CN107723253B - 一种双质粒共转化外源基因高表达基因工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基因工程菌及其制备方法，以双营养缺陷型菌株作为表达宿主，表达宿主通过一次电转化同时转入两种载体，其中一种载体含有外源目的基因、以及表达宿主的一种营养缺陷的补偿基因，另一种载体含有UPR关键基因HAC1p、以及表达宿主的另一种营养缺陷的补偿基因。本发明提供的工程菌含有不同基因剂量的功能基因和外源目的基因，能够通过筛选获得分泌表达外源目的基因高产工程菌株。

Description

一种双质粒共转化外源基因高表达基因工程菌

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种提高外源基因在酵母***中高表达的基因工程菌和方法。

背景技术

近几年来，随着人们对汉逊酵母(Hansenula polymorpha)生物学特性的深入研究，其作为外源目的基因表达宿主的优势逐渐显现。汉逊酵母也是一种甲醇营养型酵母，与毕赤酵母类似。甲醇代谢过程中的各种关键酶，包括MOX、DHAS和CAT等的表达都是在转录水平进行调解的，它们受甲醇、甘油和山梨醇的诱导，受葡萄糖和乙醇的阻遏，但当葡萄糖浓度低于0.1％时，阻遏作用即被解除。在甲醇完全诱导条件下，过氧化物酶体可占细胞总体积的80％，MOX和DHAS可占细胞总蛋白的15％，它们的启动子具有极强的启动下游基因表达的功能，目前已被用作外源目的基因在酵母中表达的常用启动子。诱导型启动子以其强启动功能和严紧的调控机制被广泛的应用于外源目的基因的表达，已有很多外源蛋白在这些启动子的调控下在汉逊酵母细胞中得到高效的表达。

总结以往有关蛋白质在酵母中高水平表达的研究，我们不难发现其中还存在各种不足之处。酵母是一种具有重要应用价值的低等真核微生物工程菌，被广泛应用于基因工程蛋白质药物的表达，因此有关提高酵母表达外源目的基因蛋白水平的工艺方法研究一直备受关注。传统的高效表达的思路主要是提高目的基因的拷贝数量，采用强启动子元件启动目的基因转录，乃至通过分泌信号肽优化筛选等方法，至今研究人员对于这些提高表达策略已有了深入的研究，也取得许多***的研究成果。但是也有不少研究发现一部分外源蛋白质的表达水平并非总是与基因拷贝数呈正相关关系，相反的当蛋白质表达水平达到一定程度后随即开始下降，这种现象提示我们还有其他因素影响着外源蛋白的表达水平。之后，又有研究发现当蛋白高水平表达时，易产生蛋白质在内质网中错误折叠和积累甚至产生沉淀，而错误折叠的蛋白则被禁止转运出内质网，或转运至蛋白酶体被降解清除。显而易见，大多数研究只是局限于某一种因素对蛋白质表达效率的影响水平，而忽视了蛋白质表达是多细胞定位的功能***之间协调互动的有序整体，这些***在蛋白质合成过程中相互影响、相互协调，才能使蛋白质多肽顺利而高效的合成，进而折叠成具有正确空间结构的蛋白质，但是其中任何一种因素的影响力都是有一定限度的，过分强调某一种因素，如基因拷贝数量，启动子效率等，对蛋白质表达影响的评价都是有失偏颇的。而且，过分的提高目的蛋白基因的转录水平，无形中会增加蛋白质转运的负荷。

已经开发了许多诱导型或组成型启动子,且已经用于生产外源蛋白。但是,当使用有效启动子使编码外源蛋白的基因在细胞中高水平表达时,或当生产不容易折叠的蛋白时,部分表达产物在内质网(ER)中会发生聚集,产生蛋白在细胞中积累的情况。此外,分泌型蛋白和膜蛋白会翻译成蛋白,此后立即移入内质网,进行特定修饰,然后转移至高尔基体。在该情况下,未折叠的蛋白有时可能由于某种原因在内质网中积累。这称作“内质网应激(UPR)”。这样的内质网应激的原因的实例包括,在内质网中发生的修饰的干扰,和从内质网运输的恶化。作为调节UPR的基因,在酵母的情况下,Irelp-Haclp是已知为这样的基因的唯一基因,Irelp-Haclp基因通过特定机制与UPR相关。首先,Irelp通常结合抗体重健结合蛋白(BiP)。但是,当胞内积累未折叠蛋白(UFP)时,BiP会结合这样的UFP。与BiP解离的Irelp通过自磷酸化或二聚化而激活,且它表现出内切核酸酶活性。尽管HAC1基因通常以未激活状态存在,具有内切核酸酶活性的Irelp使从HAC1基因转录的mRNA发生剪接,并生成有活性的HAClp(Ce11,90:1031-1039,1997；theEMBO Journal,18:3119-3132,1999)。这种有活性的HAClp迁移至细胞核,起转录因子的作用,并促进编码与称作UPR的一系列反应有关的多种蛋白的基因的表达,所述反应例如有关的糖健添加、蛋白折叠、蛋白降解、蛋白分选、脂类代谢等，从而解除“内质网应激”，提高相应外源蛋白特别是分泌表达外源蛋白的表达量和活性。汉逊酵母中也有相应的UPR关键基因HAC1及类似机制。

同巴斯德毕赤酵母表达***只有同源整合相比，汉逊酵母有明显优势的一点是：以汉逊酵母作为外源目的基因的表达宿主时，外源DNA整合到其基因组中主要可分为随机地非同源整合和同源整合两种重组机制。其中同源重组需要导入的DNA中必须含有汉逊酵母的同源序列。同源序列与酵母基因组中某段DNA序列完全或部分一致，从而导致外源DNA在此位置可通过同源交换整合到酵母基因组中，线性化质粒发生同源整合的机率仅为1％～22％。多形汉逊酵母可通过非同源重组(机率约为50％～80％)整合多个拷贝的外源目的基因,并且最高拷贝数可达100以上。由此我们推断作为外源目的基因的表达宿主，汉逊酵母具有明显优点：多个外源目的基因能够通过一步法转化同时被整合到酵母基因组中，并按照一定剂量关系同时或分别表达。

通过构建共表达载体，将功能基因和外源目的基因同时连接到一个表达载体上，一次本专利转化筛选可以实现两种基因同时在转化子中表达的目的；但这种共表达方法缺点是功能基因和外源目的基因只能以相同基因剂量转入受体细胞中，而实际上我们构建工程菌的终极目标是尽可能高表达外源目的基因，相同基因剂量的功能基因和外源目的基因反而不利于实现这一目标。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种新技术路线，在一次电转化中向双营养缺陷型宿主中同时加入两种载体，只有两种载体同时整合到宿主的转化子才能在选择培养基中生长，筛选克服了“内质网应激”的分泌表达外源目的基因高产工程菌株，自然选择功能基因和外源目的基因之间基因剂量关系。

本发明首先提供了一种基因工程菌，以双营养缺陷型菌株作为表达宿主(或称受体株)，表达宿主的转化子中同时整合有两种载体(可以分别命名为表达载体和功能载体)，其中一种载体(表达载体)含有外源目的基因、以及表达宿主的一种营养缺陷的补偿基因，另一种载体(功能载体)含有UPR关键基因HAC1p(文中也称功能基因)、以及表达宿主的另一种营养缺陷的补偿基因。

其中，所述基因工程菌的表达***可以选取具有UPR关键基因HAC1及类似机制的表达宿主，优选为酵母表达***，更优选采用(多形)汉逊酵母为表达宿主。

进一步，所述基因工程菌以腺嘌呤、亮氨酸双营养缺陷型汉逊酵母(ade-、leu-)作为表达宿主，表达宿主的转化子中同时整合有两种载体，其中一种载体(表达载体)含有外源目的基因、以及补偿表达宿主亮氨酸营养缺陷(leu-)的啤酒酵母亮氨酸基因，另一种载体(功能载体)含有UPR关键基因HAC1p、以及补偿表达宿主腺嘌呤营养缺陷(ade-)的啤酒酵母腺嘌呤基因。本发明选择和提供的两种营养缺陷型容易在汉逊酵母表达***中诱变、培养、筛选和检出，并且具有良好的遗传稳定性，同时能够方便地通过补偿基因获得补偿。

其中，所述含有外源目的基因的载体(表达载体)以强启动子甲醇氧化酶启动子(MOX)启动外源目的基因表达，所述含有UPR关键基因HAC1p的载体(功能载体)以组成型启动子甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(pGAP)启动UPR关键基因HAC1p表达。启动子的选择能够保证外源目的基因和功能基因能够在选定的表达***内有效表达。

其中，所述UPR关键基因HAC1p来源于汉逊酵母ATCC34438，所述补偿基因来源于啤酒酵母S288c。

其中，所述基因工程菌以外源目的基因高表达为筛选指标筛选而得。两种表达载体以不同的基因剂量转入受体细胞中，获得表达程度不同的多种菌株，当以外源目的基因高表达为唯一筛选指标时，能够筛选出表达量最高的菌株。

其中，构建所述基因工程菌的表达宿主和两种载体中均含有相同的菌株自主复制序列片段，优选为汉逊酵母自主复制序列(HARS)片段。自主复制序列片段的存在有利于提高表达***中基因整合的几率，尤其在汉逊酵母***中提高整合的外源基因种类数量以及拷贝数。

其中，所述外源目的基因来源于含MFa引导肽的Elafin全序列SEQ ID NO:18、或含MFa引导肽的Hirudin全序列SEQ ID NO:19。这两种外源目的基因的全序列经过序列设计，能够良好整合进入表达载体并在启动子的作用下获得高效表达。

其中，所述基因工程菌为Efn17-09所示菌株或HRN9-16所示菌株。本案经过有目的地表达载体的构建、转化和筛选，获得的这两种菌株能够持续高效地表达Elafin和Hirudin两种目的基因，表达量分别提高了2倍和0.5倍，是发酵生产的重大进步。

