CN106831973A

CN106831973A - 基于弹涂鱼多型卵黄蛋白原的水体***污染检测方法

Info

Publication number: CN106831973A
Application number: CN201710163953.3A
Authority: CN
Inventors: 吴美琴; 陈渊戈; 葛珂珂; 练青平
Original assignee: Ninghai County Sanmenwan Modern Fisheries Park Management Committee; Shanghai Maritime University; East China Sea Fishery Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences; Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries
Current assignee: Ninghai County Sanmenwan Modern Fisheries Park Management Committee; Shanghai Maritime University; Shanghai Ocean University; East China Sea Fishery Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences; Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries
Priority date: 2017-03-17
Filing date: 2017-03-17
Publication date: 2017-06-13
Anticipated expiration: 2037-03-17
Also published as: CN106831973B

Abstract

本发明公开了一种基于弹涂鱼卵黄蛋白原的水体***污染检测方法，属于分子生物学及环境污染检测领域；所述弹涂鱼卵黄蛋白原的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。目前尚未有滩涂鱼类用于环境***的生物活体检测，其相应的生物检测技术缺乏。本发明选择滩涂定居性强对生境敏感的弹涂鱼Periophthalmus modestus活体模型，设计引物，采用实时定量荧光PCR法检测其卵黄蛋白原VtgAa的表达，该检测方法可用于海水，河流入海口等水域环境***污染程度的检测。

Description

基于弹涂鱼多型卵黄蛋白原的水体***污染检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学及环境污染检测领域，具体涉及一种基于新型滩涂模式鱼类-弹涂鱼多型卵黄蛋白原(vitellogenin，vtg)的水体环境***检测方法，可广泛运用于河口滩涂水域的环境***污染程度的评估。

背景技术

工业高速发展的当代，大量化学物质在环境中不合理地释放、现代农业对农药地过分依赖都对环境造成了极大地污染。越来越多的证据表明，环境中存在多种能模拟和干扰动物及人类内分泌机能的物质。这些外源性化合物进入机体后，干扰机体内分泌的合成、释放、运输、代谢、结合等过程，并由此造成动物的雌雄性别的改变以及畸形等病变。这一大类物质称为环境内分泌干扰物(Environmental Endocrine Disrupters，EEDs)、环境***(Enviromental estrogens)、或内分泌活性化合物(Endocrine active compounds)。环境***问题与臭氧层破坏及温室效应相提并论，足见对其重视程度。

目前大部分内分泌干扰物的研究工作还是针对单一化合物的模拟暴露，实际环境体系却包含一系列具有不同***活性的物质。所以，基于单种物质的毒理学数据很难对生态风险进行准确的评估。研究混合物的***活性比研究单种物质更符合实际环境所存在的状态。由不可见效应浓度的几种类***物质组成的混合物具有明显的***活性。建立经济、方便、灵敏的环境***混合物活性检测方法，特别是寻找高效、特异、灵敏的生物标志物已成为环境内分泌干扰物质研究的焦点。

环境***种类繁多，化学分析不能穷究环境样品中的所有具有***效应的污染物，而且仅由环境***的浓度并不能得知其毒性效应的强弱。再次，化学分析方法对仪器的依赖度高，耗时耗力。而生物标志物的运用很好的解决了这一缺陷，通过测定样品的整体内分泌干扰效应而无需知道样品的详细化合物组成，且操作简单、快速、经济和高效的优点，已经成为监测环境内分泌干扰物的主要手段。

弹涂鱼Periophthalmus modestus，隶属于鲈形目、虾虎鱼亚目、弹涂鱼科、弹涂鱼属，栖息于河口咸淡水水域、近岸滩涂处或底质烂泥的低潮区，为沿岸暖水广温广盐性鱼类。

鱼类的卵黄蛋白原(vitellogenin，Vtg)是在***(estradiol-17β，E2)作用下经肝脏合成后分泌到血液中的卵黄前驱蛋白。通常情况下，Vtg是雌鱼在卵黄形成时期血液中出现的雌特异性血清蛋白，但雄鱼和稚鱼在外源性***作用下同样能诱导体内Vtg的生成。根据这一特性，Vtg除了可作为判断性别和雌鱼成熟度的指示蛋白外，也可通过检测雄鱼或稚鱼体内Vtg的异常生成来评价水域环境中外源性***物质(环境***)的污染状况(Specker&Sullivan，1994)。目前国内外已有部分针对卵黄蛋白原开发出类***污染检测方法，但所选择的鱼类模型主要为淡水鲤科鱼类，未见滩涂水域鱼类用于环境***检测方面的专利报道。而淡水鲤科鱼类和弹涂鱼生活的水体完全不同，弹涂鱼由于其生境的特殊性，在环境***检测上的应用具有鲤科鱼类不可替代的实际意义。本研究选用滩涂定居性弹涂鱼作为活体模型，建立了针对卵黄蛋白原的活体环境检测技术，具有较高的创新性和实用性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于弹涂鱼多型卵黄蛋白原的水体***污染检测方法，将其运用于各水域的环境***污染检测。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明涉及一种弹涂鱼卵黄蛋白原在作为检测环境***污染的指示蛋白中的用途，所述弹涂鱼卵黄蛋白原的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，编码所述弹涂鱼卵黄蛋白原的弹涂鱼VtgAa基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1中第3位～第5000位所示。

第二方面，本发明涉及一种检测水生环境污染的测试方法，所述方法包括检测水生环境中的鱼类中弹涂鱼卵黄蛋白原的表达水平，所述弹涂鱼卵黄蛋白原的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述水生环境污染是***效应。

