CN107805277A - 曼氏无针乌贼***表面蛋白及制备方法和用途 - Google Patents

曼氏无针乌贼***表面蛋白及制备方法和用途 Download PDF

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CN107805277A CN201711069817.4A CN201711069817A CN107805277A CN 107805277 A CN107805277 A CN 107805277A CN 201711069817 A CN201711069817 A CN 201711069817A CN 107805277 A CN107805277 A CN 107805277A
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Abstract

本发明公开了一种曼氏无针乌贼***表面蛋白及其制备方法和用途，首次克隆了曼氏无针乌贼***表面蛋白Sp17的cDNA序列全长，并根据cDNA的氨基酸序列对其物理、化学性质进行预测并构建***进化树。通过荧光定量PCR方法对曼氏无针乌贼***表面蛋白Sp17进行了不同组织表达特异性分析。有益效果为：本发明制备的曼氏无针乌贼***表面蛋白Sp17，对曼氏无针乌贼***的发生、形成起到重要的作用，并且参与顶体反应促进受精过程，对曼氏无针乌贼的生殖起到重大影响，可将其用于曼氏无针乌贼的人工生殖调控。曼氏无针乌贼***表面蛋白Sp17还可用于癌症检测及治疗中的用途。

Description

曼氏无针乌贼***表面蛋白及制备方法和用途
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体是一种曼氏无针乌贼***表面蛋白及制备方法和用途。
背景技术
在生物体的有性生殖过程中，***与***需要最终融合在一起形成受精卵并逐步发育为新的个体，***细胞作为一种高度分化的单倍体细胞在结构和功能上与体细胞差异显著，它在参与受精过程中的功能都是由***发育过程中以及发育成熟后各种相关基因特异性表达的结果，***细胞在结构和功能上的发育成熟是一个高度有序且相当复杂的过程，多种蛋白、离子等生物因子在该过程中发挥作用。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种曼氏无针乌贼***表面蛋白，运用分子生物学技术手段探测曼氏无针乌贼***表面蛋白对曼氏无针乌贼***的产生及受精过程的影响。
本发明的目的之二在于提供一种重现性好，得率高的曼氏无针乌贼***表面蛋白的制备方法。
本发明的目的之三在于提供一种曼氏无针乌贼***表面蛋白的用途，将曼氏无针乌贼***表面蛋白用于曼氏无针乌贼生殖的人工调控和癌症检测及治疗中的用途。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：曼氏无针乌贼***表面蛋白，cDNA全长1463bp，5’非编码区（UTR）92bp，3'非编码区（UTR）222bp，预测的开放阅读框（ORF）共1149bp，编码382个氨基酸，编码蛋白质相对分子质量（MW）为42.058kDa，等电点（pI）4.66。
曼氏无针乌贼***表面蛋白的制备方法，包括曼氏无针乌贼***表面蛋白Sp17基因克隆和组织表达特异性分析。
曼氏无针乌贼***表面蛋白Sp17基因克隆包括RNA提取：取性成熟雄性曼氏无针乌贼的***组织，采用Trizol法提取总RNA液；RNA质量的检验：利用核酸蛋白检测仪测定总RNA液在260nm以及280nm处的吸收波长，260/280值在1.8~2.0之间为合格；cDNA第一链的合成：以检测合格的总RNA液为模板，采用反转录试剂盒进行cDNA第一链的合成；具体的加样体系以及反应条件如下：
200ml微量离心管中加入以下反应体系：
总RNA 2µl
Oligo dt 1µl
DEPC水 3µl
混匀后离心，并置于PCR仪内，设置温度为70℃，反应10min后立即取出，冰浴2min结束；在上述反应体系中继续加入以下试剂：
RNase Inhibitor (40U/l) 0.25µl
dNTP Mixture (10mM) 0.5µl
M-MLV Rtase(200U/l) 0.25µl
5×M-MLV Buffer 2.0µl
H2O（RNase-） 7.0µl
混匀后离心，于PCR仪内设定反应条件为42℃60min，70℃15min，结束后迅速取出，冰浴15min，保存至-20℃备用，长期保存则放置于-80℃冰箱。
曼氏无针乌贼***表面蛋白Sp17基因克隆包括核心序列的扩增：以成熟的曼氏无针乌贼雄性个体***组织的cDNA为模板，利用引物分别扩增得到不同长度的产物片段，该过程所涉及到的反应体系如下：
2×Es Taq MasterMix (Dye) 12.5µl
Primer F 0.5µl
Primer R 0.5µl
cDNA 0.5µl
H2O 11µl
PCR反应条件：95℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，反应30个循环；72℃ 7min；12℃ 5min结束；反应完成后的PCR扩增产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测，对存在目的条带的PCR产物进行纯化回收；所用引物及其序列为：Sp17-1F：AGCAGATGTTAGCCCTTT；Sp17-1R：CTTCAGTATCTTTGGTGCTT；Sp17-2F：TCTTCTAGAGGGTTTCGC；Sp17-2R：TGCAGGAGCTTTTACTTC；Sp17-3F：ACTAAAACTGCTGAAGAG；Sp17-3R：TGTAGCAGCAGCACTGACCT。
