CN107709351A

CN107709351A - 细胞毒性t细胞表位肽及其用途

Info

Publication number: CN107709351A
Application number: CN201580080723.XA
Authority: CN
Inventors: 李栋梁; 大鹰弘纪; 中野绘; 中野一绘; 田路真悟
Original assignee: Medical and Biological Laboratories Co Ltd
Current assignee: Medical and Biological Laboratories Co Ltd
Priority date: 2015-06-17
Filing date: 2015-06-17
Publication date: 2018-02-16
Also published as: JPWO2016203577A1; TW201708248A; WO2016203577A1

Abstract

本发明提供对于EB病毒(Epstein‑Barr virus，以后记载为EBV)有特异性的细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte，以后称为CTL)表位肽、使用该肽的治疗或预防EBV的感染及该病毒阳性的癌的疫苗、针对EBV的被动免疫疗法剂、及EBV特异性的CTL的定量方法。另外，本发明提供一种来自细胞骨架相关蛋白(cytoskeleton‑associated protein 4：以下称为CKAP4，别名：CLIMP‑63、ERGIC‑63、P63)且由IYTEVRELV的序列(序列编号：43)构成的HLA‑A*24：02限制性表位肽。该肽特异性的细胞毒性T细胞(以下记为CTL)能够攻击高度表达CKAP4的恶性肿瘤细胞。

Description

细胞毒性T细胞表位肽及其用途

技术领域

本发明涉及对于EB病毒(Epstein-Barr virus，以下记载为EBV)有特异性的细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte，以下称为CTL)表位肽、使用了该肽的治疗或预防EBV的感染及该病毒阳性的癌的疫苗、针对EBV的被动免疫疗法剂、及对于EBV有特异性的CTL的定量方法。此外，本发明还涉及能诱导出以癌细胞为靶的CTL的肽。另外，本发明还涉及含有前述肽的癌疫苗及抗癌剂。本发明还涉及前述肽的用于诱导以癌细胞为靶的CTL的用途、获得的CTL及含前述CTL的抗癌剂。

背景技术

1964年，艾司坦(Epstein)与巴尔(Barr)从来自勃奇氏淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)组织的培养细胞中发现了新的疱疹病毒，并命名为EB病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)(非专利文献1)。EBV被分类为8种人疱疹病毒(HHV)之一的HHV-4，是于全世界广泛潜伏感染的病毒(非专利文献2)。通常儿童期曾经由唾液而感染口腔、咽粘膜，于口腔、咽粘膜上皮细胞产生的病毒会进而感染从上皮间质通过的B细胞而扩散到全身。主要通过由细胞毒性T细胞(CTL)进行的免疫监视机制对感染B细胞给予伤害而将其杀伤排除，但有一部分会成为不产生病毒的潜伏感染状态。

1970年从鼻咽癌的组织中发现了来自EBV病毒的DNA片段，自此开始，EBV是感染人的病毒的中最先被称为肿瘤病毒(非专利文献3、4)者。除EBV以外，作为肿瘤病毒的代表例，可列举成为肝癌原因的丙型肝炎病毒(HCV)、成为子***的原因的人***瘤病毒(HPV)、成为成人T细胞白血病的原因的人T细胞白血病病毒(HTLV-1)等。

EBV主要感染作为人淋巴细胞成分之一的B细胞，但是，除了B细胞以外也会感染上皮细胞、T细胞、NK细胞等，据认为其多样化细胞向性和多种肿瘤的发生相关。例如，EBV感染据认为是原因的癌，可列举勃奇氏淋巴瘤(BL)、何杰金氏淋巴瘤(HL)、NK/T细胞淋巴瘤、鼻咽癌(NPC)、胃癌(MK)等恶性肿瘤。另外，EBV和多种免疫缺陷疾病也密切相关，例如已知淋巴细胞增殖性疾病(LPD)、传染性单核细胞增多症(IM)、移植后淋巴细胞增殖性疾病(PTLD)等(非专利文献4)。

最近的研究已逐渐明了EBV也和自体免疫疾病有关。据报告多发性硬化症(MS)、全身性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、干燥综合征(Sjogren’s Syndrome，(SS))等患者的EBV的病毒量的值增高。另外，来自EBV的小分子RNA(EBV encoded small RNA，EBER)及一些蛋白据认为和自体免疫疾病的发病及进展密切相关，已寻求了解其机制(非专利文献5、6、7)。

如上，据认为EBV和癌及免疫缺陷疾病密切相关，故以EBV为靶的免疫细胞疗法的临床研究在近十数年已大有进展，成果辉煌。例如，针对EBV相关的淋巴细胞增殖性疾病(LPD)、移植后淋巴细胞增殖性疾病(PTLD)，已实施将能排除作为原因的病毒感染细胞的免疫活性细胞(immunocompetent cell)输注到患者体内的所谓免疫细胞疗法，并已证实其治疗效果(非专利文献8、9、10)。另外，针对何杰金氏淋巴瘤、鼻咽癌等EBV相关恶性肿瘤，也有人报告免疫细胞疗法的有效性(非专利文献11、12、13、14、15)。

由于这些有效的临床研究，免疫细胞疗法作为新的癌治疗战略受到重大关注。据认为免疫细胞疗法对于以往的外科处置、放射线疗法、化学疗法难以治疗的恶性肿瘤、免疫缺陷疾病可成为有力的治疗法。

