CN103014001A

CN103014001A - 双峰驼肌球蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法

Info

Publication number: CN103014001A
Application number: CN 201210478250
Authority: CN
Inventors: 陈钢粮
Original assignee: XINJIANG WANGYUAN CAMEL MILK INDUSTRIAL Co Ltd
Current assignee: XINJIANG WANGYUAN CAMEL MILK INDUSTRIAL Co Ltd
Priority date: 2012-11-22
Filing date: 2012-11-22
Publication date: 2013-04-03

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，是一种双峰驼肌球蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法，该双峰驼肌球蛋白基因，其特征在于该基因的核苷酸序列具有SEQIDNO.1所示的序列，该肌球蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:2。对包括SEQIDNO.1在内的九个物种的九条肌球蛋白基因的氨基酸序列构建了***发生树，结果发现：双峰驼与牛、人的肌球蛋白亲缘关系最近，与大熊猫的亲缘关系最远。同时，本发明研究双峰驼的肌球蛋白序列及进化树可以直观的表现出双峰驼肌球蛋白序列与其他物种此蛋白序列的差异，对研究双峰驼及其他物种以及人类的耐力运动提供一定的理论依据促进运动生理学的发展。

Description

双峰驼肌球蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，是一种双峰驼肌球蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法。

背景技术

肌球蛋白（myosin）肌原纤维粗丝的组成单位。存在于平滑肌中。在肌肉运动中起重要作用。其分子形状如豆芽状，由两条重链和多条轻链构成。两条重链的大部分相互螺旋形地缠绕为杆状，构成豆芽状的杆，重链的剩余部分与轻链一起，构成豆芽的瓣。被激活后，具有活性的、能分解ATP的ATP酶。其分子量约为51万。在粗丝中，都是分子的头朝向粗丝的两端，呈纵向线性缔合排列。

肌球蛋白是由森特·吉奥尔吉（A·Szent－Gyrgyi，1942）分离出来的，但是相当于现在所说的肌动球蛋白物质是库恩（W．Khne，1859）最初从蛙抽提出来的，并被命名为肌球蛋白。肌球蛋白的ATP酶活性是由苏联的V．A．Engelhardt夫妇（1939）发现的。

肌球蛋白作为细胞骨架的分子马达，是一种多功能蛋白质，其主要功能是为肌肉收缩提供力。纤丝滑动学说(sliding filament theory)认为肌肉收缩是由于肌动蛋白细丝与肌球蛋白丝相互滑动的结果。在肌肉收缩过程中，粗丝和细丝本身的长度都不发生改变，当纤丝滑动时，肌球蛋白的头部与肌动蛋白的分子发生接触、转动，最后脱离的连续过程，其结果使细丝进行相对的滑动。

1986年 Spudic h实验室首次建立体外模拟滑动体系, 测试肌球蛋白与肌动蛋白相互滑动产生的力。在 1994年 F iner等人成功地用双光钳进行单分子运动测试, 这样就可以在单分子水平上进行肌丝滑动研究以及测试其产生力量的大小，从而对肌球蛋白进行了更深入的研究。2005年，EI-Mounayri等比较了不善运动的人、经常参加运动的人和优秀的越野滑雪选手股外肌单根肌纤维MHC 组成，研究发现，与经常参加运动和优秀的越野选手相比, 不善运动人的肌纤维以Ⅰ型和Ⅱa 型 MHC为主, 另外还含有比例相对较高的 (约 20%) Ⅱb 型MHC 和Ⅱa/Ⅱb 共存型 MHC；经常参加运动的人股外肌含有Ⅰ型 MHC 的纤维明显增加，含有Ⅱb 以及Ⅱa/Ⅱb 共存型 MHC 的纤维明显减少。

有“沙漠之舟”之称的骆驼由于沙漠地面极为松软，限制了骆驼的狂奔疾驰，而沙漠食物的匮乏以及水源的奇缺，又使骆驼不得不具有较快的行走速度和持久的耐力。长期自然选择的结果，使骆驼的体形结构又比其他动物特殊，其颈部较长，呈“乙”字形，有利于保持身体平衡；体躯较短，前腿长，支持面小而重心高，便于躯体的前移和迈出较大的步伐；后肢短而呈刀状，具有较强的推动力和耐久力。

由于骆驼同其他动物相比有持久的耐力，可以适应沙漠中食物的匮乏及水源的奇缺，肌球蛋白是肌肉运动中非常重要的一种蛋白，所以研究骆驼的肌球蛋白有非常重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种双峰驼肌球蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法，肌球蛋白作为细胞骨架的分子马达，是一种多功能蛋白质，其主要功能是为肌肉收缩提供力，通过利用该双峰驼肌球蛋白的基因编码序列构建***发生树，可以直观的表现出双峰驼肌球蛋白序列与其他物种肌球蛋白序列的差异，对研究双峰驼及其他物种以及人类的耐力运动提供一定的理论依据促进运动生理学的发展。

本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种双峰驼肌球蛋白基因，该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列。

下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：

上述基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中21-5939位的序列。

本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种含有双峰驼肌球蛋白基因的重组蛋白。

下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：

上述重组蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO.2所示的序列。

上述重组蛋白为具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

上述重组蛋白通过设计一对引物从双峰驼肌球蛋白中得到双峰驼肌球蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下：

反引物，SEQ ID NO.4（反向）：5’- ATGGGCAAGC TGCTCCAGCA GC -3’，

正引物，SEQ ID NO.3（正向）：5’- CTGGCTGCTG GAGCAGCTTG CC -3’。

本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种双峰驼肌球蛋白基因的克隆方法，其特征在于按下述步骤进行：