曼氏无针乌贼***表面蛋白Sp17基因克隆包括曼氏无针乌贼Sp17基因5’及3’RACE扩增：利用3’RACE和5’RACE技术扩增曼氏无针乌贼Sp17基因；其中，所述Sp17基因3’RACE 所用引物为：3’-Sp17-outter：AGCAAGATCCAGGCAAGTTTTAGAGGTCA；3’-Sp17-inner：ATGCTATCGACATTGACCTAACTGACCCA；3’RACE Adapter：GCGAGCACAGAATTAATATTTTTTTTTTTT；所述Sp17基因5’RACE所用引物：5’-Sp17-outter：GCTCCGAACTGAATGA；5’-Sp17-inner：TTTTGGCTGAGCCCGTAG；5’RACE Adapter：GGCCAGGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG。
曼氏无针乌贼***表面蛋白Sp17基因克隆包括cDNA全长拼接：将经过验证的Sp17核心序列以及3’和5’端序列拼接得到基因的全长cDNA序列，并根据cDNA的氨基酸序列对其物理、化学性质进行预测并构建***进化树。
曼氏无针乌贼***表面蛋白Sp17基因cDNA为：
TGTGACCGGAGAGACTGTCGAGCACGGAATAACACGTGTACCTTGCTATTGAACTAAAGGACAAAGTTAATTCTTCGTTTTGTAAGTTAATCATGTCTGTACCCTTTTCAAACACAAAGTTGAGGGTACCCAGAGGTTTTGAGGCTCTTCTAGAGGGTTTCGCTCGTGAAGTTCTACGGGCTCAGCCAAAATGTATCATTCAGTTCGGAGCCATGCATTTCTCCAATCTTCTCAAGATTCGAACAGAAACAGGCCAAGATCCTGTTGAAGAGTGTGCTGATTTGGAAGATAGGTTCTATAACAATGATTCATTCAAGCATGAAGCTCAAGCAGATGTTAGCCCTTTTGTTGCAGAGACACAGATGGAAGCTCATGCCAGTGAAGAAGTAAAAGCTCCTGCAGAAGAGAAAGTGACTGATAATGCTCAAGAGGAAATTTCACCCAGTGACGTCACAAATGATGAAAATATTTCTGATGCTGCTACAAAGATTCAAGCTGGGTTTAAAGGATACAAGGTTCGAAAAGAAATGAAAGAACGCAAGACTGAACATTCTGAAGAGAAAACGACTGCAGGTACTATAGAAGATGCTGAAGGCACAAAAGATGCTGAAGGCACTAAAACTGCTGAAGAGGCTGCAAATGCTGAAAGCACCAAAGATACTGAAGAGGTTAAAAATGCAGAAGACACTGGAGATGCAGCAGATAATACAAAAGAACAAGAAATACCCAATGAAGAGGTTATAGATATTGACCTCAATGACCCAGAAGTGGCAAACGCTGCTAGCAAGATCCAGGCAAGTTTTAGAGGTCATAAAACCAGGAGAGATCTGCTTAGTAAGCAACAATCAGAACATCTAGAAAATGAAAAAGATGCTAACAACAGTGCAATTACAGAAGACAATGCTATCGACATTGACCTAACTGACCCAGAGGTCAGTGCTGCTGCTACAAAAATTCAAGCAATTTTTCGTGGTCATCAGARCAGGCAAAAACTTAAAGACACTCCTAAGGATCCAGCAAGTGAGAAAACCATGTCTCAAAAATCTGATAGTGCCACACCTGTTCAAGATGCTACTGGTGACCAGGGACAGGAGGATGACAAGTCTATCAACTATGAGGATCCACAGGTCCAACTGGCTGCCACTAAAATCCAAGCTGGCTTTAAAGGCTACCAAACCCGCAAGAGCCTAAAGAAGCAAGCTGGGAATTCAGAGGATCTTGAAAAGGACAGTGGATCCTAACAAGTTGGTGGATGAAAACAGATGGTGTCTTGATGGAAGAATCCTCTGTTCCTCAGTAAAGCTGATAAAATTTATTGTTCTGATATAATTATTTGTATTGATAAAATAACTCTGGTCCTATTCTTATTGGCTTTCTCCCCCTTCATAGTAAGGGAAATGTTCTGGCAAAGATAAATTTCTTATTTTCTTTAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。
组织表达特异性分析包括提取各组织的总RNA并反转录：分别提取性成熟雄性曼氏无针乌贼的脑、视叶、肌肉、胃、鰓、肝、心、***、输精管、储精囊、***、精荚、肠和胰的总RNA，反转录制备real-time PCR实验所需的cDNA模板；反转录之前需去除提取的总RNA中基因组DNA对于real-time PCR实验的干扰，具体步骤如下：
200ml离心管中加入以下反应体系：
总RNA 1ng
5×gDNA Eraser Buffer 2µl
gDNA Eraser 1µl
水（Rnase-） 8µl
混匀后稍许离心，离心管置于PCR仪内，设定反应条件为：42℃ 2min，反应结束后迅速取出置于冰浴中2min。
组织表达特异性分析包括real-time PCR引物设计：根据得到的Sp17基因全长cDNA序列设计用于real-time PCR的引物，具体为：Sp17-YF：TCATTCAGTTCGGAGCCA；Sp17-YR：CCTATCTTCCAAATCAGCACA；Actin-F：TGAGAGGGAGATTGTGCGTG；Actin-R：GAACATAGATTCTGGAGCACGG。
组织表达特异性分析包括荧光定量PCR：采用相对荧光定量的方法，选取肌肉中Sp17基因表达量作为参照，并使用曼氏无针乌贼β-actin基因（S.japonicaJN564496.1）作为内参基因，比较Sp17基因在曼氏无针乌贼脑、视叶、肌肉、胃、鰓、肝、心、***、输精管、储精囊、***、精荚、肠和胰14种不同组织中的表达量差异，并进行差异显著性分析。
曼氏无针乌贼***表面蛋白，用于提高曼氏无针乌贼的生殖调控和癌症检测及治疗中的用途。
