CN107782805B - 一种双嘧达莫合成的关键中间体杂质hplc分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双嘧达莫合成的关键中间体杂质HPLC分析方法，该方法以苯基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以含有酸性添加剂的有机相为流动相A，含有酸性添加剂的水溶液为流动相B，采用梯度洗脱方法，检测波长为210‑230nm，对双嘧达莫关键中间体2,6‑二氯‑4,8‑二(哌啶‑1‑基)嘧啶并[5,4‑d]嘧啶及其相关杂质进行分离测定。该方法具有分离度好、简单快速、专属性强、灵敏度高，能够对双嘧达莫合成过程中的关键中间体二氯化物进行质量控制，使后处理简化并保证终产物的质量。

Description

一种双嘧达莫合成的关键中间体杂质HPLC分析方法

技术领域

本发明涉及药物化学及分析领域，具体涉及一种双嘧达莫合成的关键中间体杂质HPLC分析方法。

背景技术

双嘧达莫(Dipyridamole)，是一种抗血小板聚集和冠状动脉扩张药，它通过抑制腺苷的细胞吸收和代谢，提高环磷酸腺苷浓度等多种作用模式防止血栓的形成，与阿司匹林联合使用有协同扩张冠状血管及降低血小板凝聚作用，临床上主要用于防止脑血栓的形成、降低心肌梗塞的治疗，为心脑血管治疗领域的主要用药，化学结构式如下：

式2为双嘧达莫的合成路线及合成过程的杂质谱分析谱图。从图中可以看出，整个合成过程是首先通过四氯化物(2,4,6,8-四氯嘧啶并[5,4-d]嘧啶)与哌啶缩合生成关键中间体二氯化物(2,6-二氯-4,8-二(哌啶-1-基)嘧啶并[5,4-d]嘧啶)，随后二氯化物与二乙醇胺缩合生成双嘧达莫产物。不难发现，在整个反应过程中，随着关键中间体二氯化物(2,6-二氯-4,8-二(哌啶-1-基)嘧啶并[5,4-d]嘧啶)的产生，出现了大量的副反应杂质产物，主要有一氯化物(2-氯-4,6,8-三(哌啶-1-基)嘧啶并[5,4-d]嘧啶)、三氯化物(2,4,6-三氯-8-(哌啶-1-基)嘧啶并[5,4-d]嘧啶)、四氯化物(2,4,6,8-四氯嘧啶并[5,4-d]嘧啶)。

近年来，为了提高产率、纯度及更适合于商业化生产，双嘧达莫的合成工艺得到了很多改进，如美国专利US 8946414 B2公开的一种双嘧达莫的制备工艺以及中国专利201510118075.4中公开的一种双嘧达莫纯化工艺的报道，但其中所针对的均是二氯化物与二乙醇胺反应的改进及对所得到的双嘧达莫粗品的纯化。

此外，现行的欧洲药典(EP 8.0)中规定了特定杂质，即杂质A、B、C、D、E、F、G，虽然与二乙醇胺缩合后生成的双嘧达莫粗品及后续精制过程的有关物质水平可以采用此标准进行监控，但二氯化物作为合成双嘧达莫前一步的中间体，其杂质水平的高低直接决定了成品的质量以及后续处理程度的难易。

因此，根据杂质需从源头控制的理念考虑，有必要建立一种新的用于双嘧达莫合成质量控制的关键中间体杂质分析方法，即基于对二氯化物前后步骤中的杂质进行监测和控制，使杂质能由工艺上得到有效控制，从而便于后处理，保证后续产品的质量。该方法有利于加强双嘧达莫产品内控质量，为工艺条件的优化提供必要的理论和实践依据。

发明内容

本发明的目的在于建立一种用于双嘧达莫合成质量控制的关键中间体杂质分析方法，该方法具有分离度好、简单快速、专属性强、灵敏度高，能够对双嘧达莫合成过程中的关键中间体二氯化物进行质量控制，使后处理简化并保证终产物的质量。