免疫细胞疗法为利用使患者具备的免疫力活化而特异性地攻击、排除成为靶的癌细胞或病毒感染细胞的治疗方法，具有以往的治疗方法所无的特征。发挥对这些成为靶的细胞进行特异性攻击的关键作用的是细胞毒性T细胞(CTL)。在CTL识别癌细胞或病毒感染细胞等靶细胞时，在CTL细胞膜表面上表达的T细胞受体(TCR)担任重要作用。TCR并不是直接识别癌抗原分子、病毒粒子本身，而是通过和在靶细胞的膜表面上表达的HLA(人白细胞型抗原)与为肿瘤细胞时的来自癌抗原者、或为病毒感染细胞时的来自病毒的由8～10个氨基酸构成的肽(表位肽)的复合体结合，CTL识别靶细胞并发挥杀伤效果。HLA大致分为第I型与第II型，HLA第I型与肽的复合体会由被CD8阳性T细胞表达的TCR识别，HLA第II型与肽的复合体会被在CD4阳性T细胞表达的TCR识别而引起免疫应答。HLA第I型进一步分为被称为HLA-A、B、C的古典分类，及被称为HLA-E、F、G的非古典分类。移植医疗中，就捐赠者与接受者间的HLA相容性而言，HLA-A、B与分类为HLA第II型的HLA-DRB的6座相容性是重要的，尤其在非血缘者间的移植，据认为是排斥的风险因子。现在根据IMGT的HLA数据库(http：//www.imgt.org/)，登记的HLA-A已有2,041种、HLA-B有2688种、HLA-C有1,677种蛋白。但是已知人种之间有集中性，例如日本人约60％的人保有HLA-A24，HLA-A2在白人中为50％以上，日本人也有约20％保有。发明人等鉴定的来自EBV的LMP2及EBNA1特异性的CTL表位肽会特异性地与HLA-A11结合，并由对其进行识别的CTL将EBV感染细胞予以杀伤排除。HLA-A11的保有率在日本人中为约10％，在东南亚则作为保有率第3位的等位基因而呈现广泛的人口分布。东南亚中，HLA-A24、HLA-A2及HLA-A11的等位基因频率分别为32.1％、24.5％、23.7％(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gv/mhc/ihwg.cgi)。

至今为止报告的大多数免疫细胞疗法中，世界性地以HLA-A2为对象的临床试验最多，在日本国内，以HLA-A24作为对象者的情形很多。在亚洲地区，预测由于平均寿命延长，癌患者会进一步增加，免疫细胞疗法寻求增加至今为止成为治疗对象的HLA型。迄今报告的HLA-A11限制性CTL表位数相较于HLA-A2、HLA-A24极少，几乎没有以保有HLA-A11的患者为对象者的临床试验的报告例，故可想见本发明的表现出HLA-A11限制性的EBV LMP2及EBVEBNA1特异性CTL表位的鉴定意义重大。

EBV相关恶性肿瘤中，值得特别注意的是鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma，以下记载为NPC)。NPC在包括中国南部、香港地区、新加坡、越南、马来西亚、菲律宾等的东南亚有高发病率。另外，在北非等地区也有比较高的发病率。2012年，全世界有86,691人诊断新罹患NPC，死亡数也达50,828人(GLOBOCAN2012)。另外，据报告放射线治疗后，1、3、5、10年生存率分别为89.86％、60.60％、47％、33.03％(非专利文献18)。有一份有趣的报告，是关于NPC的发病风险之一的HLA型(非专利文献17)。例如，以统计学分析NPC患者的HLA-A型频率，结果据报告：显示较高频率的HLA-A型的频率为，A11保持者为50％、A2保持者为50％、A24保持者为30％、B40保持者为32％(非专利文献15)。或根据另一研究团队的调査结果报告：A11保持者为58％、A2保持者为53％、A24保持者为30％、B40保持者为43％(非专利文献16)。最近使用新一代测序技术全面研究HLA的氨基酸序列的变化情况与SNPs的结果，据报告HLA-A11是和NPC的发病有密切相关的HLA型(非专利文献19)。如此，NPC中，HLA-A11保持者的发病率高，本发明的能提供使用了显示HLA-A11限制性的EBVLMP2及EBV EBNA1特异性CTL表位的治疗法的意义深远。

NPC为难治性恶性肿瘤，因此继外科处置、化学疗法、放射线疗法之后，对作为第4治疗法的利用在离体(in vitro)活化的EBV特异性CTL的免疫细胞治疗的关注非常多，已有大量临床试验报告其有效性。但是，在这些临床试验中使用的CTL表位肽主要是HLA-A2、HLA-A24限制性肽，几乎没有HLA-A11限制性CTL表位肽的临床试验报告例。其理由可列举，HLA-A11限制性CTL表位肽的鉴定在全世界几乎还没有尝试，以及鉴定在NPC表达的来自EBNA1的CTL表位非常困难等。

本发明中使用后述的鉴定手法，对在EBV相关恶性肿瘤、尤其在NPC患者中保有率最高的HLA-A11显示限制性的CTL表位肽的鉴定进行了努力研究。

EBV带有编码约85个基因产物的约170kbp的双链DNA，在NPC的癌患部据报告有来自EBV的蛋白LMP1、LMP2、EBNA1的表达。LMP1仅能在部分患者中检测到，而LMP2与EBNA1则是在NPC中稳态地表达(非专利文献20、21)，此2种蛋白是用以鉴定细胞毒性T细胞表位肽的有吸引力的靶。但是，迄今的报告中，CTL的免疫应答优先指向LMP2，据信EBNA1不会被CTL识别(非专利文献22、23、24、25)。其理由已解明为：EBNA1由全长641个氨基酸构成，但是其中心区域(第101号至第324号氨基酸)存在由约200个氨基酸构成的甘氨酸-丙氨酸重复序列(GAr)，其会妨碍由产生MHC第I型表位的主要的催化机制即蛋白酶体进行的处理(非专利文献26、27、28)。此外，已解明，该中心区域会妨碍EBNA1mRNA的转译，已有人报告EBNA1蛋白的表达本身低(非专利文献29、30)。

另一方面，LMP2的CTL表位已有很多研究团队报告。已有人对于由全长497个氨基酸(来自B95.8株)构成的LMP2蛋白制作重叠(overlapping)肽文库，并探索以HLA-A2、HLA-A24、HLA-A11等为靶的CTL表位，鉴定出了许多HLA-A2、HLA-A24限制性肽，但是HLA-A11限制性肽到目前为止，只鉴定出1个(非专利文献15)。EBV是在全世界的90％以上成人潜伏感染的病毒，但尽管如此，NPC的罹患率存在强地域性。例如根据免疫学调査，已知在东南亚、北非、阿拉斯加等地区，NPC的发生率高达其它地区的100倍左右(Rickinson，A.B.，andE.Kieff.1996.Epstein-Barr virus，p.2397-2446.In B.N.Fields，D.M.Knipe，andP.M.Howley(ed.)，Fields virology，3rd ed.,vol.2.Lippincott-Raven，Philadelphia，Pa)。发生此强地域性的原因可列举环境、遗传、生活习惯等因素，但据认为原因还有因EBV株的差异、致癌性蛋白的表达量差异、氨基酸的突变所致的免疫应答差异，而感染株差异据认为也是和NPC的发病相关的另一重要因子。待注意的是，NPC的罹患率非常高的地区之一为中国的广东省，在此广泛传播的一种EBV株为GD1(Zeng MS，Li DJ，Liu QL，Song LB，LiMZ，Zhang RH，Yu XJ，Wang HM，Ernberg I，Zeng YX.Genomic sequence analysis ofEpstein-Barr virus strain GD1 from a nasopharyngeal carcinoma patient.JVirol.2005 Dec；79(24)：15323-30)。在此，EBV株间、例如B95.8株与GD1株间，有时相当于特异性CTL表位肽的序列会有不同，由此可能影响CTL诱导能力、MHC-四聚物试剂的检测能力。这意味着，通过将混合2种以上的肽而诱导出的CTL用于治疗，能够制备不依赖感染者的株种的治疗用CTL。

