CN107759647B - 一种从刺玫果中同时提取金丝桃苷和木犀草素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从刺玫果中同时提取金丝桃苷和木犀草素的方法，包括对刺玫果进行脱脂处理；然后在复合酶及离子液体的辅助下经乙醇水溶液提取。本发明创造性地在提取步骤前使用适当脱脂等预处理方法；本发明创造性地在提取步骤中使用了复合酶辅助提取的方法；本发明创造性地在提取步骤中使用离子液体辅助提取的方法，并获得金丝桃苷及木犀草素二者含量尽可能高的提取浸液，金丝桃苷提取率大于33µg/g，木犀草素提取率大于16µg/g。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种从刺玫果中同时提取金丝桃苷和木犀草素的方法。
背景技术
刺玫果为蔷薇科山刺玫Rosa davurica pall．的干燥成熟果实，秋季果实成熟时采收，晒干，主要产于东北、华北及内蒙古等地，刺玫果中含总黄酮，维生素、果胶、糖及皂苷等化学成份。药理实验表明，刺玫果水提物、醇提物均可降低麻醉大鼠血压和脑血管阻力，可使麻醉猫心率减慢，增加冠脉流量，降低冠脉阻力；还可降低小鼠耗氧量及延长缺氧小鼠存活时间，并能对抗异丙肾上腺素增加心肌耗氧量的作用；刺玫果水提物静脉注射，可抑制大鼠血栓形成。近年来国内的大量研究表明它有抗衰老、增强免疫、抗疲劳，保肝等作用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供了一种从刺玫果中同时提取金丝桃苷和木犀草素的方法，包括以下步骤：
1）对刺玫果进行脱脂处理；
2）将脱脂后的刺玫果与提取溶剂混合，加入复合酶，调节体系pH值及水浴温度，进行酶解；
3）在刺玫果的酶解液中加入适量的离子液体，调节体系水浴温度，进行提取；
4）刺玫果的提取浸液置于容量瓶中定容，采用高效液相色谱法同时测定提取浸液中金丝桃苷、木犀草素的含量。
优选地，本发明所述从刺玫果中同时提取金丝桃苷和木犀草素的方法中，所述步骤1）中刺玫果的脱脂处理为将刺玫果自然晾干，使含水量低于7%重量，然后以料液比为1:3（质量：体积）的石油醚（沸程为60℃~90℃）回流脱脂，低温干燥，使含水量低于4%重量，得到预处理好的刺玫果；更优选地，所述石油醚回流脱脂次数为2次，脱脂时间分别为1.5、1.0h；更优选地，所述低温干燥的温度为低于60℃。
优选地，本发明所述从刺玫果中同时提取金丝桃苷和木犀草素的方法中，所述步骤2）中复合酶为纤维素酶与果胶酶按质量比2:1混合而成；所述步骤2）中提取溶剂为70%乙醇水溶液；所述步骤2）中体系pH值为5~6，水浴温度为45℃~50℃。所述步骤3）中离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑硝酸盐；所述步骤3）中水浴温度为75℃~80℃。
更优选地，所述步骤2）中酶解方法为将70%的乙醇水溶液与预处理好的刺玫果按料液比（质量：体积比）为1:40进行混合，加入相当于刺玫果质量0.05%的复合酶，用20%的乙酸水溶液调至体系pH值为5～6，于水浴温度45℃~50℃条件下酶解3h。
更优选地，所述步骤3）中离子液体辅助提取的方法为：在刺玫果的酶解液中，加入离子液体1-丁基-3-甲基咪唑硝酸盐适量，使离子液体摩尔浓度为0.1～0.6mol/L，然后升高水浴温度至75℃~80℃提取5h，过滤，滤液减压浓缩，置于合适的容量瓶中定容，得到刺玫果的提取浸液。
优选地，本发明所述从刺玫果中同时提取金丝桃苷和木犀草素的方法中，所述步骤4）中高效液相色谱法同时测定提取浸液中金丝桃苷、木犀草素的含量，其流动相为：乙腈为流动相A，0.25%磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱（0min--17%A;22min--20%A;27min--24%A;28min--28%A;36min--32%A;41min--35%A）。
本发明提供了上述方法获得的含有金丝桃苷和木犀草素的刺玫果提取浸液，其中，所述刺玫果中的金丝桃苷提取率大于33µg/g，木犀草素提取率大于16µg/g。
