CN116555062B - 基于乙醇代谢流调控提升酿酒酵母生产l-乳酸的方法 - Google Patents

基于乙醇代谢流调控提升酿酒酵母生产l-乳酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于乙醇代谢流调控提升酿酒酵母生产L‑乳酸的方法，属于微生物技术领域。本发明以耐酸酿酒酵母TJG16作为生产菌株，在发酵有机酸过程具有酿酒酵母的耐酸性，大幅度提升了L‑乳酸的产量。对酿酒酵母TJG16做了改进，引入了枯草芽孢杆菌来源的乙醇脱氢酶基因adhA促使乙醇转化成乙醛，及引入布鲁氏菌来源的乳酸醛缩酶基因BAL促使乙醛合成乳酸。并敲除乙醛脱氢酶基因ALD6阻止乙醛合成乙酸，敲除调控半乳糖的转录调节因子编码基因GAL80并整合乳酸脱氢酶LDH，最终实现L‑LA的提升，产量从最初的47.7g/L提升到50.5～192.3g/L。本发明提供的重组酿酒酵母进一步提升L‑乳酸的生产性能，有利于提高生产效率的同时降低生产成本。

Description

基于乙醇代谢流调控提升酿酒酵母生产L-乳酸的方法
技术领域
本发明涉及基于乙醇代谢流调控提升酿酒酵母生产L-乳酸的方法，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
L -乳酸(L-LA, CH3CHCOOH)是一种天然有机酸，广泛应用于食品、医药、化妆品、烟草和化工等行业。微生物发酵由于可以利用广泛的原料，生产成本低，提供高光学纯度的产量，并确保产品安全，已成为生产L-LA的主流方法。目前，酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae因其耐酸性和明确的遗传背景，已被广泛应用于多种有机酸的生物合成，如L -苹果酸、L-乳酸和粘康酸。将L-乳酸脱氢酶（L-lactate dehydrogenase, L-LDH）引入酿酒酵母中可以实现L-LA的生物合成。在此基础上，一些代谢调控策略被应用于酿酒酵母生产L-LA的细胞工厂的构建，包括增强关键酶L-LDH的表达，减弱副产物合成途径，加速细胞外运输。例如，利用整合表达策略，用来自瑞士乳杆菌Helveticus的LDH替代PDC1，构建了携带LDH和PDC1缺失的突变株，其L-乳酸滴度高达52.2 g/L。然而，酿酒酵母异源基因表达效率低，产量不高这个问题一直没有得到很大的突破。
近年来，多项研究聚焦于耐酸酿酒酵母菌株的选择和分离。例如，Jang等通过适应性实验室进化（Adaptive Laboratory Evolution, ALE）获得了一株耐酸（pH 4.2）的菌株（酿酒酵母BK01），该菌株使L- la滴度从102 g/L提高到119 g/L，提高了17% 。在我们之前的研究中，我们使用ALE分离了一个耐受低pH（pH 2.4）的酿酒酵母突变体突变体MTPfo-4（申请号为202010631510.4）。并进行了一系列代谢通路改造，获得重组菌株TJG16（记载于公开号为CN 114854612 A 的专利文献中），使L-LA产量达到47.7 g/L。在改造酿酒酵母生L-乳酸方面已实现L-乳酸的积累，产率的提高，同时副产物明显降低。但酿酒酵母自身具有生产乙醇的特性，产出乙醇的累积对于细胞的生长具有一定的影响。同时氧气的控制对于L-乳酸的生产也具有一定的影响，乳酸生产菌株还有待进一步的开发和改造以提升L-乳酸的生产。
发明内容
为解决上述酿酒酵母产乙醇影响L-乳酸产量、氧气量调控等问题，本发明提供一种利用Cre-loxp技术引入枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）来源的乙醇脱氢酶基因adhA促使乙醇转化成乙醛，及引入布鲁氏菌（Brucellasp.）来源的乳酸醛缩酶基因BAL促使乙醛合成乳酸。并敲除乙醛脱氢酶基因ALD6阻止乙醛合成乙酸，以进一步提高酿酒酵母菌中L-乳酸产量的方法（图1）。
本发明的第一个目的是提供一种重组酿酒酵母，所述重组酿酒酵母的基因组上整合一个或多个乙醇脱氢酶编码基因adhA和乳酸醛缩酶编码基因BAL。
在一种实施方式中，敲除乙醛脱氢酶编码基因ALD6后，在ALD6位点整合adhA基因和BAL基因。
在一种实施方式中，敲除ALD6基因后，在ALD6位点整合adhA基因和BAL基因，在1622b位点整合adhA基因。