本发明还提供了用于构建上述基因工程菌的载体，为以下载体的至少一种：

1)表达载体：含有外源目的基因、以及表达宿主的一种营养缺陷的补偿基因；

2)功能载体：含有UPR关键基因HAC1p、以及表达宿主的另一种营养缺陷的补偿基因。

其中，所述表达载体以强启动子甲醇氧化酶启动子(MOX)启动外源目的基因表达、以啤酒酵母亮氨酸基因补偿表达宿主亮氨酸营养缺陷(leu-)；所述功能载体以组成型启动子甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(pGAP)启动UPR关键基因HAC1p表达，以啤酒酵母腺嘌呤基因补偿表达宿主腺嘌呤营养缺陷(ade-)。

其中，所述表达载体和功能载体中均含有相同的菌株自主复制序列片段，优选为汉逊酵母自主复制序列(HARS)片段。

其中，所述表达载体为pMPT-leu2-Elafin或pMPT-leu2-Hirudin所示的载体，所述功能载体为pGPT-ade2-HAC1p所示的载体。

本发明还提供了一种外源目的基因高表达的方法，即采用上述基因工程菌进行筛选和培养表达。

上述基因工程菌可以通过包括下述步骤的方法获得：分别构建表达载体和功能载体，将表达载体和功能载体同时转入双营养缺陷型受体菌，筛选得到外源目的基因高表达的基因工程菌。

其中，所述受体菌为腺嘌呤、亮氨酸双营养缺陷型汉逊酵母(ade-、leu-)；所述表达载体以强启动子甲醇氧化酶启动子(MOX)启动外源目的基因表达、以啤酒酵母亮氨酸基因补偿表达宿主亮氨酸营养缺陷(leu-)；所述功能载体以组成型启动子甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(pGAP)启动UPR关键基因HAC1p表达，以啤酒酵母腺嘌呤基因补偿表达宿主腺嘌呤营养缺陷(ade-)；所述表达载体和功能载体中均含有受体菌菌株的自主复制序列片段。

上述方法中，所述表达载体的构建包括下述步骤：

S1：设计引物以啤酒酵母基因组为模板扩增出亮氨酸(LEU2sc)基因；

S2：以质粒载体pMPT基因组为模板，克隆含甲醇氧化酶启动子、终止子、和汉逊酵母自主复制序列(HARS)的片段α；

S3：以pBlueScript SK(+)为模板克隆pBlu做为穿梭载体，与步骤S2所述片段α连接得到重组载体α；

S4：分别将所述亮氨酸(LEU2sc)基因和外源目的基因***重组载体α构建表达载体；

其中，所述步骤S1在步骤S4前完成即可，即步骤S1与步骤S2和S3不分先后。

上述方法中，所述功能载体的构建包括下述步骤：

T1：设计引物以啤酒酵母基因组为模板扩增出腺嘌呤(ADE2sc)基因；

T2：以汉逊酵母ATCC34438基因组为模板扩增HAC1基因并以突变引物突变HAC1基因获得有编码活性的HAC1p基因；

T3：以汉逊酵母ATCC34438基因组为模板，克隆含甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(pGAP)组成型启动子和终止子的片段β；

T4：以pBlueScript SK(+)为模板克隆pBlu做为穿梭载体，与步骤T3所述片段β连接得到重组载体β；

T5：分别将所述腺嘌呤(ADE2sc)基因和HAC1p基因***重组载体β构建功能载体；

其中，所述步骤T1和T2在步骤T5前完成即可，即步骤T1、T2与步骤T3和T4不分先后。

为了简化操作和提高效率，在获得预先表达载体/功能载体后，也可以通过几步置换的方法经由表达载体/功能载体构建出功能载体/表达载体。

所述表达载体的构建包括下述步骤：

S1：设计引物以啤酒酵母基因组为模板扩增出亮氨酸(LEU2sc)基因；

S2：以质粒载体pMPT基因组为模板，克隆含甲醇氧化酶启动子、终止子、和汉逊酵母自主复制序列(HARS)的片段α；

S3：将亮氨酸(LEU2sc)基因、片段α、外源目的基因经三步依次与已获得的功能载体进行基因置换，获得表达载体；

其中，所述步骤S1和S2不分先后。

所述功能载体的构建包括下述步骤：

T1：设计引物以啤酒酵母基因组为模板扩增出腺嘌呤(ADE2sc)基因；

T2：以汉逊酵母ATCC34438基因组为模板扩增HAC1基因并以突变引物突变HAC1基因获得有编码活性的HAC1p基因；

T3：以汉逊酵母ATCC34438基因组为模板，克隆含甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(pGAP)组成型启动子和终止子的片段β；

T4：将腺嘌呤(ADE2sc)基因、片段β、HAC1p基因经三步依次与已获得的表达载体进行基因置换，获得表达载体；

其中，所述步骤T1、T2、T3不分先后。

本发明进一步提供了腺嘌呤、亮氨酸双营养缺陷型汉逊酵母(ade-、leu-)受体菌的构建方法，包括下述步骤：以汉逊酵母基因组为模板，设计引物分别扩增腺嘌呤基因和亮氨酸基因，并在腺嘌呤基因结构基因起始位置引入***TGGA四个碱基突变产物、在亮氨酸基因结构基因起始位置引入***TGCG四个碱基突变产物，将扩增出的含有突变产物的腺嘌呤基因和亮氨酸基因整合到汉逊酵母基因组中，获得目标产物，即双营养缺陷型汉逊酵母受体菌。

其中，所述腺嘌呤基因的扩增采用引物ADE-1和引物ADE-2；所述亮氨酸基因的扩增采用引物LEU-1、引物LEU-T1、引物LEU-T2、引物LEU-2。

本发明的思路在于，将两种载体以相同或不同的基因剂量转化入受体株中，其中功能载体使得UPR关键基因HAC1p持续表达，促使外源目的基因克服“内质网应激”获得高表达；由于不同的外源目的基因在高表达时可能需要匹配不同基因剂量的UPR关键基因HAC1p，因此两种载体的可变基因剂量同时突破了共表达载体(将HAC1p功能基因和外源目的基因同时连接到一个表达载体上)只能以相同基因剂量转入受体细胞的限制，便于通过筛选获得分泌表达外源目的基因的高产工程菌株。

本发明优化选取了汉逊酵母表达***及其营养缺陷型，获得遗传性状稳定的受体菌，并优化设计了能够使UPR关键基因HAC1p持续表达的功能载体、以及能够使外源目的基因持续高效表达的表达载体，成功获得并筛选出分泌表达外源目的基因的高产工程菌株，是本发明构思的优化实施方案。在本发明上述整体构思的基础上，可以根据需要设计不同的营养缺陷型表达宿主，采用不同的启动子启动表达多种不同的外源目的基因，使得通过不同基因剂量的转化、获得能够克服“内质网应激”效应的高产工程菌成为可能。

本发明说明书和权利要求书中所述的“双营养缺陷”，并不限于受体菌有且仅有两种营养缺陷，在需要的情况下(例如需要同时转化第三种载体的情况下)，营养缺陷可以为两种以上，即“双营养缺陷”指至少具有两种营养缺陷。

附图说明

图1为汉逊酵母腺嘌呤基因缺陷的重组载体pUC-HpADE2△构建示意图；

图2为进一步***汉逊酵母自主复制序列的重组载体pUC-HpADE2△-ARS构建示意图；

图3为进一步***G418抗性基因的重组载体KMX-HpADE2△-ARS构建示意图；

图4为进一步构建汉逊酵母亮氨酸基因缺陷的重组载体KMX-HpADE2△-HpLEU2△的示意图；

图5为表达载体pMPT-Leu2-Elafin的结构示意图；

图6为表达载体pMPT-Leu2-Hirudin的结构示意图；

图7为功能载体pGPT-ADE2-HAC1p的结构示意图；

图8为表达Elafin的工程菌发酵生物量情况对比图；

图9为表达Elafin的工程菌发酵表达量情况对比图；

图10为表达Elafin的工程菌HAC1相关基因转录水平情况对比图；

图11为表达Hirudin的工程菌发酵生物量情况对比图；

图12为表达Hirudin的工程菌发酵表达量情况对比图。

具体实施方式

下面将以汉逊酵母表达***为例，详细说明本发明。

实施例1 双营养缺陷受体菌株构建和筛选

一、获得结构基因突变的汉逊酵母腺嘌呤基因(Hp-ADE2△)并构建质粒载体

根据已报道汉逊酵母腺嘌呤(ADE2)基因核苷酸序列设计引物如下：

引物ADE-1(SEQ ID NO:1)：

(划线为限制性酶切位点EcoRI，粗体TGGA为ADE2结构基因***突变碱基)

引物ADE-2(SEQ ID NO:2)：

5’-ACGAGCTCCTATTTATTAAGGTATTCTTCAT-3’

(划线为限制性酶切位点SacI)

以汉逊酵母(Hansenula polymorpha，ATCC34438)总DNA为模板，用引物ADE-1，引物ADE-2扩增突变的Hp-ADE2△，PCR体系：预混Pfu DNA聚合酶25μL，模板1μL，引物各1μL，超纯水补足50μL混匀；用PCR仪(PC707-02，日本)设置反应条件：预变性94℃，5min一次；变性94℃，10secs，退火60℃，1min，延伸72℃，2min，循环30次；充分延伸72℃，10min一次；完成降温至4℃保存。

以上PCR产物酒精沉淀后晾干和质粒载体pUC18分别用限制性内切酶EcoRI和SacI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收纯化酶切片段，再用T4DNA连接酶16℃反应12-16小时连接，连接产物化学转化JM109感受态细胞。将筛选正确的转化子接种于5mL含有终浓度为100ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养过夜。用质粒回收试剂盒(TaKaRaMiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0)提取质粒，即得到重组载体pUC-HpADE2△，构建示意图见附图1。其中Hp-ADE2△全长1720bp(SEQ ID NO:3，所示序列的首尾6个碱基分别为限制性酶切位点)，为汉逊酵母腺嘌呤(ADE2)基因结构基因起始位置引入***TGGA四个碱基突变产物，用于同源重组汉逊酵母的同源序列，通过同源交换整合到酵母基因组中，实现对汉逊酵母腺嘌呤基因敲除。