优选的，所述方法包括如下步骤：

S1、从弹涂鱼幼鱼或雄鱼的肝脏组织中提取总RNA，进行反转录扩增；

S2、分别设计VtgAa和内参ef1-α基因荧光定量PCR引物，建立绝对定量PCR法；

S3、对样品中的卵黄蛋白原VtgAa的mRNA表达水平进行定量，分析样品的环境***污染程度。

第三方面，本发明涉及一种克隆弹涂鱼VtgAa基因全长序列的方法，所述方法包括如下步骤：

A1、从性成熟期弹涂鱼雌鱼的肝脏组织中提取总RNA，进行反转录扩增；

A2、设计VtgAa的简并引物进行扩增反应，获得VtgAa基因片段；

A3、以弹涂鱼总RNA为模板根据RACE法分别制备VtgAa基因3’端和5’端cDNA序列；

A4、设计特异性全长引物，扩增获得VtgAa基因全长序列。

优选的，步骤A2中，VtgAa基因对应的简并引物为如SEQ ID NO.3所示的vtgAa-degenerate-F1和如SEQ ID NO.4所示的vtgAa-degenerate-R1。

优选的，步骤A3中，VtgAa基因对应的RACE引物为如SEQ ID NO.7所示的vtgAa-5′RACE-GSP1和如SEQ ID NO.8所示的vtgAa-3′RACE-GSP2。

优选的，步骤A4中，VtgAa基因对应的特异性全长引物为如SEQ ID NO.11所示的vtgAa-full primer-F1和如SEQ ID NO.12所示的vtgAa-full primer-R1。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明获得了弹涂鱼VtgAa基因全长CDS序列，填补了弹涂鱼Vtg基因家族的空白。

2、弹涂鱼是我国东南沿海广泛分布的常见河口性鱼类，Vtg是了解河口咸淡水水域、近岸滩涂处或底质烂泥的低潮区环境***污染的重要生物标志物，获得VtgAa基因全长，对于更准确指示相应水域污染状况，以及更深入探究水生生物在污染水域的蛋白表达等问题具有重要意义。

3、本发明通过设计特异性引物，建立了弹涂鱼VtgAa和ef1-α(内参)基因的实时荧光定量PCR方法。运用荧光定量PCR法检测了VtgAa在***诱导下的表达水平的变化情况，进而指示出环境中的***污染情况。

附图说明

图1为弹涂鱼卵黄蛋白原VtgAa和ef1-α基因的cDNA全长电泳图；其中，M：Marker，1：VtgAa，2：ef1-α；

图2为弹涂鱼VtgAa基因和内参基因ef1-α的荧光定量PCR的标准曲线图；

图3为不同浓度***不同时间诱导下，VtgAa表达水平的变化。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例

本实施例涉及一种弹涂鱼多型卵黄蛋白原(vitellogenin，vtg)基因、编码蛋白及其应用、克隆cDNA全长序列的方法。

VtgAa基因：本发明的弹涂鱼多型VtgAa基因，其特征在于VtgAa序列全长5223bp，包含起始密码子ATG、终止密码子TAG及polyA。该基因的开放阅读框(ORF)位于3～5000bp，长4998bp，共编码1665个氨基酸，其中信号肽为15个氨基酸。根据推算，其编码蛋白分子量为185kDa。该编码氨基酸序列具有典型的完全型卵黄蛋白原结构：1个vitellogenin结构域(位于编码氨基酸肽链的24～594号氨基酸)、1个VWFD结构域(位于编码氨基酸肽链的1423～1555号氨基酸)，1个多聚丝氨酸区域(位于编码氨基酸肽链的1064～1195号氨基酸)，另外还含有1个蛋白水解酶切位点(RSRR)。将该推导氨基酸序列与其他鱼类Vtg氨基酸序列比对后发现，该氨基酸序列包含LvH、LvL、Pv和β组分4个部分。

本发明所述弹涂鱼VtgAa基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所获得的全长VtgAa cDNA序列的编码区为从第3个核苷酸到5000个核苷酸。

本发明所述弹涂鱼VtgAa基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明通过设计特异性引物，引物为如SEQ ID NO.15～18所示，建立了弹涂鱼VtgAa和ef1-α(内参)基因的实时荧光定量PCR方法。运用荧光定量PCR法检测了VtgAa基因在不同浓度***诱导下的表达变化，结果表明：随着浓度的增加诱导效应显著增强；随着暴露时间的增加，VtgAa表达量(同一浓度)存在明显的时间依存效应。

克隆cDNA全长序列的方法：从性成熟期弹涂鱼雌鱼的肝脏组织中提取总RNA，进行反转录扩增，设计Vtg的简并引物，获得相应基因片段；在此基础上，采用SMART RACE技术获得5’和3’端未知序列；最后设计全长上下游引物，克隆获得相应的全长cDNA序列。用Macvector软件确认完整开放阅读框(ORF)并分析其各功能域。通过完整氨基酸序列比对建立***分析图，确定其Vtg类型。

在实施过程中，克隆cDNA全长序列的技术方案可采用如下具体步骤：

1、动物组织器官样品采集：

采集新鲜的怀卵弹涂鱼雌鱼的肝脏，剪碎后置于RNAlater中保存用于总RNA提取。

2、弹涂鱼总RNA的提取及反转录扩增

按照ISOGEN II试剂盒操作说明提取总RNA，具体方法如下：

(1)将肝脏组织(约100mg)放入1.5ml离心管，加入1ml ISOGEN II，电动匀浆棒匀浆后，加入0.4ml RNase free水，15s剧烈振荡后，室温静置10min；在4℃下，12K×g，离心10min。

(2)取上清1ml，加入5μl对溴苯甲醚，15s剧烈振荡后，室温静置3min；在4℃下，12K×g，离心10min。

(3)取上清1ml，加入1ml(等体积)异丙醇，颠倒混匀后室温静置10min；在4℃下，12K×g，离心10min，管底及管壁的白色沉淀即为RNA沉淀。

(4)弃上清，在RNA沉淀中加入0.5ml 75％乙醇洗涤沉淀，在4℃下，7K×g，离心3min，弃上清；重复操作此步骤一次。

(5)室温遮光干燥沉淀2min。

(6)加入50μl(或适量)RNase free水溶解沉淀，此溶液即为总RNA溶液。

(7)用0.8％琼脂糖TAE凝胶电泳检测总RNA完整性；用Thermo Fisher NanoDrop2000分光光度计测定总RNA浓度及纯度。

(8)将上述总RNA按照 VILO^TM cDNA Synthesis Kit(Invitrogen)反转录成cDNA模板。

注：以上所述离心管，匀浆棒等均为RNase free处理。

2、简并引物扩增Vtg基因和ef1-α内参基因片段

Vtg基因属在序列上具有保守性，根据庸鲽、真鲷、鲻鱼、食蚊鱼、矛尾刺虾虎鱼vtg基因CDS序列，用Blast进行序列比对，根据Vtg基因的保守序列设计一对简并引物，根据ef1-α基因的保守序列设计一对特异性引物，序列如下：

