CN101718709A - 一种检测木糖醇注射液细菌内毒素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测木糖醇注射液细菌内毒素的方法，包括利用鲎试剂通过动态浊度法检测木糖醇注射液，其中，将待测木糖醇注射液稀释2-4倍，其pH调至6.2-7.2，检测温度控制在37.2℃±0.2℃。本发明的方法可避免动物热原检查法的不足，检测细菌内毒素既省时又经济，并能更快更清楚地知道木糖醇注射液内细菌内毒素的实际含量，对成品的放行有积极意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测注射液的方法，特别是涉及一种检测木糖醇注射液细菌内毒素的方法。
背景技术
木糖醇注射液生产时，按《中国药典》2005年版的规定，需要采用家兔升温法进行热原检查。该方法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，按时观察记录家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001μg/ml，试验结果接近人体真实情况，是公认的比较可靠的热原检查方法。
随着制药工业的发展和科学技术的进步，人们发现革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖(Lipoply Saccharide)和微量蛋白(Protein)的复合物-细菌内毒素，它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质，当机体内毒素浓度阈值＞0.005ng/ml时，即可刺激体温调节中枢导致机体发热。什么是热原？目前国内外仍未有统一的认识，但从国内外文献报道中，一个共同的意见，都普遍认为：它是指细菌内毒素的脂多糖。细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。鲎试剂是从栖生于海洋的节肢动物“鲎”的兰色血液中提取变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥而成的生物试剂，专用于细菌内毒素检测。目前国际上销售的鲎试剂有两种，一种称美洲鲎试剂(Limulus Amebocyte Lysate)，缩写为LAL，由美国生产；另一种称东方鲎鲎试剂(Tachypleus Amebocyte Lysate)，缩写为TAL。TAL与LAL有相同的功效。细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。鲎试剂法检查内毒素的灵敏度为0.0001μg/ml，比家兔法灵敏10倍，操作简单易行，试验费用低，结果迅速可靠，特别适用于注射剂生产过程中的热原控制和家兔法不能检测的某些细胞毒性药物制剂，也是受到各国药典承认的一种通用方法。
家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001μg/ml，试验结果接近人体真实情况，但操作繁琐费时，不适宜用于注射剂生产过程中的质量监控，且不适用于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒性药物制剂。
目前已经有学者用鲎方法检测木糖醇注射液的细菌内毒素，其结果是验证了鲎试剂法的可行性，但他们采用的是最常见的凝胶法来检测的。凝胶法也是药典规定的方法，实验设备要求低，但是该方法是一个限度测定法，只能判断是否合格，而对于合格的药液里面的细菌内毒素是在上限水平还是极低水平，不能给出判断；而且由于灵敏度复核和干扰试验都需要新做，因此要得出产品的检测结果需要较长时间，在此过程中较易被污染，对检验结果将产生不良影响。
因此，需要一种新的检测木糖醇注射液细菌内毒素的方法。该方法可避免以上动物热原检查法的不足，检测细菌内毒素既省时又省经济，能够满足大容量注射剂连续生产的需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测木糖醇注射液细菌内毒素的方法，以解决现有技术存在的上述问题。
本发明提供一种检测木糖醇注射液细菌内毒素的方法，包括利用鲎试剂通过动态浊度法检测木糖醇注射液，其中将待测木糖醇注射液稀释2-4倍，其pH调至6.2-7.2，检测温度控制在37.2℃±0.2℃。
优选将待测木糖醇注射液稀释2或4倍，即稀释倍数λ＝0.25EU/ml或λ＝0.125EU/ml。
本发明检测木糖醇注射液细菌内毒素的方法，具有以下有益效果：利用鲎试剂通过动态浊度法检测木糖醇注射液，可避免动物热原检查法的不足，检测细菌内毒素既省时又省经济；并且本发明优选的动态浊度法比凝胶法能更快更清楚地知道木糖醇注射液内细菌内毒素的实际含量，对成品的放行有积极意义。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
1材料与仪器
细菌内毒索国家标准品(批号200707，规格：140EU/支。中国药品生物制品检定所)；动态浊度鲎试剂(批号：0807302，湛江安度斯生物有限公司生产，规格：λ＝0.5EU/支；批号：08120512，福州新北生化工业有限公司生产；规格：λ＝0.5EU/支)；细菌内毒素检查用水(批号：0807100，规格：5mL/支，湛江安度斯生物有限公司)；木糖醇注射液(规格：250ml：12.5g，批号：09030161、09030162、09030163，09030191，09030192，09030193；规格：500ml：25g，批号：09030151，09030152，09030153，09030194，09030195，09030196.安徽丰原药业生产)；BET-32B细菌内毒素测定仪(天津大学无线电厂)。
