CN103966263A - 一种重组人3型腺病毒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以人3型腺病毒(HAdv3)为载体的新型肠道病毒71型-重组人3型腺病毒疫苗候选株及其制备方法。人3型腺病毒六邻体上嵌入了两种EV71的中和表位，并在其基因组E3区***了EV71的VP1蛋白表达框。该疫苗候选株可以诱导强烈的抗EV71感染和抗HAdv3感染的免疫反应，利用该疫苗候选株可制备预防EV71感染和HAdv3感染的双价疫苗。
Description
技术领域
本发明属于重组病毒基因工程技术领域，具体涉及一种以人3型腺病毒(HAdv3)为载体的新型肠道病毒71型-重组人3型腺病毒疫苗候选株及其制备方法。
背景技术
肠道病毒71型(EV71)是引起手足口病(hand-foot-mouth disease，HFMD)的主要病原体之一，并常导致如无菌性脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎样麻痹及神经源性肺水肿等严重的中枢神经***并发症，并引起死亡。1969年首次报道全球爆发EV71感染，近年来，EV71爆发流行的报道增多，流行程度呈明显上升趋势，已经成为亚太地区包括国内威胁公众健康的重要病原体。EV71经空气飞沫等途径传播，具高致病性，相对死亡率较高，目前没有有效的治疗药物和方法，疫苗接种无疑是预防EV71病毒感染的最佳途径。
EV71属小RNA病毒科肠道病毒属，无包膜的单股正链RNA病毒，其衣壳由4种蛋白质组成：VP1、VP2、VP3和VP4。其中VP1、VP2、VP3在病毒粒子表面，而VP4在病毒粒子内部。有关EV71亚单位疫苗的研究已经显示，VP1由297个氨基酸组成，是衣壳蛋白中有着最大和最多的表面暴露的蛋白，包含了EV71病毒主要的中和性抗原表位，能刺激机体产生高滴度的保护性中和抗体，是制备EV71亚单位疫苗的最重要的蛋白。目前还没有临床应用的EV71疫苗。表位疫苗是用基于抗原表位制备的疫苗，是目前研制感染性疾病和恶性肿瘤疫苗的方向。抗原表位是抗原分子中决定抗原特异性的序列，又称抗原决定簇，包括T细胞表位和B细胞表位，分别是T细胞抗原受体和B细胞抗原受体及抗体特异结合的基本单位。相较传统的疫苗，表位疫苗去除了不需要的甚至有害的抗原和表位而使免疫应答精确针对特定的表位。近年来已经有很多独特的表位已经被鉴定出来并应用于传染病、癌症和自身免疫性疾病的疫苗研究。然而单独的表位肽免疫原性弱，不能诱导免疫应答和免疫记忆，因而近年来发展了很多方法，如新型佐剂、脂肽偶联、应用通用T细胞表位、多抗原肽、纳米呈递***及病毒载体等，促进了表位疫苗的发展。目前已经发现EV71病毒的多个中和性抗原表位，如VP1蛋白的163-177位氨基酸(PESRESLAWQTATNPC，SP55)和208-222位氨基酸(YPTFGEHKQEKDLEYC，SP70)。
腺病毒载体可以有效诱导体液和细胞免疫应答，已经广泛应用于癌症和感染性疾病的基因治疗和疫苗研究中。腺病毒分子量大，其本身是一种极好的免疫佐剂，能有效地刺激机体产生特异性的细胞免疫和体液免疫；而且腺病毒载体具有容易进行基因操作、容易生产和高产量、高安全性的特点。传统的腺病毒载体疫苗是作为转基因载体，利用宿主细胞表达外源抗原，刺激机体产生抗原特异的体液或细胞免疫应答。由于人群中普遍存在针对人5型腺病毒载体的预存免疫，以及腺病毒载体的强免疫原性，导致免疫***对载体的清除作用，抑制了转基因抗原的表达，使传统的腺病毒载体作为疫苗载体的应用受到很大的限制。近年来，采用“抗原展示”策略制备的重组腺病毒疫苗得到发展，即在不影响病毒的感染性及稳定性的前提下，在腺病毒载体衣壳中嵌入外源性抗原从而获得具有新的抗原特性的重组腺病毒粒子。目的抗原肽***衣壳后作为病毒壳体的一部分，将能多次免疫机体诱导有效的免疫应答，而不需要进行转基因表达，克服了传统的腺病毒转基因载体受机体抗载体免疫限制的缺点。
