑信号蛋白3C PSI结构域的示例性氨基酸序列跨越SEQ ID NO:10的氨基酸残基514至545，以及人脑信号蛋白3DPSI结构域的示例性氨基酸序列跨越SEQ ID NO:14的氨基酸残基534至565。
此外，除氨基酸序列CX1X2A3GKD之外，本文提供的突变的脑信号蛋白3或突变的脑信号蛋白3的功能片段还包含如下述中任一项所限定的氨基酸序列中的一种或多种：SEQID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48，其中X1是氨基酸，其为K或N，X2是选自W、M和L的氨基酸，并且其中丙氨酸(A3)被亲水氨基酸取代，以及其中所述功能片段应该具有突变的脑信号蛋白3A、B、C或D的特征。在本文中应理解，本发明的突变的脑信号蛋白3的功能片段不应该具有脑信号蛋白3E、F或G的特征。在优选实施方案中，除氨基酸序列CX1X2A3GKD之外，突变的脑信号蛋白3或突变的脑信号蛋白3A的功能片段还包含如下述中任一项所限定的氨基酸序列中的一种或多种：SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:45，其中X1是K，X2是W，并且其中丙氨酸(A3)被亲水氨基酸取代，以及其中功能片段应该具有突变的脑信号蛋白3A的特征。在本文中应理解，上文给出的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56可以处于天然存在的脑信号蛋白3蛋白的氨基酸序列中。本文还设想，可以使用人工氨基酸接头(例如丝氨酸-甘氨酸接头)将这些氨基酸序列连接在一起。突变的脑信号蛋白3蛋白的功能片段的长度不受限制，只要根据本发明的功能片段显示出例如作为血管生成的抑制剂和/或作为血管正常化试剂的功能，如上文针对突变的脑信号蛋白3、其功能片段、包含功能片段或功能性sema结构域的融合蛋白所描述的。本文设想，此类功能片段可以具有例如10、20、30、40、50、60、80、100、200、250、300、400、500或600个氨基酸的长度。优选地，此类片段具有约400至500个氨基酸的长度。优选地，此类片段具有约300至400个氨基酸的长度。优选地，此类片段具有约100至300个氨基酸的长度。本文设想，本文提供的非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3蛋白的功能片段的氨基酸序列可以是在氨基酸序列的N-末端、C-末端和/或主体内截短的。本文设想，可以缺失例如10、20、30、40或50个氨基酸。这些缺失/改变不脱离本发明的范围，只要功能片段具有突变的脑信号蛋白3A、B、C或D的特征。此外，这些缺失/改变不受限制，只要本文提供的功能片段或包含本文提供的功能片段的融合蛋白/多肽(其含有取代位于通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸的亲水氨基酸)，具有突变的脑信号蛋白3、其功能片段、包含功能片段或功能性sema结构域的融合蛋白的如上文所限定的功能/活性(例如作为血管生成的抑制剂和/或作为血管正常化试剂)。
在最优选的实施方案中，根据本发明的突变的脑信号蛋白3的功能片段包含功能性sema结构域，其中所述sema结构域包含位于通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的亲水氨基酸。
换言之，根据本发明的突变的脑信号蛋白3可以包含功能性sema结构域，其中所述sema结构域包含位于通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A106位的亲水氨基酸。本发明的功能性sema结构域包含如基序-1*中所述的氨基酸序列或者包含氨基酸序列CX1X2A3GKD，其中X1是氨基酸，其为K或N，X2是选自W、M和L的氨基酸，并且其中丙氨酸(A3)被亲水氨基酸取代，以及其中所述sema结构域应该具有突变的脑信号蛋白3A、B、C或D的特征。在本文中应理解，本文所述的突变的脑信号蛋白3的功能性sema结构域不应该具有脑信号蛋白3E、F或G的特征。此外，本发明的功能性sema结构域还可以包含基序1*的氨基酸序列(SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56)、基序-2的氨基酸序列(SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:35)和/或基序-3的氨基酸序列(SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48)。此外，功能性sema结构域可以包含至少一种选自下述的另外的突变：氨基酸置换、添加、缺失、倒位和重复。此外，功能性sema结构域可以包含另外的氨基酸缺失。本文设想，功能性sema结构域的氨基酸序列可以是在氨基酸序列的N-末端、C-末端和/或主体内截短的。本文设想，可以缺失例如10、20、30、40、50或100个氨基酸。这些缺失/改变不脱离本发明的范围，只要功能性sema结构域具有如上文所限定的突变的脑信号蛋白3A、B、C或D的特征。此外，这些缺失/改变不受限制，只要本文提供的功能性sema结构域或本文提供的包含所述sema结构域的融合蛋白(其含有取代位于通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸的亲水氨基酸)，显示出突变的脑信号蛋白3或其功能片段或者包含所述功能片段或功能性sema结构域的融合蛋白的如上文所限定的功能/活性(例如作为血管生成的抑制剂和/或作为血管正常化试剂)。在本文中应理解，功能性sema结构域与脑信号蛋白的另一功能性sema结构域以及丛状蛋白受体相互作用。这可以通过sema结构域的不同表面暴露区域而发生。在不受理论束缚的情况下，sema结构域在其表面显示至少两个不同的区域。第一区域支持其与脑信号蛋白的另一sema结构域的结合，以及第二区域参与其与丛状蛋白受体的结合。
编码本发明的突变的脑信号蛋白3的功能性sema结构域或功能片段的示例性核酸分子可以包含：
SEQ ID NO:1 601至1206位的核苷酸，其中位于SEQ ID NO:1 631至633位的核苷酸GCT被编码亲水氨基酸的核苷酸取代；
SEQ ID NO:5 529至1137位的核苷酸，其中位于SEQ ID NO:5 559至561位的核苷酸GCA被编码亲水氨基酸的核苷酸取代；
SEQ ID NO:9 842至1444位的核苷酸，其中位于SEQ ID NO:9 872至874位的核苷酸GCT被编码亲水氨基酸的核苷酸取代；或者
SEQ ID NO:13 368至982位的核苷酸，其中位于SEQ ID NO:13 398至400位的核苷酸GCC被编码亲水氨基酸的核苷酸取代。
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:13分别是编码野生型人脑信号蛋白3A、B、C或D的全长核酸序列。
在优选实施方案中，编码本发明的突变的脑信号蛋白3A的功能性sema结构域或功能片段的核酸分子包含SEQ ID NO:1 601至1206位的核苷酸，其中位于SEQ ID NO:1 631至633位的核苷酸GCT被编码亲水氨基酸的核苷酸取代。
此外，编码本发明的突变的脑信号蛋白3的功能性sema结构域或功能片段的示例性核酸分子可以包含SEQ ID NO:57 601至1206位的核苷酸；SEQ ID NO:61 529至1137位的核苷酸；SEQ ID NO:65 842至1444位的核苷酸；或者SEQ ID NO:69 368至982位的核苷酸。SEQ ID NO:57、61、65或65分别包含编码突变的脑信号蛋白3A、B、C或D的核酸序列，其中赖氨酸位于通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点。在优选实施方案中，编码本发明的突变的脑信号蛋白3A的功能性sema结构域或功能片段的核酸分子包含SEQ ID NO:57 601至1206位的核苷酸。
此外，示例性的多肽包含突变的脑信号蛋白3的功能片段，其中所述功能片段包含如下所示的本发明的突变的脑信号蛋白3的功能性sema结构域或者为如下所示的本发明的突变的脑信号蛋白3的功能性sema结构域：
换言之，突变的脑信号蛋白3或其功能片段包含如下所示的本发明的突变的脑信号蛋白3的功能性sema结构域或者为如下所示的本发明的突变的脑信号蛋白3的功能性sema结构域：
SEQ ID NO:21，其中对应于SEQ ID NO:2 106位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；
SEQ ID NO:22，其中对应于SEQ ID NO:6 105位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；
SEQ ID NO:23，其中对应于SEQ ID NO:10 104位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；或者
SEQ ID NO:24，其中对应于SEQ ID NO:14 120位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代。
在优选实施方案中，本发明的突变的脑信号蛋白3A的功能性sema结构域或功能片段的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO:2 106位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代。
SEQ ID NO:49、50、51或52分别包含突变的脑信号蛋白3A、B、C或D的示例性功能性sema结构域或示例性功能片段的氨基酸序列，其中位于通过同源性比较对应于如SEQ IDNO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸被赖氨酸取代。因此，本发明的突变的脑信号蛋白3的功能性sema结构域或功能片段的示例性氨基酸序列可以包含选自SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52的氨基酸序列。在优选实施方案中，本发明的突变的脑信号蛋白3A的功能性sema结构域或功能片段的氨基酸序列包含如SEQ IDNO:49所示的氨基酸序列。本文也设想功能性sema结构域的片段。例如，sema结构域还可以包含本文限定的示例性sema结构域的缩短形式。
下述涉及本发明最优选的实施方案，融合蛋白/多肽。在最优选的实施方案中，本发明的多肽是融合蛋白。融合蛋白包含非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3蛋白，脑信号蛋白3的非天然存在的/人工的/突变的功能片段，脑信号蛋白3的非天然存在的/人工的/突变的功能性sema结构域，稳定子结构域和/或二聚化结构域。上文限定的突变的脑信号蛋白3的功能片段中的任一种可以包含于融合蛋白中，其中所述功能片段具有突变的脑信号蛋白3A、B、C或D的特征/特性，并且不具有脑信号蛋白3E、F或G的特征/特性。换言之，融合蛋白可以包含根据本发明的突变的脑信号蛋白3或其功能片段。
因此，本发明的融合蛋白包含突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述突变的脑信号蛋白3或其功能片段包含选自SEQ ID NO:25、28、31和34的氨基酸序列，其中位于通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸被亲水氨基酸取代。任选地，本发明的融合蛋白包含突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述突变的脑信号蛋白3或其功能片段包含氨基酸序列CX1X2A3GKD，其中X1是氨基酸，其为K或N，X2是选自W、M和L的氨基酸，并且其中丙氨酸(A3)被亲水氨基酸取代。任选地，本发明的融合蛋白包含突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述突变的脑信号蛋白3或其功能片段包含选自SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56的氨基酸序列。
在优选实施方案中，本发明的融合蛋白包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，其中对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A106位的丙氨酸被亲水氨基酸取代。任选地，在优选实施方案中，本发明的融合蛋白包含如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。
此外，本发明的融合蛋白包含突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中除氨基酸序列CX1X2A3GKD之外，所述突变的脑信号蛋白3或其功能片段还包含如下述中任一项所限定的氨基酸序列中的一种或多种：SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36，其中X1是氨基酸，其为K或N，X2是选自W、M和L的氨基酸，并且其中丙氨酸(A3)被亲水氨基酸取代，以及其中所述功能片段应该具有突变的脑信号蛋白3A、B、C或D的特征。在本文中应理解，本发明的突变的脑信号蛋白3的功能片段不应该具有脑信号蛋白3E、F或G的特征。在优选实施方案中，本发明的融合蛋白包含突变的脑信号蛋白3A或其功能片段，其中除氨基酸序列CX1X2A3GKD之外，所述突变的脑信号蛋白3A或其功能片段还包含如下述所限定的氨基酸序列中的一种或多种：SEQ IDNO:26或SEQ ID NO:27，其中X1是K，X2是W，并且其中丙氨酸(A3)被亲水氨基酸取代，以及其中所述功能片段应该具有突变的脑信号蛋白3A的特征。
此外，本发明的融合蛋白包含突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中除氨基酸序列CX1X2A3GKD之外，所述突变的脑信号蛋白3或其功能片段还包含如下述中任一项所限定的氨基酸序列中的一种或多种：SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48，其中X1是氨基酸，其为K或N，X2是选自W、M和L的氨基酸，并且其中丙氨酸(A3)被亲水氨基酸取代，以及其中所述功能片段应该具有突变的脑信号蛋白3A、B、C或D的特征。在本文中应理解，本发明的突变的脑信号蛋白3的功能片段不应该具有脑信号蛋白3E、F或G的特征。在优选实施方案中，本发明的融合蛋白包含突变的脑信号蛋白3A或其功能片段，其中除氨基酸序列CX1X2A3GKD之外，所述突变的脑信号蛋白3A或其功能片段还包含如下述中任一项所限定的氨基酸序列中的一种或多种：SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27或SEQ ID NO:45，其中X1是K，X2是W，并且其中丙氨酸(A3)被亲水氨基酸取代，以及其中所述功能片段应该具有突变的脑信号蛋白3A的特征。
在最优选的实施方案中，本发明涉及包含功能性sema结构域的融合蛋白，其中在突变的脑信号蛋白3的功能性sema结构域内，对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸被亲水氨基酸取代，或者其中脑信号蛋白3B、3C或3D中对应于所述106位丙氨酸的丙氨酸被亲水氨基酸取代。换言之，本发明的融合蛋白包含突变的脑信号蛋白3的功能片段，其中所述功能片段包含功能性sema结构域，其中所述sema结构域包含位于通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的亲水氨基酸。换言之，本发明的融合蛋白包含功能性sema结构域，其中所述sema结构域包含位于通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的亲水氨基酸。
本发明的融合蛋白中包含的功能性sema结构域包含如基序-1*所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56)或者本发明的融合蛋白中包含的功能性sema结构域包含氨基酸序列CX1X2A3GKD，其中X1是氨基酸，其为K或N，X2是选自W、M和L的氨基酸，并且其中丙氨酸(A3)被亲水氨基酸取代，以及其中功能性sema结构域应该具有脑信号蛋白3A、B、C或D的特征。在本文中应理解，本发明的融合蛋白中包含的突变的脑信号蛋白3的功能性sema结构域不应该具有脑信号蛋白3E、F或G的特征，而应该具有突变的脑信号蛋白3A、B、C或D的特征。此外，包含本发明的功能性sema结构域的融合蛋白还可以包含基序1*的氨基酸序列(SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56)、基序-2的氨基酸序列(SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:35)和/或基序-3的氨基酸序列(SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:36)。此外，融合蛋白中包含的突变的脑信号蛋白3的功能性sema结构域或功能片段可以包含至少一种选自下述的另外的突变：氨基酸置换、添加、缺失、倒位和重复。本文设想，融合蛋白中包含的突变的脑信号蛋白3的功能性sema结构域或功能片段的氨基酸序列可以是在氨基酸序列的N-末端、C-末端和/或主体内截短的。本文设想，可以缺失例如10、20、30、40、50或100个氨基酸。这些缺失/改变不脱离本发明的范围，只要所述功能片段或功能性sema结构域具有突变的脑信号蛋白3A、B、C或D的特征。此外，这些缺失/改变不受限制，只要包含突变的脑信号蛋白3的功能性sema结构域或功能片段的融合蛋白显示出包含所述非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3蛋白或所述脑信号蛋白3蛋白的所述非天然存在的/人工的/突变的功能片段或功能性sema结构域的融合蛋白/多肽的上文所限定的功能/活性，例如作为血管生成的抑制剂和/或作为血管正常化试剂。融合蛋白还可以包含突变的脑信号蛋白3的短的同种型。
编码可以包含于融合蛋白中的突变的脑信号蛋白3的功能性sema结构域或功能片段的示例性核酸分子在下述中给出：
SEQ ID NO:1 601至1206位的核苷酸，其中位于SEQ ID NO:1 631至633位的核苷酸GCT被编码亲水氨基酸的核苷酸取代；
SEQ ID NO:5 529至1137位的核苷酸，其中位于SEQ ID NO:5 559至561位的核苷酸GCA被编码亲水氨基酸的核苷酸取代；
SEQ ID NO:9 842至1444位的核苷酸，其中位于SEQ ID NO:9 872至874位的核苷酸GCT被编码亲水氨基酸的核苷酸取代；或者
SEQ ID NO:13 368至982位的核苷酸，其中位于SEQ ID NO:13 398至400位的核苷酸GCC被编码亲水氨基酸的核苷酸取代。
在优选实施方案中，融合蛋白包含本发明的功能性sema结构域，其中所述sema结构域由包含SEQ ID NO:1 601至1206位的核苷酸的核酸分子编码，其中位于SEQ ID NO:1631至633位的核苷酸GCT被编码亲水氨基酸的核苷酸取代。
编码包含于融合蛋白中的突变的脑信号蛋白3的功能性sema结构域或功能片段的示例性核酸分子可以包含SEQ ID NO:57 601至1206位的核苷酸；SEQ ID NO:61 529至1137位的核苷酸；SEQ ID NO:65 842至1444位的核苷酸；或者SEQ ID NO:69 368至982位的核苷酸。SEQ ID NO:57、61、65或65分别包含编码全长突变的脑信号蛋白3A、B、C或D的核酸序列，其中赖氨酸位于通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点。在优选实施方案中，编码包含于融合蛋白中的突变的脑信号蛋白3A的功能性sema结构域的核酸分子包含SEQ ID NO:57 601至1206位的核苷酸。
此外，示例性的融合蛋白/多肽可以包含突变的脑信号蛋白3的功能片段，其中所述功能片段包含如下所限定的突变的脑信号蛋白3的功能性sema结构域，或者为如下所限定的突变的脑信号蛋白3的功能性sema结构域：
SEQ ID NO:21，其中对应于SEQ ID NO:2 106位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；
SEQ ID NO:22，其中对应于SEQ ID NO:6 105位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；
SEQ ID NO:23，其中对应于SEQ ID NO:10 104位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；或者
SEQ ID NO:24，其中对应于SEQ ID NO:14 120位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代。
在优选实施方案中，包含于融合蛋白中的突变的脑信号蛋白3A的功能性sema结构域的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO:2 106位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代。
SEQ ID NO:49、50、51和52分别包含可包含于融合蛋白中的突变的脑信号蛋白3A、B、C和D的示例性功能性sema结构域或功能片段的氨基酸序列，其中位于通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的丙氨酸被赖氨酸取代。因此，示例性的融合蛋白可以包含突变的脑信号蛋白3的功能片段，其中所述功能片段包含选自SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52的sema结构域，或者为选自SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52的sema结构域。在优选实施方案中，包含于融合蛋白中的突变的脑信号蛋白3A的功能性sema结构域的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列。
在优选实施方案中，除突变的脑信号蛋白3或其功能片段之外，融合蛋白还包含稳定子结构域。所述稳定子结构域稳定非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3蛋白、本文提供的非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3蛋白的功能片段或本文提供的功能性sema结构域的结构构象和/或结构完整性。如上文所限定的，此类稳定子结构域可以是PSI结构域或其片段。因此，可以通过PSI结构域稳定包含突变的脑信号蛋白3或其功能片段的的融合蛋白。稳定子结构域可以是PSI结构域或其片段，其中所述PSI结构域可以包含下述共有序列基序中的一种：SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48。人脑信号蛋白3A PSI结构域的示例性氨基酸序列跨越SEQ ID NO:2的氨基酸残基517至567。如所附实施例中所示以及因此更优选地，PSI结构域的示例性氨基酸序列跨越SEQ ID NO:2的氨基酸残基517至548。可以包含于融合蛋白中的示例性PSI结构域在下述中给出：人脑信号蛋白3A PSI结构域的示例性氨基酸序列跨越SEQ ID NO:2的氨基酸残基517至548，人脑信号蛋白3B PSI结构域的示例性氨基酸序列跨越SEQ ID NO:6的氨基酸残基516至547，人脑信号蛋白3C PSI结构域的示例性氨基酸序列跨越SEQ ID NO:10的氨基酸残基514至545，以及人脑信号蛋白3D PSI结构域的示例性氨基酸序列跨越SEQ ID NO:14的氨基酸残基534至565。
在优选实施方案中，融合蛋白可以包含突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述功能片段包含sema结构域和PSI结构域。因此，示例性的融合蛋白可以包含突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述其功能片段包含下述氨基酸序列：
跨越SEQ ID NO:2氨基酸残基1至548的氨基酸序列，其中位于SEQ ID NO:2106位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；
跨越SEQ ID NO:6氨基酸残基1至547的氨基酸序列，其中位于SEQ ID NO:6 105位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；
跨越SEQ ID NO:10氨基酸残基1至565的氨基酸序列，其中位于SEQ ID NO:10 104位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；或者
跨越SEQ ID NO:14氨基酸残基1至545的氨基酸序列，其中位于SEQ ID NO:14 120位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代。在优选实施方案中，包含于融合蛋白中的突变的脑信号蛋白3A的功能片段含有跨越SEQ ID NO:2氨基酸残基1至548的多肽，其中位于SEQ IDNO:2 106位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代。
换言之，融合蛋白可以包含含有sema结构域和PSI结构域的突变的脑信号蛋白3。因此，示例性的融合蛋白可以包含含有下述氨基酸序列的突变的脑信号蛋白3：
跨越SEQ ID NO:2氨基酸残基1至548的氨基酸序列，其中位于SEQ ID NO:2 106位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；
跨越SEQ ID NO:6氨基酸残基1至547的氨基酸序列，其中位于SEQ ID NO:6 105位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；
跨越SEQ ID NO:10氨基酸残基1至565的氨基酸序列，其中位于SEQ ID NO:10 104位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；或者
跨越SEQ ID NO:14氨基酸残基1至545的氨基酸序列，其中位于SEQ ID NO:14 120位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代。
