CN114317303A - 一种分泌表达重组蝽防御素tha的重组毕赤酵母及其构建和表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分泌表达重组蝽防御素THA的重组毕赤酵母及其构建和表达方法。所述重组毕赤酵母通过在基因组两个不同位点***THA表达盒构建获得，遗传性能稳定，THA表达量高，经检测可达1.5g/L以上，为现有技术的两倍以上。

Description

一种分泌表达重组蝽防御素THA的重组毕赤酵母及其构建和 表达方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种分泌表达重组蝽防御素THA 的重组毕赤酵母及其构建方法。

背景技术

蝽防御素Thanatin(THA)是法国科学家在1996年从受到大肠杆菌或藤黄微球菌侵染24小时后的半翅目昆虫斑腹刺益蝽(Podisus maculiventris)体内血淋巴中发现的一种对某些革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌和真菌均具有抑菌活性的抗菌肽。成熟的THA由21个氨基酸组成，序列为GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM。THA在溶液中包含一个由两个反平行的β- 折叠形成的空间结构，其空间结构由第11位和18位半胱氨酸形成的一个二硫键(Cys11-Cys18)保持稳定。研究表明，THA对大肠杆菌，沙门氏菌，藤黄微球菌，白色念珠菌等均有较强的抑菌活性。作为一种抑菌物质，THA 在医药、食品、饲料等领域均有潜在的应用价值。

要实际应用THA，就必须建立大规模生产的方法。THA可以通过三种途径获取：生物提取，化学合成和生物合成。斑腹刺益蝽天然产生的THA非常少，因此通过提取方式生产THA不可行。而通过化学合成方式获取THA，目前其生产成本过高。生物合成主要通过基因工程手段构建能够异源表达 THA的工程菌株，然后通过工业规模的发酵进行大量生产。毕赤酵母由于易于培养、分泌能力强且分泌产物中杂蛋白含量较低，已被用于多种重组多肽和蛋白质的工业化生产。梁伟凡等前期已经构建了通过在毕赤酵母醇氧化酶基因位点***重组THA表达盒的工程菌(CN 107904182A)，但发酵表达量不高，THA含量为0.6g/L。而他们在单位点***重组THA表达盒的工程菌的基础上，利用紫外线诱变获得的工程菌株(CN108342334A)，其THA分泌表达量虽有所提高(THA含量达到0.76g/L)，但其表达量依旧不高，且在后续发酵生产过程中发现其遗传性状不稳定。

可见，现有技术还有待改进和提高。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种分泌表达重组蝽防御素THA的重组毕赤酵母及其构建方法，旨在解决现有技术中蝽防御素THA重组毕赤酵母的表达量低以及遗传性状不稳定的问题。

为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：

一种分泌表达重组蝽防御素THA的重组毕赤酵母，所述重组毕赤酵母 (Pichiapastoris)保藏编号为GDMCC No.61977。

一种构建重组毕赤酵母的方法，用于构建上述的分泌表达重组蝽防御素THA的重组毕赤酵母，包括以下步骤：

步骤S001.设计重组蝽防御素THA编码基因：以THA成熟肽序列为目标产物，根据毕赤酵母密码子偏好性设计THA编码基因；

步骤S002.构建表达载体：将步骤S001中设计得到的THA编码基因分别连接至载体pPICZαA和pPIC3.5K，分别构建pPICZαA-THA和 pPIC3.5K-THA表达载体；

步骤S003.构建重组毕赤酵母：分别对pPICZαA-THA和pPIC3.5K-THA 表达载体进行线性化处理，然后将pPICZαA-THA线性化表达载体转入毕赤酵母感受态细胞，将转化后的毕赤酵母接种至筛选培养基培养，得到单菌落后进行菌株表达量检测，挑选出最优菌株THA-1；再将pPIC3.5K-THA线性化表达载体转入菌株THA-1感受态细胞，经过筛选培养基培养得到单菌落后再次进行菌株表达量检测，挑选出最优菌株THA-2，获得所述分泌表达重组蝽防御素THA的重组毕赤酵母。