二、在质粒载体中***汉逊酵母自主复制序列

将我司自有质粒载体pMPT-HPV18L1(见发明专利CN201210013236.X，含有汉逊酵母自主复制序列HARS)和质粒载体pUC-HpADE2△分别用限制性内切酶KpnI和XmaI双酶切，琼脂糖凝胶电泳分别回收纯化酶切片段(本例分别为1106bp小片段和4407大片段)，再用T4DNA连接酶16℃反应12-16小时连接，连接产物化学转化JM109感受态细胞。将筛选正确的转化子接种于5mL含有终浓度为100ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养过夜。用质粒回收试剂盒(TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0)提取质粒，即得到重组载体pUC-HpADE2△-ARS。构建示意图见附图2。

三、进一步在质粒载体中***G418抗性基因(KanMX)

G418(Geneticin，遗传霉素)是一种氨基糖苷类抗生素，在分子遗传试验中，是稳定转染常用的抗性筛选试剂。

根据Cloning vector pMRI-40中KanMX核苷酸序列设计引物如下：

引物Kan-1(SEQ ID NO:4)：

5’-ATGTCGACGATATCAAGCTTGCCTCGTC-3’

(划线为限制性酶切位点SalI)

引物Kan-2(SEQ ID NO:5)：

5’-ATCCCGGGTCGACACTGGATGGCGGCGTTA-3’

(划线为限制性酶切位点XmaI)

以质粒Cloning vector pMRI-40为模板，用引物Kan-1，引物Kan-2扩增G418抗性基因(KanMX)，PCR体系：预混Pfu DNA聚合酶25μL，模板1μL，引物各1μL，超纯水补足50μL混匀；用PCR仪(PC707-02，日本)设置反应条件：预变性94℃，5min一次；变性94℃，10secs，退火60℃，1min，延伸72℃，2min，循环30次；充分延伸72℃，10min一次；完成降温至4℃保存。

以上PCR产物酒精沉淀后晾干和质粒载体pUC-HpADE2△-ARS分别用限制性内切酶SalI和XmaI双酶切，琼脂糖凝胶电泳分别回收纯化酶切片段(本例为1453bp小片段和5507bp大片段)，再用T4DNA连接酶16℃反应12-16小时连接，连接产物化学转化JM109感受态细胞。将筛选正确的转化子接种于5mL含有终浓度为100ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养过夜。用质粒回收试剂盒(TaKaRa MiniBEST PlasmidPurification Kit Ver.2.0)提取质粒，即得到重组载体KMX-HpADE2△-ARS。构建示意图见附图3。

四、获得结构基因突变的汉逊酵母亮氨酸基因(Hp-LEU2△)并构建质粒载体

根据已报道汉逊酵母亮氨酸基因(LEU2)核苷酸序列设计引物如下：

引物LEU-1(SEQ ID NO:6)：

5’-AGGTCGACAGATCTGGGTTTACCACCCGCA-3’

(划线为限制性酶切位点SphI)

突变引物LEU-T1(SEQ ID NO:7)：

(粗体TGCG为LEU2结构基因***突变碱基)

突变引物LEU-T2(SEQ ID NO:8)：

(粗体CGCA为LEU2结构基因***突变碱基)

引物LEU-2(SEQ ID NO:9)：

5’-ACGCATGCAGATCTGAGTCCCTGAGTACGT-3’

(划线为限制性酶切位点SalI)

以汉逊酵母(Hansenula polymorpha ATCC34438)总DNA为模板，用引物LEU-1，突变引物LEU-T1扩增突变的LEU2-1，用突变引物LEU-T2，引物LEU-2扩增突变的LEU2-2，PCR体系：预混Pfu DNA聚合酶25μL，模板1μL，引物各1μL，超纯水补足50μL混匀。用PCR仪(PC707-02，日本)设置反应条件：预变性94℃，5min一次；变性94℃，10secs，退火60℃，1min，延伸72℃，2min，循环30次；充分延伸72℃，10min一次；完成降温至4℃保存。以上PCR产物LEU2-1和LEU2-2琼脂糖凝胶电泳回收纯化，稀释100倍作为模板，扩增突变的Hp-LEU2△，PCR体系：预混Pfu DNA聚合酶25μL，两模板各1μL，超纯水22μL。用PCR仪(PC707-02，日本)设置反应条件：预变性94℃，5min一次；变性94℃，10secs，退火55℃，1min，延伸72℃，3min，循环5次；降温至4℃。再往反应体系中加入引物LEU-1和引物LEU-2各1μL。用PCR仪(PC707-02，日本)设置反应条件：预变性94℃，5min一次；变性94℃，10secs，退火60℃，1min，延伸72℃，2min，循环30次；充分延伸72℃，10min一次；完成降温至4℃保存。

以上PCR产物Hp-LEU2△酒精沉淀后晾干和质粒载体KMX-HpADE2△-ARS分别用限制性内切酶SphI和SalI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收纯化酶切片段，再用T4DNA连接酶16℃反应12-16小时连接，连接产物化学转化JM109感受态细胞。将筛选正确的转化子接种于5mL含有终浓度为100ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养过夜。用质粒回收试剂盒(TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0)提取质粒，即得到重组载体KMX-HpADE2△-HpLEU2△。构建示意图见附图4，其中Hp-LEU2△(SEQ ID NO:10，所示序列的首尾6个碱基分别为限制性酶切位点)全长2481bp，为汉逊酵母亮氨酸(LEU2)基因结构基因起始位置引入***TGCG四个碱基突变产物，用于同源重组汉逊酵母的同源序列，通过同源交换整合到酵母基因组中，实现对汉逊酵母亮氨酸基因敲除。

五、双营养缺陷受体菌株制备和筛选

取1mL汉逊酵母野生型菌株(ATCC34438)过夜培养物(OD₆₀₀6.0～10.0)转接于100mL YPD液体培养基中28℃～30℃、250～300r/培养至酵母菌的对数生长期(OD₆₀₀ 1.0～1.3)，取此菌1mL分装到1.5mL EP管中，4℃、10000g离心1min，弃上清液，沉淀用s无菌生理盐水(4℃预冷)洗涤，同样条件下离心，弃上清液。加入1mL处理液[10mM LiAc、10mMDTI、0.6M山梨醇、10mM TrisHC1(pH7.5)]，室温下放置20min。离心，弃上清液，加入1mL预冷1M山梨醇溶液，4℃、10000g离心1min，弃上清液，洗涤两次。最后加80μL 1M山梨醇溶液混匀即为感受态细胞，冰浴中保存或-80℃冰箱保存备用。

制备重组载体KMX-HpADE2△-HpLEU2△10μg，利用电转化(天津理工大学生产的LN-101型基因脉冲导入仪，设置1.5kV，20μF，380Ω，时间常数4-7mSec，将其转化入以上感受态细胞。电转化后加入1M山梨醇混匀37℃静置45min，稀释10倍取200μl涂布含0.1mg/mLG418的YPD平板上37℃培养4天。挑取生长较快的单菌落于无菌水中混匀，分别接种(1)固体MD(含20μg/ml生物素、1.34％YNB，2％葡萄糖)培养平板、(2)添加30μg/mL腺嘌呤的固体MD培养平板、(3)添加30μg/mL亮氨酸的固体MD培养平板、(4)同时添加30μg/mL腺嘌呤和30μg/mL亮氨酸的固体MD培养平板及(5)YPD平板上，37℃培养4天。在1000个转化子中，挑选出两株(1)(2)(3)均不生长，(4)(5)正常生长的转化子，为亮氨酸和腺嘌呤双营养缺陷株，命名为HTM01和HTM02。经完全培养基传代培养20次，重复以上平板试验结果一致，说明HTM01和HTM02没有回复突变，遗传稳定。

实施例2表达载体构建

一、获得MOX启动子终止子和汉逊酵母自主复制序列并构建重组载体pBlu-MP(18L1)-HARS

将我司自有质粒载体pMPT-HPV18L1(见发明专利CN201210013236.X，MOX启动子终止子间***HPV18L1基因)用限制性内切酶BssHⅡ和KpnI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收纯化大片段MP(18L1)+HARS(含MOX启动子终止子和汉逊酵母自主复制序列，4433bp，SEQ ID NO:20)，用于连接酶连接构建表达载体。

以pBlueScript SK(+)为模板，设计引物：

pB-01(SEQ ID NO:11)：

5’-TAGCGCGCTTGGCGTAATCATG-3’

(划线为限制性酶切位点BssHI)

pB-02(SEQ ID NO:12)：

5’-GCGGTACCTGACGCGTCACTGGCCGTCGTTTTACAACG-3’

(划线为限制性酶切位点KpnI、MluI)

以pBlueScript SK(+)质粒稀释10000倍为模板，用引物pB-01，引物pB-02扩增片段pBlu，PCR体系：预混Pfu DNA聚合酶25μL，模板1μL，引物各1μL，超纯水补足50μL混匀；用PCR仪(PC707-02，日本)设置反应条件：预变性94℃，5min一次；变性94℃，10secs，退火60℃，1min，延伸72℃，3min，循环30次；充分延伸72℃，10min一次；完成降温至4℃保存。

以上PCR产物酒精沉淀后晾干用限制性内切酶BssHI和KpnI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收纯化酶切2800bp片段pBlu，将酶切片段MP(18L1)+HARS和片段pBlu用T4DNA连接酶16℃反应12-16小时连接，连接产物化学转化JM109感受态细胞。将筛选正确的转化子接种于5mL含有终浓度为100ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养过夜。用质粒回收试剂盒(TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0)提取质粒，即得到重组载体pBlu-MP(18L1)-HARS。

二、获得啤酒酵母亮氨酸(LEU2sc)基因并构建重组载体pMPT-Leu2-HPV18L1

根据已报道啤酒酵母亮氨酸(LEU2sc)基因核苷酸序列设计引物如下：

引物Le-1(SEQ ID NO:13)：

5’-GCACGCGTGTCGACTACGTCGTTAAG-3’

(划线为限制性酶切位点MluI)