另一方面，担任细胞性免疫的CTL以往已知会特异性地识别各种病毒、病原菌感染细胞并进行攻击、排除。其原因为，感染细胞经由主要组织相容性抗原复合体(majorhistocompatibility complex，以下称为MHC，于人称为HLA)而呈递来自病毒、病原菌的抗原肽，其被T细胞识别而引起免疫应答。具体而言，MHC有第I型及第II型，MHC第I型(以下记为MHC-I)在所有有核细胞的细胞膜表面表达，主要将来自病毒蛋白的非自体肽呈递给CTL并使其活化。另一方面，MHC第II型(以下称为MHC-II)表达在树突状细胞等抗原呈递细胞的细胞膜表面，将非自体肽呈递给CD4⁺T细胞并诱导细胞因子的分泌、抗体的产生。即，防御生物体受感染的机制有MHC-I-CTL与MHC-II-CD4⁺T细胞这两种路径。

1991年有人报告在恶性黑色瘤特异性地表达的来自MAGE抗原的肽会被CTL识别(非专利文献31)。这是MHC-I将来自癌细胞的自体抗原肽呈递给CTL且诱导特异性细胞毒性的首次示例。即，CTL也会对自体抗原反应，显示有可能通过利用该作用来治疗癌。之后，癌中特异性地表达的蛋白(以下称癌抗原)与来自此蛋白的肽片段的鉴定积极进行。与这些发现的同时，癌免疫疗法也在积极开展。癌免疫疗法是指使杀伤、排除癌细胞的CTL等免疫活性细胞在生物体内外增殖并治疗癌的方法。癌免疫疗法据认为有几种方法。

1.将患者的癌组织用液态氮等进行粉碎处理，并将其和免疫赋活剂一起接种到患者的自体癌免疫疗法

2.将患者的癌组织用液态氮等进行粉碎处理，将其和从患者外周血分离培养的树突状细胞进行共培养后，接种到患者的自体癌树突状细胞疗法3.将患者的癌组织用液态氮等进行粉碎处理，将其和从患者外周血分离培养的淋巴细胞进行混合培养，再回到患者体内的自体癌致敏淋巴细胞移入疗法

1～3并不一定会引起癌抗原特异性的免疫应答，为非特异性的癌免疫疗法。另外，还有需要从癌患者切除癌患部等外科性处置的缺点。

4.将癌抗原特异性CTL表位肽与免疫赋活剂接种到患者的癌肽疫苗疗法

5.将癌抗原特异性CTL表位肽向从患者外周血分离培养的树突状细胞脉冲后，接种到患者的肽刺激(或“脉冲”，pulse)树突状细胞疗法

6.使用癌抗原特异性CTL表位肽对从患者外周血分离培养的淋巴细胞进行刺激培养，诱导特异性CTL，使其回到患者体内的CTL移入疗法

7. 4与6的组合疗法。将癌抗原特异性CTL表位肽与免疫赋活剂向患者接种。通过对该从患者外周血分离的淋巴细胞用癌抗原特异性CTL表位肽进行刺激培养，诱导特异性CTL，使其回到患者体内的方法。

8.从癌抗原特异性CTL提取T细胞受体(TCR)基因，通过将其向从患者外周血分离培养的淋巴细胞进行基因导入以制作人工CTL，使其回到患者体内的人工CTL移入疗法。

4～8皆引起、利用癌抗原特异性的免疫应答，是特异性的癌免疫疗法。但为了实施这些方法，鉴定癌抗原特异性CTL表位，并证明识别其的CTL存在是第一要件。

如上所述，已开发出引起、利用癌抗原特异性的免疫应答的各种癌免疫疗法，但它们的治疗效果不一定高，在许多临床试验的第II期、第III期失败。从这些失败考虑在实施癌免疫疗法时有以下注意点。

(1)适当的CTL监测

癌免疫疗法是期待在生物体内识别癌并进行攻击的CTL扩增而进行的治疗法，因此效果成分即CTL的监测很重要。作为CTL的监测法，有细胞内细胞因子染色法、细胞毒性的测定等，这些方法是间接检测CTL的方法。例如：细胞内细胞因子染色法是测定对应于肽刺激的IFNγ(interferon gamma，干扰素γ)、TNFα(tumor necrosis factor-alpha，肿瘤坏死因子α)的产生的方法，有可能也会检测到抗原肽特异性免疫应答以外的反应。另一方面，作为更适当的方法，有使用MHC-四聚物试剂的方法。MHC-四聚物试剂是在试管内制造MHC与β2-微球蛋白(以下称为β2m)及肽片段的3者复合体(MHC-单体)并将MHC-单体予以4聚化而得的试剂。

以下说明此试剂适合CTL的监测的理由。构成MHC-单体的MHC是富有多样性的分子，依据IMGT的HLA数据库(http：//hla.alleles.org/nomenclature/stats.html)，已登记HLA-A有2077种、HLA-B有2741种、HLA-C有1739种蛋白(截至2014年10月)。另外，根据各MHC的等位基因型不同，结合的肽片段(8～12个氨基酸残基长)的特征亦不同。即，MHC/肽复合体的组合仅就MHC的等位基因型与肽片段的种类即已存在庞大数量。另一方面，CTL通过TCR识别MHC-I所呈递的肽。各个TCR由TCR基因的再编组而生成，每1个体的TCR的备用(repertoire)数据说达到10¹⁸种以上。即，靶细胞的MHC/肽复合体、及CTL侧的TCR皆具有庞大的多样性。且各个CTL，一般而言在细胞膜表面上表达一种TCR，且只识别对其特异的MHC/肽复合体而活化。MHC-四聚物试剂是利用此机制的试剂。也就是说，MHC-四聚物试剂是模仿靶细胞膜上的MHC/肽复合体的结构的试剂，由此能够选择性地只检测出带有特异性TCR的CTL。据此，MHC-四聚物试剂据认为是CTL监测中理想的试剂。另外，将MHC-单体予以4聚体化的原因是因为，增强和CTL所表达的TCR间的结合力，且能够使用流式细胞仪等设备检测。