所述的构建重组毕赤酵母的方法，其中，所述步骤S001中，所述THA 编码基因序列为SEQ ID NO.2。

所述的构建重组毕赤酵母的方法，其中，所述步骤S002中，所述pPICZ αA-THA表达载体的构建包括以下步骤：在THA编码基因序列的5’端添加 XhoI序列，3’端添加XbaI序列，然后用限制性内切酶XhoI和XbaI进行双酶切处理，再用T4 DNA连接酶将经双酶切处理的THA编码基因连接至同样用XhoI和XbaI双酶切处理的线性化pPICZαA载体，构建所述pPICZα A-THA表达载体。

所述的构建重组毕赤酵母的方法，其中，所述步骤S002中，所述 pPIC3.5K-THA表达载体的构建包括以下步骤：在THA编码基因序列的5’端添加α-因子分泌信号肽序列，然后在该信号肽的起始密码子前添加 BamHI序列，在THA编码基因序列的3’端添加NotI序列，得到融合序列，然后用限制性内切酶BamHI和NotI进行双酶切处理，再用T4 DNA连接酶将经双酶切处理的THA编码基因连接至同样用BamHI和NotI双酶切处理的线性化pPIC3.5K载体，构建所述pPIC3.5K-THA表达载体。

所述的构建重组毕赤酵母的方法，其中，所述步骤S003中，所述pPICZ αA-THA和pPIC3.5K-THA线性化表达载体通过电转化转入感受态细胞。

所述的构建重组毕赤酵母的方法，其中，所述步骤S003中，所述pPICZ αA-THA表达载体采用PmeI限制性内切酶进行线性化处理。

所述的构建重组毕赤酵母的方法，其中，所述步骤S003中，所述 pPIC3.5K-THA表达载体采用SalI限制性内切酶进行线性化处理。

所述的构建重组毕赤酵母的方法，其中，所述步骤S003中，菌株表达量检测包括以下步骤：挑取单菌落进行培养，稳定后用1％甲醇诱导48小时，然后收集发酵上清液，上清液离心后用于检测抑菌圈大小，选择出表达量最优的菌株。

一种重组毕赤酵母的诱导表达方法，用于上述的重组毕赤酵母分泌表达重组蝽防御素THA，包括以下步骤：

步骤S101.一级培养：将重组毕赤酵母接种于25mL BMGY培养基中，在 30℃、220rpm的条件下培养24小时，获得一级种子液；

步骤S102.二级培养：取20mL一级种子液接种于200mL BMGY培养基中，在30℃、220rpm的条件下培养24小时，获得二级种子液；

步骤S103.三级培养：将二级种子液全部接种于含有2L BSM培养基的发酵罐中进行培养，培养时，温度控制在29.5-30.5℃，溶氧控制在 19.5-20.5％，pH控制在4.5-5.5；

步骤S104.诱导表达：当BSM培养基的甘油耗尽后，流加10％甘油，甘油耗尽后待溶氧上升至100％，饥饿1小时，然后流加甲醇诱导THA表达，诱导时间为96小时，温度控制在25.5-26.5℃，pH控制在4-4.5。

有益效果：

本发明提供了一种分泌表达重组蝽防御素THA的重组毕赤酵母，其遗传性能稳定，且THA表达量高，经检测可达1.5g/L以上，为现有技术的两倍以上，为THA抗菌肽的规模化生产打下了良好基础。

此外，本发明还提供了一种重组毕赤酵母的构建方法，用于构建分泌表达重组蝽防御素THA的重组毕赤酵母，该方法通过在毕赤酵母基因组的两个不同位点***THA表达盒，使得THA表达盒在菌株传代的过程中不易丢失，增强了遗传稳定性。另外，采用多位点***的方式还增加了THA编码基因在毕赤酵母中的拷贝数，提高重组毕赤酵母THA的表达量。