与现有技术相比，本发明的优点在于：首次克隆了曼氏无针乌贼***表面蛋白Sp17的cDNA序列全长，并根据cDNA的氨基酸序列对其物理、化学性质进行预测并构建***进化树。通过荧光定量PCR方法对曼氏无针乌贼***表面蛋白Sp17进行了不同组织表达特异性分析。本发明制备的曼氏无针乌贼***表面蛋白Sp17，对曼氏无针乌贼***的发生、形成起到重要的作用，并且参与顶体反应促进受精过程，对曼氏无针乌贼的生殖起到重大影响，可将其用于曼氏无针乌贼的人工生殖调控。曼氏无针乌贼***表面蛋白Sp17还可用于癌症检测及治疗中的用途。本发明制备曼氏无针乌贼***表面蛋白Sp17的方法重现性好，得率高，特别是反转录效率明显高于现有技术。
附图说明
图1为曼氏无针乌贼***总RNA提取电泳图；
图2 为Sp17基因核心片段扩增结果图；
图3 为Sp17基因3’端扩增结果电泳图；
图4 为Sp17基因5’端扩增结果电泳图；
图5为曼氏无针乌贼Sp17基因cDNA全长；
图6为跨膜区预测结果图；
图7 为Sp17信号肽预测结果图；
图8 为Sp17氨基酸同源性比对图；
图9 为Sp17蛋白结构域比对分析图；
图10 为Sp17的二级结构预测图；
图11为基于Sp17同源氨基酸序列构建的***进化树；
图12为曼氏无针乌贼Sp17基因在不同组织的表达图。
附图标记说明：图5中预测的开放阅读框用黑色线框标示出起始密码子（ATG）和终止密码子（TAA）；图8中相同的氨基酸残基用黑色标示，保守氨基酸用灰色标示。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
①***组织总RNA的提取
1）RNA提取前的准备工作：
为了保证RNA提取过程不被污染而造成降解，开始提取RNA之前需要将镊子、剪刀等会直接接触到待提取RNA样本的工具进行DEPC处理，即将这些工具放置于含0.1%DEPC的水溶液中浸泡过夜，并在高温条件下灭菌30min，使用前于无水乙醇中浸泡半小时。实验中使用到的移液器枪头以及离心管均需经过无RNase处理。
2）RNA提取步骤：
a）于1.5ml离心管中加入250mlTrizol试剂，用镊子及剪刀取保存于RNA保存液中的待提取样本约30mg浸入Trizol试剂中，迅速使用手持式电动匀浆器充分匀浆，直至组织分散，液体混浊，补加Trizol试剂至最终体积为1ml；
b）将离心管轻轻混匀，并于室温条件下静置5min，待组织充***解；
c）4℃条件下12000g，离心10min；
d）轻取上层清液，防止搅动下层沉淀，加入到盛有200ml提前预冷的氯仿的新离心管中，剧烈震荡混匀15s，室温静置5min；
e）4℃，12000g，离心15min；
f）离心结束后可见离心管中明显的分为上中下三层，轻取上层清液加入到提前预冷的盛有500ml异丙醇的新离心管中，轻轻混匀后于-20℃条件下静置约1小时；
g）4℃，12000g，离心10min；
h）离心后可见少量附着于管底内侧的白色沉淀，除去上清，加入预冷的75%乙醇溶液1ml，吹吸均匀；
i）4℃，7500g，离心5min；
j）除去上清，保留沉淀，超净工作台中干燥约15~20min，直至乙醇挥干，待管壁上的沉淀变为透明时，加入20mlDEPC处理水溶解RNA。
3）RNA质量的检验：
溶解于DEPC处理水的RNA利用核酸蛋白检测仪测定其在260nm以及280nm处的吸收波长，根据有关资料，260/280值在1.8~2.0之间显示所提取的RNA质量较纯，含有的杂蛋白以及多糖类物质含量较少，低于此范围的RNA不建议使用，高于2.0则说明所提取的RNA有较多降解，不适合下一步扩增基因全长cDNA实验用。测定完成后，取2~3ml上样于1%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件设定为135V和150mA，电泳15min，在凝胶成像分析***下扫描得到电泳结果如图1所示。取少量溶解后的RNA于核酸蛋白检测仪中测定260nm以及280nm处的吸光值，测定结果表明A260/A280比值介于1.80~2.00之间，而且电泳图显示28S条带明显。以上结果说明本次提取的***总RNA纯度较高，虽存在少量降解但仍适用于下一步cDNA第一链的合成反应。
②cDNA第一链的合成：
该步骤采用Takara公司生产的M-MLV Reverse Transcriptase试剂盒，以曼氏无针乌贼***组织中提取的总RNA为模板，进行cDNA第一链的合成，具体的加样体系以及反应条件如下：
200ml微量离心管中加入以下反应体系：
总RNA 2µl
Oligo dt 1µl
DEPC水 3µl
混匀后离心，并置于PCR仪内，设置温度为70℃，反应10min后立即取出，冰浴2min结束。在上述反应体系中继续加入以下试剂：
RNase Inhibitor (40U/l) 0.25µl
dNTP Mixture (10mM) 0.5µl
M-MLV Rtase(200U/l) 0.25µl
5×M-MLV Buffer 2.0µl
H2O（RNase-） 7.0µl
硫代糠酸甲酯 0.3µl
甲基环戊二烯 0.1µl
混匀后离心，于PCR仪内设定反应条件为42℃60min，70℃15min，结束后迅速取出，冰浴15min，保存至-20℃备用，长期保存则放置于-80℃冰箱。本发明采用的硫代糠酸甲酯和甲基环戊二烯与反应体系中其他成分相互作用，可避免因RNA二级结构的不同而产生额外的反转录产物，并且可明显提高反转录酶的活性，提高反转录效率，提高cDNA模板起始浓度。
③曼氏无针乌贼Sp17基因核心序列的扩增：
以成熟的曼氏无针乌贼雄性个体***组织的cDNA为模板，利用表1中引物分别扩增得到不同长度的产物片段，该过程所涉及到的反应体系如下：
2×Es Taq MasterMix (Dye) 12.5µl
Primer F 0.5µl
Primer R 0.5µl
cDNA 0.5µl
H2O 11µl
PCR反应条件：95℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，反应30个循环；72℃ 7min；12℃ 5min结束；
表1克隆Sp17基因核心片段所用引物
Tab 1 Primers used for Sp17 gene clone
引物名称 序列（5’to 3’）
Sp17-1F AGCAGATGTTAGCCCTTT