第一步，总RNA提取，采取双峰驼组织样品后，对组织样品进行组织总RNA提取；

第二步，引物设计及合成，引物对的核苷酸序列信息如下：

正引物，SEQ ID NO.3（正向）：5’- ATGGGCAAGC TGCTCCAGCA GC -3’，

反引物，SEQ ID NO.4（反向）：5’- CTGGCTGCTG GAGCAGCTTG CC -3’；

第三步，RT-PCR扩增，利用反转录试剂盒对组织样品中的蛋白基因进行反转录，并对待扩增的DNA片段进行RT-PCR扩增；

第四步，蛋白基因的克隆，首先对PCR扩增的DNA片段进行回收，然后将回收的DNA片段同T载体连接形成感受态细胞，将感受态细胞进行转化培养成单菌落，取少量该单菌落进行PCR扩增，对扩增后的单菌落鉴别T载体上是否含有目的DNA片段，若有目的DNA片段，将单菌落放入培养基中进行过夜培养，最后对质粒进行回收。

本发明双峰驼肌球蛋白基因是一种在肌肉运动中起重要作用的蛋白的基因，与骆驼能适应沙漠中食物的匮乏以及水源的奇缺，有较快的行走速度和持久的耐力有很大关系，是非常重要的一种蛋白质，同时，本发明研究双峰驼的肌球蛋白序列及进化树可以直观的表现出双峰驼肌球蛋白序列与其他物种此蛋白序列的差异，为以后研究双峰驼及其他物种中的耐力研究提供实验数据，对研究双峰驼及其他物种以及人类的耐力运动提供一定的理论依据促进运动生理学的发展。因此本发明具有很大的应用价值。

附图说明

图1. 双峰驼肌球蛋白基因RT-PCR产物电泳图

图2. 构建***发生树所用肌球蛋白氨基酸同源性比较

图3. 不同物种肌球蛋白氨基酸序列***进化树

具体实施方式

本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。

下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述：

实施例1，一种双峰驼肌球蛋白基因，该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列。该序列是肌原纤维粗丝的组成单位，存在于平滑肌中，在肌肉运动中起重要作用的蛋白的基因，本发明中的双峰驼肌球蛋白基因的核苷酸序列是通过以双峰驼肝脏组织中总RNA为模板，参考人、鼠、牛等物种的肌球蛋白基因的同源序列设计引物，进行反转录PCR而获得的基因核苷酸序列SEQ ID NO.1。

可根据实际需要，对上述双峰驼肌球蛋白基因作进一步优化或/和改进：

双峰驼肌球蛋白基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中21-5939位所示的序列。在SEQ ID NO.1中，RT-PCR产物长度为5953bp，电泳结果见附图1，其中21-23位为起始密码子ATG，5937-5939位为终止密码子TGA，21-5939位为编码蛋白质区域（CDS）。

实施例2，一种双峰驼肌球蛋白基因的重组蛋白。

可根据实际需要，对上述双峰驼肌球蛋白基因的重组蛋白作进一步优化或/和改进：

重组蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO:2所示的序列。将双峰驼肌球蛋白基因核苷酸序列中的编码序列（CDS）按通用密码子翻译成的重组蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO.2。

重组蛋白为具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

通过设计一对引物从双峰驼肌球蛋白中得到双峰驼肌球蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下：

反引物，SEQ ID NO.4（反向）：5’- ATGGGCAAGC TGCTCCAGCA GC -3’，

正引物，SEQ ID NO.3（正向）：5’- CTGGCTGCTG GAGCAGCTTG CC -3’。

实施例3，一种双峰驼肌球蛋白基因的克隆方法，按下述步骤进行：

第一步，总RNA提取

1. 组织分离(Isolation)

从内蒙古阿拉善盟采得双峰驼，快速屠宰并取肝脏样，将组织样迅速放入液氮中冷冻后于－70℃保存，拿回实验室准备提取组织总RNA；

2. 总RNA的分离(Total RNA isolation)

(1) 提取RNA的准备工作

玻璃制品用0.1M的NaOH浸泡过夜，用自来水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗2遍，180℃烘烤4小时。

匀浆器、电泳槽用3%的双氧水浸泡20-30分钟，再用0.1%的DEPC水冲洗，由于未灭活的DEPC对PCR反应有影响，可用0.5%的SDS处理。

Tip头、EP管用0.1%的DEPC水浸泡过夜,高压灭菌使DEPC失活。

双蒸水和溶液用DEPC处理，即每100ml水或溶液加0.1mlDEPC液，室温放置过夜，高压灭菌30分钟DEPC失活。

（2）组织总RNA提取

取100mg在液氮中冻存的组织样放入有1ml Trizol（trizal reagent, invitrogen BRL, USA）的匀浆器管中匀浆。4℃ 12000g离心10分钟，吸取上清液，15-30℃温育5分钟，加0.2ml氯仿，盖上盖子，用手剧烈震荡15秒，15-30℃温育2-3分钟，4℃ 12000g离心15分钟。吸取上清液，加0.8ml异丙醇，混合均匀。15-30℃温育10分钟，4℃ 12000g离心10分钟，离心管底部白色沉淀即为RNA。倒掉上清，加1ml 75%乙醇洗涤RNA，4℃ 7500g离心10分钟，自然干燥或真空干燥RNA。溶于水（RNase free）中分装，-70℃保存。

（3）组织总RNA的鉴定

通过分光光度计上测定RNA含量并且用琼脂糖电泳分析RNA的质量，具体方法如下：电泳槽用RNA清洗液（100mM NaOH,1mM EDTA）浸泡4－5小时，再用DEPC处理过的水反复冲洗数次后倒入1×TBE待用，琼脂糖凝胶用1×TBE配制。在10ul上样缓冲液（2×TBE，13%菲可，0.1%溴酚兰，7M 尿素）中加入1ul以上组织总RNA，65℃变性10分钟后立即放入冰水中2－3分钟，点样于琼脂糖凝胶中电泳。

第二步，引物设计及合成

根据GenBanK发表的人（Accession No: CAD91136.1）、鼠（Accession No: EDL10431.1）、牛（Accession No: NP_001179691.1）等物种的溶菌酶基因mRNA序列ORF侧翼同源序列，设计如下引物用于以双峰驼溶菌酶cDNA为模版的PCR扩增，以获得双峰驼溶菌酶基因cDNA序列。引物用Primer Premier 5.0自行设计，由上海桑尼生物科技有限公司合成，该引物对的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:3（正向）和SEQ ID NO:4（反向），序列信息如下：