突变引物Le-T1(SEQ ID NO:14)：

5’-GTCCTAAATGGGGTTCCGGTAGTGTTAG-3’

突变引物Le-T2(SEQ ID NO:15)：

5’-CTAACACTACCGGAACCCCATTTAGGAC-3’

(划线为通过碱基突变去除LEU2中酶切位点KpnI以便后续克隆操作)

引物Le-2(SEQ ID NO:16)：

5’-CAGGTACCTCGAGGAGAACTTCTAG-3’

(划线为限制性酶切位点KpnI)

以啤酒酵母(S288c)总DNA为模板，巢式PCR方法：用引物Le-1和突变引物Le-T1扩增突变的Leu-1，用突变引物Le-T2和引物Le-2扩增突变的Leu-2，PCR体系：预混Pfu DNA聚合酶25μL，模板1μL，引物各1μL，超纯水补足50μL混匀。用PCR仪(PC707-02，日本)设置反应条件：预变性94℃，5min一次；变性94℃，10secs，退火60℃，1min，延伸72℃，2min，循环30次；充分延伸72℃，10min一次；完成降温至4℃保存。以上PCR产物Leu-1和Leu-2琼脂糖凝胶电泳回收纯化，稀释100倍作为模板，扩增突变的sc-LEU2，PCR体系：预混Pfu DNA聚合酶25μL，两模板各1μL，超纯水22μL。用PCR仪(PC707-02，日本)设置反应条件：预变性94℃，5min一次；变性94℃，10secs，退火55℃，1min，延伸72℃，3min，循环5次；降温至4℃。再往反应体系中加入引物Le-1和引物Le-2各1μL。用PCR仪(PC707-02，日本)设置反应条件：预变性94℃，5min一次；变性94℃，10secs，退火60℃，1min，延伸72℃，2min，循环30次；充分延伸72℃，10min一次；完成降温至4℃保存。PCR产物酒精沉淀后晾干用限制性内切酶MluI和KpnI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收纯化酶切片段LEU2sc(SEQ ID NO:17，所示序列的首尾6个碱基分别为限制性酶切位点)，用于连接酶连接构建表达载体。

再将重组载体pBlu-MP(18L1)-HARS用限制性内切酶MluI和KpnI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收纯化酶切大片段，将此大片段和制备的酶切片段LEU2sc片段连接用同样的转化筛选方法构建载体pMPT-Leu2-HPV18L1(本例9212bp)。

三、***外源目的基因获得表达载体pMPT-Leu2-Elafin和pMPT-Leu2-Hirudin

Elafin作为弹性蛋白酶特异抑制因子在上皮细胞完整性方面起重要作用，本发明人工设计了含MFa引导肽的Elafin全序列(SEQ ID NO:18，其中，序列首尾各6个碱基分别为限制酶切位点，第7-255位为MFa引导肽的编码序列，第256-435位为Elafin的编码序列)，委托上海生工生物工程有限公司化学合成全序列，作为分泌表达的外源目的基因。

将载体pMPT-Leu2-HPV18L1用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收纯化酶切片段，将上述含MFa引导肽的Elafin全序列用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收纯化酶切片段，两片段连接用同样的转化筛选方法构建表达载体pMPT-Leu2-Elafin(本例8361bp)，表达载体结构如附图5所示。

同样的方法构建了表达载体pMPT-Leu2-Hirudin(8385bp)，如附图6所示。其中，人工设计了含MFa引导肽的Hirudin全序列(SEQ ID NO:19，其中，序列首尾各6个碱基分别为限制酶切位点，第7-255位为MFa引导肽的编码序列，第256-459位为Elafin的编码序列)，委托上海生工生物工程有限公司化学合成全序列，作为分泌表达的外源目的基因。

实施例3 功能载体构建

一、获得啤酒酵母母腺嘌呤(ADE2sc)基因并进行第一步载体置换

根据已报道啤酒酵母腺嘌呤(ADE2sc)基因核苷酸序列设计引物如下：

引物Ad-01(SEQ ID NO:20)：

5’-CAACGCGTCGCTATCCTCGGTTCTGCATTG-3’

(划线为限制性酶切位点MLUI)

引物Ad-02(SEQ ID NO:21)：

5’-TAGGTACCTAACGCCGTATCGTGATTAACG-3’

(划线为限制性酶切位点KpnI)

以啤酒酵母(S288c)总DNA为模板，引物Ad-01，引物Ad-02扩增啤酒酵母腺嘌呤基因ADE2sc，PCR产物酒精沉淀后晾干用限制性内切酶MluI和KpnI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收纯化酶切片段ADE2sc(SEQ ID NO:22，所示序列的首尾6个碱基分别为限制性酶切位点)，用于置换表达载体pMPT-Leu2-Elafin中Leu2sc位置。

二、获得汉逊酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因并进行第二步载体置换

根据已报道汉逊酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因核苷酸序列设计引物如下：

Gp-01(SEQ ID NO:23)：

5’-GTCCCGGGCCTTTGCTCAATGCCGTTTTGG-3’

(划线为限制性酶切位点Sma Ⅰ)

Gp-02(SEQ ID NO:24)：

5’-GCGGATCCATCGATGAATTCATTGTTTCTATATTATC-3’

(划线为限制性酶切位点BamHI、EcoRI)

Gp-03(SEQ ID NO:25)：

5’-ATGAATTCATCGATGGATCCGCACGGCCTCATCTAC-3’

(划线为限制性酶切位点EcoRI、BamHI)

Gp-04(SEQ ID NO:26)：

5’-TGCGCGCGAGCTCGGACCACAATCCAAATAAAG-3’

(划线为限制性酶切位点BssHI)

用实施例2中扩增啤酒酵母亮氨酸(LEU2sc)基因相同的巢式PCR方法扩增甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(pGAP，SEQ ID NO:27，所示序列的首尾6个碱基分别为限制性酶切位点)组成型启动子和终止子序列。

PCR产物酒精沉淀后晾干用限制性内切酶XmaI和BssHI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收纯化酶切片段GPT，用于置换表达载体pMPT-Leu2-Elafin中MOX启动子终止子位置。经过以上两步置换构建了载体pGPT-ADE2。

三、获得汉逊酵母HAC1基因并进行第三步载体置换，获得功能载体pGPT-ADE2-HAC1p

根据已报道汉逊酵母HAC1基因核苷酸序列设计引物，以汉逊酵母ATCC34438基因组为模板扩增HAC1基因，引物序列如下：

HA-01(SEQ ID NO:28)：

(划线为限制性酶切位点EcoRI)

HA-02(SEQ ID NO:29)：

5’-CTGTTAATGGTGCTGCTGCTGGATGATGCAC-3’

HA-03(SEQ ID NO:30)：

5’-GTGCATCATCCAGCAGCAGCACCATTAACAG-3’

HA-04(SEQ ID NO:31)：

5’-CAGGATCCTCAAGACAAATAGTCG-3’

(划线为限制性酶切位点BamHI)

用实施例2中扩增啤酒酵母亮氨酸(LEU2sc)基因相同的巢式PCR方法扩增以下HAC1p结构基因(SEQ ID NO:32，所示序列的地3-8位和第987-992位分别为限制性酶切位点)。

PCR产物酒精沉淀后晾干和载体pGPT-ADE2分别用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收纯化酶切片段，连接酶连接将HAC1p***载体pGPT-ADE2中构建功能载体pGPT-ADE2-HAC1p(图7)。

实施例4 双质粒共转化构建汉逊酵母分泌表达弹力素(Elafin)工程菌株

一、亮氨酸和腺嘌呤双营养缺陷株HTM01感受态细胞制备

取1mL汉逊酵母双营养缺陷株HTM01过夜培养物(OD₆₀₀6.0～10.0)转接于100mLYPD液体培养基中28℃、250-300rpm培养至酵母菌的对数生长期(OD₆₀₀ 1.0～1.3)，取此菌1mL分装到1.5mL EP管中，4℃、10000g离心1min，弃上清液，沉淀用s无菌生理盐水(4℃预冷)洗涤，同样条件下离心，弃上清液。加入1mL处理液[10mM LiAc、10mMDTI、0.6M山梨醇、10mM TrisHC1(pH 7.5)]，室温下放置20min。离心，弃上清液，加入1mL预冷1M山梨醇溶液，4℃、10000g离心1min，弃上清液，洗涤两次。最后加80μL 1M山梨醇溶液混匀即为感受态细胞HTM01，冰浴中保存或-80℃冰箱保存备用。

二、共转化筛选高表达菌株

测量DNA浓度，取10μg实施例2制备的表达载体pMPT-Leu2-Elafin、10μg实施例3制备的表达载体功能载体pGPT-ADE2-HAC1p(两质粒载体体积之和小于6μL)，加入以上制备的80μL的感受态细胞HTM01中充分混匀。利用天津理工大学生产的LN-101型基因脉冲导入仪，设置1.5kV，20μF，380Ω，时间常数4-7mSec，将其同时转化入以上感受态细胞。电转化后加入700μL1M山梨醇混匀37℃静置45min，稀释3倍取200μl涂布固体MD(含20μg/ml生物素、1.34％YNB，2％葡萄糖)培养平板上，37℃培养4天。

挑取300个转化子单菌落经固体MD培养基传代培养10次，转入液体MD培养基进行传代培养，培养约200代。传代过程中用玻璃珠制备法(A.亚当斯等，《酵母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000)提取酵母基因组，利用PCR引物：上游引物：5’-TCAAAAGCGGTATGTCCTTCCACGT-3’和下游引物：5’-GCACGGTGGTGACATCAATCTAAAG-3’进行PCR筛选，得到高拷贝菌株26株。将高拷贝菌株置于10mL甘油诱导培养基中，每12h加入200uL诱导剂(诱导剂为25％甘油)进行诱导表达，共诱导72h。活性测定结果显示，17#菌株的表达活性最高，诱导筛选重复三次。将17#菌株接种于YPD培养基中(含2％葡萄糖、2％大豆蛋白胨及1％酵母浸出粉的液体培养基)传代培养3天，以去除游离质粒。传代培养后的17#菌株稀释涂布于MD固体培养基(1.34％YNB，2％葡萄糖，2％琼脂粉)平板上进行亚克隆。挑取30个亚克隆，在10mL甘油培养基中进行诱导表达，其中表达最高的菌株为Elafin17-09。