vtgAa-degenerate-F1	5’-AARATGAAGCGYRTCMTDMAGGCTCT-3’ SEQ ID NO.3
		vtgAa-degenerate-R1	5'-AACWGGMAGRRCTYSDAKCTTAAAST-3’ SEQ ID NO.4
ef1-α-F1	5'GCCCTGCTGGCCTACACCCT--3’ SEQ ID NO.5
		ef1-α-R1	5’-GGTGGTTCAGGATGATGACCT-3’ SEQ ID NO.6

PCR扩增反应体系为10μl体系：F和R端引物(10μM)各1μl，cDNA模板0.5μl，ddH₂O2.5μl，Master Mix 5μl，反应条件为95℃预变性5min，35个循环(95℃，30s；54℃，30s；72℃，1min)，72℃延伸10min。

4、PCR产物的回收和纯化

取5μl PCR反应物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，用于确认中间序列扩增产物。将目标条带产物用GENECLEAN Turbo Kit(MP Biomedicals Europe，France)割胶纯化回收。

5、PCR扩增目的片段的连接转化

(1)连接：在0.2ml PCR管中加入PCR产物3μl，pGEM-T Easy Vector(Promega，USA)1μl，T4 ligase 1μl，Buffer 5μl，轻轻混匀后，4℃静置过夜。

(2)转化：加连接产物5μl于大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min；42℃热激45s，立刻置于冰上2min；涂平板，将培养皿倒置放入37℃培养箱过夜。

6、阳性克隆的鉴定、测序及序列分析

在0.2ml PCR管中加入10ul如下混合液：AmpliTaq Master Mix 5μl，T7和SP6引物(10μM)各0.5μl，无菌水4ul，用无菌牙签取单一克隆后放入上述PCR管中，使之充分接触后进行菌落PCR验证。PCR反应条件如下：95℃预变性5min；35个循环(95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min)；72℃延伸10min。确认包含目的片段的克隆，扩大培养，用T7和SP6引物测序。结果分别获得579bp VtgAa和640bp ef1-α基因片段。

7、5’RACE和3’RACE扩增弹涂鱼Vtg5’端和3’端基因序列

利用Macvector设计RACE引物如下：

vtgAa-5′RACE-GSP1	5’-CCTGGACCTTGGCTCTTGAGACTATGG-3’ SEQ ID NO.7
		vtgAa-3′RACE-GSP2	5’-GTCACTTGTTCCAAAATGGTGTCTCCGC-3’ SEQ ID NO.8
efl-α-5′RACE-GSP1	5’-CGTTTCCACGACGGATTTCCTTG-3’ SEQ ID NO.9
		ef1-α-3′RACE-GSP2	5’-TGTCCTGGTTCAAGGGATGGAAG-3’ SEQ ID NO.10

按照 RACE 5’/3’Kit(Clontech)说明书进行，以弹涂鱼总RNA为模板制备其3’端和5’端cDNA，与特异性引物(GSP)配制成总体积为25μl的PCR反应液：包括2.5μl10×Advantage 2 PCR bufier，0.5μl dNTPs mix(10mM)，0.5μl GSP(10μM)，2.5μl 10×UPM，1.25μl模板和0.5μl 10×Advantage 2 polymerase mix(Clontech)。PCR反应条件如下：5个循环(94℃，30s；72℃，3min)，5个循环(94℃，30s；70℃，30s；72℃，3min)，25个循环(94℃，30s；68℃，30s；72℃，3min)。

5’RACE和3’RACE进行PCR反应后连接转化步骤同5。

8、扩增VtgAa基因全长序列

根据RACE法获得的3’端和5’端cDNA序列，分别设计特异性全长引物如下：

vtgAa-full primer-F1	5’-CAGCCATGAGAGTCGTTGTACTAGCCT-3’ SEQ ID NO.11
		vtgAa-full primer-R1	5’-CAAGCAGTGGTATCAGCGCAGAGTA-3’ SEQ ID NO.12
efl-α-full primer-F1	5’-GCCTTGAAAAACCCAGAAACACCG-3’ SEQ ID NO.13
		ef1-α-full primer-R1	5’-GGTGATGTGAGGGGAAAGGGAG-3’ SEQ ID NO.14

配置如下PCR反应液：包括10×Advantage 2 PCR buffer(5μl)，dNTPs mix(10mM，1μl)，上下游引物GSP(10μM，各1μl)，模板(1μl)和10×Advantage 2 polymerase mix(1μl)，加N.F.W.至总反应体积为50μl。PCR反应条件如下：95℃预变性1min；5个循环(95℃，30s；68℃，3min)，25个循环(94℃，30s；68℃，30s；72℃，3min)，68℃延伸3min。

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果如图1所示，由图1可知，以cDNA为模板，分别以SEQ ID19和SEQID20引物扩增获得了预期的全长5000bp左右的VtgAa条带；以SEQID23和SEQID24引物扩增获得了预期的全长1500bp左右的ef1-α条带。其中，M：Marker，1：VtgAa，2：ef1-α。

9、***诱导效果试验

(1)试验鱼采自上海崇明岛东滩湿地天然无污染水域，幼鱼，暂养于10个10L玻璃水槽中，水温18，pH值7.5，每日换水一次。

(2)试验诱导剂：内源性******(E2)；助溶剂：无水乙醇。

(3)诱导试验：采用水体中暴露溶解***的方法实施对弹涂鱼卵黄蛋白原的诱导实验。实验分为E2组、对照组，每个处理分成2个平行。E2组设有3个暴露浓度(10ng/L、100ng/L、1000ng/L)。对照组分为空白对照和原始对照，空白对照组水体中加入等剂量的助溶剂无水乙醇，而原始对照组中则不添加任何试剂。在暴露后的0、2和7天对每个处理组进行随机取样，每组5尾，麻醉后活体取肝脏组织，剪碎后加入RNAlater保存液中保存以用于后续实验。

