CN107778365B - 一种多点整合的重组蛋白表达方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多点整合的重组蛋白表达方法,通过将两个人血清白蛋白的基因表达盒分散定点整合在酵母细胞的基因组中,从而获得表达效率显著提高的重组菌株。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,更具体地,本发明涉及一种多点整合的重组蛋白表达方法,该方法适用于大规模生产。
背景技术
人血清白蛋白是血浆中的主要蛋白成分,由585个氨基酸组成,分子量约为66kD。人血清白蛋白在血液中主要作用是维持正常渗透压,与钙离子、脂肪酸、氨基酸、胆红素和各种药物相结合,并起到转运载体的作用。临床上人血清白蛋白常用于外科手术、出血性休克、烫伤、肾病综合征导致的白蛋白缺乏症、肿瘤肝腹水等疾病的治疗。
一直以来,人血清白蛋白是从人血液中纯化得到的。由于血源匮乏和病毒(肝炎、AIDs)污染等原因,基因重组人血清白蛋白在近十年中得到了国内外大型制药公司的重视。近年来,采用基因重组的方法,已经在酵母菌(usP5,330,901、JP11-509525、JP6-100592)、大肠杆菌(Lawn,R.M.construction of DNA sequences and their use for microbialproduction 0f proteins,in particularhuman serum albumin“European Patent Appl”(1983)73,p646)、转基因牛奶(w9602573Al SEPARATION OF HuMAN sERuM ALBuMIN)中表达人血清白蛋白。
尽管现有技术中已经在酵母等菌株中成功表达过人血清白蛋白,然而表达的效率仍然不够理想。研究人员还经常使用一些其它方法,最常用的方法是通过增加酵母菌株中的蛋白表达盒的拷贝数(即基因剂量)来提高表达量;方式例如在一个载体上串联两个或更多目的蛋白表达盒,然后转入酵母菌株。但是这个策略局限在于,提高拷贝数不一定必然伴随着目的蛋白表达量的增高。即使有所增高,也不呈现着和表达盒的拷贝数成正相关的状况。因为蛋白在细胞内的表达量受很多因素的制约,有转录阶段的调控,翻译阶段的制约,以及翻译后的蛋白修饰等。另外,本领域也采用同一载体重复转染的方式,情况视和酵母基因组整合位点数的不同也有所不同。另外,本领域还采用先后转入不同载体的方式,比如本发明人以前的专利(申请号CN201010551018.2)采取了一种新的方法,分别先后转入含有人血白蛋白表达盒的pPIC9和pGAP两个载体到毕赤酵母中,按照这种***,为了节省成本,生长期使用甘油提供碳源,诱导期使用甲醇,在这两个阶段人血白蛋白都可以表达,故人血清白蛋白表达量比单独使用pPIC9或pGAP诱导表达要高,但也同时带来其他的一些问题,比如发酵液中杂蛋白较多不利于下游纯化,一种原因可能是这种菌株可使用甘油和甲醇诱导表达,菌株先后使用了两套表达***,使其成分复杂;一种可能的原因是人血白蛋白表达的时间过长,在发酵液中降解。并且,GAP是持续性表达的启动子,在未加入诱导剂以前就开始表达,但此阶段AOX1不发挥作用;在加入甲醇且甘油消耗完毕后,GAP不能发挥功能了,这样虽然有两个启动子,但其作用的只有一个;由于发酵时间很长,在甘油生长期就表达的蛋白,在后期降解严重,加大了纯化的难度;由于工程菌柱前后使用了两套表达***,由于这两套体系使用的酶蛋白都不一样,导致杂蛋白成分复杂,增加了纯化难度。
因此,还需要进一步优化人血清白蛋白的表达方法,以提高表达效率,使得人血清白蛋白真正实现高效地大规模工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多点整合的重组蛋白表达方法。
在本发明的第一方面,提供一种重组表达人血清白蛋白的方法,所述方法包括:(1)提供重组酵母细胞,所述的重组酵母细胞的基因组中,整合有2个人血清白蛋白的基因表达盒;所述的人血清白蛋白的N端带有人血清白蛋白信号肽;和(2)培养(1)的重组酵母细胞,从而表达人血清白蛋白。
在一个优选例中,所述的重组酵母细胞的基因组中,2个人血清白蛋白的基因表达盒分别整合到所述重组酵母细胞的基因组中选自以下的两个基因座位上:1号染色体his4基因座位,4号染色体AOX1基因座位,3号染色体的pep4基因座位上或1号染色体yapsin基因座位。较佳地,通过构建载体使之携带这些基因,然后在酵母菌里面发生同源重组,定点整合到这些位点。
在另一优选例中,所述的人血清白蛋白的基因表达盒中,从5至3’依次包括:启动子序列,人血清白蛋白前体肽编码序列,翻译终止子序列,这些序列操作性相连;其中,所述的人血清白蛋白前体肽编码序列包括:人血清白蛋白信号肽编码序列和人血清白蛋白成熟肽编码序列。
在另一优选例中,所述的启动子选自(但不限于):AOX启动子,GAP(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)启动子,DAS(DihydroxyacetonesyntHSAe),FLD1(Formaldehyde dehydrogenase 1),PHO89(Putative Na+/phosphatesymporter),THI11(Thiamine biosynthesis gene)。