(2)癌细胞的抗原呈递分子(HLA及β2m)的突变

癌细胞的HLA与β2m的突变已知是癌细胞的免疫逃避机制。若发生此现象，则癌细胞不会呈递抗原肽，CTL无法识别癌细胞且无法攻击。HLA的突变已知有同一基因位点的单侧缺损的LOH型突变(loss of heterozygosity，杂合性缺失)。另外，β2m的突变已知有读框偏移(frame shift)突变等。有人尝试通过针对β2m的突变，将β2m基因利用腺病毒载体进行基因导入，以补强β2m的表达，使癌细胞呈递抗原肽。

(3)癌细胞的目标抗原的表达

癌抗原有各种种类，表达哪种癌抗原因癌种类、个人而异。所以，在进行癌免疫疗法时，确认患者的癌抗原的表达非常重要。例如，来自肽疫苗的癌抗原在患者的癌患部完全不表达时，无法以癌细胞为目标，无法期待癌肽疫苗疗法的治疗效果。近年来，在一些癌肽疫苗疗法的临床试验中，已利用使用癌抗原特异性抗体的组织染色等，确认了患者的癌细胞表达来自肽疫苗的抗原。另一方面，为恶性神经胶质母细胞瘤等的情况下，不易取得癌细胞样品，故不易确认癌抗原在癌患部的表达。

(4)免疫抑制分子的作用

CTL若特异性地识别靶细胞所呈递的抗原肽则活化并发挥细胞毒性。另一方面，已知有妨碍CTL活化的分子存在，有TGFβ、PD-1、CTLA-4等。TGFβ是癌细胞分泌的抑制性细胞因子，会妨碍CTL、CD4⁺T细胞的增殖、分化。PD-1、CTLA-4皆为T细胞的细胞膜上的分子，若分别和癌细胞所表达的配体结合，则会传递抑制性的信号，CTL失活。近年来，据报告通过利用抗PD-1抗体、抗CTLA-4抗体妨碍这些免疫抑制分子的作用，能促进CTL的作用。

(5)患者的HLA型

表位肽基本上只会被1种HLA呈递。此现象称为HLA限制性。所以，即使是对于未保有能呈递表位肽的HLA型的患者实施癌免疫疗法，因该患者的癌细胞不呈递表位肽，因此也无法期待治疗效果。即，癌免疫疗法的对象患者受限于所使用的表位肽的HLA限制性。实际上，在癌免疫疗法的临床试验中，利用使用抗HLA抗体的血清型判定、基因型判定预先判定患者的HLA型，符合所使用的表位的HLA限制性的患者方登记进行试验。

由以上可知，为了通过癌免疫疗法获得治疗效果，实施适当的CTL监测、确认抗原呈递分子的表达、确认癌患部的癌抗原的表达、妨碍免疫抑制分子的作用、选择适合患者HLA型的癌抗原表位肽是重要的。其中，为了选择适合患者的HLA型的癌抗原表位肽，前提是鉴定出各种HLA限制性表位肽。因此为了能够广泛应对多样的癌患者，希望在多种癌抗原中尽可能鉴别出多种HLA限制性的表位肽。所以，表位肽的鉴定有重大意义。HLA-A*24：02是日本人中保有率最高的HLA-A等位基因，约60％的人保有。而本发明的目的在于提供在特异性的癌免疫疗法中能使用的HLA-A*24：02限制性的新型癌抗原表位肽、使用该肽的癌疫苗及抗癌剂、及检测表位肽特异性CTL的试剂。

CKAP4是分子量为63kDa、由全长602个氨基酸构成的II型跨膜蛋白。从N末端侧起，存在由106个氨基酸构成的细胞质内区域、由21个氨基酸构成的跨膜区域、由475个氨基酸构成的细胞外区域这3个区域(非专利文献32)。CKAP4于细胞周期的间期，在细胞质内区域结合于内质网(endoplasmic reticulum)与微管，有使内质网固定于微管的作用(非专利文献33)。细胞进入有丝***前，从CKAP4的N末端侧算起第100号的氨基酸即半胱氨酸残基会可逆地被棕榈酰基化(非专利文献34)，通过此棕榈酰基化，CKAP4的存在位置变至细胞膜(非专利文献35)，和微管间的交互作用受妨碍。另外，据报告：在有丝***期，CKAP4被磷酸化，丧失和微管间的结合能力(非专利文献36)。另一方面，已知微管于有丝***期会构成具有分配染色体而使细胞正确地一分为二的作用的纺锤体。所以，据认为CKAP4在有丝***期，通过适当地和微管解离而参与正常的有丝***的控制。另外，CKAP4亦已知在肺泡细胞表面也作为担任表面活性剂(肺表面活性物质)除去的表面活性蛋白A(surfactantprotein-A，以下称为SP-A)的受体的作用(非专利文献32)。在肺泡细胞表面，由脂质构成的表面活性剂通过减少被覆表面的水分的表面张力而帮助肺泡伸展。SP-A带有除去表面活性剂的功能，通过和受体CKAP4一起作用，担任肺泡细胞体内稳态的维持。

CKAP4在正常细胞也会表达，但是在来自乳腺癌、中枢神经***肿瘤、肺癌、肾癌、恶性黑色瘤等各种癌癌的细胞株中有高度表达(http：//129.187.44.58：7070/NCI60/protein/show/10796)。另外，据报告：CKAP4在骨肉瘤患者中有高度表达(http：//www.ebi.ac.uk/gxa/experiments/E-MEXP-3628？geneQuery＝ENSG00000136026&queryFactorValues＝g2_g1&_specific＝on)、在肝癌患者中有高度表达(非专利文献37)。所以，据认为CKAP4可能是在癌细胞中会高度表达的过度表达型的癌抗原(非专利文献38)。过度表达型的癌抗原例如已知Her-2等，也已有人实施使用来自Her-2的肽的癌肽疫苗的临床试验(非专利文献39、40)。

