CN105203724A - 一种检查布洛芬原料细菌内毒素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测布洛芬原料细菌内毒素的方法，所述方法包括：取布洛芬适量，加1/4～1/2倍量无内毒素的无水碳酸钠和15～45%（v/v）的乙醇溶液溶解，经细菌内毒素检查用水稀释，采用凝胶法检查细菌内毒素。采用本方法可以检查细菌内毒素限值为0.035EU/mg布洛芬原料的细菌内毒素。本发明的细菌内毒素检测方法具有很高的准确度和灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及细菌内毒素的检查方法，具体的说是涉及一种检查布洛芬原料细菌内毒素的方法。
背景技术
布洛芬具有抗炎、镇痛、解热作用。适用于治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊椎炎和神经炎等。细菌内毒素是注射剂药品中的主要污染物质，大量进入血液就会引起发热反应—“热原反应”，危害人体健康，甚至危及生命，故注射剂需要检查细菌内毒素。布洛芬作注射剂药物的原料时，应进行细菌内毒素的检查控制，为了临床安全用药，内毒素限值L控制在0.035EU/mg。按张德波在“布洛芬细菌内毒素检查法研究”文献（中国现代应用药学2012，29（3）：261～264）中报道的检查布洛芬细菌内毒素的方法：布洛芬样品中加入1.5倍量无内毒素的无水碳酸钠，用细菌内毒素检查用水溶解后检查内毒素，该方法的内毒素限值L为0.20EU/mg。当布洛芬内毒素限值L为0.035EU/mg，采用张德波的文献方法检测，供试品阳性对照呈阴性，说明供试品溶液干扰细菌内毒素的检查。布洛芬在水中几乎不溶，在乙醇中易溶，但是乙醇会干扰细菌内毒素的检查。因此需要采用一种既能溶解样品，又能使供试品溶液不影响内毒素检查的方法进行用于注射剂产品的布洛芬原料的细菌内毒素检查。
发明内容
本发明目的在于提供一种检查布洛芬原料的细菌内毒素的方法，以解决现有技术存在的问题。
本发明的细菌内毒素检查方法，包括以下步骤：称取布洛芬原料和1/4～1/2倍量无内毒素的无水碳酸钠，用15～45%（v/v）的乙醇溶液制成不低于14.28mg/ml的布洛芬溶液，再用细菌内毒素检查用水稀释制备各灵敏度鲎试剂对应的布洛芬溶液，然后参照《中国药典》2010年版附录细菌内毒素检查法中的凝胶法检查。
本发明人经反复研究发现，采用15～45%（v/v）的乙醇溶液和1/4～1/2倍量无内毒素的无水碳酸钠既可解决布洛芬原料的溶解性问题，又能避免样品溶液对布洛芬内毒素检查的干扰，可以用于检查内毒素限值L为0.035EU/mg的布洛芬原料。
本发明提供的布洛芬细菌内毒素检查法，操作简便，灵敏准确，完全能满足布洛芬作为注射剂原料检查细菌内毒素的要求。
具体实施方式
实施例1
1仪器与试药
1.1仪器
电热恒温水浴锅(上海仪表集团供销公司)、XW-80A旋涡混合器（上海青浦沪西仪器厂）、洁净工作台（HENGZI）、电热鼓风干燥箱（重庆永恒实验仪器厂）、电子天平（sartorius），试验所用玻璃器皿均在250℃烘烤2h，以去除可能存在的外源性细菌内毒素。
1.2试药
鲎试剂（TAL，湛江安度斯生物有限公司，0.1ml/支，灵敏度0.25EU/ml，批号：1206201；湛江博康海洋生物有限公司，0.1ml/支，灵敏度0.25EU/ml，批号：1206130；湛江安度斯生物有限公司，0.1ml/支，灵敏度0.06EU/ml，批号：1207082；湛江博康海洋生物有限公司，0.1ml/支，灵敏度0.06EU/ml，批号：1207131）；细菌内毒素工作标准品(CSE，中国药品生物制品检定所，规格:120EU/支，批号：150601-201072)；乙醇；无水碳酸钠；细菌内毒素检查用水(BET水，湛江安度斯生物有限公司，50ml/瓶，批号：1010140)；布洛芬原料(市售)。
2布洛芬原料的细菌内毒素限值的确定