在另一优选例中,所述人血清白蛋白的基因表达盒设置于表达载体中,应用表达载体将人血清白蛋白的基因表达盒整合于基因组中,所述的表达载体选自(但不限于):pPICZα系列载体,pPICZ系列载体,pPIC系列载体,PGAP系列载体。
在另一优选例中,将一个人血清白蛋白的基因表达盒设置于pPICZαA表达载体中,将另一人血清白蛋白的基因表达盒设置于pPIC9表达载体中,两个表达载体通过先后转化酵母细胞的方式,或同时转化酵母细胞的方式,将人血清白蛋白的基因表达盒整合于基因组中。
在另一优选例中,先将携带人血清白蛋白的基因表达盒的pPICZαA引入酵母细胞,然后再将携带人血清白蛋白的基因表达盒的pPIC9引入酵母细胞。
在另一优选例中,所述的酵母细胞是毕赤酵母细胞。
在本发明的另一方面,提供一种重组酵母细胞,所述的重组酵母细胞的基因组中,整合有2个人血清白蛋白的基因表达盒;所述的人血清白蛋白的N端带有人血清白蛋白信号肽;并且,2个人血清白蛋白的基因表达盒分别整合到所述重组酵母细胞的基因组中选自以下的两个基因座位上:1号染色体his4基因座位,4号染色体AOX1基因座位,3号染色体的pep4基因座位,或1号染色体yapsin基因座位。
在本发明的另一方面,提供一种用于重组表达人血清白蛋白的试剂盒,所述的试剂盒中包括所述的重组酵母细胞。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图l、pPICZα-HSA载体的结构示意图。
图2、pPIC9-HSA载体的结构示意图。
具体实施方式
本发明人致力于提高人血清白蛋白的表达效率,经过深入的研究,通过将两个人血清白蛋白的基因表达盒分散定点整合在酵母细胞的基因组中,可以获得表达效率显著提高的重组菌株。在此基础上完成了本发明。
如本文所用,所述的“人血清白蛋白”简称为“血清白蛋白”或“白蛋白”或“HSA”,它们之间可互换使用。
如本文所用,所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列,其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端),能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地,启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中,所述的启动子或启动子区包括启动子的变体,其通过***或删除调控区域,进行随机或定点突变等来获得。
如本文所用,所述的“操作性相连”,“可操作地连接”或“操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如:启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置,使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导,从而,启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
如本文所用,所述的“表达盒”是指包含有表达目的蛋白(本发明中为人血清白蛋白)所需的所有必要元件的基因表达***,通常其包括以下元件:启动子、编码蛋白的基因序列,终止子;此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。
GenBank已公开了人血清白蛋白的氨基酸序列及mRNA序列(GenBank登录号AY728024)。因此,本领域人员易于获得其序列信息。在获得了所述序列后,可以采取本领域已知的多种方法来制备所述序列。
作为本发明的优选方式,合成人血清白蛋白的cDNA,合成的cDNA的5’端是白蛋白的信号肽的编码序列,3’端添加了翻译终止信号TAA,序列如SEQ ID NO:1所示。此外,还通过在该合成的序列的两端加上限制性内切酶,从而便于将之引入到表达载体中。
本发明所建立的人血清白蛋白的基因表达盒,从5至3’依次包括:启动子序列,人血清白蛋白前体肽编码序列,翻译终止子序列,这些序列操作性相连。
其中,所述的人血清白蛋白前体肽编码序列包括:人血清白蛋白信号肽编码序列和人血清白蛋白成熟肽编码序列。
作为本发明的优选方式,所述的表达盒中,应用的启动子是诱导型启动子,较佳地为甲醇诱导型启动子。更优选地,所述的启动子包括但不限于:AOX启动子,GAP(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)启动子,DAS(DihydroxyacetonesyntHSAe),FLD1(Formaldehyde dehydrogenase 1),PHO89(Putative Na+/phosphatesymporter),THI11(Thiamine biosynthesis gene)。;最优选地,所述的启动子是AOX启动子,2个人血清白蛋白的基因表达盒可同时采用AOX启动子。