如所附实施例所指示以及如以上所解释的，突变的脑信号蛋白3蛋白的二聚化增加了抑制EC迁移的效果。因此，本发明的突变的脑信号蛋白3蛋白优选为二聚体形式。突变的脑信号蛋白3蛋白的功能性sema结构域可负责二聚化以及与丛状蛋白受体的结合。脑信号蛋白3与其丛状蛋白受体的结合导致丛状蛋白受体胞质区的激活，这导致活性的下游信号转导。在不受理论束缚的情况下，丛状蛋白受体由脑信号蛋白诱导的二聚化激活。因此，在本发明最优选的实施方案中，本文提供的突变的脑信号蛋白3或者突变的脑信号蛋白3的功能性sema结构域或功能片段是与本文提供的另一突变的脑信号蛋白3或者突变的脑信号蛋白3的功能性sema结构域或功能片段形成的二聚体形式。包含于融合蛋白中的非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3蛋白或者本文提供的非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3蛋白的功能片段的二聚化可以由所述功能片段诱导，例如由功能性sema结构域自身诱导和/或可由二聚化结构域诱导/促进。
在最优选的实施方案中，除突变的脑信号蛋白3、突变的脑信号蛋白3的功能片段和/或稳定子结构域之外，融合蛋白还包含二聚化结构域。换言之，除突变的脑信号蛋白3或其功能片段之外，融合蛋白还包含稳定分子的结构完整性的稳定子结构域和/或诱导同源二聚体或异源二聚体的二聚化结构域。换言之，融合蛋白可以包含稳定子结构域和/或二聚化结构域。“二聚化结构域”指诱导/促进非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3蛋白、本文提供的非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3蛋白的功能片段或者本文提供的功能性sema结构域的空间接近性的结构域。在本文中应理解，“二聚体”是由通过键连接的两个结构相似的单体组成的寡聚物，所述键可以是弱的或者强的，即分子间的或共价的。形成二聚体的两个单体可以包含于同一融合蛋白中或者包含于两个融合蛋白中。二聚化结构域可以是任何二聚化结构域，只要这两个二聚化结构域之间的解离常数KD的范围为10-5M至10-6M。发现脑信号蛋白3的两个sema结构域的结合亲和力的范围为10-5至10-6M(Antipenko等人，2003)。二聚化结构域可以选自：C-末端IgG恒定结构域。DARPin和亮氨酸拉链。在优选实施方案中，二聚化结构域是IgG恒定结构域。在甚至更优选的实施方案中，二聚化结构域是IgG1或IgG3结构域。在甚至更优选的实施方案中，二聚化结构域是IgG1。人IgG1的此类示例性氨基酸以及编码核酸序列在SEQ ID NO:37、38和41中给出。在最优选的实施方案中，IgG1结构域的恒定片段被用作二聚化结构域，其包含跨越104至330位的氨基酸序列。此类示例性氨基酸序列描述于SEQ ID NO:41中。也可以使用的小鼠IgG1恒定片段的对应氨基酸和核酸序列描述于SEQ ID NO:39、40和42中。估计例如亮氨酸拉链和/或恒定结构域，如免疫球蛋白CH3或Fc片段、异源二聚体和同源二聚体的亲和力强度的解离常数KD的范围为～10-5至10-6M。估计sema结构域的二聚体的解离常数的范围为10-5至10-6M(Antipenko等人，2003)。通常，本文提及的KDs(i)适用于下述条件，(ii)处于下述条件或者(iii)是在下述条件下测量的：4至38℃的温度，优选4至20℃(例如10℃)或者20至38℃(例如30℃)的温度，和/或4.5至8的pH(例如为7的pH)。如所附实施例中所示，可以通过二硫键稳定二聚化结构域，例如IgG1结构域。可以通过二聚体内的二硫键稳定二聚化结构域，例如IgG1结构域的两个单体。
在最优选的实施方案中，非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3蛋白或其功能片段或者包含所述脑信号蛋白3蛋白或所述其功能片段的融合蛋白互相形成同源二聚体或异源二聚体。术语“异源二聚体”意为两个不同的单体处于二聚体形式。
在某些方面，二聚体的两个单体可以包含于一个融合蛋白中。本文设想，两个非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3蛋白、两个本文提供的非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3蛋白的功能片段或者两个本文提供的功能性sema结构域可以包含于一个融合蛋白中。在其它方面，野生型蛋白与非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3蛋白、本文提供的非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3蛋白的功能片段或者本文提供的功能性sema结构域也可以共同形成二聚体。因此，野生型脑信号蛋白3或其片段可以与非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3蛋白、本文提供的非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3蛋白的功能片段或者本文提供的功能性sema结构域共同包含于一个融合蛋白中，其中所述融合蛋白具有突变的脑信号蛋白3A、B、C或D的特征。在本文中应理解，术语“第一多肽”指二聚体中的第一单体。术语“第二多肽”指二聚体中的第二单体。在某些方面，融合蛋白可以包含两个非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3蛋白、两个本文提供的非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3蛋白的功能片段或者两个本文提供的功能性sema结构域、两个稳定子结构域和/或一个或两个二聚化结构域。融合蛋白可以包含本发明的突变的脑信号蛋白3、其功能片段、功能性sema结构域和/或本文所述的多肽的任何组合，其中所述融合蛋白具有突变的脑信号蛋白3A、B、C或D的特征。在下述方面，示出了此类组合：
在某些方面，本发明的融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中对应于如SEQ IDNO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸或者位于其它脑信号蛋白3蛋白中通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的丙氨酸被亲水氨基酸取代，以及所述第二多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述脑信号蛋白3蛋白选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D。
在某些方面，本发明的融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中对应于如SEQ IDNO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸或者位于其它脑信号蛋白3蛋白中通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的丙氨酸被亲水氨基酸取代，以及所述第二多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸或者位于其它脑信号蛋白3蛋白中通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的丙氨酸被亲水氨基酸取代，其中所述脑信号蛋白3蛋白选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D。
在某些方面，本发明的融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3A或其功能片段，其中对应于如SEQ IDNO:2所示的野生型脑信号蛋白3A106位的丙氨酸被亲水氨基酸取代，以及所述第二多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述脑信号蛋白3蛋白选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D。
在某些方面，本发明的融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3A或其功能片段，其中对应于如SEQ IDNO:2所示的野生型脑信号蛋白3A106位的丙氨酸被亲水氨基酸取代，以及所述第二多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3A或其功能片段，其中对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸被亲水氨基酸取代。
在某些方面，本发明的融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3A或其功能片段，其中对应于如SEQ IDNO:2所示的野生型脑信号蛋白3A106位的丙氨酸被亲水氨基酸取代，以及所述第二多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3B或其功能片段，其中对应于如SEQ ID NO:6所示的野生型脑信号蛋白3B 105位的丙氨酸被亲水氨基酸取代。
在某些方面，本发明的融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3A或其功能片段，其中对应于如SEQ IDNO:2所示的野生型脑信号蛋白3A106位的丙氨酸被亲水氨基酸取代，以及所述第二多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3C或其功能片段，其中对应于如SEQ ID NO:10所示的野生型脑信号蛋白3C 104位的丙氨酸被亲水氨基酸取代。
在某些方面，本发明的融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3A或其功能片段，其中对应于如SEQ IDNO:2所示的野生型脑信号蛋白3A106位的丙氨酸被亲水氨基酸取代，以及所述第二多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3D或其功能片段，其中对应于如SEQ ID NO:14所示的野生型脑信号蛋白3D 120位的丙氨酸被亲水氨基酸取代。
在某些方面，本发明的融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3B或其功能片段，其中对应于如SEQ IDNO:6所示的野生型脑信号蛋白3B105位的丙氨酸被亲水氨基酸取代，以及所述第二多肽含有脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述脑信号蛋白3蛋白选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D。
在某些方面，本发明的融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3B或其功能片段，其中对应于如SEQ IDNO:6所示的野生型脑信号蛋白3B105位的丙氨酸被亲水氨基酸取代，以及所述第二多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3B或其功能片段,其中对应于如SEQ ID NO:6所示的野生型脑信号蛋白3B 105位的丙氨酸被亲水氨基酸取代。
在某些方面，本发明的融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3B或其功能片段，其中对应于如SEQ IDNO:6所示的野生型脑信号蛋白3B105位的丙氨酸被亲水氨基酸取代，以及所述第二多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3C或其功能片段，其中对应于如SEQ ID NO:10所示的野生型脑信号蛋白3C 104位的丙氨酸被亲水氨基酸取代。
在某些方面，本发明的融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3B或其功能片段，其中对应于如SEQ IDNO:6所示的野生型脑信号蛋白3B105位的丙氨酸被亲水氨基酸取代，以及所述第二多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3D或其功能片段，其中对应于如SEQ ID NO:14所示的野生型脑信号蛋白3D 120位的丙氨酸被亲水氨基酸取代。
在某些方面，本发明的融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3C或其功能片段，其中对应于如SEQ IDNO:10所示的野生型脑信号蛋白3C104位的丙氨酸被亲水氨基酸取代，以及所述第二多肽含有脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述脑信号蛋白3蛋白选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D。
在某些方面，本发明的融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3C或其功能片段，其中对应于如SEQ IDNO:10所示的野生型脑信号蛋白3C104位的丙氨酸被亲水氨基酸取代，以及所述第二多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3C或其功能片段，其中对应于如SEQ ID NO:10所示的野生型脑信号蛋白3C 104位的丙氨酸被亲水氨基酸取代。
在某些方面，本发明的融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3C或其功能片段，其中对应于如SEQ IDNO:10所示的野生型脑信号蛋白3C104位的丙氨酸被亲水氨基酸取代，以及所述第二多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3D或其功能片段，其中对应于如SEQ ID NO:14所示的野生型脑信号蛋白3D 120位的丙氨酸被亲水氨基酸取代。
在某些方面，本发明的融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3D或其功能片段，其中对应于如SEQ IDNO:14所示的野生型脑信号蛋白3D120位的丙氨酸被亲水氨基酸取代，以及所述第二多肽含有脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述脑信号蛋白3蛋白选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D。
在某些方面，本发明的融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3D或其功能片段，其中对应于如SEQ IDNO:14所示的野生型脑信号蛋白3D120位的丙氨酸被亲水氨基酸取代，以及所述第二多肽含有作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3D或其功能片段，其中对应于如SEQ ID NO:14所示的野生型脑信号蛋白3D 120位的丙氨酸被亲水氨基酸取代。
本文还设想，突变的脑信号蛋白3的融合蛋白包含下述结构域：
(i)sema结构域；
(ii)PSI结构域；和
(iii)与PSI结构域的C-末端融合的C-末端IgG恒定结构域，
并且其另一特征为，包含于脑信号蛋白3的基序CX1X2A3GKD中的丙氨酸(A3)残基突变为赖氨酸，其中所述脑信号蛋白3选自脑信号蛋白3A、B、C和D。
融合蛋白包含功能性sema结构域，其中所述sema结构域包含取代位于通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的丙氨酸的亲水氨基酸，以及二聚化结构域和/或稳定子结构域。
换言之，融合蛋白包含功能性sema结构域，其中所述sema结构域选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D，其中所述sema结构域包含：
取代对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸的亲水氨基酸；
取代对应于如SEQ ID NO:6所示的野生型脑信号蛋白3B 105位的丙氨酸的亲水氨基酸；
取代对应于如SEQ ID NO:10所示的野生型脑信号蛋白3C 104位的丙氨酸的亲水氨基酸；或者
取代对应于如SEQ ID NO:14所示的野生型脑信号蛋白3D 120位的丙氨酸的亲水氨基酸；
并且其中所述融合蛋白还包含二聚化结构域和/或稳定子结构域。
最优选地，融合蛋白包含功能性sema结构域和二聚化结构域和/或稳定子结构域，其中在所述功能性sema结构域内，对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸被亲水氨基酸取代，或者其中在脑信号蛋白3B、3C或3D中对应于所述106位丙氨酸的丙氨酸被亲水氨基酸取代，其中所述二聚化结构域是IgG1，以及其中所述稳定子结构域是PSI结构域。在最优选的方面，融合蛋白包含脑信号蛋白3A的功能性sema结构域，其中所述sema结构域包含取代对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸的亲水氨基酸，并且其中所述融合蛋白还包含二聚化结构域和/或稳定子结构域。
在本发明最优选的实施方案中，本发明的融合蛋白/多肽可以包含与PSI结构域融合的功能性sema结构域(如所附实施例中所示)。得到的sema-PSI结构域与二聚化结构域(例如IgG1结构域的恒定片段)融合。此外，此类融合蛋白缺乏Nrp1结合和/或弗林蛋白酶可切割的Ig样(跨越SEQ ID NO:2 580-670的氨基酸)/碱性区域(跨越SEQ ID NO:2 715-771的氨基酸)。此类融合蛋白是本文最优选的实施方案，并且此类编码的融合蛋白的示例性核酸分子可以包含含有下述的核酸序列的核酸序列：
跨越SEQ ID NO:1核苷酸316至1959的核酸序列和跨越SEQ ID NO:37核苷酸295至990的核酸序列，其中位于SEQ ID NO:1 631至633位的核苷酸GCT被编码亲水氨基酸的核苷酸取代；
跨越SEQ ID NO:5核苷酸247至1887的核酸序列和跨越SEQ ID NO:37核苷酸295至990的核酸序列，其中位于SEQ ID NO:5 559至561位的核苷酸GCA被编码亲水氨基酸的核苷酸取代；
跨越SEQ ID NO:9核苷酸563至2197的核酸序列和跨越SEQ ID NO:37核苷酸295至990的核酸序列，其中位于SEQ ID NO:9 872至874位的核苷酸GCT被编码亲水氨基酸的核苷酸取代；或者
跨越SEQ ID NO:13核苷酸41至1735的核酸序列和跨越SEQ ID NO:37核苷酸295至990的核酸序列，其中位于SEQ ID NO:13 398至400位的核苷酸GCC被编码亲水氨基酸的核苷酸取代。
在最优选的实施方案中，突变的脑信号蛋白3A的融合蛋白由跨越SEQ ID NO:1核苷酸316至1959的核酸序列和跨越SEQ ID NO:37核苷酸295至990的核酸序列编码，其中位于SEQ ID NO:1 631至633位的核苷酸GCT被编码亲水氨基酸的核苷酸取代。
本文考虑，可以如所述实例中所示使用密码子优化的核酸序列(SEQ ID NO:17、19、43和44)。
在最优选的实施方案中，融合蛋白包含sema结构域、稳定子结构域和二聚化结构域。功能性sema结构域与稳定子结构域(例如PSI结构域)融合。得到的sema-PSI结构域与二聚化结构域(例如如SEQ ID NO:38或41所示的IgG1结构域的恒定片段)融合。此类示例性融合蛋白包含sema结构域、PSI和二聚化结构域，其中所述融合蛋白包含下述氨基酸序列：
跨越SEQ ID NO:2氨基酸残基1至548的氨基酸序列和如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，其中位于SEQ ID NO:2 106位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；
跨越SEQ ID NO:6氨基酸残基1至547的氨基酸序列和如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，其中位于SEQ ID NO:6 105位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；
跨越SEQ ID NO:10氨基酸残基1至565的氨基酸序列和如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，其中位于SEQ ID NO:10 104位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；或者
跨越SEQ ID NO:14氨基酸残基1至545的氨基酸序列和如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，其中位于SEQ ID NO:14 120位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代。
在最优选的实施方案中，突变的脑信号蛋白3A的融合蛋白包含跨越SEQ ID NO:2氨基酸残基1至548的多肽和如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，其中位于SEQ ID NO:2106位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代。
包含突变的脑信号蛋白3A的功能性sema结构域、PSI结构域、IgG1结构域的示例性融合蛋白显示于SEQ ID NO:18或20中。包含突变的脑信号蛋白3B、突变的脑信号蛋白3C或突变的脑信号蛋白3D的功能性sema结构域，PSI结构域，IgG1结构域的示例性融合蛋白分别显示于SEQ ID NO:76、78或79中。SEQ ID NO:18显示了包含人突变的脑信号蛋白3A的功能性sema结构域、PSI结构域和人IgG1恒定片段的融合蛋白，其中位于通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的丙氨酸被赖氨酸取代。编码含有人突变的脑信号蛋白3A的功能性sema结构域、PSI结构域和人IgG1的恒定片段的融合蛋白的对应核酸序列在SEQ ID NO:17中给出，其中位于通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的丙氨酸被赖氨酸取代。SEQ ID NO:74和75显示了不含本发明的突变的脑信号蛋白3B的示例性融合蛋白的氨基酸序列和编码核酸序列。
SEQ ID NO:20显示了包含小鼠突变的脑信号蛋白3A的功能性sema结构域、PSI结构域和人IgG1的恒定片段的融合蛋白，其中位于通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的丙氨酸被赖氨酸取代。编码包含小鼠突变的脑信号蛋白3A的功能性sema结构域、PSI结构域和小鼠IgG1的恒定片段的融合蛋白的对应核酸序列在SEQ ID NO:19中给出，其中位于通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的丙氨酸被赖氨酸取代。
如本文所述的融合蛋白可以是异源蛋白，其中非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3蛋白、脑信号蛋白3的非天然存在的/人工的/突变的功能片段或者脑信号蛋白3的非天然存在的/人工的/突变的功能性sema结构域、二聚化结构域和/或稳定子结构域来自不同来源，例如来自不同的物种。在本文中应理解，非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3蛋白、脑信号蛋白3的非天然存在的/人工的/突变的功能片段、脑信号蛋白3的非天然存在的/人工的/突变的功能性sema结构域、二聚化结构域和/或稳定子结构域可以如天然存在的脑信号蛋白3蛋白中所见的一样被连接/融合在一起，其中维持突变的脑信号蛋白3A、B、C或D的特征。此外，非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3蛋白、脑信号蛋白3的非天然存在的/人工的/突变的功能片段、脑信号蛋白3的非天然存在的/人工的/突变的功能性sema结构域、二聚化结构域和/或稳定子结构域可以如自然中未见的那样被连接/融合在一起。非天然存在的/人工的/突变的脑信号蛋白3蛋白、脑信号蛋白3的非天然存在的/人工的/突变的功能片段、脑信号蛋白3的非天然存在的/人工的/突变的功能性sema结构域、二聚化结构域和/或稳定子结构域可以经氨基酸接头(例如丝氨酸-甘氨酸接头)缀合/连接在一起。此类接头在本领域是已知的，并且可以是例如存在于蛋白结构域之间的短肽序列。接头通常由柔性残基如甘氨酸和丝氨酸组成，以使相邻的蛋白结构域相对于另一个自由移动。当必须确保两个相邻结构域在空间上不互相干扰时，使用较长的接头。本文还设想非肽键。此类非肽键可以包括二硫键(例如Cys侧链之间的二硫键)，通过化学交联剂(如双琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)或磺酸琥珀酰亚氨基4-[p-马来酰亚胺基苯基]丁酸酯(Sulfo-SMPB))诱导的硫醚键或者非肽类共价键、金属螯合/配位基团以及非共价的蛋白-蛋白相互作用。这些仅是本发明的实施方案，并且对于技术人员而言显而易见的是，可以容易地在融合蛋白内进行并使用改变而不脱离本发明的实质。
本文还设想，可以通过添加免疫球蛋白样结构域来优化突变的脑信号蛋白3或其功能片段的稳定性，从而同时增强药代动力学特性如血清中延长的半衰期并保护不受蛋白酶的蛋白水解消化。此外，可以通过优化生产来增强形式的稳定性。由于用于共价连接结构域的接头序列经常导致聚集，已建立下述生产线：首先生产可以容易组装的两种或三种多肽以产生功能性药物。此类技术利用定向二硫键或交联剂以共价连接两个不同的多肽。其它技术利用异源-或同源-二聚化结构域如亮氨酸拉链结构域、Fc结构域以及其它技术如杵-进入-臼(knob-into-hole)技术(参见，例如WO 2007/062466)。
本发明还涉及包含本发明的核酸序列的载体。