附图说明

图1为pPICZαA-THA表达载体的构建路线图。

图2为pPIC3.5K-THA表达载体的构建路线图。

图3为步骤S003中筛选菌株的发酵上清液对大肠杆菌ATCC25922的抑菌活性的测试结果。

图4为THA-1和THA-2菌株发酵上清液的Tricine-SDS-PAGE蛋白电泳结果。

图5为THA-1和THA-2菌株发酵上清液的反相高效液相色谱结果。

图6为发酵上清液经反相HPLC分离纯化的THA的质谱结果。

图7为THA-1和THA-2菌株扩大培养后，其发酵上清液对大肠杆菌 ATCC25922的抑菌活性的测试结果。

具体实施方式

本发明提供一种分泌表达重组蝽防御素THA的重组毕赤酵母及其构建方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一种构建重组毕赤酵母的方法，用于构建分泌表达重组蝽防御素THA 的重组毕赤酵母，包括以下步骤：

步骤S001.设计重组蝽防御素THA编码基因：以THA成熟肽序列SEQ ID NO.1为目标产物，根据毕赤酵母密码子偏好性设计THA编码基因；设计得到的THA编码基因为SEQ IDNO.2。

步骤S002.构建表达载体：将步骤S001中设计得到的THA编码基因分别连接至载体pPICZαA和pPIC3.5K，分别构建pPICZαA-THA和 pPIC3.5K-THA表达载体；其中pPICZαA载体在毕赤酵母基因组上的整合位点为AOX1，pPIC3.5K载体在毕赤酵母基因组上的整合位点为HIS4，多位点的整合可以减少外源基因在菌株传代时丢失，从而提高菌株的遗传稳定性。

请参阅图1，pPICZαA-THA表达载体的构建包括以下步骤：在THA编码基因序列的5’端添加XhoI序列，3’端添加XbaI序列，然后用限制性内切酶XhoI和XbaI进行双酶切处理，再用T4 DNA连接酶将经双酶切处理的THA编码基因连接至同样用XhoI和XbaI双酶切处理的线性化pPICZαA 载体，构建所述pPICZαA-THA表达载体；

pPICZαA-THA表达载体的验证：将连接产物在42℃下热激转化至大肠杆菌Top10感受态细胞，然后将大肠杆菌Top10涂布于含博来霉素的LB抗性平板，37℃过夜培养至长出单菌落。挑选单菌落进行菌落PCR，验证阳性转化子。验证引物为：5AOX-F：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’以及3AOX-R： 5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’。挑取阳性转化子进行测序，正确菌株保存于甘油管中。

请参阅图2，pPIC3.5K-THA表达载体的构建包括以下步骤：在THA编码基因序列的5’端添加α-因子分泌信号肽序列(序列3)，然后在该信号肽的起始密码子前添加BamHI序列，在THA编码基因序列的3’端添加 NotI序列，得到融合序列，然后用限制性内切酶BamHI和NotI进行双酶切处理融合序列，再用T4 DNA连接酶将经双酶切处理的融合序列连接至同样用BamHI和NotI双酶切处理的线性化pPIC3.5K载体，构建所述 pPIC3.5K-THA表达载体；α-因子分泌信号肽序列用于使THA合成后分泌至酵母体外，便于THA的提纯；而pPICZαA载体中已设计有α-因子分泌信号肽序列，因此无需引入。

pPIC3.5K-THA表达载体的验证：将连接产物在42℃下热激转化至大肠杆菌Top10感受态细胞，然后将大肠杆菌Top10涂布于含卡那霉素的LB抗性平板，37℃过夜培养至长出单菌落。挑选单菌落进行菌落PCR，验证阳性转化子。验证引物为：5AOX-F：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’以及3AOX-R： 5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’。挑取阳性转化子进行测序，正确菌株保存于甘油管中。

步骤S003.构建重组毕赤酵母：先采用PmeI限制性内切酶对pPICZα A-THA表达载体进行线性化处理，电泳分离，切胶回收线性化表达载体，然后将pPICZαA-THA线性化表达载体电转至毕赤酵母感受态细胞，电压为1.5-2.5kV，宿主毕赤酵母可选择X33毕赤酵母或其他毕赤酵母，如GS115、 SMD1168等；然后将转化后的毕赤酵母接种至筛选培养基培养，得到单菌落后进行菌株表达量检测，挑选出最优菌株THA-1；