测活方法：猪胰弹性蛋白酶(porcine pancreatic elastase，PPE)的活性可通过测定其水解底物Suc-Ala-Ala-Pro-Abu-PNA(elastasesubstrate IV，S4)产生的荧光物质，在410nm处的吸光度值来计算。Elafin是PPE特异性抑制剂，它能够与PPE进行1：1的结合，发酵上清中rhElafin的含量越高，则它对PPE的抑制活性越强。本实验参照文献[Eur JBiochem,2004,271(12):2370-8]方法，选用pH为8.0的HEPES作为缓冲液，将发酵液上清(含有rhElafin)与PPE在37℃孵箱孵育20min后，再向反应混合物中加入S4，37℃孵箱孵育30min后，测定经rhElafin作用后残留的PPE与S4反应产物在410nm处的吸光度以检测上清中rhElafin含量的多少。通过测定药摇瓶诱导或发酵液上清中重组Elafin对猪胰弹性蛋白酶作用后的A410值大小来检测Elafin的活力，通过这种方法就可以筛选出高表达rhElafin的汉逊酵母工程菌或检测发酵表达水平。

三、工程菌株发酵工艺

以pMPT-URA3-Elafin表达载体转化HU11(尿嘧啶单营养缺陷受体株)筛选的高表达菌株为对照株Efn2-13(该工程菌株构建实施方案与发明专利CN201210013236.X相同，未转入功能基因HAC1p)，与以上筛选的高表达菌株Efn17-09(转入功能基因HAC1p)对比。采用如下相同发酵工艺条件，比较生物量和产物活性情况。

1)培养基的配制：

种子培养基：2g/100ml葡萄糖、1.34g/100ml YNB；一级种子培养基200mL，二级种子培养基1600mL，高压灭菌。

补料培养基：NH4H2PO4 87g溶于540mL水中，高压灭菌；另取260g甘油，高压灭菌，灭菌后在超净工作台合并。

去阻遏培养基：共计3L，NH₄H₂PO₄ 27g、MgSO₄·7H₂O 6g、KCl 6.8g、NaCl 0.7g，以上原料溶于660mL水中，高压灭菌；另取1.8L甘油，高压灭菌。灭菌后在超净工作台合并。

发酵培养基：NH₄H₂PO₄ 175g、MgSO₄·7H₂O 40g、KCl 44g、NaCl 4.4g、甘油520g，另加4mL消泡剂，发酵起始体积12L，罐内110-115℃高压灭菌30分钟。

2)发酵过程

从-70℃冰柜中取一支已冻存的多形汉逊酵母重组菌14-13(1mL、OD₆₀₀≈100)接入200mL一级种子培养基，31℃培养22小时转接1600mL二级种子培养基扩大培养，31℃培养22小时细胞OD600达到10以上，作为发酵种子。

将二级种子接入装有12L已灭菌发酵培养基的30L发酵罐中(日本丸菱理化装置研究所，型号：MSJ-J2)开始发酵。

发酵工艺主要包含两个时相，即生长时相和去阻遏时相。

生长时相：发酵罐pH值控制设定在5.4-5.5；发酵温度控制30℃；罐压0.5Kg/cm当发酵罐内溶氧(华东理工大学生物工程学院FC-280型溶解氧监控仪进行监测)缓慢下降至60％左右时(发酵约16小时)，连接好补料管路，用蠕动泵匀速打入约400mL补料溶液。当发酵罐溶氧水平降至40％以下时，将空气流量调至15L/min，搅拌转速调至600rpm。生长时相后期(发酵约22小时左右)，若细胞生长状态良好，发酵罐溶氧水平可下降至20％以下；细胞OD₆₀₀达到80以上。

去阻遏时相：溶氧回升前将蠕动泵电源插头与溶解氧监控仪信号输出电源连接；监控仪溶氧控制40％，死区为2％，高端打开；蠕动泵电源开关关闭。当观察到发酵罐溶氧由最低点回升到60％以上时，进入去阻遏时相；此时打开蠕动泵电源开关，设定泵速22rpm，开始流加去阻遏溶液。去阻遏后期，若细胞生长良好，OD₆₀₀可达到350以上，发酵时间大约96小时。发酵结束后，用500mL离心杯，Sigma 6K-15离心机7000rpm进行离心，收集上清以待后续纯化处理。

发酵过程每隔24h取样，不同时间点的发酵液测OD₆₀₀，比较生物量，结果如附图8所示；上清液稀释10倍，分别取60μl测定Elafin活力，换算为表达量mg/L观察表达产物Elafin随诱导时间变化的相对关系，结果附图9所示。

四、功能基因HAC1p相关基因表达情况对比

对照株Efn2-13(未转入功能基因HAC1p)和菌株Efn17-09(转入功能基因HAC1p)转入MD(含20μg/ml生物素、1.34％YNB，2％葡萄糖)31℃培养1天，置换为MM(含20μg/ml生物素、1.34％YNB)培养基，加入200uL诱导剂(诱导剂为25％甘油)进行诱导表达，每间隔12h加入200uL诱导剂，31℃培养1天后取样，取菌体提取总RNA，将获得的RNA反转录得到cDNA，在通过RT-PCR对功能基因HAC1p及分泌关键基因相对定量检测。

RT-PCR主要选取蛋白折叠相关基因KAR2、ERO1、HAC1p；蛋白降解相关基因PRB1、BUL1；蛋白转运相关基因SEC31几个基因为代表进行考察。结果如附图10所示，可见功能基因HAC1p转录水平明显提高，下游基因明显往有利于分泌表达的方向调节。这与上面的细胞生长速率提高，发酵分泌表达量明显提高提供了理论依据。通过功能基因转入持续表达甚至过表达，使外源目的基因Elafin表达量提高了2倍，工程株发酵性能也得到改善。

实施例5 双质粒共转化构建汉逊酵母分泌表达水蛭素(Hirudin)工程菌株

一、亮氨酸和腺嘌呤双营养缺陷株HTM01感受态细胞制备

同上实施例4制备感受态细胞HTM01，冰浴中保存或-80℃冰箱保存备用。

二、共转化筛选高表达菌株

测量DNA浓度，取10μg实施例2制备的表达载体pMPT-Leu2-Hirudin、10μg实施例3制备的表达载体功能载体pGPT-ADE2-HAC1p(两质粒载体体积之和小于6μL)，加入以上制备的80μL的感受态细胞HTM01中充分混匀。利用天津理工大学生产的LN-101型基因脉冲导入仪，设置1.5kV，20μF，380Ω，时间常数4-7mSec，将其同时转化入以上感受态细胞。电转化后加入700μL1M山梨醇混匀37℃静置45min，稀释3倍取200μl涂布固体MD(含20μg/ml生物素、1.34％YNB，2％葡萄糖)培养平板上，37℃培养4天。

挑取200个转化子单菌落经固体MD培养基传代培养10次，转入液体MD培养基进行传代培养,培养约200代。传代过程中用玻璃珠制备法(A.亚当斯等，《酵母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000)提取酵母基因组，利用PCR引物：上游引物：5’-TCAAAAGCGGTATGTCCTTCCACGT-3’和下游引物：5’-GCACGGTGGTGACATCAATCTAAAG-3’进行PCR筛选，得到高拷贝菌株18株。将高拷贝菌株置于10mL甘油诱导培养基中，每12h加入200uL诱导剂(诱导剂为25％甘油)进行诱导表达，共诱导72h。生色底物法活性测定结果显示，9#菌株的表达活性最高，诱导筛选重复三次。将9#菌株接种于YPD培养基中(含2％葡萄糖、2％大豆蛋白胨及1％酵母浸出粉的液体培养基)传代培养3天，以去除游离质粒。传代培养后的9#菌株稀释涂布于MD固体培养基(1.34％YNB，2％葡萄糖，2％琼脂粉)平板上进行亚克隆。挑取30个亚克隆，在10mL甘油培养基中进行诱导表达，其中表达最高的菌株为HRN9-16。

生色底物法活性测定：以生色试剂Chromozym TH为底物，凝血酶能使生色试剂水解释放对硝基苯在405nm有特异吸收，通过测定反应体系中未被水蛭素中和的TH量可以间接检测水蛭素的抗凝血酶活性。具体步骤：用1.5mL离心管各取50uL上述稀释标准品溶液和样品；加50uL凝血酶溶液，37℃保温5分钟；各管加入50uL生色试剂Chromozym TH，37℃反应2分钟；各管加入50uL醋酸终止液；各管补加600uL蒸馏水后，立即在405nm处测OD值。根据标准品计算样品活性(ATU/mL)。

通过测定药摇瓶诱导或发酵液上清中重组水蛭素活力，通过这种方法就可以筛选出高表达水蛭素的汉逊酵母工程菌或检测发酵表达水平。

三、工程菌株发酵工艺

以pMPT-URA3-Hirudin表达载体转化HU11(尿嘧啶单营养缺陷受体株)筛选的高表达菌株为对照株205-17(未转入功能基因HAC1p，见专利CN200810103154，菌种保藏号CGMCCNo.2424)，与以上筛选的高表达菌株HRN9-16(转入功能基因HAC1p)对比。采用实施例4相同的发酵工艺条件完成30L规模发酵。

发酵过程每隔24h取样，不同时间点的发酵液测OD₆₀₀，比较生物量，结果如附图11所示；上清液稀释10倍，测定Hirudin活力，表达量对比如附图12所示。比较可知，通过功能基因HAC1p转入持续表达甚至过表达，工程株发酵性能不变，使外源目的基因Hirudin表达量提高了0.5倍。

实施例6 实时定量PCR检测工程菌株功能基因和外源目的基因拷贝数

汉逊酵母工程菌株Efn17-09和HRN9-16过夜培养物(OD₆₀₀6.0～10.0)，取约1mL10OD酵母菌体至1.5mL离心管，6000rpm离心5min后去上清，加入与沉淀菌体体积相同的酸洗玻璃珠，100μL细胞破碎液，置于振荡器上振荡5min～10min。