腺病毒颗粒是一个二十面体的对称结构，壳体由12个位于顶角的五邻体基座和纤维蛋白，240个非顶角颗粒的六邻体(hexon)以及结构辅助蛋白多肽构成。六邻体是三聚体结构，是腺病毒颗粒中最丰富的免疫原，在六邻体蛋白中***一个外源抗原表位，则每个腺病毒粒子就可以展示720个抗原表位，抗原表位可得以充分表达。不同型别腺病毒的六邻体蛋白的氨基酸序列有高达78-95％的同源性，其区别主要集中在7个高变区(HVRs)，这些高变区暴露于病毒壳体表面，不涉及六邻体单体间的相互作用，也不与其它的腺病毒蛋白相互作用。已有多个基于5型腺病毒的研究表明六邻体的多个高变区具有足够的柔韧性，可以嵌入不同长度的外源肽而不影响病毒的复制、稳定性和功能；而且表位嵌合入某些特定的HVR区的腺病毒载体有可能能够在体内和体外逃避预存的腺病毒免疫，提供更强的免疫原性。
因此，衣壳展示EV71中和表位，同时转基因表达EV71的主要抗原VP1蛋白，并保留人3型腺病毒主要抗原的肠道病毒71型-重组人3型腺病毒疫苗候选株有望用于同时预防EV71感染和HAdv3感染。
发明内容
本发明提供一种重组人3型腺病毒及其制备方法和应用。
本发明提供了一种重组人3型腺病毒，所述重组人3型腺病毒基因组E3区***了EV71的VP1蛋白表达框，所述人3型腺病毒六邻体中嵌入了两种EV71中和表位SP70和SP55，所述EV71中和表位SP70的氨基酸序列为YPTFGEHKQEKDLEYC，所述中和表位SP55的氨基酸序列为PESRESLAWQTATNPC。
所述EV71中和表位SP70的替换区为HAdv3六邻体的HVR1区，所述EV71中和表位SP55的替换区为HAdv3六邻体的HVR2区。
所述EV71中和表位SP70的替换氨基酸为HVR1区的NRDNAV，所述EV71中和表位SP55的替换氨基酸为HVR2区的TTEGEE。
本发明还提供了一种人3型腺病毒-EV71的双价疫苗候选株，所述双价疫苗候选株含有上述的重组人3型腺病毒。
本发明还提供了一种载体，所述载体包含上述的重组人3型腺病毒。
本发明还提供了一种制备上述重组人3型腺病毒的方法，包括如下步骤：在重组人3型腺病毒基因组E3区***了EV71的VP1蛋白表达框，人3型腺病毒六邻体上同时嵌入了两种EV71中和表位，分别替换的氨基酸为HVR1区的NRDNAV，HVR2区的TTEGEE。
本发明所提供的重组病毒，允许EV71中和表位个别氨基酸的缺失、替换或添加，但需要保持中和表位的免疫原性；允许被置换的HVR1区和HVR2区序列个别氨基酸的缺失、替换或添加，但需要保持腺病毒的稳定性，同时保证外源表位的免疫活性；本发明中嵌入的EV71表位并不限于SP70和SP55，也可以是其它的保护性T细胞表位或B细胞表位，但需要保持腺病毒的稳定性和保证外源表位的免疫原性。
本发明中，***HAdv3基因组E3区的外源基因表达框中，包含CMV启动子和SV40po1yA，EV71的主要抗原VP1蛋白基因序列为EV71-C4亚型的VP1全基因；同时，允许使用其它的真核表达框和其它EV71亚型的VP1全长或部分基因。
本发明中，在转基因表达EV71的主要抗原VP1蛋白的同时，在六邻体衣壳上同时展示EV71的两种主要中和表位，该重组病毒载体能够逃避预存的腺病毒免疫，产生强烈的抗EV71感染的保护性免疫应答，多次注射能加强免疫。同时，本发明的重组病毒保留了HAdv3的主要抗原活性，该重组病毒可以同时用于预防HAdv3的感染。
附图说明