10、样品处理

采用ISOGEN II试剂盒提取肝脏总RNA，分光光度计鉴定RNA质量和检测RNA浓度，取1μg RNA，采用Invitrogen公司反转录试剂盒 VILO^TM cDNA Synthesis Kit反转录成cDNA，10μl反应体系包含2μl 5X VILO^TM Reaction Mix，1μl 10XEnzyme Mix，1μg RNA及DEPC-treated water。反应程序为：25℃，10min；42℃，60min；85℃，5min。反转录获得第一链cDNA，用于下一步实验。

11、实时荧光定量PCR法建立

分别从大肠杆菌中提取含有VtgAa和ef1-α(内参)基因片段的重组质粒，在分光光度计上测量其DNA浓度和纯度。以制备的质粒cDNA(目标基因和内参基因)为模板，稀释成10¹至10⁶拷贝数6个梯度，每个梯度2个重复，制作目的基因Vtg和ef1-α(内参)基因的标准曲线(图2)。根据标准曲线计算出目的基因的实际绝对定量。

实时荧光定量PCR反应采用Power SYBR Green PCR Master Mix(AppliedBiosystems，USA)配置20μl反应体系：2μl cDNA，F and R primer(终浓度200nM)，SYBRGreen Mix(10μl)，N.F.W。同时进行无反转录样本对照和组间对照。PCR反应条件为：1个循环(50℃，2min；95℃，10min)，40个循环(95℃，15s；60℃，1 min)。

根据已得到的卵黄蛋白原VtgAa全长cDNA序列，利用Primer3Plus(http：//www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/)设计如下引物进行实时荧光定量PCR反应。

ef1-αqPCR-F1	5’-TGGTGACAGCAAGAACAACC-3’ SEQ ID NO.15
		ef1-αqPCR-R1	5’-ATGAACTTGCAGGCGATGTG-3’ SEQ ID NO.16
vtgAa-qPCR-F1	5’-AAATTGCCAGAGAGCGCTTG-3’ SEQ ID NO.17
		vtgAa-qPCR-R1	5’-AACAGCTTGCCGTTCATCAG-3’ SEQ ID NO.18

12、VtgAa基因的***诱导结果

由图3实时荧光定量PCR检测VtgAa基因在E2暴露下的表达结果可知，以ef1-α基因作为对照基因，在暴露组均有表达，而在对照组无表达。在低浓度10ng/L下即有表达，随着浓度的增加诱导效应显著增强；从暴露时间上来看，各浓度暴露组又存在明显的时间依存效应。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海海洋大学