如上所述，据认为CKAP4在各种癌中有高度表达，但是对CKAP4在癌细胞中的抗原性并不了解。即，CKAP4是否作为癌抗原而成为免疫***的目标，也就是说，在来自CKAP4的肽是否会被癌细胞表面的HLA呈递并由特异性地识别其的CTL攻击癌细胞这点上尚不清楚。

现有技术文献

非专利文献

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发明内容

发明所要解决的课题

本发明是有鉴于如此的状况而完成的，将靶聚焦于EBV的LMP2与EBNA1，其目的在于鉴别LMP2特异性的细胞毒性T细胞表位肽、及EBNA1特异性的细胞毒性T细胞表位肽，并提供以使用了该肽的NPC为主的EBV相关恶性肿瘤及免疫缺陷治疗或预防用的疫苗、针对EBV的被动免疫疗法剂、及EBV特异性的细胞毒性T细胞的定量方法。另外，本发明人等针对各种来自CKAP4的肽，就癌抗原性、即CTL诱导能力进行了努力研究。其结果发现了序列编号：43所示的CKAP4的细胞外区域内的特定肽会诱导HLA-A*24：02限制性的CKAP4特异性CTL，该特异性CTL显示细胞毒性。本发明是基于这些知识见解而完成的。

用于解决课题的手段

本发明是基于如此的知识见解而完成的，具体方式例如涉及以下发明。

[1]一种表位肽，其具有对于EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)有特异性的细胞毒性T细胞的诱导活性，其中，该表位肽由选自由序列编号：1、序列编号：2、序列编号：3、序列编号：4、序列编号：5、序列编号：6、序列编号：26、序列编号：27及序列编号：28组成的组中的氨基酸序列构成。

[2]一种表位肽，其具有对于EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)有特异性的细胞毒性T细胞的诱导活性，其中，该表位肽在序列编号：1、序列编号：2、序列编号：3、序列编号：4、序列编号：5、序列编号：6、序列编号：26、序列编号：27或序列编号：28记载的氨基酸序列中取代、缺失、***和/或添加有1个或多个氨基酸。

[3]一种核酸，其编码[1]～[2]中任一项所述的表位肽。

[4]一种表达载体，其包含编码根据[1]～[2]中任一项所述的表位肽的核酸。

[5]一种用于治疗或预防EBV的感染或EBV阳性的癌的疫苗，其包含[1]～[2]中任一项所述的表位肽作为有效成分。

[6]根据[5]所述的疫苗，其中，EBV选自AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。

[7]一种用于治疗或预防EBV的感染或EBV阳性的癌的疫苗，其包含[3]～[4]中任一项所述的核酸或表达载体作为有效成分。

[8]根据[7]所述的疫苗，其中，EBV选自AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。

[9]一种用于治疗或预防EBV的感染或EBV病毒阳性的癌的疫苗，其包含将[1]～[2]中任一项所述的表位肽呈递至HLA的抗原呈递细胞作为有效成分。

[10]根据[9]所述的疫苗，其中，EBV选自AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。

[11]一种针对EBV的被动免疫疗法剂，其包含EBV特异性的细胞毒性T细胞，该EBV特异性的细胞毒性T细胞是利用[1]～[2]中任一项所述的表位肽或将该表位肽呈递至了HLA的抗原呈递细胞刺激外周血淋巴细胞而得到的。

[12]一种针对EBV的被动免疫疗法剂，其包含细胞毒性T细胞，该细胞毒性T细胞是通过使从[1]～[2]中任一项所述的表位肽制备而得的主要组织相容性抗原复合体和/或主要组织相容性抗原复合体-四聚物和外周血淋巴细胞接触，形成细胞毒性T细胞结合于该主要组织相容性抗原复合体和/或主要组织相容性抗原复合体-四聚物的结合体，然后从该结合体分离而得到的。

[13]一种EBV特异性的细胞毒性T细胞的定量方法，其包含：

用[1]～[2]中任一项所述的表位肽刺激来自对象的外周血的工序；

获得通过前述工序产生的EBV特异性的细胞毒性T细胞的工序；及

测定获得的细胞毒性T细胞所产生的细胞因子和/或趋化因子和/或细胞表面分子的工序。

[14]一种外周血中的EBV特异性的细胞毒性T细胞的定量方法，其包含：

将[1]～[2]中任一项所述的表位肽与主要组织相容性抗原复合体与β2-微球蛋白混合的工序；及

使制备的主要组织相容性抗原复合体-四聚物和来自对象的外周血接触的工序。

[15]一种EBV特异性的细胞毒性T细胞的诱导方法，其包含使[1]～[2]中任一项所述的表位肽和抗原呈递细胞接触的工序。

[16]一种用于诱导细胞毒性T细胞的试剂盒，其包含[1]～[2]中任一项所述的表位肽作为构成要素。

[17]一种生产EBV特异性CTL的方法，其包含使[1]～[2]中任一项所述的肽和外周血单核细胞在含血浆的培养基中接触的工序。

[18]一种CKAP4特异性的CTL表位肽，其由序列编号：43记载的氨基酸序列构成。

[19]一种CKAP4特异性的CTL表位肽，其在序列编号：43记载的氨基酸序列中取代、缺失、***和/或添加有1个或多个氨基酸。

[20]根据[18]～[19]中任一项所述的表位肽，其特征在于，其是HLA-A*24：02分子限制性的抗原肽，其诱导具有特异性地识别在细胞表面呈递和HLA-A*24：02分子形成的复合体的细胞的T细胞受体的CTL。