SEQ ID NO.3（正向）：5’- ATGGGCAAGCTGCTCCAGCAGC -3’

SEQ ID NO.4（反向）：5’- CTGGCTGCTGGAGCAGCTTGCC -3’

第三步，RT-PCR扩增

按大连宝生物反转录试剂盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver.1.1)要求进行反转录。反转录反应液组成：10ul 2×Bca 1st Buffer，4ul 25Mm MgSO4，1ul dNTP Mixture，0.5ul Rnase Inhibitor (40U/ul)，1ul BcaBEST Polymerase(22U/ul)，1ul Oligo dT Primer，1ul RNA Sample，1.5ul Rnase Free dH2O，总体系为20 ul。反转录反应条件：65℃1分钟，30℃5分钟（15分钟-30分钟内匀速升温），65℃25分钟，98℃5分钟，5℃5分钟。PCR扩增条件：97℃ 变性5分钟；95℃30秒→55℃30秒→72℃1分钟，如此进行30次循环；72℃延伸10分钟，4℃保存。

第四步，蛋白基因的克隆

1、PCR扩增片段的回收：片段回收按上海华舜小量胶回收试剂盒说明进行，操作过程如下：尽可能小的割下含DNA的琼脂糖块，放入1.5mlEP管中。按每100mg琼脂糖加入300ulS1液的比例加S1液，50℃水浴10分钟。将溶化的琼脂糖液移入吸附柱，10000g离心1分钟，倒掉管中液体。在吸附柱中加入500ul W1液，10000g离心15秒。倒掉管中液体，在吸附柱中加入500ul W1液，静置1分钟后，10000g离心15秒，倒掉管中液体。离心1分钟，将吸附柱放入一个干净的1.5mlEP管中，在吸附膜中央加入30ulT1液，静置1分钟后，10000g离心1分钟， EP管中液体即为回收的DNA。

2、回收片段同T载体的连接：连接用TaKaRa pMD18-T Vector试剂盒，操作过程如下：在EP管中制备下列连接反应液：pMD 18-T Vector(50ng/ul) 0.5ul，DNA 20-40ng，Solution 1 5ul，加dH2O至10ul。将上述反应液在16℃反应30分钟(过夜也可以)，产物用于转化感受态细胞。

3、质粒的转化：从—70℃冰箱中取出保存的感受态细胞，冰浴助溶。100ul感受态细胞加入10ul连接产物，冰浴30分钟。42℃水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟。加400ul液体LB培养基，37℃复活50分钟。取100ul铺于LB平板上，平板含0.1%(V/V)的氨苄青霉Amp (100mg/ml)，37℃恒温培养10-15小时。

4、转化菌落的PCR鉴定与培养：用记号笔标记转化培养的单菌落，用灭菌的牙签蘸取单菌落。将牙签头放入在加有PCR反应液（不含模板）的EP管中晃动，使单菌落充当模板。用获得该片段的PCR条件进行扩增，PCR产物同Marker一起进行琼脂糖凝胶电泳，鉴别T载体上是否含有目的片段，若得到目的片段，可用灭菌枪头挑取在平板上的与之对应的单菌落，放入40 ml LB液体培养基中，先在液体中加入0.1%(V/V)的青霉素钠(100mg/ml)，37℃过夜摇菌培养，用于质粒回收。

5、质粒的回收：质粒回收用上海华舜小量质粒抽提纯化试剂盒，操作步骤如下：将转化培养的菌液加入1.5mlEP管中，4000转/分钟离心，倒掉液体获细菌沉淀。细菌沉淀不够时可再加一次菌液离心。在细菌沉淀中加入250ulP1液，振荡悬浮。加入250ulP2液，温和摇匀，室温静置4分钟。加入350ulP3液，温和摇匀。离心10分钟，将上清液小心移入吸附柱，离心15秒，倒掉液体。在吸附柱中加入500ulW1，离心15秒，倒掉液体。在吸附柱中加入500ulW1，静置1分钟，离心15秒，倒掉液体。离心1分钟，将吸附柱放入一个干净的1.5mlEP管中，在吸附膜中央加入25-30ulT1液，静置1分钟后，离心1分钟，EP管中液体即为回收的质粒。

6、质粒的酶切鉴定：为了证明回收质粒确为***目的片段的重组质粒,采用双酶切法鉴定。本研究具体操作如下：根据TaKaRa pMD18-T Vector图，选择内切酶Bam HⅠ和Hin d Ⅲ，保证目的片段中无这两种酶的切点。组成如下酶切反应体系：Bam HⅠ1ul，Hin d Ⅲ 1ul，10×K Buffer 2ul，DNA ≤1ul，加dH2O至 20ul。30℃反应3小时，琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例4，重组质粒的测序：取20ul重组质粒于EP管中，封口膜密封，交生物技术公司测序。

实施例5，双峰驼肌球蛋白基因序列信息与生物信息学分析和***发生树构建

1、双峰驼肌球蛋白的序列信息与生物信息学分析

本发明新的双峰驼嗅觉感受器CDS的长度为5953 bp，详细序列见SEQ ID NO:1。根据全长CDS推导出双峰驼嗅觉感受器的氨基酸序列，共1972个氨基酸残基，详见SEQ ID NO:2，在线预测（http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html）结果显示，其分子量为227223.04 道尔顿，等电点（pI）为5.63。

2、肌球蛋白基因编码序列***发生树构建

在GenBank上搜索并获得人、鼠等八种物种的八条肌球蛋白基因的编码蛋白序列，加上本发明获得的SEQ ID NO.2序列，利用分子生物学软件MEGA4构建了***发生树（见附图3）。结果显示：双峰驼肌球蛋白基因同牛、人的亲缘关系最近。与大熊猫的亲缘关系最远。

双峰驼的肌球蛋白核苷酸序列与其他物种的肌球蛋白氨基酸序列相似性评价：

在SEQ ID NO.1，双峰驼肌球蛋白基因编码1972个氨基酸。双峰驼和人、鼠、牛等动物用Clustal X 中对齐的肌球蛋白基因编码氨基酸序列同源性比较结果见附图2。其氨基酸序列与人、鼠、牛等物种肌球蛋白氨基酸序列相似性见表一。