细胞破碎完成后，在离心管中加100μL无菌水，再加100μL酚/氯仿抽提液，混匀后4℃放置十分钟，在台式离心机上10000rpm离心5min，取上清液用于稀释，作为扩增反应的模板。所制备DNA不宜在冰箱长时间保存，一般不超过24小时。

已知MOX基因为汉逊酵母的单拷贝基因，本检测方法以MOX基因为内标，设计引物对同一样品同时扩增MOX基因、HAC1p基因和外源目的基因，并用荧光定量PCR仪检测，通过相对比较而确定单个细胞包含的HAC1p基因和外源目的基因拷贝数，比较两者基因剂量。

设计MOX基因引物序列如下：

MXcr-1(SEQ ID NO:33)：5’-AACCTCACAGTTGCCCTGA-3’

MXcr-2(SEQ ID NO:34)：5’-CGATGGTCTGGACGAGTAGAA-3’

设计HAC1p引物如下：

HAcr-1(SEQ ID NO:35)：5’-GAAATCGCCCAAATCGTTATC-3’

HAcr-2(SEQ ID NO:36)：5’-TCGGTTGCTTCTTGTCCTG-3’

设计Elafin目的基因引物如下：

Elcr-1(SEQ ID NO:37)：5’-TCTTGCCCAATCATCCTGA-3’

Elcr-2(SEQ ID NO:38)：5’-AACGAAGCACGCCATACC-3’

设计Hirudin目的基因引物如下：

HRNcr-1(SEQ ID NO:39)：5’-AGGACGAGACCGCTCAGAT-3’

HRNcr-2(SEQ ID NO:40)：5’-GAGGCAATAGTGGTGTTGATGA-3’

使用Rotor-Gene 3000型荧光定量PCR仪。实时定量PCR反应热循环参数：94℃5min预变性；94℃15secs变性，60℃50secs退火及延伸，35个循环；荧光强度变化由Rotor—Gene检测***在每个循环延伸阶段末期进行检测，扩增反应结束后利用Rotor—Gene 5.0.28(Corbett Research)软件分析数据。

汉逊酵母工程菌株Efn17-09和HRN9-16功能基因和外源目的基因拷贝数检测结果如表1：

表1

菌株号	Ct(功能基因)	Ct(MOX)	ΔCt	N
					Efn17-09	16.07±0.09	19.26±0.06	3.19±0.11	9.1
HRN9-16	15.76±0.11	19.81±0.08	4.05±0.14	16.6
					菌株号	Ct(目的基因)	Ct(MOX)	ΔCt
Efn17-09	14.06±0.10	19.26±0.06	5.20±0.12	36.7
					HRN9-16	13.76±0.15	19.81±0.08	6.05±0.17	66.3

通过相对定量，可知汉逊酵母工程菌株Efn17-09功能基因HAC1p拷贝数约为9个，目的基因Elafin拷贝数约为37个；汉逊酵母工程菌株HRN9-16功能基因HAC1p拷贝数约为17个，目的基因Hirudin拷贝数约为66个。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 昕因达

<120> 一种双质粒共转化外源基因高表达基因工程菌

<130> XYD1701

<160> 40

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagaattcat ggatggactc gaaggtcgtt ggaat 35

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acgagctcct atttattaag gtattcttca t 31

<210> 3

<211> 1720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaattcatgg atggactcga aggtcgttgg aattttgggc ggcggccagc tcggccgcat 60

gatggtcgag gcagctagcc gactgaacat caaaacagtg attcttgaga acggcgcaga 120

ttcgccggcc aagcagatca attccagtgc agaacacatc gacggctcct tcaacgatga 180

ggcggccatc cgcaagctcg ccgagaaatg cgacgtgctg accgttgaga ttgagcacgt 240

tgatgttgag gccttgaaga aggtgcagga gcaaacttcc gtcaagatct atccatctcc 300

tgagaccatt gctcttatca aggacaaata cttgcagaaa gagcatttga tcaggaacca 360

gatcgccgtt gctgagtcca ctgctgttga aagcactgct caagctttgc aatctgtggg 420

acagaagtat ggatatccgt acatgctcaa gtccagaacg atggcttatg atggtagggg 480

taactttgtt gttgaggatg tttccaagat cccagaggct ttggaagctt tgaaggacag 540

accgctctat gctgaaaaat gggctccctt taccaaggag ctagcagtga tggtggtgcg 600

gggtcttggc ggagacgtcc atgcctaccc aacagtagag actatccaca aaaacaatat 660

ctgccacacg gtgtttgcgc ctgcgcgtgt caatgacacc atacagaagc gcgcgcaact 720

tttggcggag aaggctgtgt ctgcattccc gggagcaggc atctttggtg tcgaaatgtt 780

cctgcttcca aatgacgagc tgttgatcaa cgagattgct cctagaccgc acaactctgg 840

acattacaca atcgatgcgt gtgtgacgag ccagtttgag gcacacatcc gtgccgtttg 900

cagtctgccg ctgccaaaga actttacttc tctatccaca ccatctaccc atgctatcat 960

gttaaacgtg ttgggcagcc ctgatccaga agagtggttg caaaagtgca agagagcgct 1020

tgaaactccg cacgcgtcgg tttatctgta cggaaaatcc aacagaccgg gccggaaact 1080

gggtcatatc aacattgtct cccagtcgat ggacgactgc atccgtcgtc tagagtacat 1140

agatggcaaa tctggcactc tgaaagagcc agaaaacaac acaggtgttg caggaaccag 1200

cagcaaacct ctagtcggcg tgataatggg ctcagactcg gatctgcctg tgatgtccct 1260

tggttgcaat attctgaaat cttttggcgt tcctttcgag gttaccattg tgtccgccca 1320

cagaacgcct cagagaatgg tcaagtacgc tgccgaagcc ccagagaggg gaatacggtg 1380

catcatcgct ggcgctggtg gagctgccca tctaccagga atggttgctg ccatgactcc 1440

attgccggtc attggtgttc ccgtcaaggg atcgactctc gacggagtcg actcgctgta 1500

ttcgatagtt cagatgccta gaggagttcc tgtggccact gttgccatca acaatgccac 1560

caacgctgcg cttctggccg tgcgtattct tggctcgttc gacccagtgt atttcagcaa 1620

aatggcgaaa tacatgagcg agatggaaaa tgaggttctt gaaaaggctg aacggttggg 1680

ctctgttggc tatgaagaat accttaataa ataggagctc 1720

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgtcgacga tatcaagctt gcctcgtc 28

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atcccgggtc gacactggat ggcggcgtta 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aggtcgacag atctgggttt accacccgca 30

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gccccgaggt tgttgcgtgc ggaggccgtc aaggttct 38

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agaaccttga cggcctccgc acgcaacaac ctcggggc 38

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acgcatgcag atctgagtcc ctgagtacgt 30

<210> 10

<211> 2481

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtcgacagat ctgggtttac cacccgcaaa cctcctgtcg ggcactattc ggcggcaccg 60