为了达到上述目的，本发明采用高效液相色谱法(HPLC)，其通过如下技术方案实现:

以苯基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以含有酸性添加剂的有机相为流动相A，含有酸性添加剂的水溶液为流动相B，采用梯度洗脱方法，检测波长为210-230nm,对双嘧达莫关键中间体二氯化物(2,6-二氯-4,8-二(哌啶-1-基)嘧啶并[5,4-d]嘧啶)及其杂质进行分离测定。

根据本发明，所述杂质为一氯化物(2-氯-4,6,8-三(哌啶-1-基)嘧啶并[5,4-d]嘧啶)、三氯化物(2,4,6-三氯-8-(哌啶-1-基)嘧啶并[5,4-d]嘧啶)、四氯化物(2,4,6,8-四氯嘧啶并[5,4-d]嘧啶)。

根据本发明，在填料的选择方面，由于二氯化物属于双环共轭含氮杂环类结构，四氯化物及不同哌啶取代个数的三氯或一氯化物均可看作二氯化物的位置异构体，而对于苯环异构的分离，苯基与被测物之间的π-π共轭作用比C18填料的疏水分配相互作用的选择性更强，也更为适合。因此，色谱柱填料采用苯基硅烷键合硅胶。

在洗脱步骤方面，采用梯度洗脱方法，是由于各物质的极性相差较大，相比等度洗脱方法，采用梯度条件更易实现二氯化物与其相关杂质的有效分离，空白无干扰，杂质之间的分离度均在2.0以上，由于梯度洗脱改善了峰形，杂质的灵敏度得到显著提高。

根据本发明，梯度洗脱的具体步骤可以为：

0min，流动相A为45％～50％；0～5min，流动相A以45％～50％等度洗脱；5～20min，流动相A增加至75％～90％；20～30min，流动相A以75％～90％等度洗脱；30～35min，流动相A线性减小至45％～50％；35min后平衡色谱柱，其中流动相A和B均为体积百分比。

根据本发明的实施方式之一，在流动相中添加酸。其原因是，含氮杂环类物质一般显弱碱性，且二氯化物及其特定杂质的溶解性较差，通过在流动相中添加酸可使被测物增强离子化，提高溶解度，从而有助于分离。流动相中的酸性添加剂为磷酸、冰醋酸、三氟乙酸、甲酸中的一种酸。优选地，酸性添加剂为磷酸。

根据本发明的实施方式之一，酸性添加剂的浓度可以为0.05％-0.2％。优选地，酸性添加剂的浓度为0.1％。

根据本发明的实施方式之一，有机相为乙腈、甲醇中的一种。优选地，有机相为乙腈。

所述色谱条件还可以进一步优选检测波长为220nm；流动相流速为0.8-1.2mL/min，优选为1.0mL/min；色谱柱的柱温为20-30℃，优选为25℃。

此外，本发明还采用了氯仿-乙腈混合物作为稀释剂，采用的样品进样量为10μL。

由于采用了上述杂质分析方法，使得本发明具有分离度好、简单快速、专属性强、灵敏度高的特点，能够对双嘧达莫合成过程中的关键中间体二氯化物进行质量控制，保证整个合成过程的可控性。故该法可以作为双嘧达莫关键中间体二氯化物中杂质水平的监测手段，同时也可为二氯化物中杂质控制策略提供有益的借鉴和依据。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为实施例1中等度洗脱条件分析二氯化物的HPLC图；

图2为实施例2中三氯化物、二氯化物及一氯化物混合对照品溶液的HPLC图；

图3为实施例2中四氯化物溶液的HPLC图；

图4为实施例3中三氯化物、二氯化物及一氯化物混合对照品溶液的HPLC图；

图5为实施例3中四氯化物溶液的HPLC图；

图6为实施例4中三氯化物、二氯化物及一氯化物混合对照品溶液的HPLC图；

图7为实施例4中四氯化物溶液的HPLC图；

图8为实施例5中***适用性溶液的HPLC图；

图9为实施例5中空白溶剂的HPLC图；

图10为实施例5中供试品溶液HPLC图。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明并不限于下面的实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。本领域的技术人员在权利要求的范围内所作出的某些改变和调整也应认为属于本发明的范围。