<120> 基于弹涂鱼卵黄蛋白原的水体***污染检测方法

<130> 2017

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5223

<212> DNA

<213> Periophthalmus modestus（VtgAa）

<400> 1

acatggggac aacccactca gccatgagag tcgttgtact agccttggct ctagcccttg 60

tggctggcca gcacgataac ttggctccta gttttgctcc cggactaacc tatgtgtaca 120

agtacaatgc ccagagcctg ggaggtctgt ctgaacagca cctagctaaa gccggactca 180

acttcaccag caatgtcaag atcagtgttg cccaagaaaa cgtcctcatg cttcagcttg 240

agaatcctcg gatctatgag ttcagtggtg tttggccaaa ggattcctac gtacaaactc 300

acctccgtgc cgacctggaa gctcatctca aaaccgccat caagttcaaa tatgaccatg 360

ggattgtgag agagatcctg gccccagaga gtgtccccat actgctgctc aacatcttta 420

gaggcatcct caacttcttc cagctgaaca tcaagaagtc acagaatgtt tatgaactgc 480

aggaggaggg agcccagggc gtgtgcaaga cccagtatgc catcacagag aacgataagg 540

ctgagcgcat ccttttgacc aagagcagga acttgaatca ctgccaggag aaggtcatga 600

gggatatcgg gttggcatac actaagacat ggcataagtg ccgggagatt tccaaaaacc 660

tgaggggaac cacaggatac ttctacaagc tgaaggcagc cccaggcggc ttgatcattg 720

agaaggcctc cggaaaggaa gtcattcagt tcacaccttt taatgaccag aatggtgctg 780

cttctatgca gacaatccaa accctggatt tcattgctgc catcaaggct cctattgttc 840

ccatcagtgc tccgtaccat ccacgtggct ccctgaaata tcagttttcc actgagcttc 900

tgcagagccc cctcaggatc cttaagatgt cagacgtgaa ggaacaggtt gctgatgttc 960

tgaacaacct ggttgtcaat aacagagaca aagtacatga ggatgctcct ctcaagtttt 1020

ttgagctgat cctgctgctg cgtgcttctg atttgactga actgcgcaac ctgctgacta 1080

cctacaaaag cagacctctt gagaggcggt ggttgatgga cgccatcagc aacactggaa 1140

caaaggctgc tttggagatt gtcatggctg agatccagaa gagagagcta tctgttcctg 1200

aagccgctca agttttgatt ggaactctgc acatgttgaa gcccactgac gagatcatcc 1260

agaaggtttg gagctacatt gagcagctct cacaggaaca aggacgctac gaacaagttg 1320

tgcgcaaagc tctgttcctg ggctatggta gcatcatcca cagacagagt gttcagaggg 1380

ctgagtggaa tgatcgtgac attcagcgca tccagtcaga ttttgagagg gcctttgctg 1440

agaaaaacac acaggagctt gttctgttgg ctaaagttat ggctaatgct gctcagcctt 1500

ggggctacaa acctattaca aagctcctac caatccatgg cacagctggt gagcaactgt 1560

cccaatcagt tcacattgaa gccatcctgg ccctgagagg cattgccaaa cagaagccca 1620

aagaggttca gaacttggct ctgcagctgt ttatggacac aactctgcag cctgagcagc 1680

gtatgcttgc cgtcatgaca ctctttgaga ccaacccttc aatggccgtc atgactaatg 1740

ttatcaacgt tgtcaagtct gacaacagcc agccagtgat cagctttact tactctctca 1800

tcaagtctca gtccagaagc acagctaacc cctcagtggc acctgaggct aatattgctc 1860

tcagactctt gggccaaagg agacagagca tgaagctgag caaggctttc aaagcggact 1920

tctacagcca tcctctgatg cttggtgctg ctgcaagtat ttattacatc aatgaggctg 1980

ctaccatcct ccccaaagcg gttatagcta agacgagtgc ctatgtcgct ggagctgctg 2040

ctgatgtttt tgagattgga gtcagaagtg agggattcca ggagtacttc ctgaaaaagg 2100

agagctctga tgtctctgat agaaccacca agatgcagcg catcattaaa gctttcacca 2160

actggaagtc tttgccaatc agcaaattgc tgggctctgt gaatgtcaag gttctgggac 2220

aggaaatcgc ttttgttgac attgacgagc agctcattga ggaggcaatg aggattcgct 2280

ctgaaattga catcaaggag tatggcttaa acttactccg tcacttgttc caaaatggtg 2340

tctccgcaca cttggtcaaa gcagtgatgc ccgctgagat cagacgtgtc atgcctactg 2400

ccgcaggcct gccaatggag cttgccttct acactgttgc tgtcactgca gcaaatgtcc 2460

aggccagatt ccaggccaac cttccacaga acttccatgt ttctgacctt ctgaagcaga 2520

agaccaacat tgaggctgac ataaagccaa gcatggccct caacacattt gctgtgatgg 2580

gaatgaacac tgacatcgtt caggctgcca tagtctcaag agccaaggtc caggtcaacg 2640

tgcccgccaa gatagctgct tctttggact tagctgagaa caactttaag atcagtgctc 2700

ttccggttcg cctctctgaa aatgttgcag ttgctgttga cgttgatact ctggccattg 2760

caagacaggc caaacgggta acccctctga ttcccgaaga tgcttctccc caagcatctt 2820

ccgaaacatc ttcatctgct agcgcctcca attctaggga gatactgggt aacatgcagc 2880

aagttcagga caggcccctt cccacgacaa gagttcccag atctgacaag aagttctgca 2940

ctgttactgc tggagtgaag atctgcatca acatcagctc cagcaatgcc aagttcatca 3000

cagattccgc tctctccaga ctggctggaa agcacgctgt tctcatgtct gtcgaacaat 3060

ctgaaagtga caatgtcgag aagtgggaaa tggagcttca gcttggagcc aaggccgcaa 3120

acaagctgat caaaaacatc aacttggaca tggatgaggt cctagagggc acacctattc 3180

tgtccaaact caagagaatc ctgaatccaa gcatgaaaaa caacacctcc tctagctcct 3240

ccagcagctc caggtccaga gttcgtagca gccatccttc ctcctcatcc tcctcctcct 3300

cctcatcgtc caagtctcac atggccggta aagttatcag caccatgggc aaaatcatcg 3360

gggttaacca aaagaggagc agcagcagca gcagcagcag taggagtcag caaaaccgca 3420

agaggcaaag gtccactgtg tccagcctga gctctctgtt cagtgctagc tccagctcct 3480

cacagttttt ccccaagtct cagcgccaga gctctcgttc caaattccag ccaaaccacc 3540

agaagacgac atccaagcgg cactcaggat ctgcctcctc tgcaagaacc tttgaggaca 3600

tcaggaaaca gaacaaattc cttggcaata ccgttgagcc agtttttgca ctgatcctcc 3660

gtgctgtcag agctaacaac aacaatccac tgggctacca gatcgctgcc tataaggatg 3720

gagacagagt tcagatgatc atggctgccc tggcttctca tgacaactgg aggctttgtg 3780

ctgatgccat taaacttagc aagaacaaag ctgctgctaa aattgcatgg ggagagaagt 3840

gccagaaata tgagaccatg attacagctg agtctggccg tgttcagaac aagggacaat 3900

ctcaagatgc agctcgtgtg agagtggcct ggaaaagact gcccactgct gttgtcaaag 3960

atgtcaaaat gatctacaac tccatcattg ccccttactt gtctagtggc tatctgcaga 4020

agagatcaga tgcgaccagg cagatttcct tcactgtggt tgttgagcct aagaaacagc 4080

ttggctttat ttggaaatca ccagcatttg tctacaggag taatgtgcct cttcccatca 4140

ctctgccaat cgatgagctg aaggaagtgc tgccatttga tgaaatgctt gacaacgctc 4200

actatctgtt ggcaaagact actggaattc agtgcagatt taatgaagga cagcttacca 4260

cttccagcaa aagacaacac aagaactaca tgccaaattc ttgctaccag ctgctggctc 4320

aggattgcac cgatgagctt aaattcattg ttttgctgaa gaaggatagc gcaggccgtt 4380

acatggtcaa tgtgaagatt ggtacaaggg atattgacat gttctttaat ggagaaagac 4440

cagctgtcat gatcaatgga aaggaaattg ccagagagcg cttgccatat gacagagatt 4500

cagtgacgat tctgctgatg aacggcaagc tgtttctccg tgctctggac tttggcattg 4560

ctgaactcca attcagtgca tcagaagtga cgatcaatgt tccagagtat ttgaggaaca 4620

aagtctgcgg tctctgcggc caaggcaatg gagacaggag aaacgattac cgcatgccca 4680

atggacgtat cactgataac cccatcagct tcgcccattc ctggactctg ccctctcaga 4740

gttgcagcga tgagactgaa tgtcgtttga ctcatgagtc cattgaactg gagagagaaa 4800

ttaacgatca cggtgtgccg tctaagtgct tctctgtgga ctctgtgctg cgctgtcgcc 4860

ctggctgcac tcccactaag accaccatgt ccagtgtgag cttccactgc agacccctca 4920

atgacaacag ccaagtgtca gatatccgta accgcagcat tgacatgact gagtccgttg 4980

aagcccatct tgactgcagt tgcacttctc agtgtgctta gatcttgtcg tcttatattg 5040

tgtctatgtg taattttaac taaataaatg aaggcatctc aaaagacaaa aaaaaaaaaa 5100

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa tataaagaaa aaaaaaaaaa aaaaaaggta ctctgcgctg 5160

ataccactgc ttgccctata gtgagtcgta ttagaatcga attcccgcgg ccgcatggcg 5220

gcc 5223

<210> 2

<211> 1665

<212> PRT

<213> Periophthalmus modestus（VtgAa）

<400> 2

Met Arg Val Val Val Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Val Ala Gly Gln