Sp17-1R CTTCAGTATCTTTGGTGCTT
Sp17-2F TCTTCTAGAGGGTTTCGC
Sp17-2R TGCAGGAGCTTTTACTTC
Sp17-3F ACTAAAACTGCTGAAGAG
Sp17-3R TGTAGCAGCAGCACTGACCT
反应完成后的PCR扩增产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测，对存在目的条带的PCR产物进行纯化回收，具体操作如下：
a）制备1%的琼脂糖凝胶，上样后电泳，电泳条件100V，150mA，20min，电泳结束后，凝胶置于凝胶成像***扫描电泳条带并保存，用干净的刀片割取目的条带于1.5ml离心管（Rnase-）中，电子天平上称取胶条的质量，按照E.Z.N.A TM Gel Extraction Kit说明书给定的比例加入试剂1，置于56℃的恒温水浴中加热10min，期间每隔5min取出震荡混匀，加速溶解；
b）将上述溶解后的混合液全部加入到试剂盒配备的离心柱中，10000rpm离心2min；
c）将收集管中的全部液体再次加入到离心柱中，重复上述操作一次；
d）清空收集管中的残液，并向离心柱中加入700ml的漂洗液，10000rpm离心1min，弃去废液；
e）再次向离心柱中加入700ml漂洗液，并离心；
f）换取干净的收集管，在吸附膜上均匀的滴加20mlEB洗脱液，室温静置2min，12000rpm条件下离心5min，收集得到回收的目的PCR产物片段；
g）取1ml回收产物使用核酸蛋白检测仪测定浓度，并送上海生工生物工程有限公司测序。经过三次PCR扩增，分别得到了长度为338bp、256bp以及336bp的目的片段，如图2所示，送样测序并最终拼接得到了曼氏无针乌贼Sp17基因的核心片段。
④曼氏无针乌贼Sp17基因3，RACE扩增：
a）3’RACE cDNA模板的制备：
提取曼氏无针乌贼***组织的总RNA，根据SMART™ RACE cDNA Amplification Kit试剂盒建议的方法制备3’RACE模板cDNA，具体操作如下：
200ml微量离心管中加入以下试剂：
***总RNA 2µl
3’RACE Adapter 2µl
H2O（Rnase-） 6µl
震荡混匀反应体系，离心后置于PCR仪内，设定条件为70℃2min，反应结束后立即取出，冰浴2min；
向上一步的微量离心管中加入以下试剂：
DTT 2µl
5×Buffer 4µl
dNTP Mixture(10mM) 2µl
PowerScript Reverse Transcriptase 2µl
震荡混匀反应体系，离心后置于PCR仪内，设定条件：42℃1.5小时，70℃7min，反应结束后立即取出冰浴2min，经过核酸蛋白检测仪测定浓度后，稀释至合适浓度后分装于-20℃保存备用。
b）Sp17基因3’端的扩增：
该过程主要是利用巢式PCR技术，扩增得到基因的3’端序列，该步反应中涉及的引物序列见下表，具体操作如下：
表2 Sp17基因3’RACE 所用引物
Tab 2 Primers used for Sp17 gene 3’RACE
引物名称 序列（5’to 3’）
3’-Sp17-outter AGCAAGATCCAGGCAAGTTTTAGAGGTCA
3’-Sp17-inner ATGCTATCGACATTGACCTAACTGACCCA
3’RACE Adapter GCGAGCACAGAATTAATATTTTTTTTTTTT
i）巢式一轮PCR：
200ml离心管中加入以下反应体系：
2×Es Taq MasterMix (Dye) 12.5µl
3’-Sp17-outter 0.5µl
3’RACE Adapter 0.5µl
cDNA 0.5µl
H2O 11µl
混匀该体系离心后置于PCR仪内，设定反应条件为：94℃ 5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，反应30个循环；72℃5min；12℃5min。
ii）巢式二轮PCR：
以一轮PCR产物为模板，200ml离心管中加入以下反应体系：
2×Es Taq MasterMix (Dye) 12.5µl
3’-Sp17-outter 0.5µl
3’RACE Adapter 0.5µl
一轮PCR产物 1.0µl
H2O 10µl
混匀反应体系，离心后置于PCR仪内，设定反应条件如下：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，反应35个循环；72℃5min；12℃5min；
反应结束后产物经过1%琼脂糖凝胶电泳分析，条带如图3所示，目的片段长度为563bp。割取目的条带纯化回收，为提高PCR产物回收浓度，可以将多管PCR产物混合到一起，采用乙醇回收，具体方法：按照PCR产物与无水乙醇体积比1:9混合，静置5分钟后12000r/min，离心5min，弃上清，然后将沉淀用75%乙醇洗涤一次，离心后保留管底的沉淀并挥发干乙醇，加适量水溶解即可。回收后的PCR产物连接到PMD18-T载体上，挑取单菌培养，经过菌液PCR验证为阳性克隆的送至上海生工测序。
⑤曼氏无针乌贼Sp17基因5，RACE扩增：
a）5’RACE模板的制备：
以曼氏无针乌贼***总RNA为模板，反转录方法同样适用于5’RACE的模板cDNA制备，操作步骤如下：
200ml离心管中加入以下试剂：
***总RNA 1.0µl
5’RACE Adapter 1.0µl
水（Rnase-） 13.5µl
混匀反应体系后离心，放置于PCR仪内，设置反应条件为70℃10min，结束后迅速取出冰浴2min。
向上一步反应结束的体系中加入以下试剂：
dNTP Mixture(10mM) 1.0µl
10×PCR Buffer 2.5µl
0.1M DTT 2.5µl
MgCl2(25mM) 2.5µl
混匀反应体系后离心，将离心管置于PCR仪内，设置反应条件为：42℃1min；取出加入SuperScript™ II RT1ml混匀离心后，放回PCR仪内，42℃50min，70℃15min反应结束，取出加入RNase mix 1ml后放回，37℃反应30min。
b）RACE模板cDNA的纯化