根据本发明的方法,可以将两个人血清白蛋白的基因表达盒分散定点整合在酵母细胞的基因组中。两个人血清白蛋白的基因表达盒分别整合到所述重组酵母细胞的基因组中选自以下的两个基因座位上:1号染色体his4基因座位,4号染色体AOX1基因座位,3号染色体的pep4基因座位,或1号染色体yapsin基因座位,获得表达效率显著提高的重组菌株。
为了将表达盒引入酵母细胞基因组,所述的人血清白蛋白的基因表达盒***到表达载体中,应用表达载体将人血清白蛋白的基因表达盒整合于基因组中,所述的表达载体选自但不限于:pPICZα系列载体,pPICZ系列载体,pPIC系列载体,PGAP系列载体。
作为本发明的更优选的方式,将一个人血清白蛋白的基因表达盒设置于pPICZαA表达载体中,将另一人血清白蛋白的基因表达盒设置于pPIC9表达载体中,两个表达载体通过先后转化酵母细胞的方式,或同时转化酵母细胞的方式,将人血清白蛋白的基因表达盒整合于基因组中。
本发明中,所述的酵母细胞可以是毕赤酵母,酿酒酵母,乳酸克鲁维酵母等。所述的毕赤酵母例如GS115、MC100-3、SMD1163、SMD1165、SMD1168或KM71;所述的酿酒酵母例如W303、CEN.PK2、S288c、FY834或S1949;所述的乳酸克鲁维酵母例如GG799。最优选的,所述的酵母细胞是毕赤酵母细胞。
本发明提供了一种高效表达人血清白蛋白的方法,将两个相同的人血清白蛋白表达盒分散整合在酵母宿主菌的基因组上。本发明人在前期研究过程中,应用过单位点整合的方法,通过在同一载体上串联两个或更多目的蛋白表达盒表达,或重复转染同一载体来整合形成单拷贝或串联方式,但这两种方式不利于筛选阳性克隆且表达效率不能提高。本发明人也研究了双位点整合的方式,重复转染携带表达盒的载体,利用带有两个可以整合的位点的载体,但整合进入酵母基因组存在多种组合,因此必须通过测序基因组或者多轮PCR来确认整合了两个拷贝,且空间距离远;当然载体上含有三个或更多的整合位点的,情况更复杂了。经过反复研究验证,本发明人意外地发现应用pPICZαA载体和pPIC9载体,将两个人血清白蛋白的基因表达盒分别整合到所述重组酵母细胞的基因组中选定的两个基因座位上,可以极为有效地提高基因表达的效率。实验结果表明,最佳的是两个拷贝的表达,而非需要更高的拷贝数。
在本发明的具体实施方式中,采用携带血清白蛋白表达盒的pPICZαA载体转染GS115菌株,通过Zeocin抗性筛选出阳性克隆,再以它为宿主菌转染携带血清白蛋白表达盒的pPIC9载体,再次通过组蛋白缺陷性的MD平板筛选出阳性克隆,然后通过PCR的方法鉴定,得到两份拷贝携带白蛋白表达盒的工程菌株。由于pPICZαA载体只能整合在AOX基因区域,AOX基因位于4号染色体上,故该白蛋白表达盒整合在4号染色体上;pPIC9载体用SalI或StuI酶线性化,使pPIC9载体整合到His4区域,而His4位于1号染色体上,这样,两份拷贝空间距离大,减少两份拷贝在转录上的干扰,提高表达量;另外这一方法的优点具有筛选方便的优点,易于操作。
本发明中,所使用载体也不局限于pPICZαA和pPIC9载体,也可以其他商业化载体或改造的载体,其目的是通过同源重组分散整合到毕赤酵母基因组上特定的位置,只要能够实现这种整合的载体即可应用于本发明中。
作为本发明的更为优选的方式,先将携带人血清白蛋白的基因表达盒的pPICZαA引入酵母细胞,然后再将携带人血清白蛋白的基因表达盒的pPIC9引入酵母细胞。pPIC9在酵母菌中一般有his4或者AOX1两个整合的位点,pPICZαA只在AOX1位置发生同源重组。如pPIC9线性化后就整合到AOX1基因上,再次转入pPICZαA产生同源重组,替换掉前面一份,故仍是单拷贝表达盒;如pPIC9用SalI或StuI线性化后,转入后就整合到His4基因座位上,故可能产生两种可能:一是替换掉pPIC9的AOX1区域,产生单拷贝表达盒;一是整合在酵母的AOX1座位上,这两种区别需要实验的来验证。若先转入pPICZαA质粒,整合到AOX1基因座位上,然后pPIC9用SalI或StuI线性化后再转入就整合到HIS4基因座位上,保证了是分散的双拷贝表达盒整合,不需要实验证,只要在抗性培养基中能生长就表明整合符合预期。
本发明的方法,有效地提高了基因的剂量和显著地提高了蛋白表达的效率,降低杂蛋白的含量。本发明的优选技术方案的优点主要表现在:(1)分别转入含有相同启动子AOX的不同表达盒,可以分散定点整合在基因组上,易于筛选工程菌株;(2)表达量显著提高,一方面可能两个空间距离大的表达盒可以更高效的表达,另一方面也是采用了突变后的白蛋白信号肽提高分泌效率;(3)杂蛋白的含量更少,一方面是比在同一个宿主菌种转染携带白蛋白的两套表达***(常为甲醇和甘油诱导)相比,杂蛋白的含量少;另一方面是敲出了某些降解白蛋白成品的蛋白酶,减少了杂蛋白。也可以替换一些结合白蛋白的杂蛋白基因,从而减少了杂蛋白。本发明的方法表达的蛋白还适合于中试及工业化生产放大。
本发明还涉及一种用于重组表达人血清白蛋白的试剂盒,所述的试剂盒中包括本发明制备的重组酵母细胞。或者,所述的试剂盒中包括本发明制备的重组表达载体以及宿主酵母细胞。
较佳地,所述的试剂盒中还包括酵母细胞培养基,诱导培养试剂等。