序列表：

<110> 新疆旺源驼奶实业有限公司

<120> 双峰驼肌球蛋白的蛋白编码序列

<160> 4

<210> 1

<211> 5953

<212> DNA

<213> 阿拉善盟双峰驼

<400> 1

gaccgaccaa gaccatcact atgagttcag accaggaaat ggctgtcttt ggggaggctg 60

ctccttacct ccgaaagtct gaaaaggagc gcatcgaggc ccagaatagg ccctttgatg 120

ccaagacatc agtctttgtg gctgagccca aggaatcctt tgtcaaaggg acgatccaga 180

gcagagaagg agggaaagtg acggtgaaga ccgaaggagg agcgactctg acagtgaaag 240

atgaccaagt ctaccccatg aaccctccca aatttgacaa gatcgaggac atggccatga 300

tgacccacct gcacgagcca ggagtgctgt acaacctcaa agagcgttac gcagcctgga 360

tgatctacac ctactcgggc ctgttctgcg tcaccgtcaa cccctacaag tggctgccgg 420

tgtacaaccc cgaggtggtg acggcctaca gaggcaaaaa gcgccaggag gccccgcccc 480

acatcttctc catctctgac aatgcctatc agttcatgct gactgaccga gagaatcagt 540

caatcctgat caccggagaa tccggggctg ggaagacggt gaacacgaag cgtgtcatcc 600

agtactttgc aacaattgca gttactgggg agaagaagaa ggaggaatct ggcaaaatgc 660

aggggactct ggaagatcag atcatcagtg ccaaccccct actggaggcc tttggcaacg 720

ccaagaccgt gaggaatgac aactcctctc gctttggtaa attcatcaga atccactttg 780

gcactacagg aaaactggct tctgctgata ttgaaacata tctgctggag aagtctagag 840

ttactttcca gcttaaagct gaaaggagct atcatatttt ttaccagatc acatcaaaca 900

ggaagccaga actaattgaa atgcttctga ttaccaccaa cccatatgat tacccattcg 960

tcagtcaagg ggagatcagt gtgcccagca ttgatgatca ggaagaactg atagcgacag 1020

atagtgccat tgatattttg ggctttacta atgaagagaa ggtctccatc tacaagctca 1080

cgggggctgt gatgcactat ggaaacttga agttcaagca aaagcaacgt gaggagcaag 1140

cagagccaga tggcactgaa gttgctgaca aggcagccta cctccagagt ctgaactctg 1200

ctgacctgct caaagccctc tgctttccca gggtcaaggt cggcaacgaa ttcgtcacca 1260

aaggccagac tgtagagcag gtgaccaatg cggtgggtgc tctggccaga gctgtctacg 1320

agaagatgtt cctgtggatg gtcacccgca tcaaccagca gctggacacc aagcagcccc 1380

ggcagtactt catcggggtc ttggacatcg ctggctttga gatctttgat ttcaacagcc 1440

tggagcagct gtgcatcaac ttcaccaacg agaaactgca acagtttttc aaccaccaca 1500

tgttcgtgct ggagcaggag gagtacaaga aggagggcat tgagtggacg ttcatcgact 1560

tcgggatgga cttggctgcc tgcatcgagc tcatcgagaa gcctatgggc atcttctcca 1620

tcctggaaga ggagtgcatg ttccccaagg ccacagacat ctccttcaag aacaagctct 1680

atgagcagca tcttggaaag tctgccaact tccagaagcc caaggttacc aaaggcaagc 1740

ccgaggccca cttctccctg attcactacg cgggcgtggt gaactacaac attattggct 1800

ggctggacaa gaacaaggac cccctgaacg acaccgtggt cgggctgtac cagaagtcag 1860

cattgaagac tctggctctc ctcttctctg gaagagaaac tgaagcagag tctgttggaa 1920

agaaaggtgg taagaagaag ggttcttcct tccagaccgt gtctgctctc ttcagggaga 1980

atttgaacaa gctgatgacc aacctgagga gcactcaccc tcactttgta cggtgcatca 2040

tccccaatga aaccaaaact cccggggcca tggagcatga actggtcctg caccagctgc 2100

gctgtaacgg agtgctggag ggcatccgca tctgcaggaa gggcttcccc agcaggatcc 2160

tctatgcaga cttcaaacag agatacaagg tattaaatgc aagtgccatc cctgaaggac 2220

agttcattga cagcaagaag gcttctgaga agctccttgg gtccatcgac attgaccaca 2280

cccagtacaa attcggtcac accaaggtct ttttcaaagc tggtcttctg gggctcctag 2340

aggagatgcg agatgagaag ctggcccagc tgatgacccg aacccaggcc aggtgcagag 2400

ggttcttggc aagagtggag taccagaaga tggtggagag caggtgcaga gggttcttgg 2460

caagagtgga gtaccagaag atggtggaga ggagggagtc catcttctgc attcagtaca 2520

acatccgagc cttcatgaac gtcaagcact ggccctggat gaaactgttc ttcaagatca 2580

agcccctcct caagagtgcg gagaccgaga aggagatggc caccatgaag gaagagttcc 2640

agaaaactaa agacgaactt gccaagtcag aagcaaaaag gaaggaactg gaagaaaaaa 2700

tggtgtcact gttgaaagaa aaaaatgact tgcagctcca ggttcagtct gaagctgaag 2760