[21]一种核酸，其编码[18]～[19]中任一项所述的表位肽。

[22]一种表达载体，其包含编码[18]～[19]中任一项所述的表位肽的核酸。

[23]一种用于癌治疗或预防的疫苗，其包含[18]～[19]中任一项所述的表位肽作为有效成分。

[24]一种用于癌治疗或预防的疫苗，其包含[21]～[22]中任一项所述的核酸作为有效成分。

[25]一种用于癌治疗或预防的疫苗，其包含将[18]～[19]中任一项所述的表位肽呈递至HLA的抗原呈递细胞作为有效成分。

[26]一种用于癌治疗的被动免疫疗法剂，其包含CKAP4特异性的CTL作为有效成分，所述CKAP4特异性的CTL是利用[18]～[19]中任一项所述的表位肽或将该表位肽呈递至了HLA的抗原呈递细胞刺激外周血淋巴细胞而得到的。

[27]一种用于癌治疗的被动免疫疗法剂，其包含CTL作为有效成分，所述CTL是使从[18]～[19]中任一项所述的表位肽制备的主要组织相容性抗原复合体和/或主要组织相容性抗原复合体-四聚物和外周血淋巴细胞接触，形成CTL结合于该主要组织相容性抗原复合体和/或主要组织相容性抗原复合体-四聚物的结合体，然后从该结合体进行分离而得到的。

[28]一种CKAP4特异性的CTL的定量方法，其包含：

用[18]～[19]中任一项所述的表位肽刺激来自对象的外周血的工序；

获得对于由前述工序产生的CKAP4特异性的CTL的工序；及

测定该获得的CTL所产生的细胞因子和/或趋化因子和/或细胞表面分子的工序。

[29]一种外周血中的CKAP4特异性的CTL的定量方法，其包含：

从[18]～[19]中任一项所述的表位肽制备主要组织相容性抗原复合体-四聚物的工序；及

使主要组织相容性抗原复合体-四聚物与来自对象的外周血接触的工序。

[30]一种CKAP4特异性CTL的诱导方法，其包含使[18]～[19]中任一项所述的表位肽和来自对象的外周血单核细胞接触的工序。

[31]一种用于癌治疗的被动免疫疗法剂的制造方法，其包含：

利用[18]～[19]中任一项所述的表位肽或将该表位肽呈递至了HLA的抗原呈递细胞刺激外周血淋巴细胞而获得CKAP4特异性的CTL的工序。

[32]一种用于癌治疗的被动免疫疗法剂的制造方法，其包含：

使从[18]～[19]中任一项所述的表位肽制备的主要组织相容性抗原复合体和/或主要组织相容性抗原复合体-四聚物和外周血淋巴细胞接触的工序；

形成CTL结合于该主要组织相容性抗原复合体和/或主要组织相容性抗原复合体-四聚物的结合体的工序；及

获得从该结合体分离而得到的CTL的工序。

[33]一种对于主要组织相容性抗原复合体有特异性的抗体，其是从[18]～[19]中任一项所述的表位肽制备的。

[A1][1]～[2]中任一项所述的表位肽的用途，其用于为了治疗或预防EBV的感染或EBV阳性的癌的药剂的制造。

[A2]根据[A1]的用途，其中，EBV选自AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。

[A3][3]～[4]中任一项所述的核酸或表达载体的用途，其用于为了治疗或预防EBV的感染或EBV阳性的癌的药剂的制造。

[A4]根据[A3]的用途，其中，EBV选自AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。

[A5]将[1]～[2]中任一项所述的表位肽呈递至了HLA的抗原呈递细胞的用途，其用于为了治疗或预防EBV的感染或EBV病毒阳性的癌的药剂的制造。

[A6]根据[A5]的用途，其中，EBV选自AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。

[A7]EBV特异性的细胞毒性T细胞的用途，其用于针对EBV的被动免疫疗法剂的制造，其中，所述EBV特异性的细胞毒性T细胞是利用[1]～[2]中任一项所述的表位肽或将该表位呈递至了HLA的肽抗原呈递细胞刺激外周血淋巴细胞而得到的。

[A8]细胞毒性T细胞的用途，其用于针对EBV的被动免疫疗法剂的制造，其中，所述细胞毒性T细胞是通过使由[1]～[2]中任一项所述的表位肽制备的主要组织相容性抗原复合体和/或主要组织相容性抗原复合体-四聚物和外周血淋巴细胞接触，形成细胞毒性T细胞结合于该主要组织相容性抗原复合体和/或主要组织相容性抗原复合体-四聚物而得到的结合体，然后从该结合体分离而得到的。

[A9][18]～[19]中任一项所述的表位肽的用途，其用于治疗或预防癌的药剂的制造。

[A10][21]～[22]中任一项所述的核酸或表达载体的用途，其用于治疗或预防癌的药剂的制造。

[A11]将[18]～[19]中任一项所述的表位肽呈递至了HLA的抗原呈递细胞的用途，其用于治疗或预防癌的药剂的制造。

[A12]CKAP4特异性的CTL的用途，其用于癌治疗的被动免疫疗法剂的制造，其中，所述CKAP4特异性的CTL是利用[18]～[19]中任一项所述的表位肽或将该表位肽呈递至了HLA的抗原呈递细胞刺激外周血淋巴细胞而得到的。

[A13]CTL的用途，其用于癌治疗的被动免疫疗法剂的制造，其中，CTL是通过使由[18]～[19]中任一项所述的表位肽制备的主要组织相容性抗原复合体和/或主要组织相容性抗原复合体-四聚物和外周血淋巴细胞接触，形成CTL结合于该主要组织相容性抗原复合体和/或主要组织相容性抗原复合体-四聚物而得到的结合体，然后从该结合体分离而得到的。

[B1]一种疫苗组合物，用于治疗或预防EBV的感染或EBV阳性的癌，包含根据[1]～[2]中任一项所述的表位肽作为有效成分。

[B2]根据[B1]所述的疫苗组合物，其中，EBV选自AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。

[B3]一种用于治疗或预防EBV的感染或EBV阳性的癌的疫苗组合物，其包含[3]～[4]中任一项所述的核酸或表达载体作为有效成分。

[B4]根据[B3]所述的疫苗组合物，其中，EBV选自AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。

[B5]一种用于治疗或预防EBV的感染或EBV病毒阳性的癌的疫苗组合物，其包含将[1]～[2]中任一项所述的表位肽呈递至了HLA的抗原呈递细胞作为有效成分。

[B6]根据[B5]所述的疫苗组合物，其中，EBV选自AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。

[B7]一种用于针对EBV的被动免疫疗法的组合物，其包含利用[1]～[2]中任一项所述的表位肽或将该表位肽呈递至了HLA的抗原呈递细胞刺激外周血淋巴细胞而得到的EBV特异性的细胞毒性T细胞。