较佳地,所述的试剂盒中还包括说明如何操作以高效表达人血清白蛋白的说明书。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。本发明不限于以下具体实验内容。
本发明所用的原材料及来源如下所示。如未特别说明,使用的原材料、试剂、仪器均是可以从常规化学或生物试剂生产商处可购买的。
所使用的毕赤酵母GS115,两种表达载体pPIC9、pPIC9K和pPICZαA均是从Invitrogen公司购买。
DNA聚合酶、DNA连接酶和限制性内切酶均为NEB公司产品。
质粒抽提试剂盒与胶回收试剂盒为康为世纪生物科技有限公司产品。
基因序列的合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成、引物合成以及基因测序均由上海生工生物工程有限公司完成。
质谱检测、N末端序列分析及C末端序列分析均由上海中科新生命生物科技有限公司完成。
实施例1、人血清白蛋白cDNA的获得
按照PUBMED公布的人血清白蛋白mRNA序列(GenBank登录号AY728024),合成cDNA。合成的cDNA的5’端是白蛋白的信号肽的编码序列,3’端添加了翻译终止信号TAA。
包含信号肽、人血清白蛋白cDNA及翻译终止信号的序列如下(SEQ ID NO:1,其中斜体下划线标示序列代表信号肽编码序列):
gatgcacacaagagtgaggttgctcatcggtttaaagatttgggagaagaaaatttcaaagccttggtgttgattgcctttgctcagtatcttcagcagtgtccatttgaagatcatgtaaaattagtgaatgaagtaactgaatttgcaaaaacatgtgttgctgatgagtcagctgaaaattgtgacaaatcacttcataccctttttggagacaaattatgcacagttgcaactcttcgtgaaacctatggtgaaatggctgactgctgtgcaaaacaagaacctgagagaaatgaatgcttcttgcaacacaaagatgacaacccaaacctcccccgattggtgagaccagaggttgatgtgatgtgcactgcttttcatgacaatgaagagacatttttgaaaaaatacttatatgaaattgccagaagacatccttacttttatgccccggaactccttttctttgctaaaaggtataaagctgcttttacagaatgttgccaagctgctgataaagctgcctgcctgttgccaaagctcgatgaacttcgcgatgaagggaaggcttcgtctgccaaacagagactcaagtgtgccagtctccaaaaatttggagaaagagctttcaaagcatgggcagtagctcgcctgagccagagatttcccaaagctgagtttgcagaagtttccaagttagtgacagatcttaccaaagtccacacggaatgctgccatggagatctgcttgaatgtgctgatgacagggcggaccttgccaagtatatctgtgaaaatcaagattcgatctccagtaaactgaaggaatgctgtgaaaaacctctgttggaaaaatcccactgcattgccgaagtggaaaatgatgagatgcctgctgacttgccttcattagctgctgattttgttgaaagtaaggatgtttgcaaaaactatgctgaggcaaaggatgtcttcctgggcatgtttttgtatgaatatgcaagaaggcatcctgattactctgtcgtgctgctgctgagacttgccaagacatatgaaaccactctagagaagtgctgtgccgctgcagatcctcatgaatgctatgccaaagtgttcgatgaatttaaacctcttgtggaagagcctcagaatttaatcaaacaaaattgtgagctttttgagcagcttggagagtacaaattccagaatgcgctattagttcgttacaccaagaaagtaccccaagtgtcaactccaactcttgtagaggtctcaagaaacctaggaaaagtgggcagcaaatgttgtaaacatcctgaagcaaaaagaatgccctgtgcagaagactatctatccgtggtcctgaaccagttatgtgtgttgcatgagaaaacgccagtaagtgacagagtcaccaaatgctgcacagaatccttggtgaacaggcgaccatgcttttcagctctggaagtcgatgaaacatacgttcccaaagagtttaatgctgaaacattcaccttccatgcagatatatgcacactttctgagaaggagagacaaatcaagaaacaaactgcacttgttg agctcgtgaaacacaagcccaaggcaacaaaagagcaactgaaagctgttatggatgatttcgcagcttttgtagagaagtgctgcaaggctgacgataaggagacctgctttgccgaggagggtaaaaaacttgttgctgcaagtcaagctgccttaggcttaTAA