cggctccagc ggcagcgtcc cggcaacgaa ccgtcgctga accgtctcga cgtgcccggc 120

atgtccagtc tgtcgtcctc ggacatgaat ccgaatgcgg ttggctccga ttcctgctgc 180

cgcacctcgc gagccagctg gaggctgacg ggaagacgac gccaaaatgc tggatgcgcg 240

cttttcgcta aggttgtctc tgtcgtcgcg ctggcgtctg cgccaaaaca ggaacaggag 300

caggagtccc aagagcagca aagctccgag gatcgacccg acagcgattc cggccttcgc 360

gcccttgctg agccccgtgg acctgttgtt ggcgctcgag gcacttgagg acgacgcggc 420

agccgacgcc gaggtggctg tagcgacgga ctgcgtgatg tagatgatcg aggtctgcat 480

gtttccaggt gaaacggacg tagttatccg cactgattcg gatgagggtg tggacgaaga 540

ggtggttgaa gacgacgacg agctctggga gaaagaaaag gacgaaatcg agcttgttgt 600

agtcgagcta gcggacagac ttgaggacgt tggagacgag tctgtggaag acatggtgga 660

gctctgtggg gaggaacttt gcttggagga agacgatgtt gaggagctgg acagactgga 720

actggaggag gaggtggtgg aggtggagga ggtggaagtg gcatcgtctg tggacgagtg 780

cgacgactgc gccgacgaac tgtcgtcgtc gttttcctca gactcgtcaa catagacgga 840

ataagagtcg ctaccaccac acttctccat gggataacca gtgcaggacg ttgtgcacga 900

gccgtcgggg ttgtccgaag gtacgtcgtc tccgcaataa cagtcctggc cgttgatcaa 960

tgcagcaact gcgtgtcccg aacactgctc cgtgcaatgg ctggagctct gccatgtgta 1020

cgagtccttc ttggtcaagc cggaaatggc atccgagctg tagcaaccta aatacgtaaa 1080

gtctgctagg acttgggtga tcacgaatac gacaccgaat ctcatgttga catggaaaag 1140

ctaaaaaata aacaatagag cgtcgcgtcg aaaaaaataa aatctgtgag gcgtgcgtgt 1200

ttaggatttt tgggattatt taggaattat tcgagatcct actttttttt ctcccttatt 1260

tagttcttga gtagcttggc cacctcctgc gcaacagcat caccaacttc ctgtgttgag 1320

gagcttccac ccaaatcggc agtcatgata cctgcatcca ggacgttctt gacggcctgc 1380

tcgatcgcac ggccggcatc caccaagtcc agcgacagct tcagcatcat ggcggcagac 1440

aaaattgtgg ccaatggatt gaccttgccc gggcccaaat ctggcgccga gccgtggcag 1500

ggctcgtaaa gaccaaacgc cttgtttgtg tctggcagag acgccaacga ggcagaaggc 1560

agcaggccca gagacccagg aatcacactg gcctcgtcac tgatgatgtc gccaaacatg 1620

ttgttggtga caatgacacc gttgagtttc gttggcgact tgaccaaaat catggctgcc 1680

gagtcgatca gctggtgctg caccgtcagc tgcgggaact cgttcttgat ggtctcctca 1740

acagtcttcc gccacaaacg cgaggatgca agcacgttgg ctttgtccag cgaccacagt 1800

gggagcggtg ggtcgctctg cagcgccaaa aaggccgcca ttctcgtgat tctctgcacc 1860

tctggaacag aatagctctc agtgtcgctg gcaactccgt cgccggcatc ctccttgcgg 1920

tcaccaaagt agattccacc aaccaactca cgcacaacaa caaagtcagt gcccttgacg 1980

atttctgatt tcagtggaga tagcttcaga agagcgtcgg aagcaaaact gcatggacgc 2040

aggttcgcgt acaagttgag ctcttttctg atcttcaaca gaccctgctc aggacgcacg 2100

gagccggttc cccacttagg tcctccgacg gctccaagca aaacggcgtc agccttcttg 2160

gcggcttcga gggcctcgtc ggacaatggc accccataag catcgatcga ggcaccgccg 2220

atcaggtgct tggaaaagtt gaacttaacg ccgattgccg acgagacagc ctcgagaacc 2280

ttgacggcct ccgcacgcaa caacctcggg gcccacgtga tcaccaggga gaagcacaat 2340

gttcttactc atgattgcaa aatgatgcaa ctattttgcg ccggtaccgg aaaaattgaa 2400

aaaccatcca cttactcatt cctgtctttt tatttcgtat taccaaaccg cttacgtact 2460

cagggactca gatctgcatg c 2481

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tagcgcgctt ggcgtaatca tg 22

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcggtacctg acgcgtcact ggccgtcgtt ttacaacg 38

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcacgcgtgt cgactacgtc gttaag 26

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gtcctaaatg gggttccggt agtgttag 28

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctaacactac cggaacccca tttaggac 28

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

caggtacctc gaggagaact tctag 25

<210> 17

<211> 2232

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

acgcgtgtcg actacgtcgt taaggccgtt tctgacagag taaaattctt gagggaactt 60

tcaccattat gggaaatggt tcaagaaggt attgacttaa actccatcaa atggtcaggt 120

cattgagtgt tttttatttg ttgtattttt ttttttttag agaaaatcct ccaatatcaa 180

attaggaatc gtagtttcat gattttctgt tacacctaac tttttgtgtg gtgccctcct 240

ccttgtcaat attaatgtta aagtgcaatt ctttttcctt atcacgttga gccattagta 300

tcaatttgct tacctgtatt cctttacatc ctcctttttc tccttcttga taaatgtatg 360

tagattgcgt atatagtttc gtctacccta tgaacatatt ccattttgta atttcgtgtc 420

gtttctatta tgaatttcat ttataaagtt tatgtacaaa tatcataaaa aaagagaatc 480

tttttaagca aggattttct taacttcttc ggcgacagca tcaccgactt ccgtggtact 540

gttggaacca cctaaatcac cagttctgat acctgcatcc aaaacctttt taactgcatc 600

ttcaatggcc ttaccttctt caggcaagtt caatgacaat ttcaacatca ttgcagcaga 660

caagatagtg gcgatagggt tgaccttatt ctttggcaaa tctggagcag aaccgtggca 720

tggttcgtac aaaccaaatg cggtgttctt gtctggcaaa gaggccaagg acgcagatgg 780

caacaaaccc aaggaacctg ggataacgga ggcttcatcg gagatgatat caccaaacat 840

gttgctggtg attataatac catttaggtg ggttgggttc ttaactagga tcatggcggc 900

agaatcaatc aattgatgtt gaaccttcaa tgtagggaat tcgttcttga tggtttcctc 960

cacagttttt ctccataatc ttgaagaggc caaaacatta gctttatcca aggaccaaat 1020

aggcaatggt ggctcatgtt gtagggccat gaaagcggcc attcttgtga ttctttgcac 1080

ttctggaacg gtgtattgtt cactatccca agcgacacca tcaccatcgt cttcctttct 1140

cttaccaaag taaatacctc ccactaattc tctgacaaca acgaagtcag tacctttagc 1200

aaattgtggc ttgattggag ataagtctaa aagagagtcg gatgcaaagt tacatggtct 1260

taagttggcg tacaattgaa gttctttacg gatttttagt aaaccttgtt caggtctaac 1320

actaccggaa ccccatttag gaccacccac agcacctaac aaaacggcat caaccttctt 1380

ggaggcttcc agcgcctcat ctggaagtgg gacacctgta gcatcgatag cagcaccacc 1440

aattaaatga ttttcgaaat cgaacttgac attggaacga acatcagaaa tagctttaag 1500

aaccttaatg gcttcggctg tgatttcttg accaacgtgg tcacctggca aaacgacgat 1560

cttcttaggg gcagacatta gaatggtata tccttgaaat atatatatat atattgctga 1620

aatgtaaaag gtaagaaaag ttagaaagta agacgattgc taaccaccta ttggaaaaaa 1680

caataggtcc ttaaataata ttgtcaactt caagtattgt gatgcaagca tttagtcatg 1740

aacgcttctc tattctatat gaaaagccgg ttccgcggct ctcacctttc ctttttctcc 1800

caatttttca gttgaaaaag gtatatgcgt caggcgacct ctgaaattaa caaaaaattt 1860

ccagtcatcg aatttgattc tgtgcgatag cgcccctgtg tgttctcgtt atgttgagga 1920

aaaaaataat ggttgctaag agattcgaac tcttgcatct tacgatacct gagtattccc 1980

acagttaact gcggtcaaga tatttcttga atcaggcgcc ttagaccgct cggccaaaca 2040

accaattact tgttgagaaa tagagtataa ttatcctata aatataacgt ttttgaacac 2100

acatgaacaa ggaagtacag gacaattgat tttgaagaga atgtggattt tgatgtaatt 2160

gttgggattc catttttaat aaggcaataa tattaggtat gtagatatac tagaagttct 2220

cctcgaggta cc 2232

<210> 18

<211> 450

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gaattcatga gattcccttc gatctttacc gccgtgctgt tcgcagcatc ttccgccctg 60

gccgctccag tcaataccac gacagaggac gagaccgctc agatccccgc tgaggccgtc 120

atcggttact ctgatcttga gggagacttc gacgtggctg ttttgccatt ttccaactcg 180

actaataacg gacttctgtt catcaacacc actattgcct cgattgccgc gaaagaagag 240

ggcgtcagcc tcgagaagag agcgcaggaa cctgttaaag gtccggtttc taccaaaccg 300

ggttcttgcc caatcatcct gatccgttgc gcgctgctga acccgccgaa ccgttgcctg 360

aaagacaccg actgcccggg tatcaaaaag tgctgcgaag gctcttgcgg tatggcgtgc 420

ttcgttccgc agtaatgaag atctggatcc 450

<210> 19

<211> 474

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gaattcatga gattcccttc gatctttacc gccgtgctgt tcgcagcatc ttccgccctg 60