本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明创造性地在提取步骤前使用适当脱脂等预处理方法；本发明创造性地在提取步骤中使用了复合酶辅助提取的方法；本发明创造性地在提取步骤中使用离子液体辅助提取的方法，并获得金丝桃苷及木犀草素二者含量尽可能高的提取浸液，金丝桃苷提取率大于33µg/g，木犀草素提取率大于16µg/g。
具体实施方式
本发明的实施例中提供了一种从刺玫果中同时提取金丝桃苷和木犀草素的方法，包括以下步骤：
1）对刺玫果进行脱脂处理；
2）然后将脱脂后的刺玫果与提取溶剂混合，加入复合酶，调节体系pH值及水浴温度，进行酶解；
3）在刺玫果的酶解液中加入适量的离子液体，调节体系水浴温度，进行提取；
4）刺玫果的提取浸液置于容量瓶中定容，采用高效液相色谱法同时测定提取浸液中金丝桃苷、木犀草素的含量。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述步骤1）中刺玫果的脱脂处理为将刺玫果自然晾干，使含水量低于7%重量，然后以料液比为1:3（质量：体积）的石油醚（沸程为60℃~90℃）回流脱脂，低温干燥，使含水量低于4%重量，得到预处理好的刺玫果。
更优选地，所述石油醚回流脱脂次数为2次，脱脂时间分别为1.5、1.0h。
更优选地，所述低温干燥的温度为低于60℃。
优选地，本发明所述从刺玫果中同时提取金丝桃苷和木犀草素的方法中，所述步骤2）中复合酶为纤维素酶与果胶酶按质量比2:1混合而成；所述步骤2）中提取溶剂为70%乙醇水溶液；所述步骤2）中体系pH值为5~6，水浴温度为45℃~50℃。
优选地，本发明所述从刺玫果中同时提取金丝桃苷和木犀草素的方法中，所述步骤3）中离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑硝酸盐；所述步骤3）中水浴温度为75℃~80℃。
更优选地，所述步骤2）中酶解方法为将70%的乙醇水溶液与预处理好的刺玫果按料液比（质量：体积）为1:40进行混合，加入相当于刺玫果质量0.05%的复合酶，用20%的乙酸水溶液调至体系pH值为5～6，于水浴温度45℃~50℃条件下酶解3h。
更优选地，所述步骤3）中离子液体辅助提取的方法为：在刺玫果的酶解液中，加入离子液体1-丁基-3-甲基咪唑硝酸盐适量，使离子液体摩尔浓度为0.1～0.5mol/L，然后升高水浴温度至75℃~80℃提取5h，过滤，滤液减压浓缩，置于合适的容量瓶中定容，得到刺玫果的提取浸液。
优选地，本发明所述从刺玫果中同时提取金丝桃苷和木犀草素的方法中，所述步骤4）中高效液相色谱法同时测定提取浸液中金丝桃苷、木犀草素的含量，其流动相为：乙腈为流动相A，0.25%磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱（0min--17%A;22min--20%A;27min--24%A;28min--28%A;36min--32%A;41min--35%A）。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述步骤4）中高效液相色谱法同时测定提取浸液中金丝桃苷、木犀草素的含量，色谱条件：色谱柱为大连依利特ODS2 C18（4.6mm×250mm,5μm）；流动相为乙腈为流动相A，0.25%磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱（0min--17%A;22min--20%A; 27min--24%A;28min--28%A;36min--32%A;41min--35%A）；体积流量为1.0mL/min；柱温35℃；检测波长 360nm；进样量 20µL。在上述色谱条件下，金丝桃苷、木犀草素的色谱峰与相邻峰的分离度均大于 1.5。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述步骤4）中高效液相色谱法同时测定提取浸液中金丝桃苷、木犀草素的含量，金丝桃苷在0.19～15.20µg/mL（R=0.9981）范围内色谱峰的峰面积与质量浓度呈良好线性关系、木犀草素在0.19～15.20µg/mL（R=0.9977）范围内色谱峰的峰面积与质量浓度呈良好线性关系；仪器精密度试验中金丝桃苷对照品的 RSD为2.40%、刺玫果提取浸液的RSD为2.07%，木犀草素对照品的RSD为 2.35%、刺玫果提取浸液的RSD为 2.99%；稳定性试验结果表明刺玫果提取浸液在5h内稳定性良好，满足测定要求；重复性试验结果表明刺玫果提取浸液中的金丝桃苷RSD 为1.47%、刺玫果提取浸液中的木犀草素RSD为 2.93%，结果表明重复性良好；加样回收率试验结果表明金丝桃苷的平均回收率为101.07%，RSD为1.77%，木犀草素的平均回收率为97.49%，RSD为1.76%，回收率良好，方法准确性较高，具有可行性。