布洛芬内毒素限值L计算，L=0.375EU/mg（K=5EU/kg·h，M=13.33mg/kg·h)，根据制成的布洛芬注射液的内毒素的限度，并考虑到还有加入其他辅料，为了保证布洛芬注射液的临床用药的安全性，将原料药的细菌内毒素限值定为L=0.035EU/mg。
3最小有效稀释浓度（MVC）的计算
最小有效稀释浓度计算公式为:MVC=λ/L，其中L为供试品的细菌内毒素限值，布洛芬原料的L为0.035EU/mg。λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度，当λ为0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml或0.03EU/ml时，相对应的最小有效稀释浓度如表1：
表1最小有效稀释浓度
| 灵敏度EU/ml | 0.25 | 0.125 | 0.06 | 0.03 |
| MVC（mg/ml） | 7.14 | 3.57 | 1.71 | 0.86 |
4布洛芬原料溶解方法选择
布洛芬内毒素限值为L=0.035EU/mg，按灵敏度为0.03EU/ml的鲎试剂计算，称取布洛芬约57.12mg，加入4ml乙醇溶液和一定量无水碳酸钠溶解样品，制备成浓度不低于14.28mg/ml的布洛芬溶液，只有在不低于14.28mg/ml的浓度下，才能逐步用细菌内毒素检查用水稀释制备浓度不低于各灵敏度对应的最小有效稀释浓度的供试品溶液，并测定0.86mg/ml的供试品溶液的pH，结果如表2。
表2布洛芬溶解方法及pH
由于方案1、5不能将布洛芬完全溶解，因此排除这两种溶解方法，方案7的pH不在6～8范围内，干扰内毒素检查，因此乙醇浓度筛选为15～45%（v/v），无水碳酸钠用量为1/4～1/2倍布洛芬称样量。
对比实施例
布洛芬细菌内毒素限值L为0.035EU/mg时，采用张德波在“布洛芬细菌内毒素检查法研究”文献（中国现代应用药学2012，29（3）：261～264）中报道的检查布洛芬细菌内毒素的方法进行实验，结果如表3。
表3布洛芬细菌内毒素检查结果
| 编号 | NPC（供试品阴性对照） | PPC（供试品阳性对照） | PC（阳性对照） | NC（阴性对照） |
| 批次1 | -- | -- | ++ | -- |
注：“＋”表示反应为阳性，“–”表示反应为阴性。
结论：供试品阳性对照呈阴性，说明采用此方法供试品溶液干扰细菌内毒素检查。
实施例2
1乙醇溶液对细菌内毒素与鲎试剂凝集反应的干扰试验
表4乙醇溶液对细菌内毒素与鲎试剂凝集反应的干扰试验
注：“＋”表示反应为阳性，“–”表示反应为阴性。
结论：45%和15%的乙醇溶液对细菌内毒素与鲎试剂凝集反应无干扰。
2鲎试剂灵敏度复核
按2010年版中国药典二部附录ⅪE的要求对鲎试剂进行灵敏度复核，用细菌内毒检查用水溶解细菌内毒素工作标准品，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30s，各批取复溶后的0.1ml/支的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml上述不同浓度的内毒素标准溶液，每个内毒素浓度平行做4管。另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口垂直放入（37±1）℃的恒温水浴锅保温(60±2)分钟。结果见表5。
表5鲎试剂灵敏度复核试验
注：“＋”表示反应为阳性，“–”表示反应为阴性。
结论：经复核，所用鲎试剂的灵敏度测定值均在0.5λ～2λ之间(包括0.5λ和2λ)，符合规定。
3干扰试验预试验
布洛芬原料做干扰预试验，分别用溶媒1（45%的乙醇溶液和1/4倍量无内毒素的无水碳酸钠的混合溶液）和溶媒2（15%的乙醇溶液和1/2倍量无内毒素的无水碳酸钠的混合溶液）溶解样品，经细菌内毒素检查用水稀释，并适当超声，逐级稀释制得7.14mg/ml、3.57mg/ml、1.71mg/ml、0.86mg/ml系列稀释液作为供试品阴性对照。另配制与NPC相同浓度梯度的供试品溶液，每个浓度均制备含2λ细菌内毒素的系列溶液作为供试品阳性对照，每个浓度平行做两管，同时作阳性对照、阴性对照。分别取两个厂家0.25EU/ml的鲎试剂进行试验，见表6。