许多合适的载体对于分子生物学领域的那些技术人员而言是已知的，其选择将取决于期望的功能，并且其包括质粒、粘粒、病毒、噬菌体以及常规用于基因工程的其它载体。可将本领域那些技术人员众所周知的方法用于构建各种质粒和载体；参见，例如Sambrook等人(见上文)和Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,Green PublishingAssociates and Wiley Interscience,N.Y.(1989),(1994)中所述的技术。可选地，可将本发明的多核苷酸和载体重构进脂质体中，以向靶细胞递送。可将相关序列转移进要求表达特定多肽的表达载体中。典型的克隆载体包括pBluescript SK、pGEM、pUC9、pBR322和pGBT9。典型的表达载体包括pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CAT。
优选地，所述载体是基因打靶载体和/或基因转移载体。基于通过离体或体内技术将治疗性基因(例如用于疫苗接种的基因)引入细胞的基因疗法是基因转移的最重要应用之一。文献中描述了用于体外或体内基因疗法的合适的载体、载体***和方法，并且其对于本领域技术人员而言是已知的；参见，例如Giordano,Nature Medicine 2(1996),534-539；Schaper,Circ.Res.79(1996),911-919；Anderson,Science 256(1992),808-813,Isner,Lancet 348(1996),370-374；Muhlhauser,Circ.Res.77(1995),1077-1086；Wang,NatureMedicine 2(1996),714-716；WO 94/29469；WO 97/00957,Schaper,Current Opinion inBiotechnology 7(1996),635-640或者Verma,Nature 389(1997),239-242以及其中引用的参考文献。在某些方面，载体是腺相关病毒(AAV)载体，在具体方面，AAV病毒是AAV8，因而载体是AAV8载体。AAV载体对于基因疗法具有吸引力。AAV***具有一些优势，包括长期基因表达、在无辅助病毒的情况下不能自动复制、转导***细胞和非***细胞以及缺乏来自野生型感染的致病性。本文设想，AAV血清型显示不同的器官趋性。因此，可将不同的AAV血清型用于使本发明的蛋白/多肽靶向不同器官的癌症。本文设想，可以根据标准方案在基因疗法中使用不同的AAV载体(Grieger等人，2012，以及Asokan等人，2012)。
可将本发明的核酸分子和如上文所述的载体设计为用于直接引入或经脂质体或病毒载体(例如腺病毒、逆转录病毒)引入细胞。此外，可将杆状病毒***或者基于牛痘病毒或塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Virus)的***用作本发明的核酸分子的真核表达***。除了重组产生，可以利用固相技术通过直接肽合成产生本发明的蛋白片段、融合蛋白或抗原片段(cf Stewart等人(1969)Solid Phase Peptide Synthesis,WH Freeman Co,San Francisco；Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85(1963),2149-2154)。可以利用手动技术或者通过自动化进行体外蛋白合成。可以例如利用Applied Biosystems 431A PeptideSynthesizer(Perkin Elmer,Foster City CA)，根据制造商提供的说明书，实现自动化合成。可以分别化学合成多种片段，并利用化学方法组合以产生全长分子。
在某些方面，载体包含核酸序列，其为可操作地连接至本文限定的所述核酸序列的调控序列。
术语“调控序列”指DNA序列，其对于影响与之相连的编码序列的表达是必须的。此类控制序列的性质根据宿主有机体的不同而不同。在原核生物中，控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和终止子。在真核生物中，一般的控制序列包括启动子、终止子，以及在一些情况下包括增强子、反式激活因子和转录因子。术语“控制序列”在最低程度上意图包括其存在对于表达而言是必须的所有组件，并且还可以包括其它有利组件。
术语“可操作地连接”指并列，其中如此描述的组件处于允许自身以其预期的方式发挥功能的关系。以在与控制序列兼容的条件下实现编码序列的表达的方式将控制序列可操作地连接”至编码序列。如果控制序列是启动子，则优选使用双链核酸，这对于技术人员而言是显而易见的。
所述载体也可以是表达载体。“表达载体”是可用于转化所选宿主并在所选宿主中提供编码序列的表达的构建体。表达载体可以，例如是克隆载体、双元载体或整合载体。表达包括核酸分子的转录，优选转录为可翻译的mRNA。确保在原核生物和/或真核细胞中的表达的调控元件对于本领域那些技术人员而言众所周知。在真核细胞的情况下，它们包含确保转录起始的正常起始子，以及任选地包含确保转录终止和转录本稳定的poly-A信号。允许在原核宿主细胞中表达的可能的调控元件包括，例如大肠杆菌中的PL、lac、trp或tac启动子，以及允许在真核宿主细胞中表达的调控元件的实例是酵母中的AOX1或GAL1启动子，或者哺乳动物以及其它动物细胞中的CMV-、SV40-、RSV-启动子(劳斯氏肉瘤病毒)、CMV-增强子、SV40-增强子或球蛋白内含子。
除了负责转录起始的元件之外，此类调控元件还可以包括多核苷酸下游的转录终止信号，如SV40-poly-A位点或tk-poly-A位点。此外，根据使用的表达***，可以向所述核酸序列的编码序列中添加能够指导多肽进入细胞区室或者将其分泌进培养基中的前导序列，并且所述前导序列在本领域众所周知。在适当的阶段将前导序列与翻译、起始和终止序列组装，并且优选能够指导翻译的蛋白或其部分分泌进细胞周质间隙或者细胞外的培养基中的前导序列。因此，此类前导序列也可以是信号肽。故而，突变的脑信号蛋白3多肽可以包含信号肽。信号肽是通常存在于指向分泌途径的蛋白的N-末端的短的氨基酸区段。此类蛋白包括驻留进某些细胞器(如内质网、高尔基体或核内体)内部或者分泌自细胞的那些。信号肽被切割，并且活性多肽通常不包含信号肽。任选地，异源序列可以编码融合蛋白，其包含赋予期望特征(例如表达的重组产物的稳定或简单纯化)的N-末端鉴定肽；参见上文。在该背景下，合适的表达载体在本领域是已知的，如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)、pEF-DHFR、pEF-ADA或pEF-neo(Mack等人，PNAS(1995)92,7021-7025，以及Raum等人，Cancer Immunol Immunother(2001)50(3),141-150)或者pSPORT1(GIBCO BRL)。
优选地，在能够转化转染真核宿主细胞的载体中，表达控制序列将是真核生物启动子***，但是也可以使用用于原核宿主的控制序列。一旦载体掺入合适的宿主中，则在适合于高水平表达核苷酸序列的条件下维持宿主，并且视需要，随后可进行本发明的多肽的收集和纯化；参见，例如所附实施例。
本发明涉及转化有本发明的载体的宿主，或者涉及包含本发明的核酸分子的宿主。所述宿主可以是任何原核或真核细胞。合适的原核/细菌细胞是通常用于克隆的那些，如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。所述真核宿主可以是哺乳动物细胞。
在优选实施方案中，所述哺乳动物细胞是神经元细胞和/或培养的细胞，如特别是HEK 293细胞(人胚肾细胞)、CHO、HeLa、NIH3T3、BHK或PC12细胞。在特别优选的实施方案中，HEK293细胞系稳定表达爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)核抗原-1(HEK293-EBNA1或293E)。通常，对于大规模转染而言，这是最常用的细胞系(CSH Protocols；2008；doi:10.1101/pdb.prot4976)。
特别设想的是，所述宿主可以是哺乳动物细胞。特别优选的宿主细胞包括稳定表达爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原-1的HEK细胞、HEK293E细胞、HEK293细胞系(HEK293-EBNA1或293E)。
在该上下文中使用的术语“细胞”或“哺乳动物细胞”还可以包括多种细胞以及组织中包含的细胞。用于筛选或验证方法的细胞可获自来自(转基因的)非人的动物或者罹患疾病(例如，血管生成性疾病、癌症或与脑信号蛋白依赖的丛状蛋白受体激活相关的疾病)的人的样品。细胞(例如肿瘤细胞等)还可以获自或者来源于患者样品(例如活组织切片)，特别是来自罹患如上文或下文所限定的疾病的患者/对象的活组织切片。因此，细胞可以是人细胞。此外，用于当前的筛选或验证方法的此类细胞可以包含于组织或组织样品(如样品活组织切片)中。本发明还提供转化或转染有本发明的载体的宿主。所述宿主可以通过将以上所述的本发明的载体或者以上所述的本发明的核酸分子引入宿主而产生。宿主中至少一种载体或至少一种核酸分子的存在可以介导编码以上所述的突变的脑信号蛋白3或其片段的基因的表达。引入宿主的本发明的所述核酸分子或载体可以整合进宿主的基因组中，或者其可以维持在染色体外。宿主可以是任何原核或真核细胞。
替代表达***是昆虫***或昆虫细胞表达***。在一种此类***中，将苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus,AcNPV)用作载体，以在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞或在粉纹夜蛾(Trichoplusia)幼虫中表达外源基因。可将所述核酸分子的编码序列克隆进病毒的非必需区，如多角体蛋白基因，并将其置于多角体蛋白启动子的控制之下。所述编码序列的成功***将导致多角体蛋白基因失活并产生缺乏外壳蛋白外壳的重组病毒。然后将重组病毒用于感染草地贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫，在其中本发明的蛋白被表达(Smith,J.Virol.46(1983),584；Engelhard,Proc.Nat.Acad.Sci.USA91(1994),3224-3227)。在某些方面，可将pFBDM载体用于表达。在转化进DH10MultiBac大肠杆菌细胞时，***至MultiBac杆状病毒DNA经Tn7转座序列介导(Berger等人，2004；Fitzgerald等人，2006)。可在Sf21(Spodoptera frugiperda)(Gibco,Invitrogen)和/或High Five(Trichoplusia ni)(Gibco,Invitrogen)细胞中进行病毒扩增和表达。
其它调控元件可以包括转录以及翻译增强子。有利地，本发明的上述载体包含选择标志物和/或评分标志物(scorable marker)。
可用于转化的细胞以及例如植物组织和植物的选择的选择标志物基因对于本领域那些技术人员而言众所周知，并且包括例如，作为dhfr筛选基础的抗代谢物抗性，其赋予针对氨甲喋呤的抗性(Reiss,Plant Physiol.(Life Sci.Adv.)13(1994),143-149)；npt，其赋予针对氨基糖苷类新霉素、卡那霉素和巴龙霉素的抗性(Herrera-Estrella,EMBO J.2(1983),987-995)以及hygro，其赋予针对潮霉素的抗性(Marsh,Gene 32(1984),481-485)。已描述其它选择标志物，即trpB，其允许细胞利用吲哚取代色氨酸；hisD，其允许细胞利用组胺醇(histinol)取代组氨酸(Hartman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988),8047)；甘露糖-6-磷酸异构酶，其允许细胞利用甘露糖(WO 94/20627)，以及ODC(鸟氨酸脱羧酶)，其赋予针对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(双氟代甲基)-DL-鸟氨酸DFMO的抗性(McConlogue,1987,In:Current Communications in Molecular Biology,Cold Spring Harbor Laboratoryed.)，或者来自土曲霉(Aspergillus terreus)的脱氨酶，其赋予针对杀稻瘟菌素S的抗性(Tamura,Biosci.Biotechnol.Biochem.59(1995),2336-2338)。
可使用的评分标志物对于本领域那些技术人员而言也是已知的，并且可商购得到。有利地，所述标志物是编码荧光素酶(Giacomin,Pl.Sci.116(1996),59-72；Scikantha,J.Bact.178(1996),121)、绿色荧光蛋白(Gerdes,FEBS Lett.389(1996),44-47)或者β-葡萄糖醛酸酶(Jefferson,EMBO J.6(1987),3901-3907)的基因。该实施方案特别适用于含有所述载体的细胞、组织和有机体的简单且快速的筛选。
如上所述，出于例如纯化以及基因疗法的目的，所述核酸分子可以单独使用或者可以作为载体的一部分使用，以在细胞中表达本发明的多肽。将含有编码本发明的上述多肽中的任一种的DNA序列的核酸分子或载体引入细胞，其转而产生目标多肽。基于通过离体或体内技术将治疗性基因引入细胞的基因疗法是基因转移的最重要应用之一。文献中描述了用于体外或体内基因疗法的合适的载体、方法或基因递送***，并且其对于本领域技术人员而言是已知的；参见，例如Giordano,Nature Medicine 2(1996),534-539；Schaper,Circ.Res.79(1996),911-919；Anderson,Science 256(1992),808-813；Verma,Nature 389(1994),239；Isner,Lancet 348(1996),370-374；Muhlhauser,Circ.Res.77(1995),1077-1086；Onodera,Blood 91(1998),30-36；Verma,Gene Ther.5(1998),692-699；Nabel,Ann.N.Y.Acad.Sci.811(1997),289-292；Verzeletti,Hum.Gene Ther.9(1998),2243-51；Wang,Nature Medicine 2(1996),714-716；WO 94/29469；WO 97/00957；US 5,580,859；US5,589,466；或者Schaper,Current Opinion in Biotechnology 7(1996),635-640。可将所述核酸分子和载体设计为用于直接引入或者经脂质体或病毒载体(例如腺病毒、逆转录病毒)引入细胞。优选地，所述细胞是生殖细胞系细胞、胚细胞或***或者来自于所述细胞的细胞，最优选地，所述细胞是干细胞。胚胎干细胞的实例可以是，特别是如Nagy,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993),8424-8428中所述的干细胞。
术语“原核生物”意为包括所有细菌，其可以转化或者转染有用于表达本发明的蛋白的DNA或RNA分子。原核宿主可以包括革兰氏阴性细菌以及***，如例如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)和枯草芽孢杆菌。术语“真核的”意为包括酵母、高等植物、昆虫，以及优选哺乳动物细胞。根据重组生产程序中使用的宿主，由本发明的多核苷酸编码的蛋白可以是糖基化的或者可以是非糖基化的。特别优选使用含有本发明的多肽的编码序列并基因融合至蛋白A标签的质粒或病毒。可以利用本领域那些普通技术人员通常已知的任何技术将以上所述的多核苷酸用于转化或转染宿主。此外，制备融合的、可操作地连接的基因并使其在例如哺乳动物细胞和细菌中表达的方法在本领域众所周知(Sambrook,见上文)。
本文还提供了产生根据本发明使用的多肽的方法，所述方法包括在允许本发明的多肽表达的条件下培养/饲养本发明的宿主，并且任选地从培养物中回收/分离产生的多肽。
转化的宿主可在发酵罐中生长，并且可以根据本领域已知的技术培养以达到最优的细胞生长。然后可从生长培养基、细胞裂解物或细胞膜碎片中分离中分离本发明的多肽。可以通过任何常规手段分离和纯化例如微生物表达的本发明的多肽，如例如制备型层析分离和免疫学分离，如涉及单克隆或多克隆抗体(例如针对本发明或者如所附实施例中描述的多肽的标签的抗体)的使用的那些。
本领域已知，允许表达的宿主的培养条件取决于此方法中使用的宿主***和表达***/载体。改进以达到允许重组多肽表达的条件的参数在本领域是已知的。因此，在无进一步创造性投入的情况下，可以由本领域技术人员确定合适的条件。
一旦表达，可以根据本领域的标准程序纯化本发明的多肽，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等；参见Scopes,"Protein Purification",Springer-Verlag,N.Y.(1982)。对于制药用途，优选至少约90至95％同质性的基本纯的多肽，并且最优选98至99％或者更高的同质性。一旦纯化(部分纯化或者达到期望的同质性)，然后可以治疗性地(包括体外)使用本发明的多肽，或者将其用于开发并进行分析程序。此外，从培养物中回收本发明的多肽的方法的实例描述于所附实施例中。
如本文所详细描述的，本发明还涉及特异性结合突变的脑信号蛋白3、其功能片段或者包含所述突变的脑信号蛋白3或其功能片段的本发明的融合蛋白的抗体。具体地，本文提供特异性结合突变的脑信号蛋白3或其功能片段的抗体，其中所述抗体特异性结合这样的表位：其包含取代对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸或者位于其它脑信号蛋白3蛋白中通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的丙氨酸的亲水氨基酸，其中所述脑信号蛋白3选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D。因此，本发明涉及特异性结合突变的脑信号蛋白3或其功能片段的抗体，其中所述抗体特异性结合这样的表位：其包含取代对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸的亲水氨基酸；取代对应于如SEQID NO:6所示的野生型脑信号蛋白3B 105位的丙氨酸的亲水氨基酸；取代对应于如SEQ IDNO:10所示的野生型脑信号蛋白3C 104位的丙氨酸的亲水氨基酸；或者取代对应于如SEQID NO:14所示的野生型脑信号蛋白3D 120位的丙氨酸的亲水氨基酸，并且其中所述脑信号蛋白3选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D。
根据本发明，术语“抗体”包括多克隆和单克隆抗体以及其仍保留结合特异性的衍生物或片段。产生抗体的技术在本领域众所周知，并且描述于，例如Harlow和Lane"Antibodies,A Laboratory Manual",Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988，以及Harlow和Lane“Using Antibodies:A Laboratory Manual”Cold Spring HarborLaboratory Press,1999中。根据本发明，术语“抗体”还包括诸如下述的实施方案：嵌合抗体、单链抗体和人源化抗体以及抗体片段，例如特别是Fab片段，由Eph受体、肝配蛋白或磷酸酶胞外结构域组成的融合蛋白以及Fc。抗体片段或衍生物还包括F(ab')2、Fv片段、scFv、单结构域VH或V-样结构域(如VhH或V-NAR-结构域)以及多聚体形式(如单链抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体或者化学缀合的Fab’-多聚体)；参见，例如，Harlow和Lane(1988)以及(1999),Altshuler(2010)Biochemistry(Moscow)75,1584-605，或者Holliger(2005)Nature Biotechnology 23,1126-36。各种程序在本领域是已知的，并且可将其用于此类和/或片段的产生。因此，可以通过模拟肽产生(抗体)衍生物。此外，所描述的用于产生单链抗体的技术(参见，特别是美国专利4,946,778)可适用于产生本发明的多肽和融合蛋白特异的单链抗体。此外，可将转基因动物用于表达本发明的多肽和融合蛋白特异性的人源化抗体。最优选地，本发明的抗体是单克隆抗体。为了制备单克隆抗体，可以使用提供由连续的细胞系培养物产生的抗体的任何技术。此类技术的实例包括最初的杂交瘤技术(和Milstein(1975)Nature 256,495)，随着技术的进一步发展，包括三源杂交瘤(trioma)技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor(1983)Immunology Today 4,72)以及EBV-杂交瘤技术，以产生人单克隆抗体(Cole等人，(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,AlanR.Liss,Inc.,77)。术语抗体还涉及人源化抗体。“人源化”形式的非人(例如鼠科动物或兔)抗体是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)。通常，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自诸如小鼠、大鼠或兔的非人物种的具有期望特异性、亲和力和能力的CDR(供体抗体)的残基取代。在一些情况中，人免疫球蛋白的Fv骨架残基被对应的非人残基取代。此外，人源化抗体可以包含既未存在于受体抗体也未存在于输入的CDR或骨架序列中的残基。进行这些改变以进一步改善并优化抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个，并且通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些区域，以及全部或基本上全部FR区域是人免疫球蛋白共有序列的那些区域。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白(通常为人免疫球蛋白)恒定区(Fc)的至少一部分。对于进一步的细节，参见：Jones Nature 321(1986),522-525；Reichmann Nature 332(1998),323-327，以及Presta Curr Op StructBiol 2(1992),593-596。
抗体人源化的常用方法包括CDR移植，其中来自非人‘供体’抗体的功能性抗原结合位点被移植到人‘受体’抗体上。CDR移植方法在本领域是已知的，并且描述于，例如US 5,225,539、US 5,693,761和US 6,407,213中。另一相关方法是从转基因动物产生人源化抗体，所述转基因动物被基因工程化以包含一个或多个能够经受基因重排和基因转换的人源化免疫球蛋白基因座(参见，例如US 7,129,084)。设计和产生人源化抗体的其它方法描述于US 07/290,975、US 07/310,252和US 2003/0229208中，或者被Queen PNAS(1989),10029-10033描述。
可将BIAcore***中使用的表面等离子体共振用于增加功效，如结合本发明的多肽的表位的噬菌体抗体的功效和/或选择性(Schier(1996)Human Antibodies Hybridomas7,97；Malmborg(1995)J.Immunol.Methods 183,7)。本发明的上下文还设想，术语“抗体”包含可在细胞中表达的抗体构建体，例如可以经病毒或质粒载体等转染和/或转导的抗体构建体。本发明上下文中描述的抗体能够特异性结合提及的多肽或如本文所限定的突变的脑信号蛋白3的表位/与提及的多肽或如本文所限定的突变的脑信号蛋白3的表位相互作用。根据本发明使用的术语“特异性结合/与……相互作用”意为，抗体不或者基本不与相似结构的表位交叉反应。可以通过例如下述测试研究中的一组抗体的交叉反应性：评估所述研究中的一组抗体在常规条件下与目标表位的结合，以及与许多更密切相关的或者较不密切相关的(结构上和/或功能上)表位的结合。只有结合其相关背景下的目标表位(例如，突变的脑信号蛋白3或其功能片段的结构中的特定基序)，而不或者基本不结合任何其它表位的那些抗体被认为是目标表位特异性的，并因而被认为是根据本发明的抗体。对应的方法描述于例如Harlow和Lane,1988和1999，见上文中。抗体特异性结合构象表位或连续表位/与构象表位或连续表位相互作用，所述构象表位或连续表位是提及的多肽，优选突变的脑信号蛋白3所特有的。构象表位或非连续表位的特点是存在两个或更多个不连续的氨基酸残基的多肽抗原，所述氨基酸残基在一级序列中是分离的，但是当多肽折叠为天然蛋白/抗原时，其在分子表面上集合(Sela(1969)Science 166,1365；Laver(1990)Cell 61,553)。有助于表位的两个或更多个不连续的氨基酸残基存在于一条或多条多肽链的单独的部分上。当多肽链折叠为三维结构以组成表位时，这些残基在分子表面上集合。相比之下，连续的或线性表位由两个或更多个不连续的氨基酸残基组成，所述氨基酸残基存在于多肽链的单一线性区段中。
为了产生抗体片段，开发了多种技术。传统地，这些片段经完整抗体的蛋白水解消化得到(参见，Morimoto等人(1992)Journal of Biochemical and Biophysical Methods24:107-117；以及Brennan等人(1985)Science 229:81)。也可以通过以上所讨论的重组宿主细胞和抗体噬菌体文库直接产生抗体片段。可以从大肠杆菌直接回收Fab′-SH片段，并将其化学连接以形成F(ab′)2片段(Carter等人(1992)Bio/Technology 10:163-167)。根据另一方法，可以从重组宿主细胞培养物直接分离F(ab′)2片段。产生抗体片段的其它技术对于熟练的从业者而言将是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利第5,571,894号；以及美国专利第5,587,458号。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利第5,641,870号中所述的线性抗体。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
具有针对至少两种不同表位的结合特异性的双特异性抗体(Millstein等人(1983),Nature 305:537-539)可以结合突变的脑信号蛋白3的两种不同的表位。也已描述了从抗体片段产生双特异性抗体的技术，如利用化学键，其中蛋白水解性地切割完整抗体以产生F(ab′)2片段(Brennan等人(1985)Science 229:81)。可从大肠杆菌回收Fab′-SH片段，并将其化学连接以形成双特异性抗体(Shalaby等人(1992)J.Exp.Med.175:217-225。“双链抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段的替代方法(Hollinger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。