使用BamHI和NotI限制性内切酶,将上述合成的序列转入载体pPIC9,命名为pPIC9-HSA,见图1。
将上述序列,请上海捷瑞公司替代PPICZαA中的941~1264之间序列,得到pPICZαA-HSA;
设计如下四条引物:
1F:5’-GAAGATCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTG-3’(SEQ ID NO:7);
1R:5’-CCTAATAGAAGGAATTGGAATGAGCGACCTCCAATCAAGCCCAATAACTGG-3’(SEQ IDNO:8);
2F:5’-CCAGTTATTGGGCTTGATTGGAGGTCGCTCATTCCAATTCCTTCTATTAGG-3’(SEQ IDNO:9);
2R:5’-GTGTGTGGGGGATCCGCACAAACGAAGG-3’(SEQ ID NO:10)。
以pPICZαA-HSA为模板,分别将1F和1R引物扩增,以2F和2R引物扩增,将所得的片段混合后再次进行overlap PCR扩增,这样操作后,原pPICZαA中的sacI突变了,将这个片段用BamHI和BglII酶切后,与pPICZα-HSA用BamHI酶切后连接起来,转化后获得的载体就包含两个表达盒,命名为pPICZα-2HSA。
同样的方法,形成包含了串联三份白蛋白编码序列的表达盒的表达载体,串联三份白蛋白表达盒的命名为pPICZα-3HSA。
使用BamHI和NotI限制性内切酶,将上述合成的序列转入载体pPIC9K命名为pPIC9K-HSA。
实施例2、HSA在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达
1、pPICZα-HSA载体转染巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
取一个含pPICZα-HSA载体的大肠杆菌克隆,在含Zeocin的LB培养基中生长过夜。第二天,离心收集菌体,采用碱裂解法制备质粒DNA。取抽提纯化的pPICZα-HSA载体DNA 20微克,用BstXI酶切使之线性化。线性化后的DNA用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀后溶于20微升纯水中。
GS115菌株(购自Invitrogen)在5毫升YPD中生长过夜,取其中0.5毫升加到500毫升新鲜YPD培养基中生长过夜,直至培养液的OD540在1.3~1.5之间,离心去上清。细胞重悬于500毫升无菌冰纯水,混合物离心去上清。沉淀加250毫升无菌冰纯水重悬后再离心去上清,沉淀重悬于20毫升冰的lM山梨糖醇(Sorbitol),混合物离心去上清,最后细胞重悬于l毫升冰的1M山梨糖醇置冰浴备用。取10微升线性化DNA(10微克)和80微升重悬GSl15细胞置于0.2cm电击杯中,混匀后将电击杯在冰浴中放置5分钟后电击将DNA转染入GS115细胞内。电击后立即加入l毫升冰的1M Sorbitol,然后转移到15毫升无菌管,30℃静止培养2小时,分别取100微升、200微升酵母细胞液均匀涂布到100ug/ml Zeocin的YPD平板,置30℃培养直至克隆生长。选择100个克隆接种到5毫升YPD培养基,30℃,200rpm生长2天,离心弃去上清,加5毫升YPM培养基(甲醇浓度为1.5%)30℃,200rpm诱导表达3天。第3天末,离心取10微升培养上清用SDS-PAGE检测白蛋白的表达。
选择表达量最高的l株克隆作为下一轮转染的母株,记为pPICZα-HSA菌株。
2、pPICZα-2HSA载体转染巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
取一个含pPICZα-2HSA载体的大肠杆菌克隆,在含Zeocin的LB培养基中生长过夜。第二天,离心收集菌体,采用碱裂解法制备质粒DNA。取抽提纯化的pPICZα-2HSA载体DNA20微克,用sacI酶切使之线性化。线性化后的DNA用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀后溶于20微升纯水中。
GS115菌株(购自Invitrogen)在5毫升YPD中生长过夜,取其中0.5毫升加到500毫升新鲜YPD培养基中生长过夜,直至培养液的OD540在1.3~1.5之间,离心去上清。细胞重悬于500毫升无菌冰纯水,混合物离心去上清。沉淀加250毫升无菌冰纯水重悬后再离心去上清,沉淀重悬于20毫升冰的l M山梨糖醇(Sorbitol),混合物离心去上清,最后细胞重悬于l毫升冰的l M山梨糖醇置冰浴备用。取10微升线性化DNA(10微克)和80微升重悬GSl15细胞置于0.2cm电击杯中,混匀后将电击杯在冰浴中放置5分钟后电击将DNA转染入GS115细胞内。电击后立即加入l毫升冰的1M Sorbitol,然后转移到15毫升无菌管,30℃静止培养2小时,分别取100微升、200微升酵母细胞液均匀涂布到100ug/ml Zeocin的YPD平板,置30℃培养直至克隆生长。选择100个克隆接种到5毫升YPD培养基,30℃,200rpm生长2天,离心弃去上清,加5毫升YPM培养基(甲醇浓度为1.5%)30℃,200rpm诱导表达3天。第3天末,离心取10微升培养上清用SDS-PAGE检测白蛋白的表达。