根据PCR产物纯化试剂盒操作方法向上一步反应结束的产物中加入5倍体积SolutionI，混合均匀后转移至离心柱中，10000rpm条件下离心1min，除去收集管中的废液，向离心柱中加入350ml的Solution II，12000rpm离心1min，重复一次;更换新的收集管，向离心柱中加入25ml DEPC处理水，室温条件下孵育1min，最后12000rpm条件下离心5min，得到纯化后的cDNA。
c）cDNA加尾，反应体系如下：
纯化后cDNA 20µl
2mM dCTP 5µl
5×Tailing Buffer 10µl
水（RNase-） 13µl
混匀后离心，PCR反应条件设定为：94℃ 3min，结束后迅速取出置于冰上静置2min，加入1ml TdT；37℃ 10min，65℃ 10min后结束反应，取出产物利用核酸蛋白检测仪测定浓度，并用H2O(RNase-)稀释至合适浓度，于-20℃保存备用；
d）Sp17基因5’端扩增：
5’RACE方法依然采用试剂盒推荐的巢式PCR方法进行，涉及的引物序列见下表，具体步骤如下：
表3 Sp17基因5’RACE所用引物
Tab 3 Primers used for sp17 5’RACE
引物名称 序列（5’to 3’）
5’-Sp17-outter GCTCCGAACTGAATGA
5’-Sp17-inner TTTTGGCTGAGCCCGTAG
5’RACE Adapter GGCCAGGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG
i）一轮PCR：
200ml离心管中加入以下试剂：
2×Es Taq MasterMix (Dye) 12.5µl
5’-Sp17-outter 0.5µl
5’RACE Adapter 0.5µl
cDNA 0.5µl
H2O 11µl
混匀反应体系后离心，离心管置于PCR仪中，设定反应条件如下：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，反应30个循环；72℃5min，12℃5min，反应结束后取出；
ii）二轮PCR：
向反应体系中加入以下试剂：
2×Es Taq MasterMix (Dye) 12.5µl
5’-Sp17-inner 0.5µl
5’RACE Adapter 0.5µl
一轮PCR产物 1µl
H2O 11µl
将反应体系混匀并离心，离心管置于PCR仪中，设定反应条件如下：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，反应35个循环；72℃5min，12℃5min，反应结束后取出；
将以上反应结束的PCR产物电泳回收目的条带，产物经过1%琼脂糖凝胶电泳分析，条带如图4所示，目的片段长度为210bp。纯化后的PCR产物连接至PMD18-T载体并转至DH5α感受态细胞中，涂板后挑取单克隆培养，菌液PCR验证后送上海生工测序。
⑥Sp177基因cDNA全长及序列分析：
使用DNAMAN软件对测序得到的核苷酸序列进行比对和全长拼接，得到经过验证的Sp17核心序列以及3’和5’端序列，并拼接得到基因的全长cDNA序列。使用ORFfinder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）在线工具预测基因的开放阅读框（ORF）位置，然后用DNAMAN软件将ORF区核苷酸序列翻译为相应的氨基酸序列。预测Sp17的相对分子质量和等电点使用的是在线工具Expasy-ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）。氨基酸亲/疏水性分析采用在线工具Expasy-ProtScale (http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)，NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）进行氨基酸磷酸化位点分析，scratch protein predictor（http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/）分析氨基酸序列中二硫键位置，蛋白质二级结构预测采用Antheprot5.0软件分析，应用在线工具SignaIP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）对编码的氨基酸序列进行信号肽预测，并用TMHMM Server v .2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/servi-ces/TMHMM/)进行跨膜区结构预测。应用NCBI在线工具对Sp17氨基酸序列进行Blastx和Blastn分析，并用ClustalW2（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）对Sp17及其同源氨基酸序列进行比对，保守结构域分析采用的是NCBI的在线搜索工具Conserved domain search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/-wrpsb.cgi）。***进化分析所选取的其它65条Sp17同源氨基酸序列均来自于NCBI数据库，使用MEGA5.0软件比对并用ClustalW功能对这些氨基酸序列进行初步的处理，然后使用Phylogeny.fr（http://www.phylogeny.fr/）在线网站的Gblooks功能对氨基酸序列进行保守氨基酸的分析，导出相应结果后，应用Modelgenerator软件对氨基酸替代模型进行预测，确定进化树模型参数，最后使用mrBayes软件基于贝叶斯理论构建***进化树。PEST序列分析采用在线网站PEST FIND（http://emboss.bioinformatics.nl/cgibin/emboss/epestfind）工具。