实施例1等度洗脱(对比实验)

仪器与条件

高效液相色谱仪：Agilent 1260

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱(Bondapak4.6×250mm,5μm)

流速：1.0mL/min

检测波长：220nm

柱温：25℃

稀释剂：氯仿-乙腈

进样量：10μL

流动相：乙腈:水＝92:8

实验步骤

精密称取二氯化物50mg，置50mL量瓶中，加氯仿溶解、并加乙腈稀释定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图1，三氯化物和一氯化物相对于二氯化物的保留时间分别为0.33和2.47。虽然二氯化物与其相关杂质的分离度满足要求，但三氯化物出峰较早，一氯化物却出峰较晚，前者易受基线干扰，后者峰形容易扁宽，灵敏度有所降低，由此可见，在等度洗脱方法下，由于一氯化物、二氯化物与三氯化物三者的极性相差较大，且在流动相中，有机相已占90％以上，可调整的空间也很有限，因此很难实现理想的分离。

实施例2

仪器与条件

高效液相色谱仪：Agilent 1260

色谱柱：苯基硅烷键合硅胶柱(Kromasil 4.6×250mm,5μm)

流速：1.0mL/min

检测波长：220nm

柱温：25℃

稀释剂：氯仿-乙腈

进样量：10μL

流动相：流动相A：含0.1％磷酸的乙腈溶液；流动相B：含0.1％磷酸的水溶液

梯度洗脱：

实验步骤

步骤一：溶液配制

***适用性溶液：分别称取四氯化物、三氯化物、二氯化物和一氯化物对照品适量，精密称定，加氯仿适量溶解，并用乙腈稀释，制成每1mL中分别约含0.5mg的混合对照品，作为***适用性溶液。

供试品溶液：精密称取二氯化物20mg，置10mL量瓶中，加氯仿溶解、并稀释定容至刻度，摇匀，再精密量取2.5mL，置10mL量瓶中，加乙腈稀释定容至刻度，摇匀，即得。

对照溶液：精密量取供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。

步骤二：测定

1、精密量取***适用性溶液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。***适用性溶液的色谱图中，出峰顺序为四氯化物、三氯化物、二氯化物和一氯化物，各峰之间的分离度应不小于2.0。

2、精密量取空白溶液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。

3、精密量取对照溶液10μL，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的10％。

4、精密量取供试品溶液和对照溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图2，三氯化物和一氯化物相对于二氯化物的保留时间分别为0.71和1.18，四氯化物结果见附图3，相对于二氯化物的保留时间约为0.55。

实施例3

仪器与条件

高效液相色谱仪：Agilent 1260

色谱柱：苯基硅烷键合硅胶柱(Kromasil 4.6×250mm,5μm)

流速：1.1mL/min

检测波长：210nm

柱温：22℃

稀释剂：氯仿-乙腈

进样量：10μL

流动相：流动相A：含0.1％磷酸的甲醇溶液；流动相B：含0.1％磷酸的水溶液

梯度洗脱：

实验步骤

实验步骤同实施例2，结果见附图4，三氯化物和一氯化物相对于二氯化物的保留时间分别为0.85和1.08，四氯化物结果见附图5，相对于二氯化物的保留时间约为0.72。

实施例4

仪器与条件

高效液相色谱仪：Agilent 1260

色谱柱：苯基硅烷键合硅胶柱(Kromasil 4.6×250mm,5μm)

流速：0.9mL/min

检测波长：230nm

柱温：27℃

稀释剂：氯仿-乙腈

进样量：10μL

流动相：流动相A：含0.2％磷酸的乙腈溶液；流动相B：含0.2％磷酸的水溶液

梯度洗脱：

实验步骤

实验步骤同实施例2，结果见附图6，三氯化物和一氯化物相对于二氯化物的保留时间分别为0.78和1.07，四氯化物结果见附图7，相对于二氯化物的保留时间约为0.62。