再采用SalI限制性内切酶对pPIC3.5K-THA表达载体进行线性化处理，电泳分离，切胶回收线性化表达载体，然后将pPIC3.5K-THA线性化表达载体转入菌株THA-1感受态细胞，经过筛选培养基培养得到单菌落后再次进行菌株表达量检测，挑选出最优菌株THA-2，获得所述分泌表达重组蝽防御素THA的重组毕赤酵母。

步骤S003中，菌株表达量检测包括以下步骤：挑取单菌落进行培养，稳定后用1％甲醇诱导48小时，然后收集发酵上清液，上清液离心后用于检测抑菌圈大小，选择出THA表达量最优的菌株。

图3为菌株发酵液对大肠杆菌ATCC25922的抑菌活性的测试结果，图中“X33”为空白菌株对照，“F1-1”和“F1-2”为THA-1菌株，“F2-1”、“F2-2”和“F2-3”为THA-2菌株，从图中可以看出，按抑菌圈大小排序， THA-2菌株＞THA-1菌株＞空白菌株，经过两次转化，THA-2菌株发酵液的抑菌活性得到明显提升，表示THA的表达量进一步增加。

重组毕赤酵母的诱导表达方法，包括以下步骤：

步骤S101.一级培养：将重组毕赤酵母接种于25mL BMGY培养基中，在 30℃、220rpm的条件下培养24小时，获得一级种子液；

步骤S102.二级培养：取20mL一级种子液接种于200mL BMGY培养基中，在30℃、220rpm的条件下培养24小时，获得二级种子液；

步骤S103.三级培养：将二级种子液全部接种于含有2L BSM培养基的发酵罐中进行培养，培养时，温度控制在29.5-30.5℃，溶氧控制在 19.5-20.5％，pH控制在4.5-5.5；

步骤S104.诱导表达：当BSM培养基的甘油耗尽后，流加10％甘油，甘油耗尽后待溶氧上升至100％，饥饿1小时，然后流加甲醇诱导THA表达，诱导时间为96小时，温度控制在25.5-26.5℃，pH控制在4-4.5。

获得的THA-1和THA-2菌株分别按照上述诱导表达方法进行培养，将获得的发酵上清液进行检测，并将检测结果进行比对。

蛋白电泳检测

用Tricine-SDS-PAGE蛋白电泳分析THA-1菌株和双位点***THA-2菌株发酵上清液中THA的表达情况，蛋白电泳结果如图4所示，图中标号“M”代表Marker，标号“1”、“2”、“3”分别代表THA-1菌株在甲醇诱导 48、72、96小时后的发酵上清液，标号“4”、“5”、“6”分别代表THA-2 菌株在甲醇诱导48、72、96小时后的发酵上清液。从图中可以看出，THA-1 和THA-2菌株的发酵上清液的蛋白条带均处于在2000-4000Da之间，蛋白条带的分子量大小与THA的理论分子量相近。此外，图中还可以看出THA-2 菌株的THA表达量明显高于THA-1菌株。

反相高效液相色谱检测

采用Agilent 1260型高效液相色谱仪进行检测，检测样品上样至C18 反相色谱柱(Agilent ZORBAX SB-C18 250×4.6mm,粒径5um)。用含0.1％TFA 的0％-80％的乙腈溶液梯度淋洗30分钟，流速1ml/min，记录220nm处的紫外吸收峰。标准品为0.5mg/ml的THA，上样量为50ul。THA发酵上清液经高速离心和0.45um孔径的滤膜过滤，上样量为25ul。色谱峰图谱如图5所示，其中图5A为50ul浓度为0.5mg/ml的THA标准品的色谱结果，图5B 为25ulTHA-1菌株发酵上清液的色谱结果，图5C为25ul THA-2菌株发酵上清液的色谱结果，按峰面积积分计算发酵液中的THA含量，THA-1菌株发酵诱导96小时后的发酵上清发酵液中THA的浓度为0.76mg/mL,THA-2菌株发酵诱导96小时后的发酵上清液中THA的浓度为1.5mg/mL。