图1是感染EV71乳鼠存活曲线图。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
本说明书实施例中所述HAdv3为HAdv3-gz01病毒株，全基因组Genbank号：DQ099432。本说明书实施例中所述EV71为EV71-08-02病毒株，全基因组序列GenBank号：FJ360545。本说明书实施例中的EV71VP1基因扩增自EV71-08-02病毒株，氨基酸序列无突变。
实施例1：生物信息学分析预测人3型腺病毒六邻体的表面暴露区
使用BLAST-P程序在Protein Data Bank(PDB)中搜索HAd3六邻体同源建模的模板结构，并使用Modeller9.9进行同源建模，构建HAd3六邻体蛋白的3D模型。图像文件实验PYMOL处理。选择暴露在衣壳表面的高变区序列进行下一步实验。
通过对3D模型进行分析，可以对人3型腺病毒六邻体上的潜在中和抗原表位进行定位，分析其中暴露在衣壳表面最可能被取代而不影响六邻体结构稳定性的序列。HVR1、HVR2、HVR4、HVR5、HVR7是潜在中和抗原表位区，其中部分氨基酸有可能被取代而不影响六邻体结构稳定性，两个高变区序列如下所示，其中下划线标记的氨基酸为本发明中为SP70和SP55所取代的序列。
HVR1：IVTTNRDNAV TTTTNT
HVR2：KEGLQIGKDIT TTEGEE KPIYADK
实施例2：构建重组病毒载体
E3区缺失穿梭载体构建以HAdv3-gz01病毒株基因组(Genbank accession no.DQ099432)为模板分别PCR扩增基因组上26，782至27，736，长973bp的E3L片段(KpnI+ClaI)和基因组上30，900至31，901，长1020bp的E3R片段(SpeI+NotI)，以pEGFP C2载体为模板PCR扩增CMV-eGFP-SV40表达框(ClaI+SpeI)，依次酶切连接至pBluescript II SK(+)载体上，获得包括E3区左右两臂序列的载体pSKE3LCMV-eGFP-SV40E3R(缺失E3区3203bp序列)。
人3型腺病毒骨架质粒构建：用引物对AdLU1(5’-GAATTCGCGATCGCTATCTATATAATATACCTTATAGATGG-3’，引入EcoRI和AsisI酶切位点)和AdLD1(5’-CTGCTGTGGATAAGCTTGAG-3’，包含HindIII酶切位点)扩增HAdv3-gz01病毒株基因组左端1391bp的片段A3L，EcoRI+HindIII双酶切连接至pBR322载体得到pBRAL载体；用引物对AdRU(5’-AACAAAGCTTACACTATGCATAGTCATAGTATC-3’，包含HindIII酶切位点)和AdRD(5’-AGTCGACGCGATCGCTATCTATATAATATACCTTATAGATG-3’，引入Sal I和AsiSI酶切位点)扩增HAdv3-gz01病毒株基因组右端2025bp的片段A3L，EcoRI+HindIII双酶切连接至pBRAL载体得到pBRALR载体。HindIII线性化pBRALR载体，与提取纯化的HAdv3-gz01病毒株全基因组在细菌BJ5183内同源重组得到人3型腺病毒骨架质粒pBRAdv3。
E3区***eGFP表达框的人3型腺病毒质粒pBRAd△E3GFP构建：EcoRV+NotI双酶切穿梭载体pSKE3LCMV-eGFP-SV40E3R，再与RsrlI酶切线性化的人3型腺病毒骨架质粒pBRAdv3在大肠杆菌BJ5183内进行同源重组，PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定得到重组质粒pBRAd△E3GFP。