在一种实施方式中，敲除ALD6基因后，在ALD6位点整合adhA基因和BAL基因，在1622b位点整合adhA基因，在1309a位点整合BAL基因。
在一种实施方式中，所述重组酿酒酵母还敲除调控半乳糖的转录调节因子GAL80基因。
在一种实施方式中，敲除GAL80基因后，在GAL80位点整合乳酸脱氢酶编码基因LDH。
在一种实施方式中，在ALD6基因位点，所述adhA和BAL基因是通过双向半乳糖诱导启动子GAL1,10起始表达。
在一种实施方式，在1622b位点，所述adhA基因通过TEF1启动子起始表达。
在一种实施方式，在1309a位点，所述BAL基因通过BLA启动子起始表达。
在一种实施方式中，以酿酒酵母TJG16为宿主细胞，所述酿酒酵母TJG16记载于公开号为CN114854612A的专利文献中。
在一种实施方式中，所述乙醇脱氢酶adhA来源于枯草芽孢杆菌，Gene ID为938739，所述基因adhA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在一种实施方式中，所述乳酸醛缩酶BAL来源于布鲁氏菌，蛋白ID为EC 4.1.2.36，所述基因BAL的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在一种实施方式中，所述乙醛脱氢酶编码基因ALD6的Gene ID为: 856044。
在一种实施方式中，所述调控半乳糖的转录调节因子编码基因GAL80的Gene ID为:854954。
在一种实施方式中，所述双向半乳糖诱导启动子GAL1,10的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
在一种实施方式中，乳酸脱氢酶编码基因LDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在一种实施方式中，所述1309a位点的上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述1622b位点的上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明的第二个目的是提供一种生产L-乳酸的方法，利用所述重组酿酒酵母发酵生产L-乳酸。
在一种实施方式中，将所述重组酿酒酵母接种于发酵体系中，在28~35 ℃，200~220 rpm下培养80~120 h。
在一种实施方式中，将所述重组酿酒酵母培养至OD600=6±0.5，按照体积比8%~10%的量接种至15 L YPD培养基中，在28~35 ℃，200~220 rpm下培养，培养至体系中葡萄糖含量低于5 g/L时，补加葡萄糖维持体系中葡萄糖的含量20~25 g/L。
在一种实施方式中，在发酵前24 h通氧发酵，之后在葡萄糖接近耗尽时关闭氧气，厌氧发酵。
在一种实施方式中，在补加葡萄糖的同时补加CaCO3，维持发酵液的pH在4.5-5之间。
本发明的第三个目的是提供所述的重组酿酒酵母在制备L-乳酸、L-乳酸衍生物、含有L-乳酸的产品及含有L-乳酸衍生物的产品中的应用。
本发明的有益效果：
本发明以耐酸酿酒酵母TJG16作为生产菌株，在发酵有机酸过程具有酿酒酵母的耐酸性，大幅度提升了L-乳酸的产量。对酿酒酵母TJG16做了改进，具体为引入枯草芽孢杆菌来源的乙醇脱氢酶基因adhA促使乙醇转化成乙醛，及引入布鲁氏菌来源的乳酸醛缩酶基因BAL促使乙醛合成乳酸。并敲除乙醛脱氢酶基因ALD6阻止乙醛合成乙酸，敲除调控半乳糖的转录调节因子编码基因GAL80并整合乳酸脱氢酶LDH，最终实现L-LA产量的显著提升，产量从最初的47.7 g/L提升到50.5~192.3 g/L。
附图说明
图1为乙醇到乳酸代谢调控；
图2为L-LA标品高效液相图；
图3为酿酒酵母菌株TJG20发酵L-LA高效液相结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
（一）培养基
LEU-平板：在无氨基酸酵母氮源（YNB）培养基基础上，添加葡萄糖搭配组氨酸（HIS）、尿嘧啶和色氨酸。用于筛选带有LEU标签的基因改造菌。
HIS-平板：在无氨基酸酵母氮源（YNB）培养基基础上，添加葡萄糖搭配亮氨酸(LEU)、尿嘧啶和色氨酸，用于筛选带有HIS标签的基因改造菌。