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述步骤4）中高效液相色谱法同时测定提取浸液中金丝桃苷、木犀草素的含量，三批工艺稳定性验证试验结果表明：该方法对刺玫果中的金丝桃苷提取率大于33µg/g，木犀草素提取率大于16µg/g。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：刺玫果中金丝桃苷、木犀草素的提取
1、刺玫果的预处理：将刺玫果自然晾干，使含水量低于7%重量，然后以料液比为1:3（质量：体积）的石油醚（沸程为60℃~90℃）回流脱脂，低温干燥，使含水量低于4%重量，得到预处理好的刺玫果。将刺玫果自然晾干，使含水量低于7%，然后以料液比为1:3（质量：体积）的石油醚（60℃~90℃）回流脱脂2次，每次分别为1.5、1.0h，主要除去刺玫果中的脂类、色素等，将脱脂后的刺玫果在干燥箱中低于60℃进行干燥，使含水量低于4%，得到预处理好的刺玫果；
2、酶解：将70%的乙醇水溶液与预处理好的刺玫果按料液比（质量：体积）为1:40进行混合，加入相当于刺玫果质量0.05%的纤维素酶与果胶酶的复合酶(质量比为2:1)，用20%的乙酸水溶液调至体系pH值为5～6，于水浴温度45℃~50℃条件下酶解3h；
3、离子液体辅助提取：在刺玫果的酶解液中，加入离子液体1-丁基-3-甲基咪唑硝酸盐适量，使离子液体摩尔浓度为0.4mol/L，然后升高水浴温度至75℃~80℃提取5h，过滤，滤液减压浓缩，置于合适的容量瓶中定容，得到刺玫果的提取浸液。
含量测定：吸取提取所得到的刺玫果提取浸液适量，经0.45µm有机滤膜过滤后，作为供试品溶液，然后按色谱条件进样20µL，测定金丝桃苷与木犀草素色谱峰的峰面积，采用外标法计算提取浸液中金丝桃苷与木犀草素的质量浓度，从而计算金丝桃苷与木犀草素的提取率，其金丝桃苷与木犀草素的提取率分别为34.62µg/g、17.01µg/g。
提取溶剂对提取效果的影响 称取干燥的刺玫果粉末适量，放入圆底烧瓶中，以料液比为1:20（g:mL）加入乙醇体积分数分别为0%、10%、30%、50%、70%、90%的乙醇水溶液，加入相当于刺玫果质量0.05%的复合酶（纤维素酶：果胶酶=2：1；质量比），用20%的乙酸水溶液调至体系pH值为5～6，于水浴温度45℃~50℃条件下酶解3h，然后加入离子液体1-丁基-3-甲基咪唑硝酸盐适量，使离子液体摩尔浓度为0.1mol/L，然后升高水浴温度至75℃~80℃提取5h，过滤，滤液减压浓缩，置于合适的容量瓶中定容，然后按色谱条件进样20μL，测定金丝桃苷与木犀草素色谱峰的峰面积，采用外标法计算提取浸液中金丝桃苷与木犀草素的质量浓度，从而计算金丝桃苷与木犀草素的提取率，结果提取溶剂为乙醇体积分数70%乙醇水溶液时，金丝桃苷与木犀草素提取率最高，分别为25.47µg/g、9.51µg/g。
酶种类对提取效果的影响 称取干燥的刺玫果粉末适量，放入圆底烧瓶中，以料液比为1:20（g:mL）加入70%乙醇水溶液，分别加入相当于刺玫果质量0.05%的纤维素酶、果胶酶及二者复合酶（纤维素酶与果胶酶的质量比分别为1：1、2：1、3：1、1：2、1：3），用20%的乙酸水溶液调至体系pH值为5～6，于水浴温度45℃~50℃条件下酶解3h，然后加入离子液体1-丁基-3-甲基咪唑硝酸盐适量，使离子液体摩尔浓度为0.1mol/L，然后升高水浴温度至75℃~80℃提取5h，过滤，滤液减压浓缩，置于合适的容量瓶中定容，然后按色谱条件进样20µL，测定金丝桃苷与木犀草素色谱峰的峰面积，采用外标法计算提取浸液中金丝桃苷与木犀草素的质量浓度，从而计算金丝桃苷与木犀草素的提取率，结果当纤维素酶与果胶酶的质量比为2:1时，金丝桃苷与木犀草素提取率最高，分别为25.55µg/g、9.48µg/g。