gcttggctga tgcagaggaa agatgtgacc agttgatcaa aaccaaaatc cacctggagg 2820

ccaagatcaa ggaggtgact gagagagctg aggatgagga agagatcaac gctgagctga 2880

cggccaagaa gaggaagctg gaggacgaat gttcagagct gaagaaagac atagatgacc 2940

ttgagctgac actggccaag gttgaaaagg aaaagcatgc tacagagaac aaggtgaaaa 3000

acctcacaga agagatggca ggactggatg aagtcatagc taagctgacc aaggagaaga 3060

aggccctcca ggaggcccac cagcagaccc tggatgacct acaggcagaa gaggacaaag 3120

tcaacaccct gaccaaagct aaaaccaagc tagagcagca agtggatgac cttgaaggat 3180

ccttggagca agaaaagaaa cttcgcatgg atctagagag ggccaagagg aaacttgaag 3240

gtgacctcaa gttggcccaa gagtccataa tggacattga aaatgaaaaa caacaacttg 3300

atgaaaagct caaaaagaaa gagtttgaaa ttggaaattt gcaaagcaag attgaagatg 3360

aacaagcact tggcattcaa ctgcagaaga agatcaaaga gctgcaagcc cgcatcgagg 3420

agctggagga ggatagcaat acgtcctgca gagctgtcca tggagacgcc cgcacagagg 3480

agctggagga agaggtcgaa gcagagcaca acctcagagc caagatcgag aagcagcgcg 3540

cggatctggc ccgggaactg gaggagatca gcgagcggct ggaagaagcc ggtggggcga 3600

cttcagccca gatcgagatg aacaagaagc gggaggccga gttccagaaa atgcgccggg 3660

acctggagga ggccaccctg cagcacgagg ccacggcggc cgcgctgagg aagaagcacg 3720

cggacagcgt ggccgagctg ggggagcaga tcgacaacct gcagagggtc aagcagaagc 3780

tggagaagga gaagagtgag atgaagatgg agatcgatga cctggccagc aatgtagaaa 3840

caatctctaa agccaaggga aacctagaga agatgtgccg cactctggag gaccaagtga 3900

gtgaactgaa atcgaaggag gaagagcagc agcggctgat caatgacctg acagctcaga 3960

gggcacgctt gcagaccgaa tctggtgaat tttcacgtca gctagatgaa aaggaaactc 4020

tggtgtctca gttatcaagg ggcaaacaag catttactca acagattgag gaattaaaga 4080

ggcagcttga agaggagata aaggccaaga acgccctggc ccacgccctg cagtcctccc 4140

gccacgactg cgacctgctg cgggaacagt acgaggagga gcaggaatcc aaggccgagc 4200

tgcagagggc gatgtccaag gccaacacgg aggtggccca gtggaggacc aaatacgaga 4260

cggacgccat ccagcgcacg gaggagctgg aggaggccaa gaagaagctg gcccagcgtc 4320

tgcaggctgc tgaggagcac gtggaagctg tgaatgccaa gtgcgcctcc cttgagaaga 4380

ccaagcagcg gctccagaat gaggttgagg acctcatgct ggatgtggag aggacaaacg 4440

cagcctgcgc ggccctggac aaaaagcaaa ggaacttcga caaggtcctg gcagaatgga 4500

aacagaagta tgaggaaacc catgccgagc tggaggcctc ccagaaggag gctcgctcgc 4560

ttggcactga gctgttcaag atgaagaatg cctacgagga gtccctggat cagctagaaa 4620

ctttgaaacg agagaacaaa aacttgcagc aggagatttc tgacctcacg gagcagattg 4680

cagaaggagg gaaacgtatc cacgaactgg agaaaataaa gaagcaagtg gaacaagaga 4740

agtctgaact tcaggctgct ttagaggaag cagaggcatc tcttgaacat gaagagggta 4800

agatcttgcg catccagctg gagttgaacc aagtcaagtc tgagattgac agaaaaattg 4860

ctgaaaagga tgaggaaatt gaccagctga agaggaacca cgttagagtc gtcgagtcaa 4920

tgcagagtat gctggatgct gagatcagga gcagaaatga tgccatcaga ctcaagaaga 4980

agatggaggg agacctcaat gaaatggaaa tccagctgaa ccatgccaac cgcatggctg 5040

ctgaagccct gaggaactac aggaacaccc aaagcatcct caaggacacc cagctacacc 5100

tggacgatgc tctccggggc caggaggacc tgaaggagca gctggccatg gtggagcgca 5160

gagccaacct gctgcaggcc gagattgagg agctgcgggc ctccctggag cagacggaga 5220

ggagcaggaa aatcgcagaa caggagctcc tggacgccag tgagcgcgtc cagctgctgc 5280

acacccagaa caccagccta atcaacacca agaagaagct ggagacagac atctcccaac 5340

tccagggaga gatggaggac attctccagg aagctcgcaa cgcagaagag aaggccaaga 5400

aggccatcac tgacgcggcc atgatggccg aggagctgaa gaaggagcag gacaccagcg 5460

cccacctgga gcggatgaag aagaacatgg aacagacggt gaaggacctg cagaaccgcc 5520

tggacgaggc tgagcagctg gccctgaagg gcgggaagaa gcagatccag aagctggagg 5580