VP1穿梭质粒构建：进行定点突变PCR扩增EV71-08-02株VP1蛋白基因(将VP1基因上的EcoRV酶切位点突变沉默便于亚克隆，使用的引物Vp1-ageI：5’-gctaccggtcgccaccatgggagatagggtggcagatgtaattg-3’，Vp1-pstI：5’-aaactgcagTcAGTGATGGTGATGGTGGTGaagagtagtgatcgccgtgcggct-3’，VP1U：5’-gcgagtgcttatCaatggttttatgacgggtatcc-3’，VP1R：5’-ctcctgtttgtgttctccgaatgtgggataccc-3’)，AgeI+PstI双酶切后与穿梭载体pSKE3LCMV-eGFP-SV40E3R连接，EV71VP1蛋白基因取代eGFP基因序列获得穿梭质粒pSKE3LCMV-VP1-SV40E3R。
重叠PCR(overlapping PCR)方法构建六邻体修饰的重组人3型腺病毒载体：以pBRAd△E3GFP为模板分别PCR扩增pBRAd△E3GFP载体上16764-21140长约4.34kb的L1片段和21125-24569长约3.44kb的L2片段，分别用EcoRI+BamHI和BamHI+SalI双酶切连接至载体pBR322上，获得载体pBRHSS。用重叠PCR(overlapping PCR)方法扩增修饰的六邻体基因，首先以HAdv3基因组为模板用重叠PCR方法获得SP70(5’-tatcccacattcggagaacacaaacaggagaaagatcttgaatat-3’)的DNA序列替换HAdv3六邻体基因的HVR1相应序列的突变六邻体片段，连接至T载体中并测序鉴定；再以该突变六邻体基因为模板用重叠PCR方法获得SP55(5’-ccagattccagggaatcccttgcatggcaaactgccaccaacccc-3’)替换HAdv3六邻体基因的HVR2相应序列的双突变六邻体片段，ClaI+BamHI双酶切后连接至pBRH3S载体上，获得穿梭载体pBRSP70R1SP55R2H3S。用EcoRI+SalI双酶切穿梭载体，与AvRII+PacI双酶切的骨架质粒pBRAd△E3GFP在大肠杆菌BJ5183内进行同源重组，得到重组质粒pAdSP70R1SP55R2△E3GFP。使用的引物见表1，Sp70r和Sp55r为PCR筛选鉴定用特异引物。
表1重叠PCR法扩增外源表位嵌入的HAdv3六邻体基因使用的引物
重组病毒载体构建：以六邻体修饰的pAdSP70R1SP55R2△E3GFP质粒为骨架质粒并用RsrII酶切线性化，EcoRV+NotI双酶切穿梭质粒pSKE3LCMV-VP1-SV40E3R，二者在大肠杆菌BJ5183内进行同源重组，PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定获得重组质粒pAdSP70R1SP55R2△E3VP1。
将上述重组得到的质粒AsisI酶切线性化后转染AD293细胞，拯救包装得到重组病毒载体AdSP70R1SP55R2△E3VP1，大量培养并CsCl密度梯度离心纯化重组病毒粒子。经过纯化的Ad3dE3VP1病毒粒子达到1×1012VPs/ml，测定0D260/0D280比值约1.2-1.4，内毒素检测＜10EU/m1。重组病毒AdSP70R1SP55R2△E3VP1在HEp-2细胞中连续传代10代后提取病毒基因组进行酶切鉴定、测序鉴定，表明重组病毒基因组保持稳定，没有基因缺少、重组现象。
实施例3：重组病毒载体免疫原性试验