表6布洛芬干扰预试验结果
注：“＋”表示反应为阳性，“–”表示反应为阴性。
由表6结果可知，布洛芬溶液对鲎试剂与细菌内毒素的反应有抑制作用，但当质量浓度稀释至1.71mg/ml及以下时，其抑制作用可以被排除，该浓度对应的鲎试剂灵敏度为0.06EU/ml。
4正式干扰试验
根据预试验结果，选择两个厂家为0.06EU/ml的鲎试剂，布洛芬稀释至1.71mg/ml的浓度作为供试品溶液进行干扰试验。分别用溶媒1（45%的乙醇溶液和1/4倍量无内毒素的无水碳酸钠的混合溶液）和溶媒2（15%的乙醇溶液和1/2倍量无内毒素的无水碳酸钠的混合溶液）溶解样品，经细菌内毒素检查用水稀释，制备含2λ、λ、0.5λ、0.25λ的细菌内毒素系列溶液，每一浓度平行做4管。并用BET水制备含2λ、λ、0.5λ、0.25λ的细菌内毒素系列溶液，每一浓度平行做4管。同时作阴性对照、供试品阴性对照，各平行做两管。结果见表7。
表7布洛芬干扰试验结果
注：“＋”表示反应为阳性，“–”表示反应为阴性。
根据表7结果表明，阴性对照管、供试品阴性对照管，结果均为阴性。两组鲎试剂的Es为0.06EU/ml，在0.5λ～2λ之间(包括0.5λ和2λ)，Et在0.5Es～2Es之间(包括0.5Es和Es)，试验有效。说明布洛芬在1.71mg/ml质量浓度时，对鲎试剂与细菌内毒素的凝集反应无干扰。
5布洛芬细菌内毒素检查
取3批布洛芬原料各适量，选择0.06EU/ml的鲎试剂，分别用溶媒1（45%的乙醇和1/4倍量无内毒素的无水碳酸钠的混合溶液）和溶媒2（15%的乙醇和1/2倍量无内毒素的无水碳酸钠的混合溶液）溶解样品，制备浓度不低于14.28mg/ml的布洛芬溶液，再用细菌内毒素检查用水稀释样品。参照2010年版《中国药典》二部附录ⅪE的要求进行检查。结果见表8。
表8布洛芬原料内毒素检查结果
注：“＋”表示反应为阳性，“–”表示反应为阴性。
由表8的检查结果可知，NPC和NC均为阴性；PPC和PC均为阳性，试验有效。结果表明3批样品的细菌内毒素检查均符合规定。
Claims (1)
1.一种检测布洛芬原料内毒素的方法，包括以下步骤：称取布洛芬原料和1/4～1/2倍量无内毒素的无水碳酸钠，用15～45%（v/v）的乙醇溶液制成不低于14.28mg/ml的布洛芬溶液，再用细菌内毒素检查用水稀释制备各灵敏度鲎试剂对应的布洛芬溶液，然后参照《中国药典》2010年版附录细菌内毒素检查法中的凝胶法检查。
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Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN111856017A (zh) * | 2020-07-24 | 2020-10-30 | 褚培忠 | 一种检测醇类溶液中内毒素的方法 |
| CN112415156A (zh) * | 2019-08-22 | 2021-02-26 | 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 | 一种阿尼芬净原料药细菌内毒素的检测方法 |
| CN113219177A (zh) * | 2021-06-07 | 2021-08-06 | 辰欣药业股份有限公司 | 一种凝胶法检测蛋黄卵磷脂中细菌内毒素的方法 |
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2014
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
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