选择表达量最高的l株克隆作为下一轮转染的母株,记为pPICZα-2HSA菌株。
3、pPICZα-3HSA载体转染巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
取一个含pPICZα-3HSA载体的大肠杆菌克隆,在含Zeocin的LB培养基中生长过夜。第二天,离心收集菌体,采用碱裂解法制备质粒DNA。取抽提纯化的pPICZα-3HSA载体DNA20微克,用sacI酶切使之线性化。线性化后的DNA用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀后溶于20微升纯水中。
GS115菌株(购自Invitrogen)在5毫升YPD中生长过夜,取其中0.5毫升加到500毫升新鲜YPD培养基中生长过夜,直至培养液的OD540在1.3~1.5之间,离心去上清。细胞重悬于500毫升无菌冰纯水,混合物离心去上清。沉淀加250毫升无菌冰纯水重悬后再离心去上清,沉淀重悬于20毫升冰的l M山梨糖醇(Sorbitol),混合物离心去上清,最后细胞重悬于l毫升冰的1M山梨糖醇置冰浴备用。取10微升线性化DNA(10微克)和80微升重悬GS115细胞置于0.2cm电击杯中,混匀后将电击杯在冰浴中放置5分钟后电击将DNA转染入GS115细胞内。电击后立即加入l毫升冰的1M Sorbitol,然后转移到15毫升无菌管,30℃静止培养2小时,分别取100微升、200微升酵母细胞液均匀涂布到100ug/ml Zeocin的YPD平板,置30℃培养直至克隆生长。选择100个克隆接种到5毫升YPD培养基,30℃,200rpm生长2天,离心弃去上清,加5毫升YPM培养基(甲醇浓度为1.5%)30℃,200rpm诱导表达3天。第3天末,离心取10微升培养上清用SDS-PAGE检测白蛋白的表达。
选择表达量最高的l株克隆作为下一轮转染的母株,记为pPICZα-3HSA菌株。
4、pPIC9-HSA载体转染pPICZα-HSA菌株
取一个含pPIC9-HSA载体的大肠杆菌克隆,在含Ampicillin的LB培养基中生长过夜。第二天,离心收集菌体,采用碱裂解法制备质粒DNA。取抽提纯化的pPIC9-HSA载体DNA20微克,用SalI酶切使之线性化。线性化后的DNA用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀后溶于20微升纯水中。
pPICZα-HSA菌株在5毫升YPD中生长过夜,取其中0.5毫升加到500毫升新鲜YPD培养基中生长过夜,直至培养液的OD540在1.3~1.5之间,离心去上清。细胞重悬于500毫升无菌冰纯水,混合物离心去上清。沉淀加250毫升无菌冰纯水重悬后再离心去上清,沉淀重悬于20毫升冰的1M山梨糖醇(Sorbitol),混合物离心去上清,最后细胞重悬于1毫升冰的1M山梨糖醇置冰浴备用。取10微升线性化DNA(10微克)和80微升重悬pPICZα-HSA细胞置于0.2cm电击杯中,混匀后将电击杯在冰浴中放置5分钟后电击将DNA转染入pPICZα-HSA细胞内。电击后立即加入l毫升冰的1M Sorbitol,然后转移到15毫升无菌管,30℃静止培养2小时,分别取100微升、200微升酵母细胞液均匀涂布到RDB(无组氨酸)的100ug/ml Zeocin的YPD平板,置30℃培养直至克隆生长。选择100个克隆接种到5毫升YPD培养基,30℃,200rpm生长2天,离心弃去上清,加5毫升YPM培养基(甲醇浓度为1.5%)30℃,200rpm诱导表达3天。第3天末,离心取10微升培养上清用SDS-PAGE检测白蛋白的表达。
选择表达量最高的l株克隆作为下一轮转染的母株,记为pPIC9/pPICZα-2HSA菌株。
5、pPIC9K-HSA载体转染pPIC9/pPICZα-2HSA菌株
取一个含pPIC9K-HSA载体的大肠杆菌克隆,在含Ampicillin的LB培养基中生长过夜。第二天,离心收集菌体,采用碱裂解法制备质粒DNA。取抽提纯化的pPIC9K-HSA载体DNA20微克,用SacI酶切使之线性化。线性化后的DNA用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀后溶于20微升纯水中。