YPD液体培养基：蛋白胨 20 g/L，酵母粉 10 g/L，葡萄糖 20 g/L。
（二）酿酒酵母的感受态制备：
（1）从YPD平板上挑取一个新鲜的重组酿酒酵母单克隆至10 ml YPD液体培养基，30℃，250 rpm培养过夜。
（2）测定过夜培养物的OD600值为3.0~5.0之间。
（3）将10 ml YPD过夜培养物稀释至OD600值为0.2~0.4。
（4）在28~30℃摇床中继续培养3~6 hr，使其OD600值达到0.6~1.0。
（5）于室温1500 g离心5 min收集酵母细胞，弃上清。
（6）用10 ml洗液洗酵母细胞，随后于室温1500 g离心5 min离心收集细胞，弃上清。
（7）用1 ml TE/LiAc重悬酵母细胞，以每管50 μl分装。
（三）酿酒酵母的转化：
（1）取50 μl感受态细胞，再加入待转质粒各2 μl，混匀。
（2）加入500 μl转化用溶液（PEG/LiAc，二甲亚砜），弹击管壁混匀。
（3）30℃水浴1 h，隔15 min弹击管壁混匀。
（4）加入1毫升YPD培养液，30℃摇床培养1小时。
（5）3500 g离心5 min，留沉淀，弃上清。
（6）沉淀用150 μl TE重悬，涂相应的SD平板；将平板倒置于30℃培养。
（四）L-乳酸的检测：
通过高效液相色谱对酿酒酵母中的L-LA进行检测，将发酵112 h的酿酒酵母菌液，取1ml加入0.5mm的玻璃珠，使用高速匀浆破碎仪破碎20 min，取出破碎后的混合液离心取上清，稀释10倍后通过0.55 μm水相膜过滤，进行高效液相色谱分析。流动相使用0.5 mM稀硫酸，流速0.6 mL/min。检测器使用紫外检测器，检测波长为210 nm，检测温度50 ℃。L-LA标准品的高效液相图如图2所示。
（五）本申请中使用的菌株酿酒酵母TJG16公开于公开号为CN114854612A的专利文献中。
实施例中所使用的引物如表1所示：
表1
实施例1：重组酿酒酵母菌TJG17的构建
将枯草芽孢杆菌来源的adhA基因（核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示）和布鲁氏菌来源的BAL基因（核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示）整合在酿酒酵母TJG16的ALD6位点，以实现adhA和BAL的过表达。
将酿酒酵母TJG16菌株制成酵母感受态细胞；
以酿酒酵母S288C基因组为模板，分别利用引物ALD6-U-F/R、LEU-A-F/R、TDH3-A-F/R、
ADHA-A-F/R、GAL-A-F/R、BAL-A-F/R、CYC1-A-F/R、ALD6-D-F/R（表1），扩增得到8个重组片段：ALD6-U、标签LEU、终止子TDH3、adhA、GAL1,10、BAL、终止子CYC1和ALD6-D。将得到的8个重组片段共转化至酿酒酵母TJG16感受态细胞中，涂布在LEU-平板上，在30℃下培养2~3 d至长出单菌落。利用引物A-Y-F/R、A-Y1-F/R、以及A-Y2-F/R进行验证，验证正确的菌株即为双表达adhA和BAL两个基因的阳性转化子，并命名为菌株TJG17。
实施例2：重组酿酒酵母菌TJG18~ TJG20的构建
（a）重组酿酒酵母菌TJG18的构建
将枯草芽孢杆菌来源的adhA基因（核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示）整合在酿酒酵母TJG17的1622b位点，以实现adhA基因的多拷贝表达，促进乙醇合成乙醛。
将实施例1构建的TJG17菌株制成酵母感受态细胞；
以酿酒酵母工程菌S288C基因组为模板，采用引物1622b-U-F、1622b-U-R扩增得到基因片段1622b-U。采用引物LEU-A1-F、LEU-A1-R扩增得到标签基因片段LEU，采用TEF1-A-F、TEF1-A-R引物扩增得到TEF1启动子。采用ADHA-F、ADHA-R引物扩增得到adhA。采用引物CYC1-A1-F、CYC1-A1-R扩增基因片段得到终止子CYC1。采用引物1622b-D-F、1622b-D-R扩增得到基因片段1622b-D。将基因片段1622b-U、LEU、TEF1、adhA、CYC1、1622b-D通过化学转化方式共同转入酿酒酵母感受态细胞TJG17中，涂布在LEU-平板上，在30℃下培养2~3 d至长出单菌落。使用引物Y1-1622-U/D、Y2-1622-U/D进行菌落PCR验证，并把验证正确的菌株命名为TJG18。