1 5 10 15

His Asp Asn Leu Ala Pro Ser Phe Ala Pro Gly Leu Thr Tyr Val Tyr

20 25 30

Lys Tyr Asn Ala Gln Ser Leu Gly Gly Leu Ser Glu Gln His Leu Ala

35 40 45

Lys Ala Gly Leu Asn Phe Thr Ser Asn Val Lys Ile Ser Val Ala Gln

50 55 60

Glu Asn Val Leu Met Leu Gln Leu Glu Asn Pro Arg Ile Tyr Glu Phe

65 70 75 80

Ser Gly Val Trp Pro Lys Asp Ser Tyr Val Gln Thr His Leu Arg Ala

85 90 95

Asp Leu Glu Ala His Leu Lys Thr Ala Ile Lys Phe Lys Tyr Asp His

100 105 110

Gly Ile Val Arg Glu Ile Leu Ala Pro Glu Ser Val Pro Ile Leu Leu

115 120 125

Leu Asn Ile Phe Arg Gly Ile Leu Asn Phe Phe Gln Leu Asn Ile Lys

130 135 140

Lys Ser Gln Asn Val Tyr Glu Leu Gln Glu Glu Gly Ala Gln Gly Val

145 150 155 160

Cys Lys Thr Gln Tyr Ala Ile Thr Glu Asn Asp Lys Ala Glu Arg Ile

165 170 175

Leu Leu Thr Lys Ser Arg Asn Leu Asn His Cys Gln Glu Lys Val Met

180 185 190

Arg Asp Ile Gly Leu Ala Tyr Thr Lys Thr Trp His Lys Cys Arg Glu

195 200 205

Ile Ser Lys Asn Leu Arg Gly Thr Thr Gly Tyr Phe Tyr Lys Leu Lys

210 215 220

Ala Ala Pro Gly Gly Leu Ile Ile Glu Lys Ala Ser Gly Lys Glu Val

225 230 235 240

Ile Gln Phe Thr Pro Phe Asn Asp Gln Asn Gly Ala Ala Ser Met Gln

245 250 255

Thr Ile Gln Thr Leu Asp Phe Ile Ala Ala Ile Lys Ala Pro Ile Val

260 265 270

Pro Ile Ser Ala Pro Tyr His Pro Arg Gly Ser Leu Lys Tyr Gln Phe

275 280 285

Ser Thr Glu Leu Leu Gln Ser Pro Leu Arg Ile Leu Lys Met Ser Asp

290 295 300

Val Lys Glu Gln Val Ala Asp Val Leu Asn Asn Leu Val Val Asn Asn

305 310 315 320

Arg Asp Lys Val His Glu Asp Ala Pro Leu Lys Phe Phe Glu Leu Ile

325 330 335

Leu Leu Leu Arg Ala Ser Asp Leu Thr Glu Leu Arg Asn Leu Leu Thr

340 345 350

Thr Tyr Lys Ser Arg Pro Leu Glu Arg Arg Trp Leu Met Asp Ala Ile

355 360 365

Ser Asn Thr Gly Thr Lys Ala Ala Leu Glu Ile Val Met Ala Glu Ile

370 375 380

Gln Lys Arg Glu Leu Ser Val Pro Glu Ala Ala Gln Val Leu Ile Gly

385 390 395 400

Thr Leu His Met Leu Lys Pro Thr Asp Glu Ile Ile Gln Lys Val Trp

405 410 415

Ser Tyr Ile Glu Gln Leu Ser Gln Glu Gln Gly Arg Tyr Glu Gln Val

420 425 430

Val Arg Lys Ala Leu Phe Leu Gly Tyr Gly Ser Ile Ile His Arg Gln

435 440 445

Ser Val Gln Arg Ala Glu Trp Asn Asp Arg Asp Ile Gln Arg Ile Gln

450 455 460

Ser Asp Phe Glu Arg Ala Phe Ala Glu Lys Asn Thr Gln Glu Leu Val

465 470 475 480

Leu Leu Ala Lys Val Met Ala Asn Ala Ala Gln Pro Trp Gly Tyr Lys

485 490 495

Pro Ile Thr Lys Leu Leu Pro Ile His Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu

500 505 510

Ser Gln Ser Val His Ile Glu Ala Ile Leu Ala Leu Arg Gly Ile Ala

515 520 525

Lys Gln Lys Pro Lys Glu Val Gln Asn Leu Ala Leu Gln Leu Phe Met

530 535 540

Asp Thr Thr Leu Gln Pro Glu Gln Arg Met Leu Ala Val Met Thr Leu

545 550 555 560

Phe Glu Thr Asn Pro Ser Met Ala Val Met Thr Asn Val Ile Asn Val

565 570 575

Val Lys Ser Asp Asn Ser Gln Pro Val Ile Ser Phe Thr Tyr Ser Leu

580 585 590

Ile Lys Ser Gln Ser Arg Ser Thr Ala Asn Pro Ser Val Ala Pro Glu

595 600 605

Ala Asn Ile Ala Leu Arg Leu Leu Gly Gln Arg Arg Gln Ser Met Lys

610 615 620

Leu Ser Lys Ala Phe Lys Ala Asp Phe Tyr Ser His Pro Leu Met Leu

625 630 635 640

Gly Ala Ala Ala Ser Ile Tyr Tyr Ile Asn Glu Ala Ala Thr Ile Leu

645 650 655

Pro Lys Ala Val Ile Ala Lys Thr Ser Ala Tyr Val Ala Gly Ala Ala

660 665 670

Ala Asp Val Phe Glu Ile Gly Val Arg Ser Glu Gly Phe Gln Glu Tyr

675 680 685

Phe Leu Lys Lys Glu Ser Ser Asp Val Ser Asp Arg Thr Thr Lys Met

690 695 700

Gln Arg Ile Ile Lys Ala Phe Thr Asn Trp Lys Ser Leu Pro Ile Ser

705 710 715 720

Lys Leu Leu Gly Ser Val Asn Val Lys Val Leu Gly Gln Glu Ile Ala

725 730 735

Phe Val Asp Ile Asp Glu Gln Leu Ile Glu Glu Ala Met Arg Ile Arg

740 745 750

Ser Glu Ile Asp Ile Lys Glu Tyr Gly Leu Asn Leu Leu Arg His Leu

755 760 765

Phe Gln Asn Gly Val Ser Ala His Leu Val Lys Ala Val Met Pro Ala

770 775 780

Glu Ile Arg Arg Val Met Pro Thr Ala Ala Gly Leu Pro Met Glu Leu

785 790 795 800

Ala Phe Tyr Thr Val Ala Val Thr Ala Ala Asn Val Gln Ala Arg Phe

805 810 815

Gln Ala Asn Leu Pro Gln Asn Phe His Val Ser Asp Leu Leu Lys Gln

820 825 830

Lys Thr Asn Ile Glu Ala Asp Ile Lys Pro Ser Met Ala Leu Asn Thr

835 840 845

Phe Ala Val Met Gly Met Asn Thr Asp Ile Val Gln Ala Ala Ile Val

850 855 860

Ser Arg Ala Lys Val Gln Val Asn Val Pro Ala Lys Ile Ala Ala Ser

865 870 875 880

Leu Asp Leu Ala Glu Asn Asn Phe Lys Ile Ser Ala Leu Pro Val Arg

885 890 895

Leu Ser Glu Asn Val Ala Val Ala Val Asp Val Asp Thr Leu Ala Ile

900 905 910

Ala Arg Gln Ala Lys Arg Val Thr Pro Leu Ile Pro Glu Asp Ala Ser

915 920 925

Pro Gln Ala Ser Ser Glu Thr Ser Ser Ser Ala Ser Ala Ser Asn Ser

930 935 940

Arg Glu Ile Leu Gly Asn Met Gln Gln Val Gln Asp Arg Pro Leu Pro

945 950 955 960

Thr Thr Arg Val Pro Arg Ser Asp Lys Lys Phe Cys Thr Val Thr Ala

965 970 975

Gly Val Lys Ile Cys Ile Asn Ile Ser Ser Ser Asn Ala Lys Phe Ile

980 985 990

Thr Asp Ser Ala Leu Ser Arg Leu Ala Gly Lys His Ala Val Leu Met

995 1000 1005

Ser Val Glu Gln Ser Glu Ser Asp Asn Val Glu Lys Trp Glu Met

1010 1015 1020

Glu Leu Gln Leu Gly Ala Lys Ala Ala Asn Lys Leu Ile Lys Asn

1025 1030 1035

Ile Asn Leu Asp Met Asp Glu Val Leu Glu Gly Thr Pro Ile Leu

1040 1045 1050

Ser Lys Leu Lys Arg Ile Leu Asn Pro Ser Met Lys Asn Asn Thr

1055 1060 1065

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Arg Ser Arg Val Arg Ser Ser

1070 1075 1080

His Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ser

1085 1090 1095

His Met Ala Gly Lys Val Ile Ser Thr Met Gly Lys Ile Ile Gly

1100 1105 1110

Val Asn Gln Lys Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Arg Ser

1115 1120 1125

Gln Gln Asn Arg Lys Arg Gln Arg Ser Thr Val Ser Ser Leu Ser

1130 1135 1140

Ser Leu Phe Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Gln Phe Phe Pro Lys