gccgctccag tcaataccac gacagaggac gagaccgctc agatccccgc tgaggccgtc 120

atcggttact ctgatcttga gggagacttc gacgtggctg ttttgccatt ttccaactcg 180

actaataacg gacttctgtt catcaacacc actattgcct cgattgccgc gaaagaagag 240

ggcgtcagcc tcgagaagag aatcacctac accgactgca ccgagtccgg acagaacctg 300

tgcctgtgcg agggctccaa cgtctgcggc cagggcaaca agtgcatcct gggcagagac 360

ggcgagaaga accagtgcgt caccggcgag ggaaccccaa agccacagtc ccacaacgac 420

ggcgacttcg aggagatccc agaggagtac ctgcagtaat gaagatctgg atcc 474

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

caacgcgtcg ctatcctcgg ttctgcattg 30

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

taggtaccta acgccgtatc gtgattaacg 30

<210> 22

<211> 2695

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

acgcgtcgct atcctcggtt ctgcattgag ccgccttata tgaactgtat cgaaacgtta 60

tttttttaat cgcagactta agcaggtaat tattccttgc ttcttgttac tggatatgta 120

tgtatgtata ataagtgatc ttatgtatga aattcttaaa aaaggacacc tgtaagcgtt 180

gatttctatg tatgaagtcc acatttgatg taatcataac aaagcctaaa aaataggtat 240

atcattttat aattatttgc tgtacaagta tatcaataaa cttatatatt acttgttttc 300

tagataagct tcgtaaccga cagtttctaa cttttgtgct ttgacaagaa cttcttcttc 360

ttgctttaat aaaaactgtt ccattttcgt tgtataactt gaatcataag cgccaagcag 420

tctgacagcc aacagcgcag cgttcgtact attattaata gcgacggtag ctactggaac 480

acctctaggc atttgcacaa ttgaatgtaa agaatctact ccatctagac aagaaccttt 540

tacgggcaca ccgatgacag gaagtggtgt cattgcagcc accatacctg gcaagtgagc 600

agccccacca gctccagcga taattgtttt aattccacgc ttgcttgcgg aaatagcata 660

tgctgacatc ctatgtggag ttctatgagc agagactatt gtcacttcaa atggaacgcc 720

aaaatctttt aaaaccgcac atgcggcaga cattaccggc aagtcagagt ctgatcccat 780

gatgattcca accaatggtt tgaccattgc ttccaagtcc aacttttgag cgacagagat 840

tttgattgga atatcagttc tacctgtaat gtagttcagc ctttgttcac attccgccat 900

actggaggca ataatattta tgtgacctac ttttctgtta ggtctagact cttttccata 960

taagtacact gaggaacctg gagtcgccaa tgctctttcg caagtttcta gctctttatc 1020

ttttgtatgt ttgtctccaa gaacatttag cataatggcg ttcgttgtaa tggtggagaa 1080

agatgtgaaa ttctttggca ttggcaaatc caatattgat ctcaaatgag cttcaaattg 1140

agaagtgacg caagcatcaa tggtataatg tccagagttg tgaggccttg gggcaatttc 1200

gttaataagc aattcccctg tttctaaata gaacatttcc acaccaaata taccacaacc 1260

gggaaaagat ttgattgcat tttctgccaa caacttcgcc ttaagttgaa cggagtccgg 1320

aactctagca ggcgcataac ataagtcaca aatattgtcc ttgtggatag tctctacaat 1380

tgggtaagaa aacactaaac cgttaacaga tctcacaatc atgactgcta attctttagt 1440

aaatggtgcc catttttcgg cgtacaaagg acgatccttc agtacttcca aagcttccgg 1500

aatcatttcc ttattcttta caacgaagtt acctcttcca tcgtatgcca aagtcctcga 1560

cttcaagacg aatggaaaac ccaaatctct tccaacattc aatagggacg tctcactggc 1620

ttgttccaca ggaacacttt gggtaactgc tataccattt ttgattaaat gctctttttg 1680

aatatatttg tcttgtatca atctgattgt ttctggagaa gggtaaattt ttaatttggg 1740

atgttttact tgaagattct ttagtgtagg aacatcaaca tgctcaatct caatcgttag 1800

cacatcacat ttttcagcta gtttttcgat atcaagagga ttggaaaagg agccattaac 1860

gtggtcattg gagttgctta tttgtttggc aggagaattt tcagcatcta gtattaccgt 1920

cttaatgttg agcctgtttg ctgcctcaac aatcatacgt cccaattgtc cccctcctaa 1980

tataccaact gttctagaat ccatacttga ttgttttgtc cgattttctt gtttttcttg 2040

attgttatag taggatgtac ttagaagaga gatccaacga ttttacgcac caatttatac 2100

atgaaatgct ccataatatt gtccatttag ttcttaataa aaggtcagca agagtcaatc 2160

acttagtatt acccggttcg tagccatgca acaagagtca tttgtcagca tagctgtaat 2220

aatcaatcat gacgtaagaa atgtatcata attaaaagtt gttaaagatg tcagtgttat 2280

gttggtgtta caaaattctc ggcttctcac taatatttaa tatctcttaa attttatctg 2340

tctttgattc ttttaagaaa agttatgtat tattcaagaa aaagtcaatt ccgcatcaaa 2400

aggtaaaatt tatataaact gctttaaaat ttcatgaaac taggcaactt ttcgaaatga 2460

tctttttcga gcatgaagtt tcttttataa taacctggtc aaaagctttc aatatataat 2520

acatttggta tttacggaaa tgagatgata tactggtagt gcgctagtca agttctaatt 2580

aaattaaaat gcaaaatagt aatgtcagat ggacacattg ggcgaaatag ctaacccata 2640

agcatgaatc ctgtaactta tgtaatacgt taatcacgat acggcgttag gtacc 2695

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gtcccgggcc tttgctcaat gccgttttgg 30

<210> 24

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gcggatccat cgatgaattc attgtttcta tattatc 37

<210> 25

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

atgaattcat cgatggatcc gcacggcctc atctac 36

<210> 26

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tgcgcgcgag ctcggaccac aatccaaata aag 33

<210> 27

<211> 1025

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

cccgggcctt tgctcaatgc cgttttggtg atatcgacca attgctggtt aacggtgtcg 60

ttgccgtact tgtaataata agtaccgcag ccaaaggcta atcttggaat gcccgaggag 120

gtggttggaa tgctcatttc gaatacagtc aacaatcaat tgagtttgta tttatagcca 180

attggtcatt aataatcagg cttcctgcat ggtttagagg ttggtctaga ctacatccgt 240

gcaccagaaa agaggcgggc cacggaggaa aaggtgacaa ctcgcaaagt tgcaacaact 300

gctatggctc cagcacggtg cgtggggtaa agacaatctc cgggaaccgg tcccgaaacc 360

gagaaagagg gttttaagcc tgtgtcctct gcggaggtgg tgtagcactt cttattgtcc 420

tttgggccgc tccggcggta gagcttccat ggaacaacct tgcacggaca ggcaagtccc 480

cgagacgcct tgttgggtga tgtccacttc tggctataca gagctttata tcaccttact 540

gaacgctaga gtagacccaa ttcccggctc acaccaccct tacatgcaga gctaaccaat 600

aaggtaatta attaacacta tatagctcgt ggtgaacact ggcccggagt agtcatacgt 660

gtaggttttt ggcgtgatga aaatcaggtg gcgcacgact tttcgtaaag ttcgggaggg 720

agtgctgcaa acggcatata aggaccagtt tttctcgcac attatcaatt gctctttagt 780

acaaagataa tatagaaaca atgaattcat cgatggatcc gcacggcctc atctacatat 840

ttacggctta actgattttt atagttaagg agaaaaaaag ttcaacatac gtcattatta 900

ttgtacgcgc tttcgtgttt caaacttggc tgccatgata aataaatcta ttgttgcttg 960

ctatgtaaaa attatttgat tacttcttcc atgcactttc tttatttgga ttgtggtccg 1020

cgcgc 1025

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cagaattcat gactgctctc aacag 25

<210> 29

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ctgttaatgg tgctgctgct ggatgatgca c 31

<210> 30

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gtgcatcatc cagcagcagc accattaaca g 31

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

caggatcctc aagacaaata gtcg 24

<210> 32

<211> 994

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

cagaattcat gactgctctc aacagctctg tccagcacca agaagtctct tcggacttgc 60

cttttggaac tctacctcca agaaagcgtg ccaagaccga agaggagaaa gagcaaagaa 120

gagttgaaag aatcttgaga aacagaaggg cagctcacgc gtctagagaa aagaagagaa 180

gacatgttga gtacctggaa aactatgtga ctgatctgga gtctgcgctg gcgacacatg 240

agggcaatta tcggaagatg gccaaaattc aatcgagcct gatatctctg ttgtctgaac 300

atggaatcga ttactcgtct gtggatttag ctgttgaacc atgtcctaaa gttgaaagac 360

cggaaggttt ggagttgact ggttcaattc cagtgaaaaa acagaaaatc gcctcggcga 420

aatcgcccaa atcgttatcg agaaaatcga agtcggaaat cccatcacca agttttgatg 480

agaatatttt ttctgaggag gaaaacgaac atgacgatgg tattgaggaa tacgggaaag 540

caggacaaga agcaaccgag gctccatcct tgtctcacaa ccgcaaaaga aaggcgcaag 600

atgcttatat ctcgcctccg ggctccacct ccccatccaa gttgaaactt gaagaagacg 660

aaaggatctc caaacatgaa tacagtaact tgtttgatga caccgatgac attttcccgt 720

cggagaagtc atcaagtctc gagctgtata aacaggatga tctgaccatg gcatcatttg 780

tgaaacaaga agaggaagaa atggtgccat ttgtgaaaca ggaagacgag ttcaagtttc 840

ctgattcggg tttcaacgct gacgattgtc atcttatcca agtggaagac ctctgctctt 900

ttaatagcgt gcatcatcca gcagcagcac cattaacagc agagagtatc gacaaccact 960

ttgaatttga cgactatttg tcttgaggat cctg 994

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

aacctcacag ttgccctga 19

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

cgatggtctg gacgagtaga a 21

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gaaatcgccc aaatcgttat c 21

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

tcggttgctt cttgtcctg 19

<210> 37

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

tcttgcccaa tcatcctga 19

<210> 38

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

aacgaagcac gccatacc 18

<210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

aggacgagac cgctcagat 19

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gaggcaatag tggtgttgat ga 22

Claims (6)

1.一种获得高表达外源基因的基因工程菌的方法，包括下述步骤：分别构建表达载体和功能载体，将表达载体和功能载体同时转入双营养缺陷型受体菌，筛选得到外源目的基因高表达的基因工程菌；

所述受体菌为腺嘌呤、亮氨酸双营养缺陷型汉逊酵母；所述表达载体以强启动子甲醇氧化酶启动子启动外源目的基因表达、以啤酒酵母亮氨酸基因补偿表达宿主亮氨酸营养缺陷；所述功能载体以组成型启动子甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子启动UPR关键基因HAC1p表达，以啤酒酵母腺嘌呤基因补偿表达宿主腺嘌呤营养缺陷；所述表达载体和功能载体中均含有受体菌菌株的自主复制序列片段；所述表达载体和功能载体通过一次电转化同时转入受体菌中，同时实现对腺嘌呤、亮氨酸双营养缺陷的补偿、以及功能基因和目的基因的表达；

所述外源目的基因来源于含MFa引导肽的Elafin全序列SEQ ID NO:18、或含MFa引导肽的Hirudin全序列SEQ ID NO:19。

2.权利要求1所述的方法获得的基因工程菌，以双营养缺陷型菌株作为表达宿主，表达宿主的转化子中同时整合有两种载体，其中一种载体含有外源目的基因、以及表达宿主的一种营养缺陷的补偿基因，另一种载体含有UPR关键基因HAC1p、以及表达宿主的另一种营养缺陷的补偿基因。

3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述UPR关键基因HAC1p来源于汉逊酵母ATCC34438，所述补偿基因来源于啤酒酵母S288c。

4.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述自主复制序列片段来源于汉逊酵母，为汉逊酵母自主复制序列片段。

5.用于构建权利要求2-4任一项所述的基因工程菌的载体，其特征在于，包含以下载体：

1）表达载体：含有外源目的基因、以及表达宿主的一种营养缺陷的补偿基因；所述外源目的基因来源于含MFa引导肽的Elafin全序列SEQ ID NO:18、或含MFa引导肽的Hirudin全序列SEQ ID NO:19；

2）功能载体：含有UPR关键基因HAC1p、以及表达宿主的另一种营养缺陷的补偿基因。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌的载体，其特征在于，所述表达载体以强启动子甲醇氧化酶启动子启动外源目的基因表达、以啤酒酵母亮氨酸基因补偿表达宿主亮氨酸营养缺陷；所述功能载体以组成型启动子甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子启动UPR关键基因HAC1p表达，以啤酒酵母腺嘌呤基因补偿表达宿主腺嘌呤营养缺陷。

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