（b）重组酿酒酵母菌TJG19的构建
将布鲁氏菌来源的BAL基因（核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示）整合在酿酒酵母TJG18的1309a位点，以实现BAL基因的多拷贝表达，促进乙醛合成乳酸。
将步骤（a）构建的TJG18菌株制成酵母感受态细胞；
以酿酒酵母工程菌S288C基因组为模板，采用引物1309-U-F、1309-U-R扩增得到基因片段1309a-U。采用引物HIS-B-F、HIS-B-R扩增得到标签基因片段HIS，采用BLA-B-F、BLA-B-R引物扩增得到BLA启动子。采用BAL-F、BAL-R引物扩增得到BAL。采用引物TDH3-B-F、TDH3-B-R扩增基因片段得到终止子TDH3。采用引物1309-D-F、1309-D-R扩增得到基因片段1309-D。将基因片段1309a-U、HIS、BLA、BAL、TDH3、1309-D通过化学转化方式共同转入酿酒酵母感受态细胞TJG18中，涂布在HIS-平板上，在30℃下培养2~3 d至长出单菌落。使用引物Y1-BAL-F/R、Y2-BAL-F/R进行菌落PCR验证，最终得到菌株TJG19。
（c）重组酿酒酵母菌TJG20的构建
将乳酸脱氢酶LDH，整合至酿酒酵母TJG19的GAL80处，实现GAL80的敲除，不需要添加半乳糖启动L-乳酸的合成途径。
按照（b）相似步骤，以酿酒酵母工程菌S288C基因组为模板，采用引物GAL80-U-F、GAL80-U-R扩增得到基因片段GAL80-U，采用引物GAL80-D-F、GAL80-D-R扩增得到基因片段GAL80-D，采用引物G-HIS-F、G-HIS-R扩增得到标签基因片段HIS，采用引物G-LLDH-F、G-LLDH-R扩增得到基因片段LLDH（TEF1启动子+乳酸脱氢酶LDH+终止子CYC1），将基因片段GAL80-U、LLDH和HIS通过化学转化方式共同转入酿酒酵母感受态细胞TJG19中，涂布在HIS-平板上，在30℃下培养2~3 d至长出单菌落。并用引物Y1-G80-FR、Y2-G80-F/R进行菌落PCR验证，最终得到菌株TJG20。
实施例3：重组酿酒酵母发酵生产L-乳酸
在2 mL YPD液体培养基中分别接入从固体YPD平板上挑取的实施例1和2构建得到的酿酒酵母菌TJG17~ TJG20单菌落，在30℃，220 rpm培养18~24 h后，发酵菌株OD600值达到6左右后按10%体积比接入含有15 L YPD液体培养基的30 L发酵罐内，在30℃，220 rpm培养，在发酵前24 h通氧发酵，之后在葡萄糖接近耗尽时关闭氧气，厌氧发酵。发酵至葡萄糖<5 g/L时，加入葡萄糖进行碳源的补充，保持葡萄糖含量在20~25 g/L。在补加葡萄糖的同时补加CaCO3，维持发酵液的pH在4.5-5之间。
总共发酵112 h，发酵结束后，离心取沉淀，除去上清，使用10 mL无菌水重悬，加入0.5 mm的玻璃珠，使用高速匀浆破碎仪破碎20 min，取出破碎后的混合液，0.55 μm过滤后进行高效液相色谱分析。流动相使用稀硫酸，检测器使用紫外检测器，检测波长为210 nm，检测温度50 ℃。
经过液相分析，在TJG16基础上，构建成功的高产乳酸菌株TJG17~TJG20的L-LA产量分别为50.5 g/L，72.7 g/L，119.0 g/L，192.3 g/L（图3）。
将菌株TJG16按照上述方法发酵生产L-乳酸，经检测，L-乳酸的产量为47.7 g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (6)

1.一种重组酿酒酵母，其特征在于，以酿酒酵母TJG16为宿主细胞，敲除乙醛脱氢酶ALD6基因后，在ALD6位点整合adhA基因和BAL基因；
或，敲除ALD6基因后，在ALD6位点整合adhA基因和BAL基因，在1622b位点整合adhA基因；
或，敲除ALD6基因后，在ALD6位点整合adhA基因和BAL基因，在1622b位点整合adhA基因，在1309a位点整合BAL基因；
所述adhA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述BAL基因的核酸序列如SEQ IDNO.2所示；所述ALD6基因的Gene ID为: 856044。