酶解时间对提取效果的影响 称取干燥的刺玫果粉末适量，放入圆底烧瓶中，以料液比为1:20（g:mL）加入70%乙醇水溶液，加入相当于刺玫果质量0.05%的复合酶（纤维素酶：果胶酶=2:1；质量比），用20%的乙酸水溶液调至体系pH值为5～6，于水浴温度45℃~50℃条件下分别酶解1、2、3、4、5h，然后加入离子液体1-丁基-3-甲基咪唑硝酸盐适量，使离子液体摩尔浓度为0.1mol/L，然后升高水浴温度至75℃~80℃提取5h，过滤，滤液减压浓缩，置于合适的容量瓶中定容，然后按色谱条件进样20µL，测定金丝桃苷与木犀草素色谱峰的峰面积，采用外标法计算提取浸液中金丝桃苷与木犀草素的质量浓度，从而计算金丝桃苷与木犀草素的提取率，结果当酶解时间为3h，金丝桃苷与木犀草素提取率最高，分别为26.01µg/g、9.55µg/g，继续延长酶解时间，金丝桃苷与木犀草素的提取率略有增加。
离子液体摩尔浓度对提取效果的影响 称称取干燥的刺玫果粉末适量，放入圆底烧瓶中，以料液比为1:20（g:mL）加入70%乙醇水溶液，加入相当于刺玫果质量0.05%的复合酶（纤维素酶：果胶酶=2:1；质量比），用20%的乙酸水溶液调至体系pH值为5～6，于水浴温度45℃~50℃条件下酶解3h，然后加入离子液体1-丁基-3-甲基咪唑硝酸盐适量，使离子液体摩尔浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mol/L，然后升高水浴温度至75℃~80℃提取5h，过滤，滤液减压浓缩，置于合适的容量瓶中定容，然后按色谱条件进样20µL，测定金丝桃苷与木犀草素色谱峰的峰面积，采用外标法计算提取浸液中金丝桃苷与木犀草素的质量浓度，从而计算金丝桃苷与木犀草素的提取率，结果当离子液体摩尔浓度为0.4mol/L时，金丝桃苷与木犀草素提取率最高，分别为29.06µg/g、12.21µg/g，继续提高离子液体摩尔浓度，金丝桃苷与木犀草素的提取率增加不明显。
料液比对提取效果的影响 称取干燥的刺玫果粉末适量，放入圆底烧瓶中，以料液比分别为1:5、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50（g:mL）加入70%乙醇水溶液，加入相当于刺玫果质量0.05%的复合酶（纤维素酶：果胶酶=2:1；质量比），用20%的乙酸水溶液调至体系pH值为5～6，于水浴温度45℃~50℃条件下酶解3h，然后加入离子液体1-丁基-3-甲基咪唑硝酸盐适量，使离子液体摩尔浓度为0.4mol/L，然后升高水浴温度至75℃~80℃提取5h，过滤，滤液减压浓缩，置于合适的容量瓶中定容，然后按色谱条件进样20µL，测定金丝桃苷与木犀草素色谱峰的峰面积，采用外标法计算提取浸液中金丝桃苷与木犀草素的质量浓度，从而计算金丝桃苷与木犀草素的提取率，结果当料液比为1:40时，金丝桃苷与木犀草素提取率较高，分别为31.15µg/g、14.08µg/g，以后随着料液比的增加，金丝桃苷与木犀草素的的提取率略有增加，但幅度较小。
离子液体辅助提取时间对提取效果的影响 称取干燥的刺玫果粉末适量，放入圆底烧瓶中，以料液比为1:40（g:mL）加入70%乙醇水溶液，加入相当于刺玫果质量0.05%的复合酶（纤维素酶：果胶酶=2:1；质量比），用20%的乙酸水溶液调至体系pH值为5～6，于水浴温度45℃~50℃条件下酶解3h，然后加入离子液体1-丁基-3-甲基咪唑硝酸盐适量，使离子液体摩尔浓度为0.4mol/L，然后升高水浴温度至75℃~80℃，分别提取1、2、3、4、5、6h，过滤，滤液减压浓缩，置于合适的容量瓶中定容，然后按色谱条件进样20µL，测定金丝桃苷与木犀草素色谱峰的峰面积，采用外标法计算提取浸液中金丝桃苷与木犀草素的质量浓度，从而计算金丝桃苷与木犀草素的提取率，结果当离子液体辅助提取时间为5h时，金丝桃苷与木犀草素提取率较高，分别为32.64µg/g、15.21µg/g，以后随着提取时间的延长，金丝桃苷与木犀草素的的提取率略有增加，但幅度较小。
离子液体辅助提取水浴温度对提取效果的影响 称取干燥的刺玫果粉末适量，放入圆底烧瓶中，以料液比为1:40（g:mL）加入70%乙醇水溶液，加入相当于刺玫果质量0.05%的复合酶（纤维素酶：果胶酶=2:1；质量比），用20%的乙酸水溶液调至体系pH值为5～6，于水浴温度45℃~50℃条件下酶解3h，然后加入离子液体1-丁基-3-甲基咪唑硝酸盐适量，使离子液体摩尔浓度为0.4mol/L，然后将水浴温度分别控制在50℃~60℃、60℃~70℃、70℃~75℃、75℃~80℃、80℃~85℃，提取5h，过滤，滤液减压浓缩，置于合适的容量瓶中定容，然后按色谱条件进样20µL，测定金丝桃苷与木犀草素色谱峰的峰面积，采用外标法计算提取浸液中金丝桃苷与木犀草素的质量浓度，从而计算金丝桃苷与木犀草素的提取率，结果当离子液体辅助提取水浴温度为75℃~80℃时，金丝桃苷与木犀草素提取率最高，分别为32.29µg/g、15.37µg/g。