制备抗血清，进行血清中和试验，验证重组病毒载体的免疫原性。将纯化的重组病毒AdSP70R1SP55R2△E3VP1肌肉注射免疫小鼠，得到多克隆血清，然后进行微量中和试验，以检测重组病毒产生的抗体是否具有体外中和EV71病毒和HAdv3病毒的能力。
单次免疫后21天采集的小鼠血清中和反应的实验结果见表2，单次免疫即可诱导出高滴度的抗EV71病毒和抗HAdv3病毒的中和作用抗体；免疫3次后第14天采集的小鼠血清中和反应的实验结果见表3，表3为多次免疫小鼠血清中和效价，实验结果数据表明多次免疫后抗EV71病毒和抗HAdv3病毒的免疫应答均得到加强。
表2单次免疫血清中和效价
表3多次免疫血清中和效价
实施例4：乳鼠保护实验
由于大于一周龄的小鼠感染EV71病毒后没有明显的症状，为了进一步验证重组病毒注射诱导出体内保护作用的免疫应答，有作为疫苗候选株应用的潜力，进行乳鼠保护实验。该实验的具体步骤如下：
1、小鼠按常规免疫程序分别肌肉免疫重组病毒AdSP70R1SP55R2△E3VP1和对照HAdv3病毒、对照PBS，腹腔注射佐剂乳化的灭活EV71病毒，21天后采集小鼠血清，纯化抗体。
2、腹腔注射的方式给1日龄乳鼠感染致死剂量的EV71病毒，病毒含量为1000TCID50。
3、感染后4小时腹腔注射免疫小鼠抗体，同时设立未攻毒乳鼠对照及未注射抗体乳鼠攻毒对照。每日记录小鼠的存活情况。
实验结果见图1，图1是感染EV71乳鼠存活曲线图。由图可见，重组病毒AdSP70R1SP55R2△E3VP1免疫的小鼠抗体相对PBS免疫的小鼠抗体或未注射抗体对乳鼠有显著的保护作用(P＜0.05)。该实验结果表明重组病毒诱导出抗EV71的免疫应答。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (6)
1.一种重组人3型腺病毒，其特征在于，所述重组人3型腺病毒的基因组E3区***了EV71的VP1蛋白表达框，所述重组人3型腺病毒的六邻体中嵌入了两种EV71中和表位SP70和SP55，所述EV71中和表位SP70的氨基酸序列为YPTFGEHKQEKDLEYC，所述中和表位SP55的氨基酸序列为PESRESLAWQTATNPC。
2.根据权利要求1所述重组人3型腺病毒，其特征在于，所述EV71中和表位SP70的替换区为HAdv3六邻体的HVR1区，所述EV71中和表位SP55的替换区为HAdv3六邻体的HVR2区。
3.根据权利要求2所述重组人3型腺病毒，其特征在于，所述EV71中和表位SP70的替换氨基酸序列为HVR1区的NRDNAV，所述EV71中和表位SP55的替换氨基酸序列为HVR2区的TTEGEE。
4.一种人3型腺病毒-EV71的双价疫苗候选株，其特征在于，所述双价疫苗候选株含有权利要求1-3之一所述的重组人3型腺病毒。
5.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求1-3之一所述的重组人3型腺病毒。
6.一种制备权利要求1-3之一所述的重组人3型腺病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
在重组人3型腺病毒基因组E3区***了EV71的VP1蛋白表达框，人3型腺病毒六邻体上同时嵌入了两种EV71中和表位SP70和SP55；其中，
所述EV71中和表位SP70的氨基酸序列为YPTFGEHKQEKDLEYC，所述中和表位SP55的氨基酸序列为PESRESLAWQTATNPC；
所述EV71中和表位SP70的替换氨基酸为HVR1区的NRDNAV，所述EV71中和表位SP55的替换氨基酸序列为HVR2区的TTEGEE。
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