实施例5

仪器与条件

高效液相色谱仪：Agilent 1260

色谱柱：苯基硅烷键合硅胶柱(Kromasil 4.6×250mm,5μm)

流速：1.0mL/min

检测波长：220nm

柱温：25℃

稀释剂：氯仿-乙腈

进样量：10μL

流动相：流动相A：含0.05％磷酸的乙腈溶液；流动相B：含0.05％磷酸的水溶液

梯度洗脱：

实验步骤

实验步骤同实施例2，结果见附图8，四氯化物、三氯化物和一氯化物相对于二氯化物的保留时间分别为0.62、0.78、和1.09，且各杂质与主峰的分离度均大于2.0。

精密称取二氯化物20mg，置10mL量瓶中，加氯仿溶解、并稀释定容至刻度，摇匀，再精密量取2.5mL，置10mL量瓶中，加乙腈稀释定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图9～10。该条件下空白对检测无干扰，二氯化物及其特定杂质均能较好分离，各杂质的含量分别为四氯化物0.51％、三氯化物3.5％、一氯化物0.08％，可见，在四氯化物到二氯化物的反应过程中，一哌啶取代的副产物的残留量较高，因此可以推测，在二氯化物与二乙醇胺的缩合过程中，杂质B和杂质F生成的风险较大，故需要严格控制二氯化物中的三氯化物。

实施例6

参照实施例5的试验条件，分别改变色谱条件中的柱温、流速、检测波长、酸性添加剂的种类及浓度和有机相种类等参数，其他条件及参数不变，考察二氯化物与四氯化物、三氯化物及一氯化物的分离情况，结果见下表

根据上表的结果说明，各参数改变条件下，二氯化物与其相关杂质均能得到良好的分离，体现出该方法具有良好的耐用性，从而能够实现对关键中间体二氯化物中相关杂质水平有效地定量监控，该法不仅专属性强，准确度高，同时也为后续反应过程的杂质来源及控制提供了一个适用性较为广泛的内控方法。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (7)

1.一种双嘧达莫合成的关键中间体杂质HPLC分析方法，其特征在于，该方法包括：以苯基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以含有酸性添加剂的有机相为流动相A，含有酸性添加剂的水溶液为流动相B，采用梯度洗脱方法，检测波长为210-230nm，对双嘧达莫关键中间体2,6-二氯-4,8-二(哌啶-1-基)嘧啶并[5,4-d]嘧啶及其相关杂质进行分离测定，所述相关杂质为2-氯-4,6,8-三(哌啶-1-基)嘧啶并[5,4-d]嘧啶、2,4,6-三氯-8-(哌啶-1-基)嘧啶并[5,4-d]嘧啶、2,4,6,8-四氯嘧啶并[5,4-d]嘧啶；所述酸性添加剂为磷酸、冰醋酸、三氟乙酸、甲酸中的一种；所述有机相为乙腈、甲醇中的一种；所述梯度洗脱方法为：0min，流动相A为45％～50％；0～5min，流动相A以45％～50％等度洗脱；5～20min，流动相A增加至75％～90％；20～30min，流动相A以75％～90％等度洗脱；30～35min，流动相A线性减小至45％～50％；35min后平衡色谱柱，其中流动相A和B均为体积百分比；所述流动相的流速为0.8-1.2mL/min。

2.根据权利要求1所述的杂质HPLC分析方法，其特征在于所述酸性添加剂为磷酸。

3.根据权利要求1或2所述的杂质HPLC分析方法，其特征在于所述酸性添加剂的浓度为0.05％～0.2％。

4.根据权利要求3所述的杂质HPLC分析方法，其特征在于所述酸性添加剂的浓度为0.1％。

5.根据权利要求1所述的杂质HPLC分析方法，其特征在于所述有机相为乙腈。

6.根据权利要求1所述的杂质HPLC分析方法，其特征在于所述检测波长为220nm。

7.根据权利要求1所述的杂质HPLC分析方法，其特征在于所述色谱柱的柱温为20-30摄氏度。

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