最终拼接得到的曼氏无针乌贼Sp17基因cDNA序列全长共1463bp，5’UTR区92bp，3'UTR区222bp，预测的开放阅读框1149bp，共编码382个氨基酸（图5）。跨膜区分析表明该蛋白不含跨膜区结构（图6），在线信号肽预测结果显示Sp17不含信号肽（图7），因此该蛋白可能定位于在细胞外发挥作用。编码的蛋白质相对分子质量为42.058kDa，等电点4.66，为亲水性蛋白。进一步分析发现，该蛋白氨基酸序列中存在45个可能发生磷酸化修饰的位点，虽不存在明显的二硫键，但是在34和61位氨基酸处存在潜在形成二硫键的可能。
使用ClustalW在线分析（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）Sp17氨基酸同源性，比对结果显示曼氏无针乌贼Sp17氨基酸序列和太平洋牡蛎（Crassostrea gigas XP_011412976.1）、海蜗牛（Aplysia californica XP_012936202.1）、加州双斑蛸（Octopus bimaculoides XP_014778086.1）、光滑双脐螺（Biomphalaria glabrata XP_013090015.1）、紫海胆（Strongylocentrotus purpuratus XP_011680588.1）以及囊舌虫（Saccoglossus kowalevskii XP_006818979.1）的相似性分别为36%、36%、36%、31%、44%和38%，部分氨基酸在进化中的保守情况如图8所示。对应的氨基酸保守结构域如图9所示，在曼氏无针乌贼Sp17以及其同源蛋白中均含有DD CABYR SP17结构域以及至少一个IQ结构域，而且DD CABYR SP17均出现在同一位置（12-50aa）。
通过对Sp17蛋白的二级结构分析发现，其蛋白中含有54%的螺旋（Helix），3%的折叠（Sheet），6%的转角（Turn）以及38%的无规则卷曲（Coil）结构，各结构在在肽链上的相对位置如图10所示。
选取65条曼氏无针乌贼Sp17氨基酸同源序列，基于贝叶斯方法构建***进化树，结果显示曼氏无针乌贼Sp17与加州双斑蛸在进化关系上最近，其次是太平洋牡蛎、海蜗牛、紫海胆、光滑双脐螺以及紫海胆等软体动物以及棘皮动物，与人以及东非狒狒的亲缘关系最远（图11）。
⑦提取曼氏无针乌贼不同组织中总RNA：
按照上述提取曼氏无针乌贼***总RNA的提取方法提取脑、视叶、肌肉、胃、鰓、肝、心、***、输精管、储精囊、***、精荚、肠、胰共14个组织的总RNA，提取的RNA经过测定260/280nm处吸光度以及电泳验证合格后于-20℃保存备用。
⑧cDNA第一链的合成及模板稀释：
将上一步已经提取的来自不同组织的总RNA反转录制备real-time PCR实验所需的cDNA模板，具体方法参照M-MLV Reverse Transcriptase试剂使用说明书。反转录之前需去除提取的总RNA中基因组DNA对于real-time PCR实验的干扰，具体步骤如下：
200ml离心管中加入以下反应体系：
总RNA 1ng
5×gDNA Eraser Buffer 2µl
gDNA Eraser 1µl
水（Rnase-） 8µl
混匀后稍许离心，离心管置于PCR仪内，设定反应条件为：42℃ 2min，反应结束后迅速取出置于冰浴中2min。接下来利用已经去除基因组DNA污染的RNA合成cDNA第一链，这一步反应需要在离心管中加入以下反应体系：
Primer script buffer 24µl
Primerscript RT enzyme mix I1µl
Rt primer mix 1µl
水（Rnase-） 14µl
反应体系混匀后离心，置于PCR仪内设定反应条件为：37℃ 15min，85℃5s，结束后取出反转录产物迅速置于冰浴中15min。产物保存至-20℃冰箱中备用。上机实验之前，已制备的曼氏无针乌贼不同组织cDNA需要稀释到100ng/ml的浓度，该过程需要借助于核酸蛋白检测仪测定cDNA浓度，并计算稀释倍数。
⑨real-time PCR引物设计：
设计用于real-time PCR的引物，并选择曼氏无针乌贼β-actin基因（S.japonicaJN564496.1）作为内参基因。设计的引物之间不存在互补，不会形成二聚体、发卡结构，具体信息为：
表4 曼氏无针乌贼Sp17基因荧光定量PCR使用到的引物
Table 4 Primers of Sp17 in S.japonicaused in quantitative real-time PCR
引物名称 序列（5’to 3’）
Sp17-YF TCATTCAGTTCGGAGCCA
Sp17-YR CCTATCTTCCAAATCAGCACA
Actin-F TGAGAGGGAGATTGTGCGTG
Actin-R GAACATAGATTCTGGAGCACGG
⑩荧光定量PCR：
采用的是相对荧光定量的方法，选取肌肉中Sp17基因表达量作为参照，并使用曼氏无针乌贼β-actin基因（S.japonicaJN564496.1）作为内参基因，比较Sp17基因在曼氏无针乌贼脑、视叶、***、输精管等14种不同组织中的表达量差异。按照SYBR Permix Ex TaqTM IIKit试剂使用说明书，反应体系如下：
2×SYBR 10.0µl
Sp17-YF 0.8µl
Sp17-YR 0.8µl
cDNA 0.8µl
ROX Reference Dye II 0.4µl
H2O 7.2µl
混匀后的反应体系离心后置于荧光定量PCR仪内，每个样品三个副孔。设定反应条件为：94℃30s;94 5s;59℃30s,反应40个循环；55℃~95℃，2min结束。
通过real-time PCR方法对曼氏无针乌贼脑、视叶、肌肉、胃、肠、胰、心脏、肝、鳃、***、输精管、***、储精囊、精荚共14个组织进行了Sp17基因组织表达特异性分析，实验中选取肌肉中Sp17基因的表达量作为参照。如图12所示，Sp17基因在性成熟时期曼氏无针乌贼的***、储精囊中均有显著性表达（p<0.05），在脑、精荚，输精管中也具有较高的表达量，而在其它组织中表达量极低。