1145 1150 1155

Ser Gln Arg Gln Ser Ser Arg Ser Lys Phe Gln Pro Asn His Gln

1160 1165 1170

Lys Thr Thr Ser Lys Arg His Ser Gly Ser Ala Ser Ser Ala Arg

1175 1180 1185

Thr Phe Glu Asp Ile Arg Lys Gln Asn Lys Phe Leu Gly Asn Thr

1190 1195 1200

Val Glu Pro Val Phe Ala Leu Ile Leu Arg Ala Val Arg Ala Asn

1205 1210 1215

Asn Asn Asn Pro Leu Gly Tyr Gln Ile Ala Ala Tyr Lys Asp Gly

1220 1225 1230

Asp Arg Val Gln Met Ile Met Ala Ala Leu Ala Ser His Asp Asn

1235 1240 1245

Trp Arg Leu Cys Ala Asp Ala Ile Lys Leu Ser Lys Asn Lys Ala

1250 1255 1260

Ala Ala Lys Ile Ala Trp Gly Glu Lys Cys Gln Lys Tyr Glu Thr

1265 1270 1275

Met Ile Thr Ala Glu Ser Gly Arg Val Gln Asn Lys Gly Gln Ser

1280 1285 1290

Gln Asp Ala Ala Arg Val Arg Val Ala Trp Lys Arg Leu Pro Thr

1295 1300 1305

Ala Val Val Lys Asp Val Lys Met Ile Tyr Asn Ser Ile Ile Ala

1310 1315 1320

Pro Tyr Leu Ser Ser Gly Tyr Leu Gln Lys Arg Ser Asp Ala Thr

1325 1330 1335

Arg Gln Ile Ser Phe Thr Val Val Val Glu Pro Lys Lys Gln Leu

1340 1345 1350

Gly Phe Ile Trp Lys Ser Pro Ala Phe Val Tyr Arg Ser Asn Val

1355 1360 1365

Pro Leu Pro Ile Thr Leu Pro Ile Asp Glu Leu Lys Glu Val Leu

1370 1375 1380

Pro Phe Asp Glu Met Leu Asp Asn Ala His Tyr Leu Leu Ala Lys

1385 1390 1395

Thr Thr Gly Ile Gln Cys Arg Phe Asn Glu Gly Gln Leu Thr Thr

1400 1405 1410

Ser Ser Lys Arg Gln His Lys Asn Tyr Met Pro Asn Ser Cys Tyr

1415 1420 1425

Gln Leu Leu Ala Gln Asp Cys Thr Asp Glu Leu Lys Phe Ile Val

1430 1435 1440

Leu Leu Lys Lys Asp Ser Ala Gly Arg Tyr Met Val Asn Val Lys

1445 1450 1455

Ile Gly Thr Arg Asp Ile Asp Met Phe Phe Asn Gly Glu Arg Pro

1460 1465 1470

Ala Val Met Ile Asn Gly Lys Glu Ile Ala Arg Glu Arg Leu Pro

1475 1480 1485

Tyr Asp Arg Asp Ser Val Thr Ile Leu Leu Met Asn Gly Lys Leu

1490 1495 1500

Phe Leu Arg Ala Leu Asp Phe Gly Ile Ala Glu Leu Gln Phe Ser

1505 1510 1515

Ala Ser Glu Val Thr Ile Asn Val Pro Glu Tyr Leu Arg Asn Lys

1520 1525 1530

Val Cys Gly Leu Cys Gly Gln Gly Asn Gly Asp Arg Arg Asn Asp

1535 1540 1545

Tyr Arg Met Pro Asn Gly Arg Ile Thr Asp Asn Pro Ile Ser Phe

1550 1555 1560

Ala His Ser Trp Thr Leu Pro Ser Gln Ser Cys Ser Asp Glu Thr

1565 1570 1575

Glu Cys Arg Leu Thr His Glu Ser Ile Glu Leu Glu Arg Glu Ile

1580 1585 1590

Asn Asp His Gly Val Pro Ser Lys Cys Phe Ser Val Asp Ser Val

1595 1600 1605

Leu Arg Cys Arg Pro Gly Cys Thr Pro Thr Lys Thr Thr Met Ser

1610 1615 1620

Ser Val Ser Phe His Cys Arg Pro Leu Asn Asp Asn Ser Gln Val

1625 1630 1635

Ser Asp Ile Arg Asn Arg Ser Ile Asp Met Thr Glu Ser Val Glu

1640 1645 1650

Ala His Leu Asp Cys Ser Cys Thr Ser Gln Cys Ala

1655 1660 1665

<210> 3

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> vtgAa-degenerate-F1

<400> 3

Ala Ala Arg Ala Thr Gly Ala Ala Gly Cys Gly Tyr Arg Thr Cys Met

1 5 10 15

Thr Asp Met Ala Gly Gly Cys Thr Cys Thr

20 25

<210> 4

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> vtgAa-degenerate-R1

<400> 4

Ala Ala Cys Trp Gly Gly Met Ala Gly Arg Arg Cys Thr Tyr Ser Asp

1 5 10 15

Ala Lys Cys Thr Thr Ala Ala Ala Ser Thr

20 25

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ef1-α-F1

<400> 5

gccctgctgg cctacaccct 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ef1-α-R1

<400> 6

ggtggttcag gatgatgacc t 21

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> vtgAa-5'RACE-GSP1

<400> 7

cctggacctt ggctcttgag actatgg 27

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> vtgAa-3'RACE-GSP2

<400> 8

gtcacttgtt ccaaaatggt gtctccgc 28

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ef1-α-5'RACE –GSP1

<400> 9

cgtttccacg acggatttcc ttg 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ef1-α-3'RACE -GSP2

<400> 10

tgtcctggtt caagggatgg aag 23

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> vtgAa-full primer-F1

<400> 11

cagccatgag agtcgttgta ctagcct 27

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> vtgAa-full primer-R1

<400> 12

caagcagtgg tatcagcgca gagta 25

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ef1-α-full primer-F1

<400> 13

gccttgaaaa acccagaaac accg 23

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ef1-α-full primer-R1

<400> 14

ggtgatgtga ggggaaaggg ag 22

<210> 15

<211>

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ef1-α qPCR-F1

<400> 15

tggtgacagc aagaacaacc 20

<210> 16

<211>

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ef1-α qPCR-R1

<400> 16

atgaacttgc aggcgatgtg 20

<210> 17

<211>

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> vtgAa-qPCR-F1

<400> 17

aaattgccag agagcgcttg 20

<210> 18

<211>

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> vtgAa-qPCR-R1

<400> 18

aacagcttgc cgttcatcag 20

Claims

1.一种弹涂鱼卵黄蛋白原在作为检测环境***污染的指示蛋白中的用途，所述弹涂鱼卵黄蛋白原的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，编码所述弹涂鱼卵黄蛋白原的弹涂鱼VtgAa基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中第3位～第5000位所示。

3.一种检测水生环境污染的测试方法，其特征在于，所述方法包括检测水生环境中的鱼类中弹涂鱼卵黄蛋白原的表达水平，所述弹涂鱼卵黄蛋白原的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

4.根据权利要求3所述的检测水生环境污染的测试方法，其特征在于，所述水生环境污染是***效应。

5.根据权利要求3所述的检测水生环境污染的测试方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

6.一种克隆弹涂鱼VtgAa基因全长序列的方法，所述方法包括如下步骤：

A2、设计VtgAa的简并引物进行扩增反应，获得VtgAa基因片段；

A4、设计特异性全长引物，扩增获得VtgAa基因全长序列。

7.如权利要求6所述的克隆弹涂鱼VtgAa基因全长序列的方法，其特征在于，步骤A2中，VtgAa基因对应的简并引物为如SEQ ID NO.3所示的vtgAa-degenerate-F1和如SEQ IDNO.4所示的vtgAa-degenerate-R1。

8.如权利要求6所述的克隆弹涂鱼VtgAa基因全长序列的方法，其特征在于，步骤A3中，VtgAa基因对应的RACE引物为如SEQ ID NO.7所示的vtgAa-5′RACE-GSP1和如SEQ ID NO.8所示的vtgAa-3′RACE-GSP2。

9.如权利要求6所述的克隆弹涂鱼VtgAa基因全长序列的方法，其特征在于，步骤A4中，VtgAa基因对应的特异性全长引物为如SEQ ID NO.11所示的vtgAa-full primer-F1和如SEQ ID NO.12所示的vtgAa-full primer-R1。