“Fab片段”通常由一条轻链以及一条重链的CH1和可变区组成。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。“Fc”区通常包含含有抗体的CH2和CH3结构域的两个重链片段。通过两个或更多个二硫键以及通过CH3结构域的疏水相互作用将两个重链片段聚在一起。“Fab'片段”通常包含一条轻链以及一条重链含有VH结构域和CH1结构域以及CH1与CH2结构域之间的区域的部分，以便在两个Fab'片段的两条重链之间形成二硫键，从而形成F(ab')2分子。“F(ab')2片段”通常包含两条轻链和含有CH1与CH2结构域之间的恒定区的一部分的两条重链，以便在两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab')2片段由通过两条重链之间的二硫键聚在一起的两个Fab'片段组成。“Fv区”通常包含来自重链和轻链的可变区，但是缺乏恒定区。考虑具有多于二价的抗体。可以通过重组表达编码抗体的多肽链的核酸容易地产生具有三个或更多个抗原结合位点以及两个或更多个可变结构域的多价“章鱼抗体(Octopus antibody)”(US 2002/0004586；WO01/77342)。例如，可以制备三特异性抗体(Tutt等人(1991)J.Immunol.147:60.)。
本文提供的结合分子/抗体/抗原结合片段优选位于IgG1或IgG3骨架，更优选人IgG1或IgG3骨架。IgG1或IgG3，优选人IgG1或IgG3骨架内的结合分子、抗体或这些抗体的抗原结合片段特别优选用于疫苗疗法。
可将下述示例性分析用于确定候选抗体确实特异性结合根据本发明的突变的脑信号蛋白3或其功能片段。
可以通过例如捕获ELISA分析鉴定选择性且特异性结合表位的抗体，所述表位包含位于通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的脑信号蛋白3A 106位的位点的亲水氨基酸。为了进行此类分析，用含有渐增量(0.02nM至3.5nM)的亲和纯化的突变的脑信号蛋白3(或其功能片段)或纯化的野生型脑信号蛋白3(或其功能片段)的0.05M Na2CO3(pH 9.6)将Corning 96Well Clear Polystyrene High Bind Stripwell Microplate(产品#2592)在4℃包被过夜。随后，在室温用含0.05％Tween-20(PBS-T)和5％BSA的PBS封闭反应，持续2小时。通过在4℃过夜孵育捕获含有等量产生的抗体的溶液。通过用PBS-T充分洗涤移除未结合的物质。通过在4℃，用含合适的辣根过氧化物酶-缀合的二抗和1％BSA的PBS-T孵育孔1h来检测抗-突变的-脑信号蛋白3抗体的结合。进一步洗涤之后，通过与邻苯二胺的显色反应检测突变的脑信号蛋白3结合的(或其功能片段结合的)或者野生型脑信号蛋白3结合的(或其功能片段结合的)抗-突变的-脑信号蛋白3抗体。选择特异性结合突变的脑信号蛋白3(或其功能片段)而不结合野生型脑信号蛋白3(或其功能片段)的抗体。
在又一实施方案中，可将根据本发明的核酸分子、载体、突变的脑信号蛋白3、其功能片段或融合蛋白/多肽用作药物，即本文提供以及描述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段被用于药物用途。术语“药物”和“药物组合物”在本文可互换使用。因此，本文提供的关于“药物组合物”的定义和解释加上必要的修改适用于术语“药物”。
本文使用的术语“病症或疾病的治疗”，如“癌症的治疗”在本领域众所周知。“病症或疾病的治疗”指示在患者/对象中，病症或疾病被怀疑或已被确诊。疑患病症或疾病的患者/对象通常显示技术人员可以归因于特定病理状态的特定的临床和/或病理学症状(即诊断病症或疾病)。
病症或疾病的“治疗”可以，例如导致病症或疾病进展的停止(例如，无症状的恶化)或者病症或疾病进展的延迟(如果进展的停止仅是短暂性的)。病症或疾病的“治疗”还可以导致罹患病症或疾病的对象/患者的部分应答(例如，症状的缓解)或完全应答(例如，症状的消失)。因此，病症或疾病的“治疗”还可以指病症或疾病的缓解，这可以，例如导致病症或疾病进展的停止或者病症或疾病进展的延迟。此类部分或完全应答随后可以复发。应当理解，对象/患者可以经历宽范围的针对治疗的应答(例如，如上文所述的示例性应答)。病症或疾病的治疗可以特别包含根治治疗(优选导致完全应答，并最终导致病症或疾病的治愈)和姑息治疗(包括症状减轻)。因此，术语“治疗”意为获得期望的病理学和/或生理学效果。效果在完全或部分预防疾病/医学病况/病症或其症状方面还可以是预防性的和/或在部分或完全治愈疾病/医学病况/病症和/或属于疾病/医学病况/病症的副反应方面可以是治疗性的。
本文使用的术语“病症或疾病的预防”，如“癌症的预防”在本领域也众所周知。例如，疑似易患如本文所限定的病症或疾病的患者/对象可以，具体地，获益于病症或疾病的预防。对象/患者可以具有针对病症或疾病的易感性或倾向，包括但不限于遗传倾向。可以利用例如遗传标志物或表型指标，通过标准分析确定此类倾向。应当理解，根据本发明待预防的病症或疾病在患者/对象中未被诊断或未能诊断(例如，患者/对象未显示任何临床或病理学症状)。因此，术语“预防”包括在主治医师确诊或确定或者可以确诊或确定任何临床和/或病理学症状之前使用本发明的化合物。
本发明提供包含本发明的核酸分子、本发明的突变的脑信号蛋白3或其功能片段、本发明的融合蛋白或多肽的药物组合物。药物组合物可以包含药物赋形剂。在本文中应理解，所述药物赋形剂可以包含或者为药物载体、媒介物和/或稀释剂。在一个具体实施方案中，所述药物载体是病毒。在优选实施方案中，所述病毒是腺相关病毒(AAV)，其中所述腺相关病毒是AAV8。AAV可以例如用于基因疗法中。因此，在一方面，本发明提供包含腺病毒基因组的元件以及受真核转录启动子控制的突变的脑信号蛋白3或其片段的核苷酸序列。该核酸序列可以作为载体发挥功能，当载体被引入个体细胞中时，其允许前述提及的异源基因的表达。
此外，本发明提供用作药物的药物组合物。此外，本发明提供用于治疗下述疾病的药物组合物：血管生成性病症、癌症、肿瘤、肿瘤性疾病、血管性视网膜病、血脑屏障通透性改变、神经炎性病症、炎性病症、骨质疏松症、银屑病、肥胖症、分枝杆菌感染和/或肉芽肿。本发明还提供药物组合物，其中所述肿瘤是实体瘤。具体地，本发明提供用于***的药物组合物，其中所述肿瘤是胰腺肿瘤。此外，本发明提供用于治疗癌症的药物组合物，其中所述癌症选自胰腺癌、***、乳腺癌、结肠癌、黑素瘤、***癌、膀胱癌和舌癌。具体地，本发明提供用于治疗胰腺癌的药物组合物。此外，本发明提供药物组合物，其中涉及血管正常化、肿瘤生长的降低、转移降低或者存活延长。此外，本发明提供药物组合物、核酸分子、载体、突变的脑信号蛋白3、其功能片段和/或融合蛋白/多肽，其将与抗增殖药物、抗癌药物、细胞抑制药物、细胞毒性药物和/或放射疗法组合施用。在特别优选的方面，药物组合物、核酸分子、载体、突变的脑信号蛋白3、其功能片段和/或融合蛋白/多肽将经肠胃外施用。
此外，本发明提供用于***或癌症的药物组合物、突变的脑信号蛋白3、其功能片段和/或融合蛋白/多肽或者编码核酸分子，其用于通过增加周细胞覆盖率和/或增加血管灌注以及抑制癌缺氧而抑制肿瘤生长、降低肝转移或转移体积、减少血管面积和/或促进癌血管正常化。
药物组合物、核酸分子、载体、所述突变的脑信号蛋白3、其功能片段和/或融合蛋白/多肽可与其它治疗剂组合使用。当将本发明的化合物与针对同一疾病具有活性的第二治疗剂组合使用时，各化合物的剂量可以区别于当单独使用化合物时的剂量。本发明的化合物与第二治疗剂的组合可以包括施用第二治疗剂和本发明的化合物。此类施用可以包括同时/伴随施用。但是，如下文所述，也设想顺序/分开施用。
优选地，将与本发明的化合物组合施用的第二治疗剂是抗癌药。将与根据本发明的药物组合物、核酸分子、载体、突变的脑信号蛋白3、其功能片段和/或融合蛋白/多肽组合施用的抗癌药可以是：肿瘤血管生成抑制剂(例如，蛋白酶抑制剂、表皮生长因子受体激酶抑制剂或血管内皮生长因子受体激酶抑制剂)；细胞毒性药物(例如抗代谢物，如嘌呤和嘧啶类类似物抗代谢物)；抗有丝***剂(例如，微管稳定药物或抗有丝***生物碱)；铂配位复合物；抗肿瘤抗生素；烷化剂(例如，氮芥或亚硝基脲)；内分泌剂(例如，肾上腺皮质类固醇、雄性激素、抗雄激素、***、抗***、芳香酶抑制剂、***释放激素激动剂或生长激素抑制激素类似物)；或者靶向过表达和/或以其它方式参与肿瘤细胞中失调的具体代谢通路的酶或受体的化合物(例如，ATP和GTP磷酸二酯酶抑制剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂(如丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸激酶抑制剂(例如，Abelson蛋白酪氨酸激酶))以及各种生长因子、它们的受体和对应的激酶的抑制剂(如表皮生长因子受体激酶抑制剂、血管内皮生长因子受体激酶抑制剂、成纤维细胞生长因子抑制剂、***受体抑制剂和血小板来源的生长因子受体激酶抑制剂))；甲硫氨酸、氨肽酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、环氧酶抑制剂(例如，环氧酶-1或环氧酶-2抑制剂)以及拓扑异构酶抑制剂(例如，拓扑异构酶I抑制剂或拓扑异构酶II抑制剂)。
可以作为抗癌药物与本发明的药物组合物、核酸、载体、突变的脑信号蛋白3、其功能片段和/或融合蛋白/多肽组合使用的烷化剂可以是，例如氮芥(如环磷酰胺、二氯甲基二乙胺(双氯乙基甲胺)、乌拉莫司汀、美法仑、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、苯达莫司汀或曲磷胺)、亚硝基脲(如卡莫司汀、链脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、泼尼氮芥、雷莫司汀或司莫司汀)、烷基磺酸盐(如白消安、甘露舒凡或曲奥舒凡)、氮丙啶(如六甲三聚氰胺(六甲蜜胺)、三乙撑蜜胺、ThioTEPA(N,N'N'-三亚乙基硫代磷酰胺)、卡波昆或三亚胺醌)、肼(如丙卡巴肼)、三氮烯(如达卡巴嗪)或者咪唑并四嗪(如替莫唑胺)。
可以作为抗癌药物与本发明的药物组合物、核酸分子、载体、突变的脑信号蛋白3、其功能片段和/或融合蛋白/多肽组合使用的铂配位复合物可以是，例如顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、沙铂或四硝酸三铂。
可以作为抗癌药物与本发明的药物组合物、核酸分子、载体、突变的脑信号蛋白3、其功能片段和/或融合蛋白/多肽组合使用的细胞毒性药物可以是，例如抗代谢物，包括叶酸类似物抗代谢物(如氨基蝶呤、甲氨蝶呤、培美曲塞或雷替曲塞)、嘌呤类似物抗代谢物(如克拉屈滨、氯法拉滨、氟达拉滨、6-巯基嘌呤(包括其前药形式硫唑嘌呤)、喷司他丁或6-硫鸟嘌呤)以及嘧啶类似物抗代谢物(如阿糖胞苷、地西他滨、5-氟尿嘧啶(包括其前药形式卡培他滨和喃氟啶)、氟脲苷、吉西他滨、依诺他滨或沙帕他滨)。
可以作为抗癌药物与本发明的药物组合物、核酸分子、载体、突变的脑信号蛋白3、其功能片段和/或融合蛋白/多肽组合使用的抗有丝***剂可以是，例如紫杉烷(如多西紫杉醇、拉洛他赛(larotaxel)、奥他赛(ortataxel)、紫杉醇/紫杉酚或替司他赛(tesetaxel))、长春花生物碱(如长春碱、长春新碱、长春氟宁、长春地辛或长春瑞滨)、埃博霉素(如埃博霉素A、埃博霉素B、埃博霉素C、埃博霉素D、埃博霉素E或埃博霉素F)或者埃博霉素B类似物(如伊沙匹隆/杂氮埃博霉素B)。
可以作为抗癌药物与本发明的药物组合物、核酸分子、载体、突变的脑信号蛋白3、其功能片段和/或融合蛋白/多肽组合使用的抗肿瘤抗生素可以是，例如，蒽环类抗生素(如阿柔比星、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、氨柔比星、吡柔比星、戊柔比星或佐柔比星)、蒽二酮(如米托蒽醌或匹克生琼)或者分离自链霉菌的抗肿瘤抗生素(如放线菌素(包括放线菌素D)、博来霉素、丝裂霉素(包括丝裂霉素C)或普利霉素)。
可以作为抗癌药物与本发明的药物组合物、核酸分子、载体、突变的脑信号蛋白3、其功能片段和/或融合蛋白/多肽组合使用的酪氨酸激酶抑制剂可以是，例如阿西替尼、伯舒替尼、西地尼布、达沙替尼、埃罗替尼、吉非替尼、伊马替尼、拉帕替尼、来他替尼、尼罗替尼、司马沙尼、索拉非尼、舒尼替尼或凡德他尼。
可以作为抗癌药物与本发明的药物组合物、核酸分子、载体、突变的脑信号蛋白3、其功能片段和/或融合蛋白/多肽组合使用的拓扑异构酶抑制剂可以是，例如拓扑异构酶I抑制剂(如伊立替康、拓扑替康、喜树碱、贝洛替康、卢比替康或层状素D)或者拓扑异构酶II抑制剂(如安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷或多柔比星)。
可将其它抗癌药物与本发明的药物组合物、核酸分子、载体、突变的脑信号蛋白3、其功能片段和/或融合蛋白/多肽组合使用。抗癌药物可以包含生物和化学分子，如TNF-相关的细胞凋亡-诱导配体(TRAIL)、他莫昔芬、安吖啶、贝沙罗汀、雌氮芥、伊洛福芬、曲贝替定、西妥昔单抗、帕尼单抗、托西莫单抗、阿伦珠单抗、贝伐单抗、依决洛单抗、吉妥单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、盐酸阿伐新地(alvocidib)、Seliciclib、氨基酮戊酸、氨基酮戊酸甲酯、乙法昔罗、卟吩姆钠、他拉泊芬、替莫泊芬、维替泊芬、阿利维a酸、维a酸、阿那格雷、三氧化二砷、阿曲生坦、硼替佐米、卡莫氟、塞来昔布、秋水仙胺、伊利司莫、依沙芦星、依托格鲁、氯尼达明、硫蒽酮、马索罗酚、二溴甘露醇、米托胍腙、米托坦、奥利默森(oblimersen)、奥马西他辛(omacetaxine)、腺病毒载体定位码基因(sitimagene ceradenovec)、喃氟啶、睾内酯、噻唑呋林、替吡法尼以及伏立诺他。
另外，针对增殖性疾病中涉及的癌症或肿瘤标志物/因子/细胞因子的生物药物，如抗体、抗体片段、抗体构建体(例如，单链构建体)和/或修饰的抗体(如CDR移植抗体、人源化抗体、“全人源化”抗体等)可以用于与本发明的药物组合物、核酸分子、载体、突变的脑信号蛋白3、其功能片段和/或融合蛋白/多肽一起的共-治疗方法中。此类生物分子的实例为抗-HER2抗体(例如曲妥单抗、)、抗-CD20抗体(例如利妥昔单抗、)、抗-CD19/CD3构建体(参见，例如，EP-B11071752)和抗-TNF抗体(参见，例如，Taylor PC.Antibody therapy for rheumatoidarthritis.Curr Opin Pharmacol.2003.3(3):323-328)。与本发明的药物组合物、核酸分子、载体、突变的脑信号蛋白3、其功能片段和/或多肽一起用于共-治疗方法中的另外的抗体、抗体片段、抗体构建体和/或修饰的抗体可以见于Taylor PC.Curr OpinPharmacol.2003.3(3):323-328；Roxana A.Maedica.2006.1(1):63-65。
上文提及的组合可以方便地以药物制剂的形式呈现使用。此类组合的各个组分可以通过任何方便的途径以分开的或组合的药物制剂顺序地或同时地/伴随地施用。当顺序施用时，可以首先施用本发明的药物组合物、核酸分子、载体、突变的脑信号蛋白3、其功能片段和/或融合蛋白/多肽或第二治疗剂。当施用为同时的时候，可以以相同或不同药物组合物施用组合。当在同一制剂中组合时，应理解两种化合物必须是稳定的，且彼此以及与制剂的其它组分相容。当分别配制时，它们可以以任何方便的制剂提供。
药物组合物、核酸分子、载体、突变的脑信号蛋白3、其功能片段和/或融合蛋白/多肽也可以与物理疗法，如放射疗法组合施用。放射疗法可以在本发明化合物的施用之前、之后或与本发明化合物的施用同时开始。例如，放射疗法可以在施用化合物之后1-10分钟、1-10小时或24-72小时开始。然而，这些时间范围不应被解释为限制性的。将对象暴露于辐射，优选γ辐射，由此辐射可以以单剂量或在几小时、几天和/或几周内施用的多剂量提供。可以使用标准剂量和方案根据标准放射治疗方案递送γ辐射。
因此，本发明涉及用于治疗或预防癌症，特别是治疗或预防胰腺癌的核酸分子、突变的脑信号蛋白3、其功能片段、融合蛋白或多肽和/或其药学可接受的盐、溶剂化物或前药，或包含与药学可接受的赋形剂组合的任何前述实体的药物组合物，其中所述化合物或药物组合物与抗癌药物组合和/或与放射疗法组合施用。
换言之，本发明提供用作药物的本发明的核酸分子，本发明的载体和/或突变的脑信号蛋白3或其功能片段、本发明的融合蛋白或本发明的多肽。另外，本发明提供本发明的核酸分子、本发明的载体和/或本发明的突变的脑信号蛋白3或其功能片段、或本发明的融合蛋白/多肽，其用于治疗血管生成性病症、癌症、肿瘤性疾病、血管性视网膜病、血脑屏障通透性改变、神经炎性病症、骨质疏松症、肥胖症、分枝杆菌感染和/或肉芽肿。另外，本发明提供用于***的本发明的核酸分子、本发明的载体和/或本发明的突变的脑信号蛋白3或其功能片段或本发明的融合蛋白/多肽，其中所述肿瘤为实体瘤。另外，本发明提供本发明的核酸分子、本发明的载体和/或本发明的突变的脑信号蛋白3或其功能片段或本发明的融合蛋白/多肽，其用于治疗选自以下的肿瘤：胰腺肿瘤、***、乳腺癌、结肠癌、黑素瘤、***癌、膀胱癌和舌癌。具体地，本发明提供用于治疗胰腺癌的本发明的核酸分子、本发明的载体和/或本发明的突变的脑信号蛋白3或其功能片段或本发明的融合蛋白/多肽。另外，本发明提供本发明的核酸分子、本发明的载体和/或本发明的突变的脑信号蛋白3或其功能片段或本发明的融合蛋白/多肽，其中涉及血管正常化、肿瘤生长降低、转移降低或存活延长。
术语“血管生成”意为血管EC从已存在的血管开始生长并且以进入组织的方式形成毛细血管。形成过程为蛋白酶消化血管基底膜、血管EC的迁移/生长和内腔形成。“血管生成性病症”为血管疾病，如动脉硬化、张力亢进、心绞痛、阻塞性动脉硬化、心肌梗塞、脑梗塞、糖尿病血管病变或血管畸形；炎性疾病，如肝炎、肺炎、肾小球肾炎、甲状腺炎、骨炎、滑膜炎、骨破坏(osteoclasia)、软骨溶解、风湿病、支气管哮喘、结节病、Crow-Fukase综合征、血管翳、过敏水肿、溃疡、腹水、腹膜硬化或组织粘连；眼内新生血管疾病，如糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞或衰老性黄斑变性；生殖***疾病，如子宫功能障碍、胎盘功能障碍、卵巢机能亢进或卵巢黄素囊肿；中枢神经***疾病，如视网膜变性、脑卒中、血管性痴呆或阿尔茨海默病；癌症，如实体癌、血管瘤、血管内皮瘤、肉瘤、卡波西氏肉瘤或造血器官溃疡。
根据本发明，“癌症”是指这样的一类疾病或病症，其特征在于不受控制的细胞***以及这些细胞能够通过入侵直接生长至相邻组织，或通过转移植入远端部位而扩散，其中癌细胞通过血流或淋巴***运输。肿瘤性疾病可以为任何形式的癌症、肿瘤，或选自胰腺癌、乳腺癌、上皮癌、肝细胞癌、胆管细胞癌、胃癌(stomach cancer)、结肠癌、***癌、膀胱癌、舌癌、头颈癌、皮肤癌(黑素瘤)、泌尿生殖道癌，例如，卵巢癌、子宫内膜癌、***和肾癌；肺癌、胃癌(gastric cancer)、小肠癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、食道癌、唾液腺癌或甲状腺癌。
血管生成抑制剂可以用作疾病(其状况可以通过上述疾病中的血管生成变得严重)的预防剂或治疗剂。血管生成抑制剂对其具有作用的疾病为血管疾病、炎性疾病、眼内新生血管疾病、生殖***疾病、中枢神经***疾病、癌症等。本发明的载体的制剂的形式(基因治疗剂)可以为根据上述各个施用形式的不同形式之一。例如，当其为包含作为活性成分的本发明的DNA的注射剂时，可以通过常用方法制备该注射剂。基因治疗剂的基础成分没有特别限制，只要其为通常用于注射剂的基础成分。例如，其为蒸馏水，氯化钠，盐溶液，如氯化钠和矿物盐的混合物，诸如甘露醇、乳糖、葡聚糖或葡萄糖的溶液、诸如甘氨酸或精氨酸的氨基酸溶液，或有机酸溶液或盐溶液和葡萄糖溶液的混合物。可以根据常用方法利用助剂，如渗透调节剂、pH调节剂、诸如芝麻油或大豆油的植物油、诸如卵磷脂或非离子型表面活性剂的表面活性剂等将注射剂制备成溶液、悬浮液或分散液。如上所述的注射剂可以为通过诸如崩解或冻干的操作在使用中溶解的制剂。
另外，本发明提供根据本发明的突变的脑信号蛋白3或其功能片段、核酸分子、融合蛋白、多肽或宿主的用途。
另外，本发明提供治疗血管生成性病症和/或肿瘤性疾病和/或癌症的方法，其包括以下步骤：向需要此类治疗的对象施用药物活性量的本发明的核酸分子、或根据本发明的突变的脑信号蛋白3或其功能片段、本发明的融合蛋白、多肽、本发明的药物组合物或通过本文所述的方法制备的药物组合物。
根据本发明待治疗的对象或患者可以为动物(例如，非人动物)、脊椎动物、哺乳动物、啮齿动物(例如，豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠科动物(例如，小鼠)、犬(例如，狗)、猫科动物(例如，猫)、猪(例如，猪)、马(例如，马)、灵长类动物、类人猿(例如，猴或猿)、猴(例如，狨猴、狒狒)、猿(例如，大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿)或人。在本发明的上下文中，特别设想要对在经济上、农艺学上或科学上重要的动物进行治疗。科学上重要的生物体包括但不限于小鼠、大鼠和兔。低等生物体，如，例如，果蝇，如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)和线虫，如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)也可以用于科学方法中。农艺学上重要的动物的非限制性实例为羊、牛和猪，然而，例如，猫和狗可以被认为是经济学上重要的动物。优选地，对象/患者为哺乳动物；更优选地，对象/患者为人或非人哺乳动物(如，例如，豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠、兔、狗、猫、马、猴、猿、狨猴、狒狒、大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿、羊、牛或猪)；最优选地，对象/患者为人。
药物有效量可以高于10mg/kg体重。另外，药物有效量可以低于0.5mg/kg体重。在特别优选的方面，本发明提供根据本发明的治疗方法，其中所述药物有效量在0.5至10mg/kg体重的范围内。
本文设想，根据疾病的治疗目的、施用部位、剂量数、期望的治疗持续时间、患者的年龄或体重等，制剂中DNA的含量为不同的，并且可以适当地调整。对于患者(体重为60kg)，通常为约0.01-2000mg，优选0.1-100mg编码本发明蛋白质的DNA。
考虑到个体患者的临床状况、药物组合物的递送部位、施用方法、施用时程以及执业医生已知的其他因素，药物组合物将以符合良好医学实践的方式配制和给药。因此，通过这些考虑因素确定用于本文目的的药物组合物的“有效量”。
技术人员知晓施用于个体的药物组合物的有效量将尤其取决于化合物的性质。
本文提供的组合物的施用可以尤其包括这样的施用：每天两次、每天、每隔一天、每三天、每四天、每五天、一周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次等。
例如，如果所述化合物为(多)肽或蛋白质，则每剂量肠胃外施用的药物组合物的总的药学有效量将在约1μg蛋白质/kg患者体重/天至15mg蛋白质/kg患者体重/天的范围内，尽管如上所述，但这将受治疗判断的支配。更优选地，该剂量为至少0.01mg蛋白质/kg/天，最优选为约0.01至1mg蛋白质/kg/天(对于人而言)。如果连续给予，则通常通过每天的1-4次注射或通过连续的皮下输注，例如，使用微型泵，以约1μg/kg/小时至约50μg/kg/小时的给药速率施用药物组合物。也可以使用静脉内袋溶液。观察到变化所需的治疗长度和在治疗之后出现应答的间隔似乎根据期望效果而变化。可以通过本领域技术人员众所周知的常规测试确定具体的量。
可以肠胃外、口服、直肠、脑池内(intracisternally)、***内、腹腔内、局部地(如通过粉末、软膏剂、滴剂或透皮贴剂)或经颊施用本发明的药物组合物。在特别优选的实施方案中，肠胃外施用药物组合物。
本发明的药物组合物优选地包含药学可接受的载体。“药学可接受的载体”意为任何类型的病毒、无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、封装材料或制剂助剂。本文使用的术语“肠胃外”是指施用模式，其包括静脉内、肌内、腹腔内、气管内、鼻内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注。
药物组合物也适当地通过持续释放***施用。持续释放组合物的合适实例包括处于成形制品，例如，膜或微胶囊形式的半渗透聚合物基质。持续释放基质包括聚乳酸(美国专利第3,773,919号，EP 58,481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman,U.等人，Biopolymers 22:547-556(1983))、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)(R.Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.15:167-277(1981)和R.Langer,Chem.Tech.12:98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(R.Langer等人，同上)或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。持续释放的药物组合物还包括脂质体包埋的化合物。含有药物组合物的脂质体通过本身已知的方法制备：DE 3,218,121；Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82:3688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)77:4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本专利申请83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；以及EP 102,324。通常，脂质体为小的(约200-800埃)单层类型，其中脂质含量大于约30mol％的胆固醇，调整所选择的比例用于最佳治疗。
对于肠胃外施用，药物组合物通常通过将其在期望的纯度下，与药学可接受的载体(即在采用的剂量和浓度下对接受者无毒且与制剂的其它成分相容的载体)混合成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液或乳状液)来配制。