曼氏无针乌贼***表面蛋白17（Sp17）基因cDNA全长1463bp，预测的开放阅读框（ORF）共1149bp，编码382个氨基酸，3’UTR区222bp, 5’UTR区92bp。预测编码蛋白的相对分子质量为42.058kDa，pI 4.66。针对该蛋白的信号肽以及跨膜区分析发现，它不存在信号肽以及跨膜区结构，不是细胞内分泌的蛋白，该蛋白氨基酸序列中含有45个的磷酸化位点，这些位点在细胞信号转导过程中发挥作用。其N端的DD CABYR SP17结构域以及位于34和61位氨基酸处潜在的形成二硫键的位点与Sp17蛋白在顶体反应过程中形成的三聚体结构有关。进一步分析发现其氨基酸序列的C端存在一个潜在的PEST位点，这与Sp17蛋白能够被剪切为分子量较小的蛋白的过程有关。肽链上的IQ基序与它能够结合卵膜透明带上的糖基分子起作用有关。而二级结构分析发现螺旋结构在整个肽链上占很大比例，特别是位于IQ结构域内。通过氨基酸同源性比对发现该蛋白在进化中并不保守，与加州双斑蛸的进化关系最近，而相似性最高仅为44%。最后通过对Sp17基因表达量的组织差异性分析，我们发现Sp17基因主要在***与储精囊中有显著表达，在整个性腺中的表达量较其它组织也较高，因此，结合之前的研究成果我们推测Sp17在***的形成以及成熟过程中起作用。
将制备得到的曼氏无针乌贼***表面蛋白用于提高曼氏无针乌贼的生殖调控和癌症检测及治疗中的用途。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 曼氏无针乌贼***表面蛋白及制备方法和用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1463
<212> DNA
<213> 曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)
<400> 1
tgtgaccgga gagactgtcg agcacggaat aacacgtgta ccttgctatt gaactaaagg 60
acaaagttaa ttcttcgttt tgtaagttaa tcatgtctgt acccttttca aacacaaagt 120
tgagggtacc cagaggtttt gaggctcttc tagagggttt cgctcgtgaa gttctacggg 180
ctcagccaaa atgtatcatt cagttcggag ccatgcattt ctccaatctt ctcaagattc 240
gaacagaaac aggccaagat cctgttgaag agtgtgctga tttggaagat aggttctata 300
acaatgattc attcaagcat gaagctcaag cagatgttag cccttttgtt gcagagacac 360
agatggaagc tcatgccagt gaagaagtaa aagctcctgc agaagagaaa gtgactgata 420
atgctcaaga ggaaatttca cccagtgacg tcacaaatga tgaaaatatt tctgatgctg 480
ctacaaagat tcaagctggg tttaaaggat acaaggttcg aaaagaaatg aaagaacgca 540
agactgaaca ttctgaagag aaaacgactg caggtactat agaagatgct gaaggcacaa 600
aagatgctga aggcactaaa actgctgaag aggctgcaaa tgctgaaagc accaaagata 660
ctgaagaggt taaaaatgca gaagacactg gagatgcagc agataataca aaagaacaag 720
aaatacccaa tgaagaggtt atagatattg acctcaatga cccagaagtg gcaaacgctg 780
ctagcaagat ccaggcaagt tttagaggtc ataaaaccag gagagatctg cttagtaagc 840
aacaatcaga acatctagaa aatgaaaaag atgctaacaa cagtgcaatt acagaagaca 900
atgctatcga cattgaccta actgacccag aggtcagtgc tgctgctaca aaaattcaag 960
caatttttcg tggtcatcag arcaggcaaa aacttaaaga cactcctaag gatccagcaa 1020
gtgagaaaac catgtctcaa aaatctgata gtgccacacc tgttcaagat gctactggtg 1080
accagggaca ggaggatgac aagtctatca actatgagga tccacaggtc caactggctg 1140
ccactaaaat ccaagctggc tttaaaggct accaaacccg caagagccta aagaagcaag 1200
ctgggaattc agaggatctt gaaaaggaca gtggatccta acaagttggt ggatgaaaac 1260
agatggtgtc ttgatggaag aatcctctgt tcctcagtaa agctgataaa atttattgtt 1320
ctgatataat tatttgtatt gataaaataa ctctggtcct attcttattg gctttctccc 1380
ccttcatagt aagggaaatg ttctggcaaa gataaatttc ttattttctt taggaaaaaa 1440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1463

Claims (10)

1.曼氏无针乌贼***表面蛋白，其特征在于其cDNA全长1463bp，5’非编码区（UTR）92bp，3'非编码区（UTR）222bp，预测的开放阅读框（ORF）共1149bp，编码382个氨基酸，编码蛋白质相对分子质量（MW）为42.058kDa，等电点（pI）4.66。