2方法与结果
2.1细菌内毒素限值的确定按公式L＝K/M，K为规定的给药途径。即人用公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量。注射剂为5.0EU/(kg.h)；木糖醇注射液最大用量为0.3g/h。人均体重按60kg计，L＝K/M＝1.0EU/mg，为了更好的控制产品质量，本发明将把L值定在0.5EU/mg。
2.2标准曲线的制作及可靠性用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素国家标准品进行溶解稀释。并制成其最终内毒素浓度分别为1.0、0.25、0.0625EU/mL系列，各取0.2mL分别加到预先加有0.1mL动态浊度鲎试剂的反应管内，混合均匀后，并立即***BET-32B细菌内毒素测定仪进行自动检测。且每一标准浓度做3支平行管，并同时做2支阴性对照管(NC)。结果(见表1)。
表1标准曲线的可靠性
| 外加内毒素(EU/mL) | 平均反应时间(s) | 变异系数(CV％) | 实测内毒素(EU/mL) |
| NC | ＞3600 | ||
| 1.0 | 1018 | 2.29 | 0.9177 |
| 0.25 | 1434 | 0.94 | 0.2969 |
| 0.0625 | 2360 | 0.042 | 0.0574 |
标准曲线结果为lgT＝2.9435+(-0.2728lgC)，相关系数：r＝-0.9972，标准曲线最低内毒素浓度点＝0.0625Eu/mL，阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间。因此标准曲线成立。
2.3干扰试验
2.3.1样品稀释倍数计算
按公式MVD＝L·C/λ1计算：
L为木糖醇注射液内毒素限值；C是木糖醇注射液的浓度，为0.05g/ml；λ1为标准曲线的最低内毒素浓度0.0625EU/ml计算得木糖醇注射液最大有效稀释倍数，MVD为8倍。
2.3.2样品溶液配制及干扰预试验
将批号为09030161木糖醇注射液用内毒素检查用水依次稀释为2、4、8倍的溶液，并分别加入磷酸盐标准缓冲液约10滴调节pH至6.8左右，记为A液；同时另取3管，进行同样倍数稀释，但在稀释液中添加细菌内毒素标准溶液，使其最终浓度为中点浓度M(0.25EU/ml)，作为样品添加内毒素阳性对照管，记为B液；分别取上述各液0.2ml加入预先加有0.10ml鲎试剂的反应管内，混匀，立即***BET-32B型细菌内毒素测定仪内进行检测，测定仪的温度设置在37.2℃，其中每一浓度重复3管，计算平均回收率。回收率(％)＝(B液内毒素值一A液内毒素值)×M-1×100％。其中内毒素回归方程lgT＝2.9435+(-0.2728lgC)，r＝-0.9972，干扰预试验的结果见表2。
表2木糖醇注射液的干扰预实验
由表2可以看出：不同稀释倍数下的木糖醇注射液添加内毒素的平均回收率均在50％～200％范围内，表明样品稀释溶液在本试验条件下对鲎试剂反应均无干扰影响。因此正式干扰试验时用4倍稀释溶液进行。
2.3.3正式干扰试验
将批号为09030161、09030162、09030163的木糖醇注射液分别用内毒素检查用水稀释为4倍的溶液，并分别加入磷酸盐标准缓冲液约10滴调节pH至6.8左右，记为A液；同时另取3管，同样进行2倍稀释，但在稀释液中添加细菌内毒素标准溶液，使其最终浓度为中点浓度M(0.25EU/ml)，作为样品添加内毒素阳性对照管，记为B液；分别取上述各液0.2ml加入预先加有0.10ml鲎试剂的反应管内，混匀，立即***BET-32B型细菌内毒素测定仪内进行检测，，测定仪的温度设置在37.2℃，其中每一浓度重复3管，计算平均回收率。回收率(％)＝(B液内毒素值一A液内毒素值)×M-1×100％。其中内毒素回归方程lgT＝2.7860+(-0.3588lgC)，r＝-0.9988，干扰试验的结果见表3。
表3木糖醇注射液的干扰预实验
| 批号 | 稀释倍数 | A液浓度(EU/ml) | B液浓度(EU/ml) | 回收率(％) |
| 09030161 | 4 | ＜0.0625 | 0.2632 | 105.3 |
| 09030162 | 4 | ＜0.0625 | 0.2543 | 101.7 |
| 09030163 | 4 | ＜0.0625 | 0.2938 | 117.5 |
2.4样品用鲎试剂法检查的结果和无菌检查结果的对比
取十二批木糖醇注射液的样品，分别选用湛江安度斯和福州新北两家企业生产的鲎试剂按照本发明方法进行了检查，检查的结果均为合格。
结论：本发明用不同的包装材料包装的产品用细菌内毒素法检查都与家兔热原法检测的结果相同，说明了该方法可以替代原有的热原检查法。并且本方法是仪器检测，操作简便，减少了人为操作的误差，检测的结果灵敏而准确，对实际的企业生产中的过程控制，有积极意义。
Claims (3)
1.一种检测木糖醇注射液细菌内毒素的方法，包括利用鲎试剂通过动态浊度法检测木糖醇注射液，其特征在于，将待测木糖醇注射液稀释2-4倍，其pH调至6.2-7.2，检测温度控制在37.2℃±0.2℃。
2.根据权利要求1所述的检测木糖醇注射液细菌内毒素的方法，其特征在于，将待测木糖醇注射液稀释2或4倍。
3.根据权利要求1所述的检测木糖醇注射液细菌内毒素的方法，其特征在于，将待测木糖醇注射液的pH调至6.8。
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