2.根据权利要求1所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述重组酿酒酵母还敲除调控半乳糖的转录调节因子GAL80基因，所述GAL80基因的Gene ID为:854954。
3.根据权利要求2所述的重组酿酒酵母，其特征在于，敲除GAL80基因后，在GAL80位点整合乳酸脱氢酶编码基因LDH，所述乳酸脱氢酶编码基因LDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.一种生产L-乳酸的方法，其特征在于，利用权利要求1~3任一所述重组酿酒酵母发酵生产L-乳酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将权利要求1~3任一所述重组酿酒酵母接种于发酵体系中，培养至OD600=6±0.5，按照体积比8%~10%的量接种至YPD培养基中，在28~35 ℃，200~220 rpm下培养，培养至体系中葡萄糖含量低于5 g/L时，补加葡萄糖维持体系中葡萄糖的含量20~25 g/L。
6.权利要求1~3任一所述重组酿酒酵母在制备L-乳酸或含有L-乳酸的产品中的应用。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1902319A (zh) * 2003-11-20 2007-01-24 泰特&莱尔组分美国公司 产乳酸酵母
WO2014180820A2 (en) * 2013-05-08 2014-11-13 Dsm Ip Assets B.V. Gpd- yeast strains with improved osmotolerance
CN105087407A (zh) * 2015-08-20 2015-11-25 天津大学 一种酿酒酵母工程菌株及其制备方法、应用、发酵培养方法
WO2018172328A1 (en) * 2017-03-21 2018-09-27 Dsm Ip Assets B.V. Improved glycerol free ethanol production

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1902319A (zh) * 2003-11-20 2007-01-24 泰特&莱尔组分美国公司 产乳酸酵母
WO2014180820A2 (en) * 2013-05-08 2014-11-13 Dsm Ip Assets B.V. Gpd- yeast strains with improved osmotolerance
CN105087407A (zh) * 2015-08-20 2015-11-25 天津大学 一种酿酒酵母工程菌株及其制备方法、应用、发酵培养方法
WO2018172328A1 (en) * 2017-03-21 2018-09-27 Dsm Ip Assets B.V. Improved glycerol free ethanol production

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Genome-wide responses to carbonyl electrophiles in Bacillus subtilis: control of the thiol-dependent formaldehyde dehydrogenase AdhA and cysteine proteinase YraA by the MerR-family regulator YraB (AdhR);Nguyen Thi Thu Huyen et al;Molecular Microbiology;第71卷(第4期);第876-894 *
代谢工程改造酿酒酵母生产L-乳酸的研究进展;梁欣泉;李宁;任勤;刘继栋;;中国生物工程杂志(02);第109-114页 *
高效表达L-乳酸的酿酒酵母工程菌构建研究;吴晓燕;张光一;;食品研究与开发(07);第164-168页 *

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