[B8]一种用于针对EBV的被动免疫疗法的组合物，其包含使由[1]～[2]中任一项所述的表位肽制备的主要组织相容性抗原复合体和/或主要组织相容性抗原复合体-四聚物和外周血淋巴细胞接触，形成细胞毒性T细胞结合于该主要组织相容性抗原复合体和/或主要组织相容性抗原复合体-四聚物而得到的结合体，从该结合体分离而得到的细胞毒性T细胞。

[B9]一种用于癌治疗或预防的疫苗组合物，其包含[18]～[19]中任一项所述的表位肽作为有效成分。

[B10]一种用于癌治疗或预防的疫苗组合物，其包含[21]～[22]中任一项所述的核酸或表达载体作为有效成分。

[B11]一种用于癌治疗或预防的疫苗组合物，其包含将[18]～[19]中任一项所述的表位肽呈递至了HLA的抗原呈递细胞作为有效成分。

[B12]一种用于利用被动免疫疗法治疗癌的组合物，其包含利用[18]～[19]中任一项所述的表位肽或将该表位肽呈递至了HLA的抗原呈递细胞刺激外周血淋巴细胞而得到的CKAP4特异性的CTL作为有效成分。

[B13]一种用于利用被动免疫疗法治疗癌的组合物，其包含CTL作为有效成分，所述CTL是通过使由[18]～[19]中任一项所述的表位肽制备的主要组织相容性抗原复合体和/或主要组织相容性抗原复合体-四聚物和外周血淋巴细胞接触，形成于该主要组织相容性抗原复合体和/或主要组织相容性抗原复合体-四聚物结合CTL而得到的结合体，从该结合体分离而得到的。

[C1]一种治疗或预防EBV的感染或EBV阳性的癌的方法，其包含将[1]～[2]中任一项所述的表位肽对需要其的个体投予的工序。

[C2]根据[C1]的方法，其中，EBV选自AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。

[C3]一种治疗或预防EBV的感染或EBV阳性的癌的方法，其包含将[3]～[4]中任一项所述的核酸或表达载体对需要其的个体投予的工序。

[C4]根据[C3]的方法，其中，EBV选自AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。

[C5]一种治疗或预防EBV的感染或EBV病毒阳性的癌的方法，其包含用将[1]～[2]中任一项所述的表位肽呈递至了HLA的抗原呈递细胞对需要其的个体投予的工序。

[C6]根据[C5]的方法，其中，EBV选自AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。

[C7]一种针对EBV的被动免疫疗法，其包含将EBV特异性的细胞毒性T细胞对需要其的个体投予的工序，所述EBV特异性的细胞毒性T细胞是通过利用[1]～[2]中任一项所述的表位肽或将该表位肽呈递至了HLA的抗原呈递细胞刺激外周血淋巴细胞而获得的。

[C8]一种针对EBV的被动免疫疗法，其包含：

使由[1]～[2]中任一项所述的表位肽制备的主要组织相容性抗原复合体和/或主要组织相容性抗原复合体-四聚物和外周血淋巴细胞接触的工序；

形成细胞毒性T细胞结合于该主要组织相容性抗原复合体和/或主要组织相容性抗原复合体-四聚物而得到的结合体的工序；

将从该结合体分离而得到的细胞毒性T细胞对需要其的个体投予的工序。

[C9]一种癌治疗或预防的方法，其包含将[18]～[19]中任一项所述的表位肽对需要其的个体投予的工序。

[C10]一种癌治疗或预防的方法，其包含将[21]～[22]中任一项所述的核酸或表达载体对需要其的个体投予的工序。

[C11]一种癌治疗或预防的方法，其包含将[18]～[19]中任一项所述的表位肽呈递至了HLA的抗原呈递细胞对需要其的个体投予的工序。

[C12]一种用于癌治疗的被动免疫疗法，其包含将利用[18]～[19]中任一项所述的表位肽或将该表位肽呈递至了HLA的抗原呈递细胞刺激外周血淋巴细胞而得到的CKAP4特异性的CTL对需要其的个体投予的工序。

[C13]一种用于癌治疗的被动免疫疗法，其包含：

使由[18]～[19]中任一项所述的表位肽制备的主要组织相容性抗原复合体和/或主要组织相容性抗原复合体-四聚物和外周血淋巴细胞接触的工序；

形成CTL结合于该主要组织相容性抗原复合体和/或主要组织相容性抗原复合体-四聚物而得到的结合体的工序；

将从该结合体分离而得到的CTL对需要其的个体投予的工序。

附图说明

图1为显示可见MHC-单体形成时的代表性凝胶过滤柱分析例的图。

图2为显示EBV LMP2特异性CTL表位候选肽的折叠试验(foldingtest)结果的图。

图3为显示EBV EBNA1特异性CTL表位候选肽的折叠试验结果的图。

图4为显示使用了对照肽的细胞内IFNγ产生细胞定量法的研究结果的图。

图5为显示利用细胞内IFNγ产生细胞定量法确认EBV LMP2特异性CTL诱导，并将CD8阳性细胞中存在的IFNγ产生生细胞的比例予以数值化而得到的图。

图6为显示进行下述定量的结果的图：利用细胞内IFNγ产生细胞定量法确认LMP2特异性CTL诱导(捐赠者ID*11-11)，在X轴将CD8以log尺度表示、Y轴将相对于IFNγ的荧光强度以log尺度表示的散点图展开图中，使用与诱导中使用的肽相同的肽进行再刺激，对细胞内IFNγ产生细胞进行定量。