质谱检测

为精确测定发酵表达的THA多肽的分子量，将经反相HPLC分离纯化的 THA(浓度为1mg/mL)寄送北京北达微构分析测试中心，用岛津高分辨 MALDI-TOF质谱仪，以α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)为基质，正离子反射模式下测定了纯化THA的单同位素质量，质谱结果如图6所示，测得其精确分子量为2434.75Da,与根据分子式计算的理论分子量2434.29吻合。

发酵上清液抑菌活性检测

分别取THA-1和THA-2菌株诱导96h后的发酵上清液检测对大肠杆菌 ATCC25922的抑菌活性，图7为抑菌活性测试结果，图中标号“1”和“2”分别代表THA-1和THA-2菌株诱导前的发酵上清液，标号“3”和“4”分别代表THA-1和THA-2菌株诱导96小时后的发酵上清液，图中每孔的点样量为10ul。从图中可以看出，THA-1和THA-2菌株诱导96小时后的发酵上清液均具有明显的抑菌活性。

菌株稳定性评价

通过连续传代培养评价菌株稳定性。评价方法如下：将菌株接种于3mL BMGY培养基中，30℃，220rpm培养24小时制备种子液。取0.5mL种子液接种于25mL BMGY培养基中，30℃，220rpm培养24小时。菌液转移到50mL 离心管中，6000rpm离心5min，弃上清，然后用25mL甲醇浓度为1％的BMMY 培养基重悬菌体，菌液转移到250mL三角瓶中，30℃，220rpm培养72小时，每24小时添加甲醇至1％浓度。诱导完成后取发酵液，8000rpm离心5min 后，取上清液进行THA的最低抑菌浓度检测(MIC)。

将THA-2菌株连续传代培养10代，检测发酵上清液最低抑菌浓度，结果显示每一代菌株的摇瓶发酵上清液的MIC＝1/80，说明菌株稳定性良好。

综合上述检测结果，可以得出，通过多位点***的方法所构建的重组毕赤酵母(Pichia pastoris)THA-2菌株能够稳定地表达并分泌出具有抑菌活性的THA，其诱导96小时的THA表达量可达1.5g/L，是现有技术的2倍以上，且其遗传稳定性好，应用价值高。

重组毕赤酵母(Pichia pastoris)THA-2菌株，于2021年10月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼 5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No.61977。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

序列表

<110> 广东海纳川生物科技股份有限公司

<120> 一种分泌表达重组蝽防御素THA的重组毕赤酵母及其构建方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Podisus maculiventris)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(66)

<223> 根据THA蛋白序列设计，用于构建毕赤酵母表达载体

<400> 1

ggttctaaga aacctgtgcc tatcatctat tgtaacagaa gaaccggtaa gtgtcaacgt 60

atgtaa 66

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> 斑腹刺益蝽(Podisus maculiventris)

<400> 2

Gly Ser Lys Lys Pro Val Pro Ile Ile Tyr Cys Asn Arg Arg Thr Gly

1 5 10 15

Lys Cys Gln Arg Met

20

<210> 3

<211> 255

<212> DNA

<213> α-因子分泌信号序列(Pichia pastoris)

<400> 3

atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctctcgaga aaaga 255

Claims (10)

1.一种分泌表达重组蝽防御素THA的重组毕赤酵母，其特征在于，所述重组毕赤酵母(Pichia pastoris)保藏编号为GDMCC No.61977。

2.一种构建重组毕赤酵母的方法，其特征在于，用于构建权利要求1所述的分泌表达重组蝽防御素THA的重组毕赤酵母，包括以下步骤：

步骤S001.设计重组蝽防御素THA编码基因：以THA成熟肽序列为目标产物，根据毕赤酵母密码子偏好性设计THA编码基因；

步骤S002.构建表达载体：将步骤S001中设计得到的THA编码基因分别连接至载体pPICZαA和pPIC3.5K，分别构建pPICZαA-THA和pPIC3.5K-THA表达载体；