通过多次试验发现酶种类固定为复合酶（纤维素酶：果胶酶=2:1；质量比），离子液体辅助提取时间固定为5h，离子液体辅助提取水浴温度固定为75℃~80℃时，金丝桃苷与木犀草素的提取率较高，为了进一步优化提取工艺条件，选择乙醇体积分数A（65%、70%、75%）、料液比B（1:35、1:40、1:45）、酶解时间C（3.0、3.5、4.0h）、离子液体摩尔浓度（0.35、0.4、0.45mol/L）进行四因素三水平正交实验。
正交试验结果及工艺验证试验：正交试验结果表明，最佳提取条件为A2B2C1D2，即提取溶剂为70%乙醇水溶液，料液比为1:40，酶种类为复合酶（纤维素酶：果胶酶=2:1；质量比），酶解时间为3h，离子液体摩尔浓度为0.4mol/L，离子液体辅助提取水浴温度为75℃~80℃，离子液体辅助提取时间为5h。三次工艺验证试验结果金丝桃苷的提取率分别为35.48µg/g、33.98µg/g、36.29µg/g，木犀草素的提取率分别为16.61µg/g、17.37µg/g、17.02µg/g，表明工艺稳定、可行。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种从刺玫果中同时提取金丝桃苷和木犀草素的方法，包括以下步骤：
1)对刺玫果进行脱脂处理；
2)将脱脂后的刺玫果与提取溶剂混合，加入复合酶，调节体系pH值及水浴温度，进行酶解；所述复合酶为纤维素酶与果胶酶按质量比2：1混合而成；所述提取溶剂为70％乙醇水溶液；所述体系pH值为5～6，所述水浴温度为45℃～50℃；
3)在刺玫果的酶解液中加入离子液体，然后调节体系水浴温度，进行提取；所述离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑硝酸盐；所述水浴温度为75℃～80℃；所述提取的方法为：在刺玫果的酶解液中，加入离子液体1-丁基-3-甲基咪唑硝酸盐，使离子液体摩尔浓度为0.1～0.5mol/L，然后升高水浴温度至75℃～80℃，提取5h，过滤，滤液减压浓缩，定容至合适的容量瓶中，得到刺玫果的提取浸液；
4)刺玫果的提取浸液定容至容量瓶中，采用高效液相色谱法同时测定提取浸液中金丝桃苷、木犀草素的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中刺玫果的脱脂处理为将刺玫果自然晾干，使含水量低于7％重量，然后以料液比为质量体积比1:3的沸程为60℃～90℃的石油醚回流脱脂，低温干燥，使含水量低于4％重量，得到预处理好的刺玫果。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述石油醚回流脱脂次数为2次，脱脂时间分别为1.5h、1.0h；所述低温干燥的温度为低于60℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中酶解方法为将70％的乙醇水溶液与预处理好的刺玫果按料液比为质量体积比1:40进行混合，加入相当于刺玫果质量0.05％的复合酶，用20％的乙酸水溶液调至体系pH值为5～6，于水浴温度45℃～50℃条件下酶解3h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中高效液相色谱法同时测定提取浸液中金丝桃苷、木犀草素的含量，其流动相为：乙腈为流动相A，0.25％磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱程序为：0min--17％A；22min--20％A；27min--24％A；28min--28％A；36min--32％A；41min--35％A。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述刺玫果中的金丝桃苷提取率大于33μg/g，木犀草素提取率大于16μg/g。
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