通常，通过使药物组合物的组分与液体载体或细粒固体载体或两者均匀地和紧密地接触来制备制剂。然后，如果需要，使产品成形为期望的制剂。优选地，载体为肠胃外载体，更优选与接受者的血液等渗的溶液。此类载体媒介物的实例包括水、盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。非水性媒介物，如固定油和油酸乙酯，以及脂质体也可用于本文。载体适当地含有少量的添加剂，如增强等渗性和化学稳定性的物质。此类材料在使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸和其它有机酸或它们的盐；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量(少于约十个残基)(聚)肽，例如，聚精氨酸或三肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨醇；抗衡离子，如钠；和/或非离子型表面活性剂，如聚山梨醇酯、泊洛沙姆或PEG。
用于治疗施用的药物组合物的组分必须是无菌的。通过无菌过滤膜(例如，0.2微米膜)过滤容易地实现无菌性。药物组合物的治疗组分通常置于具有无菌进入口的容器，例如，具有通过皮下注射针可刺破的塞子的静脉内溶液袋或小瓶中。
药物组合物的组分通常被作为水溶液或作为用于复水的冻干制剂储存在单位或多剂量容器，例如，密封的安瓿瓶或小瓶中。作为冻干制剂的实例，用5ml无菌过滤的1％(w/v)水溶液填充10-ml小瓶，并冻干所得混合物。通过使用抑菌注射用水使冻干的化合物复水来制备输注溶液。
本发明还涉及包含如本文所限定的突变的脑信号蛋白3或其功能片段、融合蛋白、核酸分子、抗体和/或药物组合物的试剂盒。此类试剂盒可以用于，例如，治疗癌症、肿瘤和/或肿瘤性疾病，其中所述肿瘤、癌症、肿瘤性疾病为实体瘤，尤其为胰腺肿瘤/癌。
根据本发明，术语“核酸分子”包含编码序列，和在适用情况下，非编码序列(如启动子、增强子等)。
术语“多肽”、“(多)肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，并且是指经由一个氨基酸的氨基与另一氨基酸的羧基之间形成的酰胺键连接的两个或更多个氨基酸的聚合物。肽或蛋白质中包含的氨基酸(其也被称为氨基酸残基)可以选自20种标准蛋白原性α-氨基酸(即，Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val)，而且还选自非蛋白原性和/或非标准α-氨基酸(如，例如，鸟氨酸、瓜氨酸、高赖氨酸、吡咯赖氨酸、或4-羟脯氨酸)以及β-氨基酸(例如，β-丙氨酸)、γ-氨基酸和δ-氨基酸。优选地，肽或蛋白质中包含的氨基酸残基选自α-氨基酸，更优选选自20种标准蛋白原性α-氨基酸(其可以以L-异构体或D-异构体存在，并且优选全部以L-异构体存在)。肽或蛋白质在例如其N-端、其C-端和/或其氨基酸残基的任一个的侧链中的官能团(特别是在Lys、His、Ser、Thr、Tyr、Cys、Asp、Glu和/或Arg残基中的一个或多个的侧链官能团)可以为未修饰的或可以为修饰的。此类修饰可以包括，例如，针对相应官能团在Wuts PG&Greene TW,Greene’s protective groups in organic synthesis,John Wiley&Sons,2006中所述的任何保护基团的连接。此类修饰还可以包括一个或多个聚乙二醇(PEG)链的共价连接(形成聚乙二醇化肽或蛋白质)、糖基化和/或用一种或多种脂肪酸的酰化(例如，一种或多种C8-30链烷酸或烯酸；形成脂肪酸酰化肽或蛋白质)。肽或蛋白质中包含的氨基酸残基可以，例如，作为线性分子链存在(形成线性肽或蛋白质)，或可以形成一个或多个环(对应于环肽或蛋白质)。肽或蛋白质也可以形成来自由两个或更多个相同或不同分子组成的寡聚物。如本文所用，术语“结构域”涉及能够自主采用特定结构和/或功能的氨基酸序列的任何区域/部分。因此，在本发明的上下文中，“结构域”可以代表功能结构域或结构结构域。
术语“共有序列”或“共有序列基序”为在序列比对的各个位置发现的最常见残基(核苷酸或氨基酸)的计算顺序。其代表多个序列比对的结果，其中将相关序列彼此比较并且计算相似的序列基序。
如本文所用，术语“包含(comprising)”和“包括(including)”或它们的语法变型应被认为是指定所述特征、整数、步骤或组分，但不排除一个或多个额外的特征、整数、步骤、组分或它们的组的添加。该术语涵盖术语“由……组成”和“基本上由……组成”。
因此，术语“包含(comprising)”/“包括(including)”/“具有(having)”意为能够/可以存在任何另外的组分(或同样的特征、整数、步骤等)。
术语“由……组成”意为不存在另外的组分(或同样的特征、整数、步骤等)。
术语“基本上由……组成”或其语法变型在本文使用时，被认为是指定所述特征、整数、步骤或组分，但不排除一个或多个额外的特征、整数、步骤、组分或它们的组的添加，但前提是额外的特征、整数、步骤、组分或它们的组不会实质上改变要求保护的组合物、装置或方法的基本和新的特征。
因此，术语“基本上由……组成”意为可以存在那些特定的其它组分(或同样的特征、整数、步骤等)，即不会实质上影响组合物、装置或方法的本质特征的那些。换言之，术语“基本上由……组成”(其在本文中可以与术语“基本上包含”互换使用)允许除了强制性组分(或同样的特征、整数、步骤等)之外在组合物、装置或方法中还存在其它组分，条件是装置或方法的本质特征不会在实质上受其它组分的存在的影响。
术语“方法”是指完成给定任务的方式、手段、技术和程序，其包括但不限于化学、生物和生物物理学的从业者已知的或化学、生物和生物物理学的从业者由已知的方式、手段、技术和程序容易开发的方式、手段、技术和程序。
术语“约”优选指指示的数值的±10％，更优选指示的数值的±5％，具体指指示的精确数值。
如本文所用，术语“约”是指指示的数值的±10％，尤其指指示的数值的±5％。每当使用术语“约”时，也都包括具体提及指示的精确数值。如果术语“约”与以整数定量的参数(如给定核酸中核苷酸的数目)一起使用，则对应于指示数值的±10％或±5％的数值应四舍五入至最接近的整数。例如，表述“约25个核苷酸”是指23至28个核苷酸的范围，特别是24至26个核苷酸的范围，并且优选指25个核苷酸的具体值。
通过参考下述非限制性附图和实施例进一步描述本发明。除非另有说明，否则如，例如，Sambrook,Russell"Molecular Cloning,A Laboratory Manual",Cold SpringHarbor Laboratory,N.Y.(2001)(将其通过引用整体并入本文)中所述使用建立的重组基因技术的方法。
如本文所用，术语“分离的”是指已经从其体内位置移除的组合物。优选地，本发明的分离的组合物或化合物基本上不含在其体内位置存在的其它物质(例如，其它蛋白质或其它化合物)(即纯化的或半纯化的组合物或化合物)。
给定的定义和解释也适用于这些项目并且加上必要的变更适用。根据上文，本发明在某些实施方案中涉及下述项目。
1.核酸分子，其编码包含作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3或其功能片段的氨基酸序列的多肽，其中对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸或者位于其它脑信号蛋白3蛋白中通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的丙氨酸被亲水氨基酸取代，其中所述脑信号蛋白3选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D。
2.如项目1所述的核酸分子，其中所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段作为血管生成的抑制剂发挥功能。
3.如项目1或2所述的核酸分子，其中所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段包含氨基酸序列CX1X2A3GKD，其中
X1是K或N，
X2是选自W、M和L的氨基酸，
并且其中丙氨酸(A3)被所述亲水氨基酸取代。
4.如项目1至3中任一项所述的核酸分子，其选自：
(a)核酸分子，其选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:13，
其中位于SEQ ID NO:1 631至633位的核苷酸GCT被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，
其中位于SEQ ID NO:5 559至561位的核苷酸GCA被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，
其中位于SEQ ID NO:9 872至874位的核苷酸GCT被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，以及
其中位于SEQ ID NO:13 398至400位的核苷酸GCC被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代；
(b)核酸分子，其编码选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:14的多肽，其中位于SEQ ID NO:2 106位、位于SEQ ID NO:6 105位、位于SEQ ID NO:10104位或者位于SEQ ID NO:14120位的丙氨酸残基被所述亲水氨基酸取代；
(c)核酸分子，其在严紧条件下与如(a)或(b)所限定的核酸分子的互补链杂交；
(d)核酸分子，其编码作为血管生成的抑制剂发挥功能，并与(b)中提及的任一多肽具有至少55％的同一性的多肽；以及
(e)核酸分子，其与(a)至(d)中任一项所限定的核酸分子的核苷酸序列是由于遗传密码而简并的，其中简并的核酸分子编码作为血管生成的抑制剂发挥功能的多肽。
5.如项目1至4中任一项所述的核酸分子，其中所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段包含位于SEQ ID NO:2 106位、位于SEQ ID NO:6 105位，位于SEQ ID NO:10 104位或者位于SEQ ID NO:14 120位的所述亲水氨基酸。
6.如项目1至5中任一项所述的核酸分子，其中所述突变的脑信号蛋白3或其功能片段包含至少一种选自氨基酸置换、添加、缺失和重复的另外的突变。
7.如项目1至6中任一项所述的核酸分子，其中所述亲水氨基酸选自K、R、N、Q、S、T、E、D和H。
8.如项目7所述的核酸分子，其中所述亲水氨基酸选自K、R、E、D和H。
9.如项目7所述的核酸分子，其中所述亲水氨基酸残基是K或R。
10.如项目7所述的核酸分子，其中所述亲水氨基酸残基是K。
11.如项目1至10中任一项所述的核酸分子，其中K由密码子AAG或AAA编码。
12.如项目1至11中任一项所述的核酸分子，其中所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段是突变的人或小鼠脑信号蛋白3或其功能片段。
13.如项目1至12中任一项所述的核酸分子，其中所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段包含下述任一项所限定的序列的一种或多种：SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47以及SEQ ID NO:48。
14.如项目1至13中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含：
(a)SEQ ID NO:1 601至1206位的核苷酸，其中位于SEQ ID NO:1 631至633位的核苷酸GCT被编码亲水氨基酸的核苷酸取代；
(b)SEQ ID NO:5 529至1137位的核苷酸，其中位于SEQ ID NO:5 559至561位的核苷酸GCA被编码亲水氨基酸的核苷酸取代；
(c)SEQ ID NO:9 842至1444位的核苷酸，其中位于SEQ ID NO:9 872至874位的核苷酸GCT被编码亲水氨基酸的核苷酸取代；或者
(d)SEQ ID NO:13 368至982位的核苷酸，其中位于SEQ ID NO:13 398至400位的核苷酸GCC被编码亲水氨基酸的核苷酸取代。
15.如项目1至14中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO:57601至1206位的核苷酸；SEQ ID NO:61 529至1137位的核苷酸；SEQ ID NO:65 842至1444位的核苷酸；或者SEQ ID NO:69 368至982位的核苷酸。
16.如项目1至15中任一项所述的核酸分子，其中所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段包含如下所示的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO:21，其中对应于SEQ ID NO:2 106位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；
(b)SEQ ID NO:22，其中对应于SEQ ID NO:6 105位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；
(c)SEQ ID NO:23，其中对应于SEQ ID NO:10 104位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；或者
(d)SEQ ID NO:24，其中对应于SEQ ID NO:14 120位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代。
17.如项目1至16中任一项所述的核酸分子，其中所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段包含选自SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52的氨基酸序列。
18.如项目1至17中任一项所述的核酸分子，其中所述多肽是融合蛋白。
19.如项目18所述的核酸分子，其中所述多肽包含所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段、稳定子结构域和/或二聚化结构域。
20.如项目18或19所述的核酸分子，其中所述稳定子结构域是丛状蛋白脑信号蛋白整合蛋白(PSI)结构域，其中所述PSI结构域包含下述序列中的一种或多种：SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48。
21.如项目18至20中任一项所述的核酸分子，其中所述二聚化结构域与另一此类二聚化结构域的解离常数KD的范围为10-5M至10-6M。
22.如项目18至21中任一项所述的核酸分子，其中所述二聚化结构域选自C-末端IgG恒定结构域、DARPin和亮氨酸拉链。
23.如项目22所述的核酸分子，其中所述IgG恒定结构域是IgG1或IgG3。
24.如项目1至23中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含具有下述核酸序列的核酸序列：
(a)跨越SEQ ID NO:1核苷酸316至1959的核酸序列和跨越SEQ ID NO:37核苷酸295至990的核酸序列，其中位于SEQ ID NO:1 631至633位的核苷酸GCT被编码亲水氨基酸的核苷酸取代；
(b)跨越SEQ ID NO:5核苷酸247至1887的核酸序列和跨越SEQ ID NO:37核苷酸295至990的核酸序列，其中位于SEQ ID NO:5 559至561位的核苷酸GCA被编码亲水氨基酸的核苷酸取代；
(c)跨越SEQ ID NO:9核苷酸563至2197的核酸序列和跨越SEQ ID NO:37核苷酸295至990的核酸序列，其中位于SEQ ID NO:9 872至874位的核苷酸GCT被编码亲水氨基酸的核苷酸取代；或者
(d)跨越SEQ ID NO:13核苷酸41至1735的核酸序列和跨越SEQ ID NO:37核苷酸295至990的核酸序列，其中位于SEQ ID NO:13 398至400位的核苷酸GCC被编码亲水氨基酸的核苷酸取代。
25.如项目1至24中任一项所述的核酸分子，其中所述多肽包含下述氨基酸序列：
(a)跨越SEQ ID NO:2氨基酸残基1至548的氨基酸序列和如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，其中位于SEQ ID NO:2的106位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；
(b)跨越SEQ ID NO:6氨基酸残基1至547的氨基酸序列和如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，其中位于SEQ ID NO:6的105位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；
(c)跨越SEQ ID NO:10氨基酸残基1至565的氨基酸序列和如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，其中位于SEQ ID NO:10的104位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；或者
(d)跨越SEQ ID NO:14氨基酸残基1至545的氨基酸序列和如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，其中位于SEQ ID NO:14的120位的丙氨酸残基被所述亲水氨基酸取代。
26.载体，其包含项目1至25中任一项所述的核酸分子。
27.如项目26所述的载体，其中所述载体是基因打靶载体或基因转移载体。
28.如项目26或27所述的载体，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。
29.如项目26至28中任一项所述的载体，其中所述腺相关病毒是AAV8载体。
30.宿主，其转化有项目26至29中任一项所述的载体，或者包含项目1至22所述的核酸分子。
31.如项目30所述的宿主，其是哺乳动物细胞。
32.如项目30或31所述的宿主，其中所述哺乳动物细胞是HEK细胞。
33.如项目30至32中任一项所述的宿主，其中所述HEK细胞是HEK293-EBNA1或HEK293E细胞。
34.产生由项目1至25中任一项所述的核酸分子编码的所述多肽、所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段的方法，所述方法包括培养/饲养项目30至33中任一项所述的宿主，并且任选地分离产生的多肽。
35.多肽，其由项目1至25中任一项所述的核酸分子编码。
36.突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中作为血管生成的抑制剂发挥功能的所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段包含氨基酸序列，其中对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸或者位于其它脑信号蛋白3中通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的丙氨酸被亲水氨基酸取代，其中所述脑信号蛋白3选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D。
37.如项目36所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段作为血管生成的抑制剂发挥功能。
38.如项目36至37中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段包含氨基酸序列CX1X2A3GKD，其中
X1是K或N，
X2是选自W、M和L的氨基酸，
并且其中丙氨酸(A3)被所述亲水氨基酸取代。
39.如项目36至38中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述突变的脑信号蛋白3选自：
(a)多肽，其由选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:13的核酸分子编码，
其中位于SEQ ID NO:1 631至633位的核苷酸GCT被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，
其中位于SEQ ID NO:5 559至561位的核苷酸GCA被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，
其中位于SEQ ID NO:9 872至874位的核苷酸GCT被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，以及
其中位于SEQ ID NO:13 398至400的核苷酸GCC被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代；
(b)多肽，其选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:14，其中对应于SEQ ID NO:2 106位、对应于SEQ ID NO:6 105位、对应于SEQ ID NO:10 104位或者对应于SEQ ID NO:14 120位的丙氨酸残基被所述亲水氨基酸取代；
(c)多肽，其由在严紧条件下与如(a)或(c)中所限定的核酸分子的互补连杂交的核酸分子编码；
(d)多肽，其与(a)至(d)中任一项的多肽具有至少55％的同一性，并作为血管生成的抑制剂发挥功能；以及
(e)多肽，其作为血管生成的抑制剂发挥功能，并包含由与如(a)、(c)和(d)中任一项所限定的核酸分子的核苷酸序列是由于遗传密码而简并的核酸分子编码的氨基酸序列。
40.如项目36至39中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段包含位于SEQ ID NO:2 106位、位于SEQ ID NO:6 105位、位于SEQ ID NO:10 104位或者位于SEQ ID NO:14 120位的所述亲水氨基酸。
41.如项目36至40中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述突变的脑信号蛋白3或其功能片段包含至少一种选自氨基酸置换、添加、缺失和重复的另外的突变。
42.如项目36至41中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述亲水氨基酸选自K、R、N、Q、S、T、E、D和H。
43.如项目42所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述亲水氨基酸选自K、R、E、D和H。
44.如项目42所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述亲水氨基酸是K或R。
45.如项目42所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述亲水氨基酸是K。
46.如项目36至45中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段是突变的人或小鼠脑信号蛋白3或其功能片段。
47.如项目36至46中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段36，其中所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段包含下述任一项所限定的序列中的一种或多种：SEQID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48。
48.如项目36至47中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段由包含下述的核酸分子编码：
(a)SEQ ID NO:1 601至1206位的核苷酸，其中位于SEQ ID NO:1631至633位的核苷酸GCT被编码亲水氨基酸的核苷酸取代；
(b)SEQ ID NO:5 529至1137位的核苷酸，其中位于SEQ ID NO:5559至561位的核苷酸GCA被编码亲水氨基酸的核苷酸取代；
(c)SEQ ID NO:9 842至1444位的核苷酸，其中位于SEQ ID NO:9872至874位的核苷酸GCT被编码亲水氨基酸的核苷酸取代；或者
(d)SEQ ID NO:13 368至982位的核苷酸，其中位于SEQ ID NO:13398至400位的核苷酸GCC被编码亲水氨基酸的核苷酸取代。
49.如项目36至48中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段由包含下述核苷酸的核酸分子编码：SEQ ID NO:57601至1206位的核苷酸；SEQ ID NO:61529至1137位的核苷酸；SEQ ID NO:65 842至1444位的核苷酸；或者SEQ ID NO:69 368至982位的核苷酸。
50.如项目36至49中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段包含如下所示的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO:21，其中对应于SEQ ID NO:2 106位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；
(b)SEQ ID NO:22，其中对应于SEQ ID NO:6 105位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；
(c)SEQ ID NO:23，其中对应于SEQ ID NO:10 104位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；或者
(d)SEQ ID NO:24，其中对应于SEQ ID NO:14 120位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代。
51.如项目36至50中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段包含选自SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52的氨基酸序列。
52.多肽，其中所述多肽包含项目36至51中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段.