pPIC9/pPICZα-2HSA菌株在5毫升YPD中生长过夜,取其中0.5毫升加到500毫升新鲜YPD培养基中生长过夜,直至培养液的OD540在1.3~1.5之间,离心去上清。细胞重悬于500毫升无菌冰纯水,混合物离心去上清。沉淀加250毫升无菌冰纯水重悬后再离心去上清,沉淀重悬于20毫升冰的l M山梨糖醇(Sorbitol),混合物离心去上清,最后细胞重悬于l毫升冰的l M山梨糖醇置冰浴备用。取10微升线性化DNA(10微克)和80微升重悬pPIC9/pPICZα-2HSA细胞置于0.2cm电击杯中,混匀后将电击杯在冰浴中放置5分钟后电击将DNA转染入pPIC9/pPICZα-2HSA细胞内。电击后立即加入l毫升冰的1M Sorbitol,然后转移到15毫升无菌管,30℃静止培养2小时,分别取100微升、200微升酵母细胞液均匀涂布到RDB(无组氨酸)的100ug/ml Zeocin和100ug/ml的G418的YPD平板,置30℃培养直至克隆生长。选择100个克隆接种到5毫升YPD培养基,30℃,200rpm生长2天,离心弃去上清,加5毫升YPM培养基(甲醇浓度为1.5%)30℃,200rpm诱导表达3天。第3天末,离心取10微升培养上清用SDS-PAGE检测白蛋白的表达。
选择表达量最高的l株克隆作为下一轮转染的母株,记为pPIC9/pPICZα/pPIC9K-3HSA菌株。
6、pPIC9/pGAP-2HSA菌株的构建
按照GenBank登录号AY728024合成cDNA。合成的cDNA 5’端带有部分酵母α信号肽3’端的编码序列CTC GAG AAG AGA,紧接着是白蛋白成熟肽的编码序列(SEQ ID NO:2),在DNA的3’端添加了翻译终止信号TAA和EcoRI酶切位点的序列GAATTC,该DNA***到PUC18载体(购自New England Biolabs)中,定名为PUC18-HSA。
SEQ ID NO:2序列如下:
将PUC18-HSA克隆载体中带有部分α信号肽序列的HSA基因片段用XhoI和EcoRI双酶切下,1%琼脂糖电泳分离,回收DNA片段。将约2Kb的带有编码末端的HSA基因回收片段与用相同酶切的pGAPZα表达载体(自带GAP启动子)或pPIC9K(自带AOX1启动子)连接,转化E.coli TGI(购自New England Biolabs)感受态细胞,分别以含有Zeocin或Kanamycin LB琼脂板筛选阳性克隆。采用碱裂解法制备质粒DNA。所得质粒DNA用XhoI和EcoRI双酶切。鉴定出重组质粒pGAPZα-HSA或pPIC9K-HSA。
采用与前述类似的方法,将重组质粒pGAPZα-HSA或pPIC9K-HSA转入GS115中,获得pPIC9/pGAP-2HSA菌株。
实施例3、定量PCR确定基因整合的拷贝数
为了进一步确认重组克隆的基因组内***了目的蛋白表达盒,提取上述实施例2中1~5中获得的工程细胞候选株的基因组DNA。这5种细胞的基因组DNA作为模板,以GAP为内参,分别扩增GAP和HSA的基因片段,得到实验的验证。
用于扩增HSA基因的引物为:
HSA-F:5’-TCGGCTTATTCCAGGGGTG-3’(SEQ ID NO:3);
HSA-R:5’-GGGGGAGGTTTGGGTTGT-3’(SEQ ID NO:4);
用于扩增GAP基因的引物为:
GAP-F:5’-TCCTTCCACCGCCCGTTAC-3’(SEQ ID NO:5);
GAP-R:5’-ATGCGTCCGCCCGCTATTA-3’(SEQ ID NO:6)。
实施例4、工程细胞株表达的白蛋白确认
为了在蛋白分子结构水平上确认与天然的人血白蛋白一致。工程细胞株pPIC9/pPICZα-2HSA在200毫升YPD培养基中生长2天,然后添加200毫升含2%甲醇的YP培养基继续生长3天,培养条件为30℃,200rpm。培养结束后离心,收集培养上清。上清液用醋酸调pH至3.5,过pH 3.5,20mM醋酸钠缓冲液平衡过的SP-sepharose FF离子交换柱,目的蛋白用pH7.0,含500mM氯化钠,20mM磷酸钠缓冲液洗脱。洗脱蛋白过用pH 7.0,含50mM氯化钠,20mM磷酸钠缓冲液平衡的Sephadex G-25凝胶柱,进行缓冲液交换。交换了缓冲液后的SP-sepharose FF洗脱蛋白过pH 7.0,含50mM氯化钠,20mM磷酸钠缓冲液平衡过的DEAE-sepharose FF层析柱,白蛋白为pH 7.0,含500mM氯化钠,20mM磷酸钠缓冲液洗脱下来的组分。DsD-PAGE显示其纯度大于98%。
纯化的重组白蛋白用TRYPsIN消化后用c18柱进行肽图分析,结果与人血清白蛋白的TRYPSIN酶切肽图完全一致。N端15个氨基酸序列测定结果为:Asp-Ala-ms-Lys-ser-Glu-Val-Ala-His-Arg-Phe-Lys-Asp-Leu-Gly;C末端两氨基酸的序列测定结果为:Gly-Leu,与人血清白蛋白的C末端两个氨基酸相同。
纯化的重组白蛋白还进行了园二色谱检测,检测的结果与人血清白蛋白一致。
上述实验结果证明,本发明的方法可以正确地表达人血白蛋白。
实施例5、高表达克隆的比较
挑取GS115,pPICZα-HSA菌株,pPICZα-2HSA菌株,pPICZα-3HSA菌株,pPIC9/pPICZα-2HSA和pPIC9/pPICZα/pPIC9K-3HSA菌株及pPIC9/pGAP-2HSA菌株各5株,均在30℃,200rpm条件下,5毫升YPD培养基中生长2天,离心取沉淀,加含l%甲醇的YP培养基,使各株的细胞密度相同,体积均为5毫升,仍置于30℃,200rpm条件下培养3天,每天取上清检测白蛋白的含量(取第3天作为最终含量)。
具体结果如下:
GS115没有目的蛋白的表达;
5株pPICZα-HSA工程细胞候选株的平均表达量:140毫克/升;