ccagggtacg tgagctggaa ggagaggttg agagtgagca aaagcgtaac gtggaagccg 5640

tcaagggcct gcgcaaacat gagaggagag tgaaggaact cacctaccag acggaagaag 5700

atcggaaaaa tattctcagg cttcaagacc tggtagataa acttcaggca aaagtgaaat 5760

cttacaagag acaagctgag gaggctgagg aacaatccaa tacaaatcta tctaaattcc 5820

gcaaactcca gcatgaactg gaggaagccg aggagagggc tgacattgct gaatcccagg 5880

tcaacaagct gcgggtgaag agccgggagg ttcacacgaa agtcataagt gaagagtgaa 5940

tttttatcaa tta 5953

<210> 2

<211> 1972

<212> PRT

<213> 阿拉善盟双峰驼

<400> 2

Met Ser Ser Asp Gln Glu Met Ala Val Phe Gly Glu Ala Ala Pro Tyr

1 5 10 15

Leu Arg Lys Ser Glu Lys Glu Arg Ile Glu Ala Gln Asn Arg Pro Phe

20 25 30

Asp Ala Lys Thr Ser Val Phe Val Ala Glu Pro Lys Glu Ser Phe Val

35 40 45

Lys Gly Thr Ile Gln Ser Arg Glu Gly Gly Lys Val Thr Val Lys Thr

50 55 60

Glu Gly Gly Ala Thr Leu Thr Val Lys Asp Asp Gln Val Tyr Pro Met

65 70 75 80

Asn Pro Pro Lys Phe Asp Lys Ile Glu Asp Met Ala Met Met Thr His

85 90 95

Leu His Glu Pro Gly Val Leu Tyr Asn Leu Lys Glu Arg Tyr Ala Ala

100 105 110

Trp Met Ile Tyr Thr Tyr Ser Gly Leu Phe Cys Val Thr Val Asn Pro

115 120 125

Tyr Lys Trp Leu Pro Val Tyr Asn Pro Glu Val Val Thr Ala Tyr Arg

130 135 140

Gly Lys Lys Arg Gln Glu Ala Pro Pro His Ile Phe Ser Ile Ser Asp

145 150 155 160

Asn Ala Tyr Gln Phe Met Leu Thr Asp Arg Glu Asn Gln Ser Ile Leu

165 170 175

Ile Thr Gly Glu Ser Gly Ala Gly Lys Thr Val Asn Thr Lys Arg Val

180 185 190

Ile Gln Tyr Phe Ala Thr Ile Ala Val Thr Gly Glu Lys Lys Lys Glu

195 200 205

Glu Ser Gly Lys Met Gln Gly Thr Leu Glu Asp Gln Ile Ile Ser Ala

210 215 220

Asn Pro Leu Leu Glu Ala Phe Gly Asn Ala Lys Thr Val Arg Asn Asp

225 230 235 240

Asn Ser Ser Arg Phe Gly Lys Phe Ile Arg Ile His Phe Gly Thr Thr

245 250 255

Gly Lys Leu Ala Ser Ala Asp Ile Glu Thr Tyr Leu Leu Glu Lys Ser

260 265 270

Arg Val Thr Phe Gln Leu Lys Ala Glu Arg Ser Tyr His Ile Phe Tyr

275 280 285

Gln Ile Thr Ser Asn Arg Lys Pro Glu Leu Ile Glu Met Leu Leu Ile

290 295 300

Thr Thr Asn Pro Tyr Asp Tyr Pro Phe Val Ser Gln Gly Glu Ile Ser

305 310 315 320

Val Pro Ser Ile Asp Asp Gln Glu Glu Leu Ile Ala Thr Asp Ser Ala

325 330 335

Ile Asp Ile Leu Gly Phe Thr Asn Glu Glu Lys Val Ser Ile Tyr Lys

340 345 350

Leu Thr Gly Ala Val Met His Tyr Gly Asn Leu Lys Phe Lys Gln Lys

355 360 365

Gln Arg Glu Glu Gln Ala Glu Pro Asp Gly Thr Glu Val Ala Asp Lys

370 375 380

Ala Ala Tyr Leu Gln Ser Leu Asn Ser Ala Asp Leu Leu Lys Ala Leu

385 390 395 400

Cys Phe Pro Arg Val Lys Val Gly Asn Glu Phe Val Thr Lys Gly Gln

405 410 415

Thr Val Glu Gln Val Thr Asn Ala Val Gly Ala Leu Ala Arg Ala Val

420 425 430

Tyr Glu Lys Met Phe Leu Trp Met Val Thr Arg Ile Asn Gln Gln Leu

435 440 445

Asp Thr Lys Gln Pro Arg Gln Tyr Phe Ile Gly Val Leu Asp Ile Ala

450 455 460

Gly Phe Glu Ile Phe Asp Phe Asn Ser Leu Glu Gln Leu Cys Ile Asn

465 470 475 480

Phe Thr Asn Glu Lys Leu Gln Gln Phe Phe Asn His His Met Phe Val

485 490 495

Leu Glu Gln Glu Glu Tyr Lys Lys Glu Gly Ile Glu Trp Thr Phe Ile

500 505 510

Asp Phe Gly Met Asp Leu Ala Ala Cys Ile Glu Leu Ile Glu Lys Pro

515 520 525

Met Gly Ile Phe Ser Ile Leu Glu Glu Glu Cys Met Phe Pro Lys Ala

530 535 540

Thr Asp Ile Ser Phe Lys Asn Lys Leu Tyr Glu Gln His Leu Gly Lys

545 550 555 560

Ser Ala Asn Phe Gln Lys Pro Lys Val Thr Lys Gly Lys Pro Glu Ala

565 570 575

His Phe Ser Leu Ile His Tyr Ala Gly Val Val Asn Tyr Asn Ile Ile

580 585 590

Gly Trp Leu Asp Lys Asn Lys Asp Pro Leu Asn Asp Thr Val Val Gly