53.如项目52所述的多肽，其中所述多肽是融合蛋白。
54.如项目52或53所述的多肽，其中所述多肽包含所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段、稳定子结构域和/或二聚化结构域。
55.如项目52至54中任一项所述的多肽，其中所述稳定子结构域是丛状蛋白脑信号蛋白整合蛋白(PSI)结构域，其中所述PSI结构域包含下述序列中的一种或多种：SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48。
56.如项目52至55中任一项所述的多肽，其中所述二聚化结构域与另一此类二聚化结构域的解离常数KD的范围是10-5M至10-6M。
57.如项目52至56中任一项所述的多肽，其中所述二聚化结构域选自C-末端IgG恒定结构域、DARPin和亮氨酸拉链。
58.如项目57所述的多肽，其中所述IgG恒定结构域是IgG1或IgG3。
59.如项目52至58中任一项所述的多肽，其中所述多肽由包含含有下述核酸序列的核酸序列的核酸分子编码：
(a)跨越SEQ ID NO:1核苷酸316至1959的核酸序列和跨越SEQ ID NO:37核苷酸295至990的核酸序列，其中位于SEQ ID NO:1 631至633位的核苷酸GCT被编码亲水氨基酸的核苷酸取代；
(b)跨越SEQ ID NO:5核苷酸247至1887的核酸序列和跨越SEQ ID NO:37核苷酸295至990的核酸序列，其中位于SEQ ID NO:5 559至561位的核苷酸GCA被编码亲水氨基酸的核苷酸取代；
(c)跨越SEQ ID NO:9核苷酸563至2197的核酸序列和跨越SEQ ID NO:37核苷酸295至990的核酸序列，其中位于SEQ ID NO:9 872至874位的核苷酸GCT被编码亲水氨基酸的核苷酸取代；或者
(d)跨越SEQ ID NO:13核苷酸41至1735的核酸序列和跨越SEQ ID NO:37核苷酸295至990的核酸序列，其中位于SEQ ID NO:13 398至400位的核苷酸GCC被编码亲水氨基酸的核苷酸取代。
60.如项目52至59中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含下述氨基酸序列：
(a)跨越SEQ ID NO:2氨基酸残基1至548的氨基酸序列和如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，其中位于SEQ ID NO:2 106位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；
(b)跨越SEQ ID NO:6氨基酸残基1至547的氨基酸序列和如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，其中位于SEQ ID NO:6 105位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；
(c)跨越SEQ ID NO:10氨基酸残基1至565的氨基酸序列和如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，其中位于SEQ ID NO:10 104位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；或者
(d)跨越SEQ ID NO:14氨基酸残基1至545的氨基酸序列和如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，其中位于SEQ ID NO:14 120位的丙氨酸残基被所述亲水氨基酸取代。
61.抗体，其特异性结合项目36至51中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述抗体特异性结合表位，所述表位包含取代对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸或者位于其它脑信号蛋白3蛋白中通过同源性比较对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的位点的丙氨酸的亲水氨基酸，其中所述脑信号蛋白3选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D。
62.药物组合物，其包含项目1至25中任一项所述的核酸分子或者项目36至51中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段或者项目52至60中任一项所述的多肽，其任选地包含药物赋形剂。
63.如项目62所述的药物组合物，其中所述组合物包含项目36至51中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段或者项目52至60中任一项所述的多肽，其任选地包含药物赋形剂。
64.如项目62或63所述的药物组合物，其中所述药物赋形剂是药物载体，其为病毒。
65.如项目62至64中任一项所述的药物组合物，其中所述病毒是腺相关病毒(AAV)。
66.如项目62至65中任一项所述的药物组合物，其中所述腺相关病毒是AAV8。
67.项目1至25中任一项所述的核酸分子，项目26至29中任一项所述的载体，项目36至51中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，项目52至60中任一项所述的多肽或者项目62至66中任一项所述的药物组合物，其用作药物。
68.项目1至25中任一项所述的核酸分子，如26至29中任一项所述的载体，项目36至51中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，项目52至60中任一项所述的多肽或者项目62至66中任一项所述的药物组合物，其应用于下述疾病的治疗：血管生成性病症、癌症、肿瘤、肿瘤性疾病、血管性视网膜病、血脑屏障通透性改变、神经炎性病症、骨质疏松症、肥胖症、分枝杆菌感染和/或肉芽肿。
69.如项目68所述应用的项目1至25中任一项所述的核酸分子，项目68所述应用的项目26至29中任一项所述的载体，项目68所述应用的项目36至51中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，项目68所述应用的项目52至60中任一项所述的多肽或者项目68所述应用的项目62至66中任一项所述的药物组合物，其中所述肿瘤是实体瘤。
70.如项目68或69所述的应用的项目1至25中任一项所述的核酸分子，项目68或69所述的应用的项目26至29中任一项所述的载体，项目68或69所述的应用的项目36至51中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，项目68或69所述的应用的项目52至60中任一项所述的多肽或者项目68或69所述的应用的项目62至66中任一项所述的药物组合物，其中所述肿瘤是胰腺肿瘤。
71.如项目68至70中任一项所述应用的项目1至25中任一项所述的核酸分子，项目68至70中任一项所述应用的项目26至29中任一项所述的载体，项目68至70中任一项所述应用的项目36至51中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，项目68至70中任一项所述应用的项目52至60中任一项所述的多肽或者项目68至70中任一项所述应用的项目62至66中任一项所述的药物组合物，其中所述癌症选自胰腺癌、***、乳腺癌、结肠癌、黑素瘤、***癌、膀胱癌和舌癌。
72.如项目68至71中任一项所述应用的项目1至25中任一项所述的核酸分子，项目68至71中任一项所述应用的项目26至29中任一项所述的载体，项目68至71中任一项所述应用的项目36至51中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，项目68至71中任一项所述应用的项目52至60中任一项所述的多肽或者项目68至71中任一项所述应用的项目62至66中任一项所述的药物组合物，其中涉及血管正常化、肿瘤生长的降低、转移降低或存活延长。
73.如项目68至72中任一项所述应用的项目1至25中任一项所述的核酸分子，项目68至72中任一项所述应用的项目26至29中任一项所述的载体，项目68至72中任一项所述应用的项目36至51中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，项目68至72中任一项所述应用的项目52至60中任一项所述的多肽或者项目68至72中任一项所述应用的项目62至66中任一项所述的药物组合物，其中将所述核酸分子、所述载体、所述突变的脑信号蛋白3、所述其功能片段、所述多肽或所述药物组合物与抗增殖药物、抗癌药物、细胞抑制药物、细胞毒性药物和/或放射疗法组合施用。
74.如项目68至72中任一项所述应用的项目1至25中任一项所述的核酸分子，项目68所述应用的项目26至29中任一项所述的载体，项目68至72中任一项所述应用的项目36至51中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，项目68至72中任一项所述应用的项目52至60中任一项所述的多肽或者项目68至72中任一项所述应用的项目62至66中任一项所述的药物组合物，其中所述核酸分子、所述载体、所述突变的脑信号蛋白3、所述其功能片段、所述多肽或所述药物组合物将经肠胃外施用。
75.由项目1至25中任一项所述的核酸分子编码的突变的脑信号蛋白3或其功能片段或者项目36至51中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段或者项目52至60中任一项所述的多肽或者项目30至33中任一项所述的宿主的用途。
76.治疗血管生成性病症、肿瘤性疾病和/或癌症的方法，其包括下述步骤：向需要此类治疗的对象施用药物有效量的项目1至23中任一项所述的核酸分子或者项目36至51中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，项目52至60中任一项所述的多肽，项目62至68中任一项所述的药物组合物或者通过项目34所述的方法产生的多肽、突变的脑信号蛋白3或其功能片段。
77.如项目76所述的方法，其中所述对象是人。
78.如项目76或77所述的方法，其中所述药物有效量的范围是0.5至10mg/kg体重。
通过参考下述非限制性附图和实施例进一步描述本发明。
除非另有说明，否则如，例如，Sambrook,Russell"Molecular Cloning,ALaboratory Manual",Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(2001)(将其通过引用整体并入本文)中所述使用建立的重组基因技术的方法。
附图显示：
图1.Sema3A-Nrp1-丛状蛋白A4信号转导复合物。Sema3A的特征在于在其NH2-末端存在sema结构域，随后是PSI结构域、Ig样结构域和另外的短的C端碱性区段(b)。Nrp1的细胞外部分含有两个重复的补体结合结构域(a1-a2结构域)、两个凝血因子样结构域(b1-b2结构域)和近膜穿膜肽酶(meprin)/A5/mu-磷酸酶(MAM；c)同源性结构域。丛状蛋白A4的特征在于细胞外sema结构域，随后是多个PSI和整合蛋白-丛状蛋白-转录因子(IPT)结构域，而细胞内显示半***的GAP结构域。Sema3A的C端碱性区段以高亲和力(黑色边缘双向箭头)结合Nrp1的b1结构域，其充当保持二聚Sema3A接近丛状蛋白A4的共受体。在不受理论束缚的情况下，Sema3A被认为经由非常低的亲和力的sema结构域-sema结构域相互作用(灰色边缘双向箭头)驱动丛状蛋白A4二聚化和激活，这导致R-Ras和Rap1GTP-负载的抑制以及ERK1/2的磷酸化。
图2.Sema3A蛋白构建体的图示。描述了Sema3A突变体的代表：(A)在具有或没有额外的PSI结构域或能够稳定功能性sema结构域的功能的结构域(稳定子结构域)的情况下，包含A106K突变的Sema3A结构域；(B)Sema3A A106K ΔIg-b；(C)Sema3A ΔIg-b，和(D)全长SEMA3A WT(R&D Systems)。
图3.小鼠Sema3A、Sema3B、Sema3C、Sema3D、Sema3E、Sema3F和Sema3G的氨基酸序列的比对。小鼠Sema3A、Sema3B、Sema3C、Sema3D、Sema3E、Sema3F和Sema3G以及人SEMA3A、SEMA3B、SEMA3C和SEMA3D的蛋白质序列均以单字母氨基酸密码描述。(A)CX1X2A3GKD肽基序突出显示(粗体)。(B)以粗体突出显示三个共有序列基序，其预测允许sema结构域与丛状蛋白的sema结构域的强烈的相互作用。(C)在PSI结构域中以粗体突出显示一个共有序列基序。保守性用ClustalW共有符号表示：星号(*)表示具有单个完全保守残基的位置；冒号(:)表示在具有强相似性质的组(-在Gonnet PAM 250矩阵中评分>0.5)之间的保守性；句号(.)表示在具有弱相似性质的组(-在Gonnet PAM 250矩阵中评分＝<0.5)之间的保守性。
图4.脑信号蛋白3和突变的脑信号蛋白3蛋白与A型丛状蛋白和Nrp1受体的分析。(A)将碱性磷酸酶(AP)和全长Sema3A WT、突变体Sema3A ΔIg-b或突变体Sema3A A106K ΔIg-b的cDNA融合以产生相应的AP缀合的Sema3A配体。在原位结合分析中，用不同的候选受体转染COS-7细胞。通过磷酸酶底物氮蓝四唑显示配体与表达特异性受体的细胞的结合。(B-D)通过AP底物对硝基苯基磷酸酯的显色转化的光谱测定独立地定量在不同浓度的配体(B，C，Sema3A A106K ΔIg-b；D，Sema3A WT)下丛状蛋白A4(B，C)或Nrp1(D)结合的结合曲线(B，D)和斯卡查德分析(C)。(E)Sema3A WT、Sema3A ΔIg-b和Sema3A A106K ΔIg-b与丛状蛋白A4受体的估计的亲和力。通过AP底物对硝基苯基磷酸酯的显色转化的光谱测定独立地定量AP缀合的Sema3A WT、突变体Sema3A ΔIg-b或突变体Sema3A A106K ΔIg-b与表达丛状蛋白A4受体的COS-7细胞的配体结合曲线。Sema3A WT、突变体Sema3A ΔIg-b或突变体Sema3A A106K ΔIg-b与丛状蛋白A4的结合分别显示7nM、200nM和0.7nM的估计的Kd。(F).在原位结合分析中，用不同的A型丛状蛋白受体或绿色荧光蛋白(模拟)(用于对照目的)转染COS-7细胞。通过碱性磷酸酶(AP)缀合的山羊抗人IgG Fc二抗在免疫细胞化学中显示人Fc-标记的SEMA3B ΔIg-b、SEMA3B A105K ΔIg-b和SEMA3A A106K ΔIg-b与表达不同的A型丛状蛋白受体的细胞的结合。将氯化硝基四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3'-吲哚基磷酸酯对甲苯胺盐(BCIP)的组合用作AP底物以在AP缀合的山羊抗人IgG Fc二抗结合人Fc标记的重组SEMA3蛋白的位置处产生不溶的黑紫色产物。
图5.Fc-标记的Sema3A ΔIg-b和Sema3A A106K ΔIg-b重组蛋白的纯化。在人HEK293细胞中制备蛋白质，将其从蛋白A-琼脂糖上的上清液中纯化，洗脱并在非还原或还原条件下通过NuPAGE 4-12％凝胶分析。泳道：1)分子量标记；2)Fc-标记的Sema3A ΔIg-b细胞培养基；3)未结合的蛋白A；4)Fc-标记的Sema3A ΔIg-b级分1；5)Fc-标记的Sema3A ΔIg-b级分2；6)Fc-标记的Sema3A ΔIg-b级分3；7)Fc-标记的Sema3A A106KΔIg-b细胞培养基；8)未结合的蛋白A；9)Fc-标记的Sema3A A106K ΔIg-b级分1；10)Fc-标记的Sema3A A106KΔIg-b级分2；11)Fc-标记的Sema3A A106K ΔIg-b级分3；12)Fc-标记的Sema3A ΔIg-b，合并的级分1、2和3；13)Fc-标记的Sema3A ΔIg-b，合并的级分1、2和3(还原的)；14)Fc-标记的Sema3A A106K ΔIg-b，合并的级分1、2和3；15)Fc-标记的Sema3A A106K ΔIg-b，合并的级分1、2和3(还原的)。在非还原条件下，Fc-标记的Sema3A ΔIg-b和Fc-标记的Sema3AA106K ΔIg-b都显示为约200kDa二聚体而没有降解产物。
图6.Fc-标记的Sema3A A106K ΔIg-b在抑制EC定向迁移中比市售的Fc-标记的SEMA3A WT更有效。通过实时分析来分析EC向I型胶原蛋白(1μg/ml)的定向迁移。(A-C)在xCELLigence***平台的CIM-Plates 16中，在不存在(对照，黑色实线)或存在0.2nM(A)、0.9nM(B)和3.5nM(C)Fc-标记的SEMA3A WT(灰色实线)或Fc-标记的Sema3A ΔIg-b(黑色点线)或Fc-标记的Sema3A A106K ΔIg-b(黑色虚线)下，在4小时长的时段内追踪EC的迁移。每条曲线为四个技术性重复的平均值±SD。统计学分析：通过双尾异方差学生t检验分析结果；*Fc-标记的Sema3A A106K ΔIg-b相对于Fc-标记的SEMA3A WT；#Fc-标记的Sema3AA106K ΔIg-b相对于Fc-标记的Sema3A ΔIg-b；*，#p<0.05，**，##p<0.01，***，###p<0.001。(D，E)在不存在(对照，黑色实线)或存在1.8nM Fc-标记的Sema3A A106K ΔIg-b(黑色虚线)下，将对照沉默的(D)或丛状蛋白A4沉默的(E)EC在2个半小时长的时段内静置迁移；*，p<0.05；**，p<0.01；***p<0.001。
图7.人Fc-标记的SEMA3A A106K ΔIg-b蛋白在抑制EC定向迁移中比市售的Fc-标记的SEMA3A WT更有效。通过实时分析来分析EC向I型胶原蛋白(1μg/ml)的定向迁移。在xCELLigence***平台的CIM-Plates 16中，在不存在(对照，黑色实线)或存在(A)等摩尔(0.9nM)量的商购的Fc-标记的SEMA3A WT(灰色实线)或Fc-标记的人SEMA3A A106K ΔIg-b(黑色虚线)；(B)3,5nM商业的Fc-标记的SEMA3A WT(灰色实线)或0.2nM Fc-标记的人SEMA3A A106K ΔIg-b(黑色虚线)下，在4小时长的时段内追踪EC的迁移。每条曲线为四个技术性重复的平均值±SD。统计学分析：通过双尾异方差学生t检验分析结果；*Fc-标记的SEMA3A A106K ΔIg-b相对于Fc-标记的SEMA3A WT；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
图8.Fc-标记的Sema3A A106K ΔIg-b蛋白在引发EC的生物化学信号转导中比市售的Fc-标记的SEMA3A WT更有效。(A)用0.02nM Fc-标记的SEMA3A WT、Sema3A ΔIg-b或Sema3A A106K ΔIg-b处理1分钟或未经处理的EC中，活性Rap1GTP的下拉分析(pull-downassay)。在输入部分检测到的总的Rap1被用于计算活性Rap1的归一化光密度(N.O.D.)。(B)用0.2nM Fc-标记的SEMA3A WT或Sema3A ΔIg-b或Sema3A A106K ΔIg-b处理15分钟或未经处理的EC中，激活的磷酸化-ERK1/2的蛋白质印迹分析。总ERK1/2的蛋白质印迹分析被用于计算活性ERK 1/2的N.O.D.。显示了具有相似结果的三个独立分析的代表。定量条带，并相对于对照计算N.O.D.(数值为平均值±SD；n＝3个单独的分析)。统计学分析：通过双尾异方差学生t检验分析结果；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图9.Sema3A A106K ΔIg-b损害RIP-Tag2小鼠的血管生成并使其癌症脉管***正常化。如图所示，将对照和Sema3A A106K ΔIg-b-处理的癌症组织的免疫荧光分析进行染色。共聚焦图像代表每组7只小鼠，并且每种癌症五个视野。(A)抗-Meca32Ab(绿色)用于对血管EC进行染色。Sema3A A106K ΔIg-b显著降低51％的血管面积。(B)抗-α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)与抗-Meca32(绿色)一起用于检测周细胞(红色)。Sema3A A106K ΔIg-b使血管周细胞强烈地增加。(C)用FITC-凝集素(绿色)心脏灌注对照和Sema3A A106K ΔIg-b-处理的小鼠，然后用抗-Meca32Ab(红色)对癌症组织进行染色。当对照癌症显示出差的灌注脉管***时，Sema3A A106K ΔIg-b增强癌血管的灌注。(D)Sema3A A106K ΔIg-b有效地抑制癌缺氧，其通过在用哌莫硝唑处死之前注射小鼠检测到(Maione等人，2012)。
图10.AAV8-全长SEMA3A WT在PDAC小鼠模型中抑制癌症生长和转移形成。如先前所述(Maione等人，2009,2012)，通过AAV-8-介导的体细胞基因转移，将全长SEMA3A WT转导至PDAC小鼠的胰腺中。将AAV8-LacZ作为对照进行转导。在SEMA3A WT基因治疗三周之后，处死小鼠并对其进行分析。AAV8-SEMA3A WT抑制52％的癌症体积(A)，并且使肝脏转移发生率降低59％(B)。每组小鼠的数目(n＝10)。统计学分析：使用曼-惠特尼U检验，**p<0.01。
图11.Sema3A A106K ΔIg-b在PDAC小鼠模型中抑制癌症生长、损害转移形成和增加周细胞的血管覆盖率。(A,B)用3mg/kg(i.p.)Sema3A A106K ΔIg-b处理具有癌症的PDAC小鼠三周。Sema3A A106K ΔIg-b缩小64％的癌症体积(A)，并抑制81％的肝脏转移发生率(B)；每组小鼠的数目(n＝10)；统计学分析：使用曼-惠特尼U检验，**p<0.01,***p<0.001。(C)用抗-NG2(红色，以标记周细胞)和抗-Meca32Ab(绿色)染色的Sema3A A106K ΔIg-b-处理的癌症组织和对照癌症组织的免疫荧光分析的共聚焦图像。与对照相比，Sema3A A106KΔIg-b使血管周细胞强烈增加。图像代表每组7只小鼠，并且每种癌症五个视野。
图12.Sema3F A106K不能增加内皮细胞迁移的抑制。通过实时分析来分析EC向I型胶原蛋白(1μg/ml)的定向迁移。在xCELLigence***平台的CIM-Plates 16中，在不存在(对照，黑色实线)或存在3.5nM Fc-标记的Sema3F ΔIg-b(黑色点线)或Fc-标记的Sema3FS107K ΔIg-b(虚线)下，在4小时长的时段内追踪EC的迁移。每条曲线为四个技术性重复的平均值±SD。统计学分析：通过双尾异方差学生t检验分析结果；*Fc-标记的Sema3F ΔIg-b相对于对照；*，p<0.05；**,p<0.01；***p<0.001。