2.曼氏无针乌贼***表面蛋白的制备方法，其特征在于包括曼氏无针乌贼***表面蛋白Sp17基因克隆和组织表达特异性分析。
3.根据权利要求2所述的曼氏无针乌贼***表面蛋白的制备方法，其特征在于：所述的曼氏无针乌贼***表面蛋白Sp17基因克隆包括RNA提取：取性成熟雄性曼氏无针乌贼的***组织，采用Trizol法提取总RNA液；RNA质量的检验：利用核酸蛋白检测仪测定总RNA液在260nm以及280nm处的吸收波长，260/280值在1.8~2.0之间为合格；cDNA第一链的合成：以检测合格的总RNA液为模板，采用反转录试剂盒进行cDNA第一链的合成；具体的加样体系以及反应条件如下：
200ml微量离心管中加入以下反应体系：
总RNA 2µl
Oligo dt 1µl
DEPC水 3µl
混匀后离心，并置于PCR仪内，设置温度为70℃，反应10min后立即取出，冰浴2min结束；在上述反应体系中继续加入以下试剂：
RNase Inhibitor (40U/l) 0.25µl
dNTP Mixture (10mM) 0.5µl
M-MLV Rtase(200U/l) 0.25µl
5×M-MLV Buffer 2.0µl
H2O（RNase-） 7.0µl
混匀后离心，于PCR仪内设定反应条件为42℃60min，70℃15min，结束后迅速取出，冰浴15min，保存至-20℃备用，长期保存则放置于-80℃冰箱。
4. 根据权利要求2所述的曼氏无针乌贼***表面蛋白的制备方法，其特征在于：所述的曼氏无针乌贼***表面蛋白Sp17基因克隆包括核心序列的扩增：以成熟的曼氏无针乌贼雄性个体***组织的cDNA为模板，利用引物分别扩增得到不同长度的产物片段，该过程所涉及到的反应体系如下：
2×Es Taq MasterMix (Dye) 12.5µl
Primer F 0.5µl
Primer R 0.5µl
cDNA 0.5µl
H2O 11µl
PCR反应条件：95℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，反应30个循环；72℃ 7min；12℃ 5min结束；反应完成后的PCR扩增产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测，对存在目的条带的PCR产物进行纯化回收；所用引物及其序列为：Sp17-1F：AGCAGATGTTAGCCCTTT；Sp17-1R：CTTCAGTATCTTTGGTGCTT；Sp17-2F：TCTTCTAGAGGGTTTCGC；Sp17-2R：TGCAGGAGCTTTTACTTC；Sp17-3F：ACTAAAACTGCTGAAGAG；Sp17-3R：TGTAGCAGCAGCACTGACCT。
5. 根据权利要求2所述的曼氏无针乌贼***表面蛋白的制备方法，其特征在于：所述的曼氏无针乌贼***表面蛋白Sp17基因克隆包括曼氏无针乌贼Sp17基因5’及3’RACE扩增：利用3’RACE和5’RACE技术扩增曼氏无针乌贼Sp17基因；其中，所述Sp17基因3’RACE 所用引物为：3’-Sp17-outter：AGCAAGATCCAGGCAAGTTTTAGAGGTCA；3’-Sp17-inner：ATGCTATCGACATTGACCTAACTGACCCA；3’RACE Adapter：GCGAGCACAGAATTAATATTTTTTTTTTTT；所述Sp17基因5’RACE所用引物：5’-Sp17-outter：GCTCCGAACTGAATGA；5’-Sp17-inner：TTTTGGCTGAGCCCGTAG；5’RACE Adapter：GGCCAGGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG。
6.根据权利要求2所述的曼氏无针乌贼***表面蛋白的制备方法，其特征在于：所述的曼氏无针乌贼***表面蛋白Sp17基因克隆包括cDNA全长拼接：将经过验证的Sp17核心序列以及3’和5’端序列拼接得到基因的全长cDNA序列，并根据cDNA的氨基酸序列对其物理、化学性质进行预测并构建***进化树。
7. 根据权利要求2所述的曼氏无针乌贼***表面蛋白的制备方法，其特征在于：所述的组织表达特异性分析包括提取各组织的总RNA并反转录：分别提取性成熟雄性曼氏无针乌贼的脑、视叶、肌肉、胃、鰓、肝、心、***、输精管、储精囊、***、精荚、肠和胰的总RNA，反转录制备real-time PCR实验所需的cDNA模板；反转录之前需去除提取的总RNA中基因组DNA对于real-time PCR实验的干扰，具体步骤如下：
200ml离心管中加入以下反应体系：
总RNA 1ng
5×gDNA Eraser Buffer 2µl
gDNA Eraser 1µl
水（Rnase-） 8µl
混匀后稍许离心，离心管置于PCR仪内，设定反应条件为：42℃ 2min，反应结束后迅速取出置于冰浴中2min。
8. 根据权利要求2所述的曼氏无针乌贼***表面蛋白的制备方法，其特征在于：所述的组织表达特异性分析包括real-time PCR引物设计：根据得到的Sp17基因全长cDNA序列设计用于real-time PCR的引物，具体为：Sp17-YF：TCATTCAGTTCGGAGCCA；Sp17-YR：CCTATCTTCCAAATCAGCACA；Actin-F：TGAGAGGGAGATTGTGCGTG；Actin-R：GAACATAGATTCTGGAGCACGG。
9.根据权利要求2所述的曼氏无针乌贼***表面蛋白的制备方法，其特征在于：所述的组织表达特异性分析包括荧光定量PCR：采用相对荧光定量的方法，选取肌肉中Sp17基因表达量作为参照，并使用曼氏无针乌贼β-actin基因（S.japonicaJN564496.1）作为内参基因，比较Sp17基因在曼氏无针乌贼脑、视叶、肌肉、胃、鰓、肝、心、***、输精管、储精囊、***、精荚、肠和胰14种不同组织中的表达量差异，并进行差异显著性分析。
10.曼氏无针乌贼***表面蛋白的用途，其特征在于用于提高曼氏无针乌贼的生殖调控和癌症检测及治疗中的用途。
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