595 600 605

Leu Tyr Gln Lys Ser Ala Leu Lys Thr Leu Ala Leu Leu Phe Ser Gly

610 615 620

Arg Glu Thr Glu Ala Glu Ser Val Gly Lys Lys Gly Gly Lys Lys Lys

625 630 635 640

Gly Ser Ser Phe Gln Thr Val Ser Ala Leu Phe Arg Glu Asn Leu Asn

645 650 655

Lys Leu Met Thr Asn Leu Arg Ser Thr His Pro His Phe Val Arg Cys

660 665 670

Ile Ile Pro Asn Glu Thr Lys Thr Pro Gly Ala Met Glu His Glu Leu

675 680 685

Val Leu His Gln Leu Arg Cys Asn Gly Val Leu Glu Gly Ile Arg Ile

690 695 700

Cys Arg Lys Gly Phe Pro Ser Arg Ile Leu Tyr Ala Asp Phe Lys Gln

705 710 715 720

Arg Tyr Lys Val Leu Asn Ala Ser Ala Ile Pro Glu Gly Gln Phe Ile

725 730 735

Asp Ser Lys Lys Ala Ser Glu Lys Leu Leu Gly Ser Ile Asp Ile Asp

740 745 750

His Thr Gln Tyr Lys Phe Gly His Thr Lys Val Phe Phe Lys Ala Gly

755 760 765

Leu Leu Gly Leu Leu Glu Glu Met Arg Asp Glu Lys Leu Ala Gln Leu

770 775 780

Met Thr Arg Thr Gln Ala Arg Cys Arg Gly Phe Leu Ala Arg Val Glu

785 790 795 800

Tyr Gln Lys Met Val Glu Ser Arg Cys Arg Gly Phe Leu Ala Arg Val

805 810 815

Glu Tyr Gln Lys Met Val Glu Arg Arg Glu Ser Ile Phe Cys Ile Gln

820 825 830

Tyr Asn Ile Arg Ala Phe Met Asn Val Lys His Trp Pro Trp Met Lys

835 840 845

Leu Phe Phe Lys Ile Lys Pro Leu Leu Lys Ser Ala Glu Thr Glu Lys

850 855 860

Glu Met Ala Thr Met Lys Glu Glu Phe Gln Lys Thr Lys Asp Glu Leu

865 870 875 880

Ala Lys Ser Glu Ala Lys Arg Lys Glu Leu Glu Glu Lys Met Val Ser

885 890 895

Leu Leu Lys Glu Lys Asn Asp Leu Gln Leu Gln Val Gln Ser Glu Ala

900 905 910

Glu Gly Leu Ala Asp Ala Glu Glu Arg Cys Asp Gln Leu Ile Lys Thr

915 920 925

Lys Ile His Leu Glu Ala Lys Ile Lys Glu Val Thr Glu Arg Ala Glu

930 935 940

Asp Glu Glu Glu Ile Asn Ala Glu Leu Thr Ala Lys Lys Arg Lys Leu

945 950 955 960

Glu Asp Glu Cys Ser Glu Leu Lys Lys Asp Ile Asp Asp Leu Glu Leu

965 970 975

Thr Leu Ala Lys Val Glu Lys Glu Lys His Ala Thr Glu Asn Lys Val

980 985 990

Lys Asn Leu Thr Glu Glu Met Ala Gly Leu Asp Glu Val Ile Ala Lys

995 1000 1005

Leu Thr Lys Glu Lys Lys Ala Leu Gln Glu Ala His Gln Gln Thr Leu

1010 1015 1020

Asp Asp Leu Gln Ala Glu Glu Asp Lys Val Asn Thr Leu Thr Lys Ala

1025 1030 1035 1040

Lys Thr Lys Leu Glu Gln Gln Val Asp Asp Leu Glu Gly Ser Leu Glu

1045 1050 1055

Gln Glu Lys Lys Leu Arg Met Asp Leu Glu Arg Ala Lys Arg Lys Leu

1060 1065 1070

Glu Gly Asp Leu Lys Leu Ala Gln Glu Ser Ile Met Asp Ile Glu Asn

1075 1080 1085

Glu Lys Gln Gln Leu Asp Glu Lys Leu Lys Lys Lys Glu Phe Glu Ile

1090 1095 1100

Gly Asn Leu Gln Ser Lys Ile Glu Asp Glu Gln Ala Leu Gly Ile Gln

1105 1110 1115 1120

Leu Gln Lys Lys Ile Lys Glu Leu Gln Ala Arg Ile Glu Glu Leu Glu

1125 1130 1135

Glu Asp Ser Asn Thr Ser Cys Arg Ala Val His Gly Asp Ala Arg Thr

1140 1145 1150

Glu Glu Leu Glu Glu Glu Val Glu Ala Glu His Asn Leu Arg Ala Lys

1155 1160 1165

Ile Glu Lys Gln Arg Ala Asp Leu Ala Arg Glu Leu Glu Glu Ile Ser

1170 1175 1180

Glu Arg Leu Glu Glu Ala Gly Gly Ala Thr Ser Ala Gln Ile Glu Met

1185 1190 1195 1200

Asn Lys Lys Arg Glu Ala Glu Phe Gln Lys Met Arg Arg Asp Leu Glu

1205 1210 1215

Glu Ala Thr Leu Gln His Glu Ala Thr Ala Ala Ala Leu Arg Lys Lys

1220 1225 1230

His Ala Asp Ser Val Ala Glu Leu Gly Glu Gln Ile Asp Asn Leu Gln

1235 1240 1245

Arg Val Lys Gln Lys Leu Glu Lys Glu Lys Ser Glu Met Lys Met Glu

1250 1255 1260

Ile Asp Asp Leu Ala Ser Asn Val Glu Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