图13.Fc-标记的Sema3A A106K ΔIg-b在抑制EC定向迁移中比市售的Fc-标记的SEMA3E和SEMA3F更有效。通过实时分析来分析EC向I型胶原蛋白(1μg/ml)的定向迁移。(A-B)在xCELLigence***平台的CIM-Plates 16中，在不存在(对照，黑色实线)或存在等摩尔量的Fc-标记的Sema3A A106K ΔIg-b(A-B，黑色虚线)或市售的Fc-标记的SEMA3E WT(黑色点线)或市售的Fc-标记的Sema3F WT(灰色实线)下，在4小时长的时段内追踪EC的迁移。每条曲线为四个技术性重复的平均值±SD。统计学分析：通过双尾异方差学生t检验分析结果；*Fc-标记的Sema3A A106K ΔIg-b相对于Fc-标记的SEMA3E WT或Fc-标记的Sema3FWT；*，p<0.05，**，p<0.01，***，p<0.001。
下述不具有约束性的实施例说明本发明。
实施例1-Sema3A A106K ΔIg-b为丛状蛋白A4的特异性结合剂、强大的活化剂和EC的趋触性迁移的抑制剂
材料和方法
细胞结合分析和斯卡查德分析
利用先前所述方案(Tamagnone等人，1999)的改进方案进行原位结合分析。具体地，将用表达不同脑信号蛋白受体的cDNA构建体转染的COS7细胞接种在48-孔培养皿的孔中。然后，将其用含有与分泌的胎盘碱性磷酸酶融合的重组脑信号蛋白分子(例如Sema3A-AP)的完全培养基在37℃孵育1小时。在五次洗涤之后，将细胞固定，在65℃加热10min以使内源性磷酸酶失活，并与NBT–BCIP(硝基蓝四唑-5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸酯)AP底物(Promega,目录#S3771)孵育用于原位细胞染色。为了定量评估配体结合，将表达受体的细胞与渐增浓度的AP缀合的配体(具有预定比活性/μg)一起孵育；通过与显色可溶性底物对硝基苯基磷酸酯(Sigma-Aldrich,目录#P7998)一起孵育最终显示细胞结合的AP活性，并通过多孔分光光度计(在405nm的吸光度)对其进行测量。使用Prism 6(GraphPad SoftwareInc.)进行斯卡查德图分析。
驱触性内皮细胞迁移分析
通过xCELLigence(Acea Biosciences Inc.)监测人脐静脉EC的实时定向迁移，所述xCELLigence为基于电阻抗的***，其中微电子传感器阵列为集成的微板孔。基于阻抗的xCELLigence***基于实时细胞分析仪(RTCA)仪器。该仪器的核心为E-板。E-Plates 16为一次性使用的板，并且在E-Plate 16上的每个单独的孔已经并入传感器电极阵列，其允许持续监测孔中的细胞。使用RTCA Software 1.2设置实验文件：该软件将阻抗值进行转换以获得诸如以下的参数：细胞指数(CI)、平均值、最大和最小值、标准差(SD)、半最大效应浓度(EC50)、半最大抑制浓度(IC50)。然后，可以将以CI单位表示的数据导出用于任何类型的数学和统计分析。
在该分析中，我们通过使用xCELLigence RTCA DP仪器的CIM-Plate 16实时监测EC的定向迁移。在组织培养罩内，将CIM-Plate的上室的底侧(朝向下室的一侧)用30μl I型胶原蛋白(1μg/ml)包被30分钟。首先用160μl无血清的M199培养基(含有或不含Sema3A)填充每个下室的孔，然后将其组装至上室。将该组装的板在37℃孵育1小时至平衡(在上室的每个孔中添加30μl无血清的培养基)。分离EC并将其重悬至30000个细胞/100μl的终浓度。开始BLANCK步骤以测量细胞培养基的背景阻抗，然后将其用作参照阻抗用于计算CI值。然后，将100μl细胞悬浮液(30,000个细胞)添加至上室的每个孔中。将CIM-Plate 16置于在CO2培养箱中平衡的RTCA DP仪器中。使用RTCA DP仪器持续监测EC迁移。
对于统计学评估，通过双尾异方差学生t检验分析结果。对于每个实验条件以时间计的技术性重复，在由RTCA仪器导出的CI数据上计算平均值、标准差和p值。迁移数据表示为将对照样品视为100％的百分比。
Rap1-GTP下拉分析
首先，使EC饥饿3小时，然后在37℃用0.02nM SEMA3A处理1分钟，或未经处理。然后，将活性Rap1-GTP在通过谷胱甘肽琼脂糖树脂分离的人Ral鸟嘌呤核苷酸解离刺激因子(RalGDS)的Rap1-结合结构域(RBD)的谷胱甘肽-S-转移酶-融合蛋白上下拉。我们根据制造商的指南和检测试剂盒(Thermo Scientific,产品目录#16120)进行活性Rap1下拉分析。在输入部分中检测到的总Rap1被用于计算活性Rap1-GTP的归一化光密度(N.O.D.)。显示了具有相似结果的三个独立下拉分析的代表。定量条带，并相对于对照计算N.O.D(数值为平均值±SD；n＝3个单独的分析)。对于统计学评价，通过双尾异方差学生t检验分析结果。
ERK 1/2磷酸化
首先，使EC饥饿3小时，然后在37℃用SEMA3A[0.225nM]处理15’或未经处理。我们裂解细胞，并利用抗-磷酸化ERK 1/2[小鼠抗-磷酸化-p44/42MAPK(ERK1/2；Thr202/Tyr204)(克隆E10)；稀释度1:1000；Cell Signaling Technology,产品目录#9106]和抗-Tot ERK[兔抗-p44/42MAPK(ERK1/2)(克隆137F5)；稀释度1:1000；Cell SignalingTechnology,产品目录#4695]抗体通过WB进行蛋白质分析。使用二辛可宁酸(BCA)蛋白分析试剂(Thermo Scientific)确定总蛋白量。利用预制的Bolt 4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)通过SDS-PAGE分离等量的蛋白质。然后，将蛋白质转移至Trans-BlotTurboTMMini Nitrocellulose Transfer(Biorad)，用山羊抗-兔IgG(H+L)二抗HRP缀合物(Invitrogen,目录#:65-6120)或山羊抗-小鼠IgG(H+L)二抗HRP缀合物(JacksonImmunoResearch Inc.目录#:11-035-062)探测，并通过增强的化学发光技术(WesternLightning Plus-ECL,Enhanced Chemiluminescence Substrate；Perkin Elmer,目录#NEL105001EA)检测。在输入部分中检测到的总ERK1/2被用于计算磷酸化-ERK1/2的N.O.D.。显示了具有相似结果的三个独立下拉分析的代表。定量条带，并相对于对照计算N.O.D(数值为平均值±SD；n＝3个单独的分析)。对于统计学评估，通过双尾异方差学生t检验分析结果。
人和小鼠脑信号蛋白3蛋白为保守蛋白。SEQ ID NO:1中所示的人脑信号蛋白3A与SEQ ID NO:5中所示的人脑信号蛋白3B为至少52％同源/相同的。另外，SEQ ID NO:1中所示的人脑信号蛋白3A与SEQ ID NO:9中所示的人脑信号蛋白3C为至少45％同源/相同的。另外，SEQ ID NO:1中所示的人脑信号蛋白3A与SEQ ID NO:13中所示的人脑信号蛋白3D为至少53％同源/相同的。另外，SEQ ID NO:3中所示的小鼠脑信号蛋白3A与SEQ ID NO:13或SEQID NO:15中所示的人或小鼠脑信号蛋白3A为至少53％同源/相同的。另外，SEQ ID NO:3中所示的小鼠脑信号蛋白3A与SEQ ID NO:11中所示的小鼠脑信号蛋白3C为至少45％同源/相同的。
结果
我们研发了一种策略以提供新型的、容易纯化和肠胃外可递送的来源于Sema3AWT的突变型合成蛋白。该突变体应包含下述特征：i)不能结合Nrp1；ii)缺乏任何弗林蛋白酶切割位点；iii)为稳定二聚的；和iv)能够以高亲和力结合丛状蛋白。因此，产生了新型的重组小鼠Sema3A突变型蛋白。以融合蛋白的形式设计该示例性的突变型Sema3A。该突变型脑信号蛋白3A包含表2中概述的特征，并且被指定为Sema3A A106KΔIg-b(表2和图2)。示例性氨基酸序列示于SEQ ID NO:18或20中。此外，也产生了突变的脑信号蛋白3B、C和D的相应的融合蛋白。这些突变体在本文被指定为Sema3B A105K-Fc、Sema3C A104K-Fc和Sema3DA120K-Fc(分别显示于SEQ ID NO 76、78或79中)。保留106位的丙氨酸但包含与Sema3AA106K ΔIg-b相同结构的脑信号蛋白3A的突变体被指定为Sema3A ΔIg-b，此类分子的核酸序列在SEQ ID NO:43或44中给出(分别为人和小鼠Sema3A ΔIg-b)。
表2.新型Sema3A A106K ΔIg-b的分子特征
Sema3A A106K ΔIg-b突变体的特征在于下述特征和优势：
1)缺失Sema3A WT的Nrp1结合和弗林蛋白酶可切割的Ig样/碱性区域(例如，氨基酸549-772)；
2)将突变型小鼠Sema3A的剩余Sema-PSI结构域区域(例如，氨基酸1-548)以其C-端与IgG1恒定片段(例如，来自小鼠)(Fc，通过铰链、CH2和CH3结构域形成的)融合以诱导二聚化。IgG1Fc允许在琼脂糖蛋白A上进行突变型Sema3A蛋白的容易且大规模的纯化；
3)用Lys取代Sema3A WT的Ala106残基(A106K)，赋予突变体形式与A型丛状蛋白丛状蛋白A4的高的(Kd＝0.7nM)亲和力。
使用标准蛋白质纯化制备突变的和野生型的脑信号蛋白3A、B、C、D、E和F。具体地，通过服务使用常规蛋白质纯化制备人和小鼠Fc-标记的Sema3A A106K ΔIg-b(分别在SEQID NO:18或20中给出)以及小鼠Fc-标记的Sema3A ΔIg-b。SEMA3A WT全长购自R&DSystems Inc.,Minneapolis,MN；目录#1250-S3-025。通过合成基因设计(GeneSynthesis,Life-Technologies/Thermo Fisher Scientific Inc.)产生指定为SEQ IDNO:19的编码Sema3A A106KΔIg-b的cDNA。
然后，将编码Sema3A A106K ΔIg-b的cDNA(SEQ ID NO:19)亚克隆至pUPE表达载体中。然后，将携带编码Sema3A A106K ΔIg-b的cDNA的pUPE表达载体的转染级制备物(Sema3A A106K ΔIg-b pUPE)瞬时转染至培养稳定表达爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原-1的HEK293细胞系(HEK293-EBNA1或293E，即最常用于大规模转染的细胞系)的悬浮液中。在一周之后，通过离心收获Sema3A A106K ΔIg-b pUPE HEK293E悬浮培养物的培养基。将融合蛋白与蛋白A-琼脂糖分批结合。收集珠粒，并将其转移至重力流柱中。具体地，通过用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤柱来去除结合的蛋白。使用20mM柠檬酸盐、150mM NaCl pH 2.7洗脱结合的融合蛋白，将0.9ml级分收集在含有0.1ml 1M KH2PO4/K2HPO4pH 8.0的Eppendorf管中用于中和。
为查明Sema3A中A106K突变的功能，产生了Sema3A ΔIg-b重组蛋白。Sema3A ΔIg-b缺乏Ig样/碱性区域，但保留了野生型残基Ala106(图2)。将Sema3A ΔIg-b和Sema3AA106K ΔIg-b突变体两者的生物化学和生物活性与市售的全长SEMA3A WT(来自R&DSystems Inc.,Minneapolis,MN；目录#1250-S3-025)的活性进行比较。
配体-受体原位结合分析(Flanagan等人，2000；Tamagnone等人，1999)确认碱性磷酸酶(AP)-缀合的Sema3A WT与COS细胞中的Nrp1相互作用。然而，Sema3A ΔIg-b和Sema3AA106K ΔIg-b突变体均不与Nrp1相互作用(图4A)。
脑信号蛋白为通过丛状蛋白传递信号的配体(Kumanogoh和Kikutani,2013；Tamagnone等人，1999)。因此，筛选这些构建体直接结合丛状蛋白家族成员的能力。重要的是，与Sema3A WT或Sema3A ΔIg-b突变体相比，Sema3A A106K ΔIg-b以高亲和力结合丛状蛋白A4(图4A和B)。如通过斯卡查德图分析所评估的，Sema3A A106K ΔIg-b与丛状蛋白A4的结合亲和力增加至0.7nM的Kd(图4C)。相比之下，Sema3A WT结合Nrp1的Kd为1.1nM(图4D)，这与先前的数据一致(Takahashi等人，1999)。此外，没有其它A型丛状蛋白显示出可检测的与Sema3A A106K ΔIg-b的结合(图4A)。因此，Sema3A A106K ΔIg-b对于丛状蛋白A4的结合为高度特异的。最后，配体结合分析允许估计Sema3A WT、Sema3A ΔIg-b和Sema3A A106KΔIg-b对于丛状蛋白A4受体的亲和力范围，以及显示Sema3A WT、突变体Sema3A ΔIg-b或突变体Sema3A A106K ΔIg-b与丛状蛋白A4的结合如何分别显示7nM、200nM和0.7nM的估计的Kd(图4E)。此外，分析了突变的脑信号蛋白3B与丛状蛋白的结合亲和力(图4F)。例如，示例性Sema3B A105K-Fc显示以高的结合亲和力结合丛状蛋白A2。与突变形式相比，与Sema3BA105K-Fc具有相同的构建体设计，但缺乏在105位丙氨酸至赖氨酸的突变的脑信号蛋白3B(SEMA3B ΔIg-b)没有显示增加的结合。如上文所述，脑信号蛋白3蛋白与其丛状蛋白受体的强烈的相互作用对于受体激活和脑信号蛋白3下游信号转导是重要的。因此，这些数据提供这样的证据：突变的脑信号蛋白3A、B、C和D可以用于改善的抗-血管生成和/或抗血管发生疗法中。在体外以及在体内***中的进一步分析在本文中以突变的脑信号蛋白3A例示。
为了评估人脐静脉内皮细胞(HUVEC或EC)向ECM蛋白的趋触性迁移，我们产生并纯化了Fc-标记的Sema3A ΔIg-b和Sema3A A106K ΔIg-b蛋白(图2、3、5)。在xCELLigence***平台(Acea Biosciences Inc.,San Diego,CA)中，比较了等摩尔量的Fc-标记的Sema3AΔIg-b、Sema3A A106K ΔIg-b蛋白和SEMA3A WT抑制EC向ECM蛋白，如I型胶原蛋白的趋触性迁移(图6)。在宽浓度范围(0.2-3.5nM)内，Fc-标记的Sema3A A106K ΔIg-b在抑制EC定向迁移中总是比Fc-标记的Sema3A ΔIg-b或商购的Fc-标记的SEMA3A WT有效得多(图6A-C)。如表3中详述，虽然小鼠Fc-标记的Sema3A A106K ΔIg-b抑制36-45％的EC定向迁移，但商购的人Fc-标记的SEMA3A WT和小鼠Fc-标记的Sema3A A106K ΔIg-b分别损害仅23-25％和19-24％的EC运动性。此外，丛状蛋白A4的基因沉默实验将响应于Sema3A A106K ΔIg-b的EC的迁移增加至对照水平。因此，Fc-标记的Sema3A A106K ΔIg-b对EC趋触性的抑制活性依赖于丛状蛋白A4(图6D，E)，这与其A型丛状蛋白受体结合概况一致(图4A)。
表3.关于Fc-标记的SEMA3A WT、小鼠Fc-标记的Sema3A ΔIg-b和小鼠Fc-标记的Sema3A A106K ΔIg-b抑制EC定向迁移的能力的另外的定量细节。此处报告了对应于图6中所述的代表性定向迁移实验的实验时间点3小时45分钟的原始数值数据。
表4.关于Fc-标记的SEMA3A WT和人Fc-标记的SEMA3A A106K ΔIg-b抑制EC定向迁移的能力的另外的定量细节。此处报告了对应于图7中所述的代表性定向迁移实验的实验时间点3小时36分钟的原始数值数据。
我们产生并测试了人Fc-标记的SEMA3A A106K ΔIg-b，其生物活性与其鼠科动物对应物的生物活性基本可重叠(图7)。如表4中详述，虽然最大(3.5nM)剂量的商购的人Fc-标记的SEMA3A WT抑制20％的EC定向迁移，但低17.5倍的剂量(0.2nM)的人Fc-标记的SEMA3A A106K ΔIg-b抑制46％的EC运动性。此外，由Fc-标签诱导的SEMA3A A106K的二聚化进一步增加EC定向迁移的抑制(数据未示出)。
Sema3F在通过同源性比较对应于Sema3A 106位的位点处具有极性氨基酸，即丝氨酸(Ser107)。这与Sema3A、Sema3B、Sema3C和Sema3D相反，其在对应位置包含疏水性丙氨酸。因此，出于对照目的，我们研究了将极性Ser107突变成带正电荷的Lys(Sema3F S107K)是否导致Sema3F对丛状蛋白的亲和力的显著增加和抑制EC向ECM蛋白迁移的能力。通过COS细胞中的配体-受体原位结合分析，我们发现AP缀合的Sema3F ΔIg-b和Sema3F S107K ΔIg-b突变体如何未能以高亲和力结合任何类型的A、B、C或D丛状蛋白家族成员。因此，我们观察到等摩尔(3.5nM)量的Sema3F ΔIg-b和Sema3F S107K ΔIg-b抑制EC向ECM蛋白迁移的能力是如何大部分可重叠的(图12)。类似地，与Fc-标记的SEMA 3E(R&D Systems)或Sema 3F(R&D Systems)相比，SEMA3A A106K ΔIg-b显示增加的EC定向迁移的抑制(图13)。用等摩尔量的蛋白分别进行EC迁移分析。因此，在不受理论束缚的情况下，我们断定如果取代的氨基酸为疏水性的，如Sema3A A106的情况下，将带正电荷的氨基酸合成引入至Sema3蛋白更可能增加其对丛状蛋白受体的亲和力和化学排斥活性。换言之，在Sema 3A、B、C或D的情况下，本文所述的亲水氨基酸的人工引入增加抗血管生成和/或血管发生特性。
为了测试Sema3A构建体对下游信号转导的影响，进行了Sema3A结合伴侣的下拉分析。Fc-标记的Sema3A A106K ΔIg-b在抑制Rap1小GTP酶的GTP-负载(图8A)以及在引发ERK1/2激酶的磷酸化(图8B)中比Fc-标记的Sema3A ΔIg-b和商购的Fc-标记的SEMA3A WT显著更强大。具体地，商购的Fc-标记的SEMA3A WT、Fc-标记的Sema3A ΔIg-b和Fc-标记的Sema3A A106KΔIg-b分别：i)抑制42％、44％和65％的Rap1GTP负载；ii)激活1.95倍、2.3倍和3.9倍的ERK 1/2磷酸化。
因此，可以推断新型的Fc-标记的Sema3A A106K ΔIg-b突变体i.)以高亲和力特异性结合受体丛状蛋白A4；ii.)为强大得多的丛状蛋白信号转导的活化剂；iii.)为强大得多的EC功能的抑制剂；iv.)不与Nrp1相互作用；以及v.)不能被切割。
这使得Sema3A A106K ΔIg-b成为丛状蛋白A4的特异性结合剂、强大的活化剂和EC的趋触性迁移的抑制剂。
实施例2-Sema3A A106K ΔIg-b有效抑制胰腺癌中的癌症生长和转移
考虑到自发性胰腺神经内分泌癌的小鼠模型(RIP-Tag2)的目前的体外数据和临床前经验(Maione等人，2012；Maione等人，2009)，评估宽范围[0.5-5mg/kg/小鼠，通过渗透微型泵或腹腔内(i.p.)递送4周]的Fc-标记的Sema3A ΔIg-b和Sema3A A106K ΔIg-b在停止癌症发展和延长RIP-Tag2小鼠存活中的能力至少长达16周龄，如同我们先前通过腺相关病毒(AAV)-8-介导的基因转移观察到的(Maione等人，2012；Maione等人，2009)。我们发现通过任何治疗方法递送的Sema3A ΔIg-b的剂量并不能够与AAV-8全长Sema3A一样延长RIP-Tag2小鼠存活(Maione等人，2012；Maione等人，2009)。相反，Sema3A A106K ΔIg-b显示了类似于AAV-8全长Sema3A的促存活活性，因此表明增加的丛状蛋白A4-结合活性如何赋予Sema3A A106K ΔIg-b强大的Nrp1-独立的抗癌效果。具体地，通过一周i.p.注射三次来递送3mg/kg Sema3A A106K ΔIg-b为损害癌症发展、使癌症脉管***正常化和延长RIP-Tag2小鼠存活的最有效和无毒的治疗方案。事实上，与盐水处理的对照相比，用Sema3AA106K ΔIg-b处理RIP-Tag2一个月(3mg/kg,i.p,一周三次)：i)诱导癌症体积减小67％；ii)使癌血管面积有效降低了51％(图9A)；iii)在增加的周细胞覆盖率方面，有利于癌血管的正常化(图9B)；iv)增强了灌注(图9C)和降低了组织缺氧(图9D)。
此外，在显著更频繁和致命的人胰腺癌组织型的小鼠模型，即胰腺导管腺癌(PDAC)的同系K-RasG12D；Ink4a/Arf-/-；p53R172H原位小鼠模型中分析Sema3A A106K ΔIg-b的作用。通过AAV-8-介导的基因转移在原位RasG12D；Ink4a/Arf-/-；p53R172H PDAC小鼠模型中递送全长SEMA3A WT(Maione等人，2009)。用全长SEMA3A WT的处理在3周之后导致癌症生长(52％)和肝脏转移(59％)的抑制(图10A，B)。源于先前有希望的数据，然后，我们用纯化的Sema3A A106K ΔIg-b突变型蛋白处理具有癌症的PDAC小鼠(3mg/kg，i.p.，一周三次)，并评估其对癌症生长和转移形成的药理学作用。Sema3A A106K ΔIg-b蛋白强烈抑制癌症生长(64％)(图11A)，使肝脏转移发生率降低了81％(图11B)以及使转移体积减少了78％。最重要和令人惊讶的是，在PDAC小鼠中，与Sema3A全长相比，Sema3A A106K ΔIg-b在降低癌症发展和转移扩散中发挥更强的作用。与RIP-tag2小鼠的处理一致，另外在PDAC小鼠模型中，通过增加周细胞覆盖率(图11C)、增加血管灌注和抑制癌缺氧，Sema3A A106K ΔIg-b减少血管面积(数据未示出)，并促进癌血管正常化。
本文引用的所有参考文献通过引用完全并入。现已完全描述了本发明，本领域技术人员应理解，本发明可以在宽且等同范围的条件、参数等内实践，而不影响本发明或其任何实施方案的精神或范围。
Adams等人，(1997)EMBO J.16:6077-6086。
Bos等人，(2012)Sci Signal.5:pe6。
Casazza等人，(2013)Cancer Cell.24:695-709。
Cleaver等人，(2003)Nat Med.9:661-668。
Conley等人，(2012)Proc Natl Acad Sci U S A。
Gherardi等人，(2004)Curr Opin Struct Biol.14:669-678。
Goel等人，(2011)Physiol Rev.91:1071-1121。
Hahn等人，(2009)Nat Rev Mol Cell Biol.10:53-62。
Janssen等人，(2010)Nature.467:1118-1122。
Kinbara等人，(2003)Nat Rev Mol Cell Biol.4:767-776。
Koppel等人，(1998)J Biol Chem.273:15708-15713。
Kruger等人，(2005)Nat Rev Mol Cell Biol.6:789-800。
Kumanogoh等人，(2013)Nat Rev Immunol.13:802-814。
Lucitti等人，(2007)Development.134:3317-3326。
Maione等人，(2012)J Clin Invest.122:1832–1848.