5株pPICZα-2HSA工程细胞候选株的平均表达量:240毫克/升;
5株pPICZα-3HSA工程细胞候选株的平均表达量:210毫克/升;
5株pPIC9/pPICZα-2HSA工程细胞候选株的表达量:320毫克/升;
5株pPIC9/pPICZα/pPIC9K-3HSA菌株的平均表达量:260毫克/升;
5株pPIC9/pGAPZα-2HSA工程细胞候选株的表达量:310毫克/升。
上述结果表明,并非HSA的拷贝数越多越好,应用合适的载体、选择两个拷贝HSA进行重组表达最为理想。
因此,本发明人筛选到了最佳的白蛋白表达工程菌,即pPIC9/pPICZα-2HSA。
实施例6、工程细胞株的发酵罐发酵工艺研究
将工程细胞株(克隆1;pPIC9/pPICZα-2HSA)接种到YPD平板生长2天,挑取单克隆接种到装有400毫升YPD培养基的摇瓶中,30℃250~300rpm条件下生长16~24个小时直到OD600在2~6之间。
发酵罐内加含4%甘油的基础盐培养液8升,加热高压灭菌。设置发酵温度30℃、pH控制5.6、转速200~1500rpm、通气条件为0.1~1.0vvm空气,用28%氢氧化铵调节基础培养盐培养液pH到5.6,每升培养液加4.35ml PTMl痕量盐。待发酵罐内基础盐培养液的温度降至30℃后,将400毫升来自摇瓶中培养的OD540在2~6之间的种子液,加入发酵罐。
启动发酵罐温度、pH、通气和搅拌等装置使酵母细胞生长,继续细胞生长直到甘油消耗完毕。一旦所有的甘油都消耗完毕,启动甘油流加步骤来增加细胞的量,甘油补料中甘油的浓度为50%,每升甘油补料内需含有12毫升PTMl痕量盐溶液,设置补料速度为18.15ml/hr/L(起始体积),甘油流加持续4小时。甘油流加结束后开始流加甲醇,流加的甲醇补料含l00%甲醇,每升甲醇添加12毫升PTM1痕量盐。设置流加速度为3ml/hr每升起始发酵体积。4小时后甲醇流加速度增加至6ml/hr每升发酵体积,以此速度补加2小时后甲醇补加速度调整至9ml/r每升起始发酵体积,此补料速度一直维持到发酵结束,整个甲醇流加时间为60小时。
发酵结束后,放罐收集发酵液,发酵液通过陶瓷过滤膜过滤方法分离发酵上清,含重组白蛋白的发酵上清用离子交换,分子筛等方法进行进一步处理。
经测定,在上述发酵条件下,pPIC9/pPICZα-2HSA的白蛋白产量为14g/L,pPIC9/pGAPZα-2HSA的白蛋白产量为10g/L,明显具有较高的表达量。
观察发酵液色泽,发现其色泽较为理想,并非呈现杂蛋白众多的相关色泽。
白蛋白约67Kd,以往发酵中其较易于被降解为约45Kd的没有活性的蛋白。对发酵液中的杂蛋白进行评估发现,约45Kd的蛋白量少(比采用本发明人的在先专利申请(申请号CN201010551018.2)的方法的发酵液中的45Kd的蛋白量减少50%以上),约23Kd蛋白也量少。可见白蛋白降解较少,杂蛋白也显著少。
对发酵液中的糖含量进行评估发现,糖含量也显著减少,比采用本发明人的在先专利申请(申请号CN201010551018.2)的方法获得的发酵液相比,发酵液中的糖含量少40%以上。
因此,由两个AOXl共同驱动分散整合到酵母基因组上的菌株的表达产生很少的杂蛋白,易于后续纯化。
实施例7、发酵产物纯化
在发酵终止时加入乙酰色氨酸、半胱氨酸至35mm的蛋白重组液中;上清加热到68℃,保温30分钟,上清经过过滤以后,使用GE公司的Streamline柱子纯化蛋白,洗脱液中重组白蛋白的纯度达到95%以上。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (2)
1.一种重组表达人血清白蛋白的方法,其特征在于,所述方法包括:
(1) 提供重组毕赤酵母细胞,所述的重组毕赤酵母细胞的基因组中,整合有2个人血清白蛋白的基因表达盒,其从5’至3’依次包括:AOX启动子序列、人血清白蛋白前体肽编码序列、翻译终止子序列,这些序列操作性相连,所述的人血清白蛋白前体肽编码序列包括:人血清白蛋白信号肽和成熟肽编码序列;所述的人血清白蛋白的N端带有人血清白蛋白信号肽;所述2个人血清白蛋白的基因表达盒分别整合到所述重组毕赤酵母细胞的基因组中以下的两个基因座位上:1号染色体his4基因座位,4号染色体AOX1基因座位;将一个人血清白蛋白的基因表达盒设置于pPICZαA表达载体中,另一人血清白蛋白的基因表达盒设置于pPIC9表达载体中;其中,采用携带血清白蛋白表达盒的pPICZαA载体转染,抗性筛选出阳性克隆,以它为宿主菌转染携带血清白蛋白表达盒的pPIC9载体,再次通过组蛋白缺陷性的平板筛选出阳性克隆,得到两份拷贝携带白蛋白表达盒的工程菌株;由于pPICZαA载体只整合在AOX基因区域,AOX基因位于4号染色体上,故该白蛋白表达盒整合在4号染色体上;pPIC9载体用SalI或StuI酶线性化,使pPIC9载体整合到His4区域,而His4位于1号染色体上,这样,两份拷贝空间距离大,减少了两份拷贝在转录上的干扰;和
(2) 培养(1)的重组毕赤酵母细胞,从而表达人血清白蛋白。
2.如权利要求l所述的方法,其特征在于,所述的毕赤酵母细胞是毕赤酵母细胞GS115。
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