步骤S003.构建重组毕赤酵母：分别对pPICZαA-THA和pPIC3.5K-THA表达载体进行线性化处理，然后将pPICZαA-THA线性化表达载体转入毕赤酵母感受态细胞，将转化后的毕赤酵母接种至筛选培养基培养，得到单菌落后进行菌株表达量检测，挑选出最优菌株THA-1；再将pPIC3.5K-THA线性化表达载体转入菌株THA-1感受态细胞，经过筛选培养基培养得到单菌落后再次进行菌株表达量检测，挑选出最优菌株THA-2，获得所述分泌表达重组蝽防御素THA的重组毕赤酵母。

3.根据权利要求2所述的构建重组毕赤酵母的方法，其特征在于，所述步骤S001中，所述THA编码基因序列为SEQ ID NO.2。

4.根据权利要求2所述的构建重组毕赤酵母的方法，其特征在于，所述步骤S002中，所述pPICZαA-THA表达载体的构建包括以下步骤：在THA编码基因序列的5’端添加XhoI序列，3’端添加XbaI序列，然后用限制性内切酶XhoI和XbaI进行双酶切处理，再用T4DNA连接酶将经双酶切处理的THA编码基因连接至同样用XhoI和XbaI双酶切处理的线性化pPICZαA载体，构建所述pPICZαA-THA表达载体。

5.根据权利要求2所述的构建重组毕赤酵母的方法，其特征在于，所述步骤S002中，所述pPIC3.5K-THA表达载体的构建包括以下步骤：在THA编码基因序列的5’端添加α-因子分泌信号肽序列，然后在该信号肽的起始密码子前添加BamHI序列，在THA编码基因序列的3’端添加NotI序列，得到融合序列，然后用限制性内切酶BamHI和NotI进行双酶切处理，再用T4 DNA连接酶将经双酶切处理的THA编码基因连接至同样用BamHI和NotI双酶切处理的线性化pPIC3.5K载体，构建所述pPIC3.5K-THA表达载体。

6.根据权利要求2所述的构建重组毕赤酵母的方法，其特征在于，所述步骤S003中，所述pPICZαA-THA和pPIC3.5K-THA线性化表达载体通过电转化转入感受态细胞。

7.根据权利要求2所述的构建重组毕赤酵母的方法，其特征在于，所述步骤S003中，所述pPICZαA-THA表达载体采用PmeI限制性内切酶进行线性化处理。

8.根据权利要求2所述的构建重组毕赤酵母的方法，其特征在于，所述步骤S003中，所述pPIC3.5K-THA表达载体采用SalI限制性内切酶进行线性化处理。

9.根据权利要求2所述的构建重组毕赤酵母的方法，其特征在于，所述步骤S003中，菌株表达量检测包括以下步骤：挑取单菌落进行培养，稳定后用1％甲醇诱导48小时，然后收集发酵上清液，上清液离心后用于检测抑菌圈大小，选择出表达量最优的菌株。

10.一种重组毕赤酵母的诱导表达方法，其特征在于，用于权利要求1所述的重组毕赤酵母分泌表达重组蝽防御素THA，包括以下步骤：

步骤S101.一级培养：将重组毕赤酵母接种于25mL BMGY培养基中，在30℃、220rpm的条件下培养24小时，获得一级种子液；

步骤S102.二级培养：取20mL一级种子液接种于200mL BMGY培养基中，在30℃、220rpm的条件下培养24小时，获得二级种子液；

步骤S103.三级培养：将二级种子液全部接种于含有2L BSM培养基的发酵罐中进行培养，培养时，温度控制在29.5-30.5℃，溶氧控制在19.5-20.5％，pH控制在4.5-5.5；

步骤S104.诱导表达：当BSM培养基的甘油耗尽后，流加10％甘油，甘油耗尽后待溶氧上升至100％，饥饿1小时，然后流加甲醇诱导THA表达，诱导时间为96小时，温度控制在25.5-26.5℃，pH控制在4-4.5。

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