Maione等人，(2009)J Clin Invest.119:3356-3372。
Michieli等人，(2009)Cell Cycle.8:3291-3296。
Nogi等人，(2010)Nature.467:1123-1127。
Parker等人，(2010)Biochemistry.49:4068-4075。
Parker等人，(2012)J Biol Chem。
Sennino等人，(2012)Nat Rev Cancer.12:699-709。
Serini等人，(2013)Journal of Internal Medicine。
Serini等人，(2003)Nature.424:391-397。
Shattil等人，(2010)Nat Rev Mol Cell Biol.11:288-300。
Takahashi等人，(1999)Cell.99:59-69。
Tamagnone等人，(1999)Cell.99:71-80。
Tran等人，(2007)Annu.Rev.Cell Dev.Biol.23::263–292。
Tzima等人，(2001)EMBO J.20:4639-4647。
Van der Veldt等人，(2012)Cancer Cell.21:82-91。
Wang等人，(2012)Sci Signal.5:ra6。
Flanagan Methods Enzymol.2000；327:198-210。
Gherardi等人，(2004)Curr Opin Struct Biol 14:669-678。
Love等人，(2003)Nat Struct Biol 10:843-848。
Xiong J等人，(2004)J Biol Chem 279:40252-40254。
Rein FEBS Letters 513(2002)141-144,Oct 2001。
Antipenko等人，(2003)Neuron.39:589-598。
Chen等人，(2011)Trends Biochem Sci.36:553-561。
Conley等人，(2012)Proc Natl Acad Sci U S A。
Desgrosellier等人，(2010)Nat Rev Cancer.10:9-22。
Flanagan等人，(2000)Methods Enzymol.327:19-35。
Gherardi等人，(2004)Curr Opin Struct Biol.14:669-678。
Love等人，(2003)Nat Struct Biol.10:843-848。
Sennino等人，(2012)Nat Rev Cancer.12:699-709。
Xiong等人，(2004)J Biol Chem.279:40252-40254。

Claims (49)

1.突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述突变的脑信号蛋白3选自脑信号蛋白3A、脑信号蛋白3B、脑信号蛋白3C和脑信号蛋白3D，并且其中所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段包含氨基酸序列CX1X2A3GKD，其中
X1是氨基酸，其为K或N，
X2是选自W、M和L的氨基酸，
并且其中所述丙氨酸(A3)被亲水氨基酸取代。
2.如权利要求1所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段包含：
取代对应于如SEQ ID NO:2所示的野生型脑信号蛋白3A 106位的丙氨酸的所述亲水氨基酸；
取代对应于如SEQ ID NO:6所示的野生型脑信号蛋白3B 105位的丙氨酸的所述亲水氨基酸；
取代对应于如SEQ ID NO:10所示的野生型脑信号蛋白3C 104位的丙氨酸的所述亲水氨基酸；或者
取代对应于如SEQ ID NO:14所示的野生型脑信号蛋白3D 120位的丙氨酸的所述亲水氨基酸。
3.如权利要求1或2所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述脑信号蛋白3选自：
(a)由选自下述的核酸序列编码的多肽：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:13，
其中位于SEQ ID NO:1的631至633位的核苷酸GCT被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，
其中位于SEQ ID NO:5的559至561位的核苷酸GCA被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，
其中位于SEQ ID NO:9的872至874的核苷酸GCT被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代，以及
其中位于SEQ ID NO:13的398至400位的核苷酸GCC被编码所述亲水氨基酸的核苷酸取代；
(b)具有选自下述的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:14，其中位于SEQ ID NO:2的106位、位于SEQ ID NO:6的105位、位于SEQ ID NO:10的104位或者位于SEQ ID NO:14的120位的丙氨酸残基被所述亲水氨基酸取代；
(c)由在严紧条件下与编码(a)或(b)中所限定的多肽的核酸分子的互补链杂交的核酸序列编码的多肽；
(d)作为血管生成的抑制剂发挥功能并与(b)中提及的任一多肽具有至少55％同一性的多肽。
4.如权利要求1至3中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述脑信号蛋白3或所述其功能片段包含位于下述位点的亲水氨基酸：
(a)SEQ ID NO:2的106位；
(b)SEQ ID NO:6的105位；
(c)SEQ ID NO:10的104位；或者
(d)SEQ ID NO:14的120位。
5.如权利要求1至4中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述脑信号蛋白3或所述其功能片段包含功能性sema结构域，并且包含至少一种选自下述的另外的突变：氨基酸置换、添加、缺失和重复。
6.如权利要求1至5中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述亲水氨基酸选自K、R、N、Q、S、T、E、D和H。
7.如权利要求1至6中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述亲水氨基酸是K或R。
8.如权利要求6所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中取代所述丙氨酸的所述亲水氨基酸是K。
9.如权利要求1至8中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段包含下述任一项所限定的序列的一种或多种：SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48。
10.如权利要求1至9中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中编码所述脑信号蛋白3或所述其功能片段的核酸分子包含：
(a)SEQ ID NO:1的601至1206位的核苷酸，并且其中位于SEQ ID NO:1的631至633位的核苷酸GCT被编码亲水氨基酸的核苷酸取代；
(b)SEQ ID NO:5的529至1137位的核苷酸，并且其中位于SEQ ID NO:5的559至561位的核苷酸GCA被编码亲水氨基酸的核苷酸取代；
(c)SEQ ID NO:9的842至1444位的核苷酸，并且其中位于SEQ ID NO:9的872至874位的核苷酸GCT被编码亲水氨基酸的核苷酸取代；或者
(d)SEQ ID NO:13的368至982位的核苷酸，并且其中位于SEQ ID NO:13的398至400位的核苷酸GCC被编码亲水氨基酸的核苷酸取代。
11.如权利要求1至10中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述脑信号蛋白3或所述其功能片段包含所述功能性sema结构域，其中所述sema结构域选自下述所示的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO:21，其中对应于SEQ ID NO:2的106位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；
(b)SEQ ID NO:22，其中对应于SEQ ID NO:6的105位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；
(c)SEQ ID NO:23，其中对应于SEQ ID NO:10的104位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；或者
(d)SEQ ID NO:24，其中对应于SEQ ID NO:14的120位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代。
12.如权利要求1至11中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段，其中所述突变的脑信号蛋白3包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70以及SEQ ID NO:72。
13.融合蛋白，其包含权利要求1至12中任一项所限定的作为血管生成的抑制剂发挥功能的突变的脑信号蛋白3或其功能片段。
14.如权利要求13所述的融合蛋白，其中所述功能性sema结构域包含下述所限定的多肽或者为下述所限定的多肽：
(a)SEQ ID NO:21，其中对应于SEQ ID NO:2的106位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；
(b)SEQ ID NO:22，其中对应于SEQ ID NO:6的105位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；
(c)SEQ ID NO:23，其中对应于SEQ ID NO:10的104位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；或者
(d)SEQ ID NO:24，其中对应于SEQ ID NO:14的120位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代。
15.如权利要求13或14所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含权利要求1至12中任一项所限定的所述突变的脑信号蛋白3或所述其功能片段，其中所述融合蛋白还包含：
(a)稳定子结构域；和/或
(b)二聚化结构域。
16.如权利要求15所述的融合蛋白，其中
(a)所述稳定子结构域是丛状蛋白脑信号蛋白整合蛋白(PSI)结构域，其中所述PSI结构域包含下述序列中的一种或多种：SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47或SEQ IDNO:48；和/或
(b)所述二聚化结构域与另一此类二聚化结构域的解离常数KD的范围为10-5M至10-6M，和/或其中所述二聚化结构域选自C-末端IgG恒定结构域、DARPin和亮氨酸拉链。
17.如权利要求16所述的融合蛋白，其中所述IgG恒定结构域是IgG1或IgG3。
18.如权利要求13至17中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白由包含核酸序列的核酸分子编码，所述核酸序列具有下述核酸序列：
跨越SEQ ID NO:1的核苷酸316至1959的核酸序列和跨越SEQ ID NO:37的核苷酸295至990的核酸序列，其中位于SEQ ID NO:1631至633位的核苷酸GCT被编码亲水氨基酸的核苷酸取代；
跨越SEQ ID NO:5的核苷酸247至1887的核酸序列和跨越SEQ ID NO:37的核苷酸295至990的核酸序列，其中位于SEQ ID NO:5559至561位的核苷酸GCA被编码亲水氨基酸的核苷酸取代；
跨越SEQ ID NO:9的核苷酸563至2197的核酸序列和跨越SEQ ID NO:37的核苷酸295至990的核酸序列，其中位于SEQ ID NO:9872至874位的核苷酸GCT被编码亲水氨基酸的核苷酸取代；或者
跨越SEQ ID NO:13的核苷酸41至1735的核酸序列和跨越SEQ ID NO:37的核苷酸295至990的核酸序列，其中位于SEQ ID NO:13398至400位的核苷酸GCC被编码亲水氨基酸的核苷酸取代。
19.如权利要求13至18中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含下述氨基酸序列：
跨越SEQ ID NO:2的氨基酸残基1至548的氨基酸序列和如SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列，其中位于SEQ ID NO:2的106位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；
跨越SEQ ID NO:6的氨基酸残基1至547的氨基酸序列和如SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列，其中位于SEQ ID NO:6的105位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；
跨越SEQ ID NO:10的氨基酸残基1至565的氨基酸序列和如SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列，其中位于SEQ ID NO:10的104位的丙氨酸残基被亲水氨基酸取代；或者
跨越SEQ ID NO:14的氨基酸残基1至545的氨基酸序列和如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，其中位于SEQ ID NO:14的120位的丙氨酸残基被所述亲水氨基酸取代。
20.如权利要求13至19中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79。
21.抗体，其特异性结合权利要求1至12中任一项所限定的突变的脑信号蛋白3或其功能片段或者特异性结合权利要求13至20中任一项所限定的融合蛋白。
22.核酸分子，其编码权利要求1至12中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段或权利要求13至20中任一项所述的融合蛋白。
23.载体，其包含权利要求22所述的核酸分子。
24.如权利要求23所述的载体，其中所述载体是基因打靶载体或基因转移载体。
25.如权利要求23或24所述的载体，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。
26.如权利要求23至25中任一项所述的载体，其中所述腺相关病毒是AAV8载体。
27.宿主，其转化有权利要求23至26中任一项所述的载体或包含权利要求22所述的核酸分子。
28.如权利要求27所述的宿主，其是哺乳动物细胞。
29.如权利要求27或28所述的宿主，其中所述哺乳动物细胞是HEK细胞。
30.如权利要求27至29中任一项所述的宿主，其中所述HEK细胞是HEK293-EBNA1或HEK293E细胞。
31.产生权利要求22所述的核酸分子编码的突变的脑信号蛋白3、其功能片段或者融合蛋白的方法，其中所述方法包括培养/饲养权利要求27至30中任一项所述的宿主，以及任选地分离产生的多肽。
32.多肽，其由权利要求22所述的核酸分子编码和/或通过权利要求31所述的方法产生。
33.药物组合物，其包含
(a)权利要求1至12中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段；
(b)权利要求13至20中任一项所述的融合蛋白；和/或
(c)权利要求22所述的核酸分子；
任选地，其包含药物赋形剂。
34.如权利要求33所述的药物组合物，其中所述药物赋形剂是药物载体。
35.如权利要求34所述的药物组合物，其中所述药物载体是病毒。
36.如权利要求35所述的药物组合物，其中所述病毒是腺相关病毒(AAV)。
37.如权利要求35或36所述的药物组合物，其中所述腺相关病毒是AAV8。
38.权利要求1至12中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段、权利要求13至20中任一项所述的融合蛋白、权利要求22所述的核酸分子、权利要求33至37中任一项所述的药物组合物和/或通过权利要求31产生的多肽，其用作药物。
39.权利要求1至12中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段、权利要求13至20中任一项所述的融合蛋白、权利要求22所述的核酸分子、权利要求33至37中任一项所述的药物组合物和/或通过权利要求31产生的多肽，其应用于下述疾病的治疗：癌症、肿瘤、肿瘤性疾病、血管生成性病症、血管性视网膜病、血脑屏障通透性改变、神经炎性病症、骨质疏松症、肥胖症、分枝杆菌感染和/或肉芽肿。
40.权利要求1至12中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段、权利要求13至20中任一项所述的融合蛋白、权利要求22所述的核酸分子、权利要求33至37中任一项所述的药物组合物和/或通过权利要求31产生的多肽，其应用于癌症、肿瘤和/或肿瘤性疾病的治疗，其中所述肿瘤、癌症和/或肿瘤性疾病是实体瘤。
41.如权利要求39或40所述应用的权利要求1至12中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段、权利要求39或40所述应用的权利要求13至20中任一项所述的融合蛋白、权利要求39或40所述应用的权利要求22所述的核酸分子、权利要求39或40所述应用的权利要求33至37中任一项所述的药物组合物和/或权利要求39或40所述应用的通过权利要求31产生的多肽，其中所述癌症选自胰腺癌、***、乳腺癌、结肠癌、黑素瘤、***癌、膀胱癌以及舌癌。
42.如权利要求39或41中任一项所述应用的权利要求1至12中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段、权利要求39或41中任一项所述应用的权利要求13至20中任一项所述的融合蛋白、权利要求39或41中任一项所述应用的权利要求22所述的核酸分子、权利要求39或41中任一项所述应用的权利要求33至37中任一项所述的药物组合物和/或权利要求39或41中任一项所述应用的通过权利要求31产生的多肽，其中所述肿瘤、癌症或肿瘤性疾病是胰腺肿瘤/胰腺癌。
43.如权利要求39至42中任一项所述应用的权利要求1至12中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段、权利要求39至42中任一项所述应用的权利要求13至20中任一项所述的融合蛋白、权利要求39至42中任一项所述应用的权利要求22所述的核酸分子、权利要求39至42中任一项所述应用的权利要求33至37中任一项所述的药物组合物和/或权利要求39至42中任一项所述应用的通过权利要求31产生的多肽，其中涉及血管正常化、肿瘤生长降低、转移降低和/或存活延长。
44.如权利要求39至43中任一项所述应用的权利要求1至12中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段、如权利要求39至43中任一项所述应用的权利要求13至20中任一项所述的融合蛋白、如权利要求39至43中任一项所述应用的权利要求22所述的核酸分子、如权利要求39至43中任一项所述应用的权利要求33至37中任一项所述的药物组合物和/或如权利要求39至43中任一项所述应用的通过权利要求31产生的多肽，其中所述突变的脑信号蛋白3或其功能片段、所述融合蛋白、所述核酸分子、所述药物组合物和/或所述多肽将与抗增殖药物、抗癌药物、细胞抑制药物、细胞毒性药物和/或放射疗法组合施用。
45.如权利要求39至44中任一项所述应用的权利要求1至12中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段、如权利要求39至44中任一项所述应用的权利要求13至20中任一项所述的融合蛋白、如权利要求39至44中任一项所述应用的权利要求22所述的核酸分子、如权利要求39至44中任一项所述应用的权利要求33至37中任一项所述的药物组合物和/或如权利要求39至44中任一项所述应用的通过权利要求31产生的多，其中所述突变的脑信号蛋白3或其功能片段、所述融合蛋白、所述核酸分子、所述药物组合物和/或所述多肽将经肠胃外施用。
46.权利要求1至12中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段、权利要求13至20中任一项所述的融合蛋白、权利要求21所述的抗体、权利要求22所述的核酸分子、权利要求23至26中任一项所述的载体、权利要求27至30中任一项所述的宿主、通过权利要求31产生的多肽和/或权利要求33至37中任一项所述的药物组合物作为药物的用途。
47.治疗血管生成性病症、肿瘤性疾病和/或癌症的方法，其包括下述步骤：向需要此类治疗的对象施用药物有效量的权利要求1至12中任一项所述的突变的脑信号蛋白3或其功能片段、权利要求13至20中任一项所述的融合蛋白、权利要求22所述的核酸分子、权利要求23至26中任一项所述的载体、通过权利要求31产生的多肽和/或权利要求33至37中任一项所述的药物组合物。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述对象是人。
49.如权利要求47或48所述的方法，其中所述药物有效量的范围是0.5至10mg/kg体重。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109821009A (zh) * 2019-01-22 2019-05-31 南京医科大学 轴突导向因子重组蛋白Semaphorin3G的医药用途
CN110684805A (zh) * 2019-11-19 2020-01-14 四川大学华西医院 神经导向因子Sema基因重组慢病毒载体在制备治疗骨关节炎药物中的应用
WO2021068962A1 (zh) * 2019-10-11 2021-04-15 田中纯美 一种用于血管新生、***新生相关疾病的多肽及其用途
CN112687338A (zh) * 2020-12-31 2021-04-20 云舟生物科技（广州）有限公司 基因序列的存储和还原方法、计算机存储介质及电子设备
CN116790610A (zh) * 2023-05-18 2023-09-22 四川大学 一种治疗骨科疾病的基因及以aav为载体的基因治疗药物

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2016287787B2 (en) 2015-06-29 2021-10-28 The University Of British Columbia B1SP fusion protein therapeutics, methods, and uses
EP3321683A4 (en) * 2015-07-09 2018-11-21 Juntendo Educational Foundation Method for evaluating lymph node metastatic potential of endometrial cancer
WO2019207051A1 (en) 2018-04-25 2019-10-31 Università Degli Studi Di Torino Medical use of combinations of non-natural semaphorins 3 and antimetabolites
CN111009287B (zh) * 2019-12-20 2023-12-15 东软集团股份有限公司 SLiMs预测模型的生成方法、装置、设备和存储介质
JP2023532415A (ja) * 2020-06-04 2023-07-28 メディカル リサーチ アンド ディベロップメント ファンド フォー ヘルス サービシーズ ベネイ ツィオン メディカル センター 改変セマフォリン３ａ、それを含む組成物およびその使用
WO2023114245A2 (en) * 2021-12-14 2023-06-22 Radin Daniel Pierce Compositions and methods for treating cancers of the central nervous system (cns), including glioblastoma and chemoresistant cns tumors, and related compositions and methods for inhibiting and eliminating cns cancer stem cells

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
ATE12348T1 (de) 1980-11-10 1985-04-15 Gersonde Klaus Prof Dr Verfahren zur herstellung von lipid-vesikeln durch ultraschallbehandlung, anwendung des verfahrens und vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens.
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
EP0088046B1 (de) 1982-02-17 1987-12-09 Ciba-Geigy Ag Lipide in wässriger Phase
DE3218121A1 (de) 1982-05-14 1983-11-17 Leskovar, Peter, Dr.-Ing., 8000 München Arzneimittel zur tumorbehandlung
EP0102324A3 (de) 1982-07-29 1984-11-07 Ciba-Geigy Ag Lipide und Tenside in wässriger Phase
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
JPS607934A (ja) 1983-06-29 1985-01-16 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd リポソ−ムの製造方法
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
EP0142641B1 (de) 1983-09-26 1991-01-16 Udo Dr. Ehrenfeld Mittel und Erzeugnis für die Diagnose und Therapie von Tumoren sowie zur Behandlung von Schwächen der zelligen und humoralen Immunabwehr
DE3474511D1 (en) 1983-11-01 1988-11-17 Terumo Corp Pharmaceutical composition containing urokinase
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US20030229208A1 (en) 1988-12-28 2003-12-11 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DK0590058T3 (da) 1991-06-14 2004-03-29 Genentech Inc Humaniseret heregulin-antistof
GB9304200D0 (en) 1993-03-02 1993-04-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
EP1997894B1 (en) 1992-02-06 2011-03-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
EP0702722B1 (en) 1993-06-07 2005-08-03 Vical Incorporated Plasmids suitable for gene therapy
US5639856A (en) 1993-09-13 1997-06-17 The Regents Of The University Of California Semaphorin gene family
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
WO1997000957A1 (en) 1995-06-23 1997-01-09 President And Fellows Of Harvard College Transcriptional regulation of genes encoding vascular endothelial growth factor receptors
PT1071752E (pt) 1998-04-21 2003-11-28 Micromet Ag Polipeptidos especificos para cd19xcd3 e suas utilizacoes
WO2001023425A1 (en) 1999-09-28 2001-04-05 Universität Zürich Factors having prion-binding activity in serum and plasma and agents to detect transmissible spongiform encephalopathitis
JP2003531588A (ja) 2000-04-11 2003-10-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 多価抗体とその用途
CN1468250A (zh) 2000-08-03 2004-01-14 ��ķһ����˹��̹ 在转基因动物中产生人源化抗体
US7290975B2 (en) 2001-03-17 2007-11-06 Mechanical Tech & Engineering Co. Two-speed passenger lift and pump assembly therefor
US7781413B2 (en) * 2001-10-31 2010-08-24 Board Of Regents, The University Of Texas System SEMA3B inhibits tumor growth and induces apoptosis in cancer cells
US7184284B2 (en) 2004-03-30 2007-02-27 Micron Technology, Inc. Closed-loop high voltage booster
EP1962961B1 (en) 2005-11-29 2013-01-09 The University Of Sydney Demibodies: dimerisation-activated therapeutic agents
SG178744A1 (en) * 2007-02-02 2012-03-29 Biogen Idec Inc Use of semaphorin 6a for promoting myelination and oligodendrocyte differentiation
CA2702655A1 (en) 2007-10-19 2009-04-23 Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences Compositions comprising semaphorins for the treatment of angiogenesis related diseases and methods of selection thereof
US8871205B2 (en) * 2009-11-25 2014-10-28 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for the treatment of immune disorders
WO2014058915A2 (en) * 2012-10-08 2014-04-17 St. Jude Children's Research Hospital Therapies based on control of regulatory t cell stability and function via a neuropilin-1:semaphorin axis

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109821009A (zh) * 2019-01-22 2019-05-31 南京医科大学 轴突导向因子重组蛋白Semaphorin3G的医药用途
WO2021068962A1 (zh) * 2019-10-11 2021-04-15 田中纯美 一种用于血管新生、***新生相关疾病的多肽及其用途
CN114466859A (zh) * 2019-10-11 2022-05-10 田中纯美 一种用于血管新生、***新生相关疾病的多肽及其用途
CN110684805A (zh) * 2019-11-19 2020-01-14 四川大学华西医院 神经导向因子Sema基因重组慢病毒载体在制备治疗骨关节炎药物中的应用
CN110684805B (zh) * 2019-11-19 2023-08-01 四川大学华西医院 神经导向因子Sema基因重组慢病毒载体在制备治疗骨关节炎药物中的应用
CN112687338A (zh) * 2020-12-31 2021-04-20 云舟生物科技（广州）有限公司 基因序列的存储和还原方法、计算机存储介质及电子设备
CN116790610A (zh) * 2023-05-18 2023-09-22 四川大学 一种治疗骨科疾病的基因及以aav为载体的基因治疗药物

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