1265 1270 1275 1280

Asn Leu Glu Lys Met Cys Arg Thr Leu Glu Asp Gln Val Ser Glu Leu

1285 1290 1295

Lys Ser Lys Glu Glu Glu Gln Gln Arg Leu Ile Asn Asp Leu Thr Ala

1300 1305 1310

Gln Arg Ala Arg Leu Gln Thr Glu Ser Gly Glu Phe Ser Arg Gln Leu

1315 1320 1325

Asp Glu Lys Glu Thr Leu Val Ser Gln Leu Ser Arg Gly Lys Gln Ala

1330 1335 1340

Phe Thr Gln Gln Ile Glu Glu Leu Lys Arg Gln Leu Glu Glu Glu Ile

1345 1350 1355 1360

Lys Ala Lys Asn Ala Leu Ala His Ala Leu Gln Ser Ser Arg His Asp

1365 1370 1375

Cys Asp Leu Leu Arg Glu Gln Tyr Glu Glu Glu Gln Glu Ser Lys Ala

1380 1385 1390

Glu Leu Gln Arg Ala Met Ser Lys Ala Asn Thr Glu Val Ala Gln Trp

1395 1400 1405

Arg Thr Lys Tyr Glu Thr Asp Ala Ile Gln Arg Thr Glu Glu Leu Glu

1410 1415 1420

Glu Ala Lys Lys Lys Leu Ala Gln Arg Leu Gln Ala Ala Glu Glu His

1425 1430 1435 1440

Val Glu Ala Val Asn Ala Lys Cys Ala Ser Leu Glu Lys Thr Lys Gln

1445 1450 1455

Arg Leu Gln Asn Glu Val Glu Asp Leu Met Leu Asp Val Glu Arg Thr

1460 1465 1470

Asn Ala Ala Cys Ala Ala Leu Asp Lys Lys Gln Arg Asn Phe Asp Lys

1475 1480 1485

Val Leu Ala Glu Trp Lys Gln Lys Tyr Glu Glu Thr His Ala Glu Leu

1490 1495 1500

Glu Ala Ser Gln Lys Glu Ala Arg Ser Leu Gly Thr Glu Leu Phe Lys

1505 1510 1515 1520

Met Lys Asn Ala Tyr Glu Glu Ser Leu Asp Gln Leu Glu Thr Leu Lys

1525 1530 1535

Arg Glu Asn Lys Asn Leu Gln Gln Glu Ile Ser Asp Leu Thr Glu Gln

1540 1545 1550

Ile Ala Glu Gly Gly Lys Arg Ile His Glu Leu Glu Lys Ile Lys Lys

1555 1560 1565

Gln Val Glu Gln Glu Lys Ser Glu Leu Gln Ala Ala Leu Glu Glu Ala

1570 1575 1580

Glu Ala Ser Leu Glu His Glu Glu Gly Lys Ile Leu Arg Ile Gln Leu

1585 1590 1595 1600

Glu Leu Asn Gln Val Lys Ser Glu Ile Asp Arg Lys Ile Ala Glu Lys

1605 1610 1615

Asp Glu Glu Ile Asp Gln Leu Lys Arg Asn His Val Arg Val Val Glu

1620 1625 1630

Ser Met Gln Ser Met Leu Asp Ala Glu Ile Arg Ser Arg Asn Asp Ala

1635 1640 1645

Ile Arg Leu Lys Lys Lys Met Glu Gly Asp Leu Asn Glu Met Glu Ile

1650 1655 1660

Gln Leu Asn His Ala Asn Arg Met Ala Ala Glu Ala Leu Arg Asn Tyr

1665 1670 1675 1680

Arg Asn Thr Gln Ser Ile Leu Lys Asp Thr Gln Leu His Leu Asp Asp

1685 1690 1695

Ala Leu Arg Gly Gln Glu Asp Leu Lys Glu Gln Leu Ala Met Val Glu

1700 1705 1710

Arg Arg Ala Asn Leu Leu Gln Ala Glu Ile Glu Glu Leu Arg Ala Ser

1715 1720 1725

Leu Glu Gln Thr Glu Arg Ser Arg Lys Ile Ala Glu Gln Glu Leu Leu

1730 1735 1740

Asp Ala Ser Glu Arg Val Gln Leu Leu His Thr Gln Asn Thr Ser Leu

1745 1750 1755 1760

Ile Asn Thr Lys Lys Lys Leu Glu Thr Asp Ile Ser Gln Leu Gln Gly

1765 1770 1775

Glu Met Glu Asp Ile Leu Gln Glu Ala Arg Asn Ala Glu Glu Lys Ala

1780 1785 1790

Lys Lys Ala Ile Thr Asp Ala Ala Met Met Ala Glu Glu Leu Lys Lys

1795 1800 1805

Glu Gln Asp Thr Ser Ala His Leu Glu Arg Met Lys Lys Asn Met Glu

1810 1815 1820

Gln Thr Val Lys Asp Leu Gln Asn Arg Leu Asp Glu Ala Glu Gln Leu

1825 1830 1835 1840

Ala Leu Lys Gly Gly Lys Lys Gln Ile Gln Lys Leu Glu Ala Arg Val

1845 1850 1855

Arg Glu Leu Glu Gly Glu Val Glu Ser Glu Gln Lys Arg Asn Val Glu

1860 1865 1870

Ala Val Lys Gly Leu Arg Lys His Glu Arg Arg Val Lys Glu Leu Thr

1875 1880 1885

Tyr Gln Thr Glu Glu Asp Arg Lys Asn Ile Leu Arg Leu Gln Asp Leu

1890 1895 1900

Val Asp Lys Leu Gln Ala Lys Val Lys Ser Tyr Lys Arg Gln Ala Glu

1905 1910 1915 1920

Glu Ala Glu Glu Gln Ser Asn Thr Asn Leu Ser Lys Phe Arg Lys Leu

1925 1930 1935

Gln His Glu Leu Glu Glu Ala Glu Glu Arg Ala Asp Ile Ala Glu Ser

1940 1945 1950

Gln Val Asn Lys Leu Arg Val Lys Ser Arg Glu Val His Thr Lys Val

1955 1960 1965

Ile Ser Glu Glu

1970

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<400> 3

atgggcaagc tgctccagca gc 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<400> 4

ctggctgctg gagcagcttg cc 22

Claims

1.一种双峰驼肌球蛋白基因，其特征在于该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列。

2.根据权利要求1所述的双峰驼肌球蛋白基因，其特征在于该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中21-5939位的序列。

3.一种含有权利要求1或2所述的双峰驼肌球蛋白基因的重组蛋白。

4.根据权利要求3所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO.2所示的序列。

5.根据权利要求3或4所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白为具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

6.根据权利要求3或4所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼肌球蛋白中得到双峰驼肌球蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下：

正引物，SEQ ID NO.3（正向）：5’- ATGGGCAAGC TGCTCCAGCA GC -3’，

反引物，SEQ ID NO.4（反向）：5’- CTGGCTGCTG GAGCAGCTTG CC -3’。

7.根据权利要求5所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼肌球蛋白中得到双峰驼肌球蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下：

正引物，SEQ ID NO.3（正向）：5’- ATGGGCAAGC TGCTCCAGCA GC -3’，

反引物，SEQ ID NO.4（反向）：5’- CTGGCTGCTG GAGCAGCTTG CC -3’。

8.一种根据权利要求1或2所述的双峰驼肌球蛋白基因的克隆方法，其特征在于按下述步骤进行：

第二步，引物设计及合成，引物对的核苷酸序列信息如下：

正引物，SEQ ID NO.3（正向）：5’- ATGGGCAAGC TGCTCCAGCA GC -3’，

反引物，SEQ ID NO.4（反向）：5’- CTGGCTGCTG GAGCAGCTTG CC -3’；