图7为显示利用制作的MHC-四聚物试剂进行LMP2特异性CTL的检测结果的图(捐赠者ID*11-11)。

图8为显示利用制作的MHC-四聚物试剂进行EBNA1特异性CTL的检测结果(1)的图。

图9为显示利用制作的MHC-四聚物试剂进行EBNA1特异性CTL的检测结果(2)的图。

图10为显示利用细胞内IFNγ产生细胞定量法进行EBNA1特异性CTL诱导的确认结果的图(捐赠者ID*11-8)。

图11为显示由于ASS(10mer)的N末端与C末端的氨基酸缺失所致MHC亲和性的变化的图。

图12为显示由于ASS(10mer)的N末端与C末端的氨基酸缺失所致CTL诱导能力的变化的图(捐赠者ID*11-11)。

图13为显示由于ASS(10mer)的N末端与C末端的氨基酸缺失所致TCR结合性的变化的图(捐赠者ID*11-11)。

图14为显示ASS(10mer)及HRG的EBV株间的氨基酸突变比较的图。

图15为显示ASS(10mer)CTL表位的测序结果的图。

图16为显示ASS(10mer)的氨基酸突变导致的诱导能力的差异的图(捐赠者ID：*11-11)。

图17为显示ASS(10mer)的氨基酸取代导致的TCR结合性的变化的图(捐赠者ID：*11-11)。

图18为显示使用了培养袋进行CTL的大量培养(1)的结果的图。

图19为显示使用了培养袋进行CTL的大量培养(2)的结果的图。

图20为显示使用了培养袋进行CTL的大量培养(3)的结果的图。

图21为显示可见MHC-单体形成时的代表性凝胶过滤柱分析例的图。

图22为显示CKAP4特异性CTL表位候选肽的折叠试验结果的图。

图23为显示CKAP4特异性CTL的诱导结果的图(试样编号；A24-37，第1阶段)。

图24为显示CKAP4特异性CTL的诱导结果的图(试样编号；A24-37，第2阶段，lane(“条带”、或“泳道”)7)。

图25为显示CKAP4特异性CTL的诱导结果的图(试样编号；A24-39，第1阶段)。

图26为显示CKAP4特异性CTL的诱导结果的图(试样编号；A24-39，第2阶段，lane10、11)。

图27为显示CKAP4特异性CTL的IFNγ产生细胞的定量结果的图。

具体实施方式

针对本发明进一步详细说明。

[表位肽]

本发明所称的肽是：有生理活性且通过相邻的氨基酸残基的α-氨基与羧基间的肽键互相键合成的线状的氨基酸的分子链。肽并不是指特定长度者，可以为各种长度。另外，可为无电荷或盐的形态，视情形，也可经糖基化、酰胺化、磷酸化、羧基化、磷酸化等修饰。此外，本发明的表位肽只要是生理活性及免疫活性未实质改变，投予时不具有有害活性，则发生了1个或数个(例如1～10个)氨基酸或氨基酸类似物***、添加、取代、缺失等的肽也包括在本发明内。如此的氨基酸的变更目的，可列举例如：

1.为了提高与HLA的亲和性的变更(Rosenberg SA，Yang JC，Sch wartzentruberDJ，Hwu P，Marincola FM，Topalian SL，Restifo NP，Du dley ME，Schwarz SL，Spiess PJ，Wunderlich JR，Parkhurst MR，Kawa kami Y，Seipp CA，Einhorn JH，WhiteDE.Immunologic and therapeutic evaluation of a synthetic peptide vaccine forthe treatment of patients wi th metastatic melanoma.Nat Med.1998；4：321-327、Berzofsky JA，Ahl ers JD，Belyakov IM.Strategies for designing and optimizingnew generat ion vaccines.Nat Rev Immunol.2001；1：209-219)、

2.为了使TCR的识别性提高的变更(Fong L，Hou Y，Rivas A，Be nike C，Yuen A，Fisher GA，Davis MM，Engleman EG.Altered peptide ligand vaccination withFlt3ligand expanded dendritic cells for tumor im munotherapy.Proc Natl AcadSci U S A.2001；98：8809-8814、Rivoltini L，Squarcina P，Loftus DJ，Castelli C，Tarsini P，Mazzocchi A，Rini F，Viggiano V，Belli F，Parmiani G.A superagonistvariant of peptide M ART1/Melan A27-35 elicits anti-melanoma CD8+T cells withenhanced f unctional characteristics：implication for more effectiveimmunotherapy.C ancer Res.1999；59：301-306)、

3.为了避免因为血清中的肽分解酶等而代谢的变更(Berzofsky JA，A hlers JD，Belyakov IM.Strategies for designing and optimizing new gener ationvaccines.Nat Rev Immunol.2001；1：209-219、Parmiani G，Cast elli C，Dalerba P，Mortarini R，Rivoltini L，Marincola FM，Anichini A.Cancer immunotherapy withpeptide-based vaccines：what have we achiev ed？Where are we going？J NatlCancer Inst.2002；94：805-818、Brinck erhoff LH，Kalashnikov VV，Thompson LW，Yamshchikov GV，Pierce R A，Galavotti HS，Engelhard VH，Slingluff CL Jr.Terminalmodifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MAR第三1(27-35)p eptide：implications for peptide vaccines.Int J Cancer.1999；83：326-33 4)等。

也包括为了如此的目的而在肽的N末端或C末端***附加的氨基酸序列者。另外，本发明的肽可以以附加了糖类、聚乙二醇、脂质等而得到的复合体、利用放射性同位元素等而得到的衍生物、或聚合体等形态使用。作为前述氨基酸类似物，可以列举各种氨基酸的N-酰基化物、O-酰基化物、酯化物、酰胺化物、烷基化物等。

另外，只要是在CTL能特异性地识别将HLA分子与β2-微球蛋白、表位肽的3者复合体呈递至细胞表面的细胞的范围内，则抗原肽的N末端、游离的氨基也可以键合甲酰基、乙酰基、叔丁氧基羰基(t-Boc)基等，在抗原肽的C末端、游离羧基也可以键合甲基、乙基、叔丁基、苄基等。

另外，本发明的表位肽也可以是施有能容易地导入到生物体内的各种修饰者。作为能容易地导入到生物体内的各种修饰的例子，例如PT(Prote in Transduction，蛋白传导)区域是有名的。HIV的PT区域是由Tat蛋白的第49～57号氨基酸(Arg Lys Lys Arg ArgGln Arg Arg Arg)构成的肽。据报告通过将此PT区域附加于目标蛋白或肽的N末端与C末端这两者、或任一者，能容易地导入到细胞内(Ryu J，Han K，Park J，Choi SY.En hanceduptake of a heterologous protein with an HIV-1Tat protein transd uctiondomainS(PTD)at both termini.Mol Cells.2003；16：385-391、Kim DT，Mitchell DJ，Brockstedt DG，Fong L，Nolan GP，Fathman CG，Engleman EG，Rothbard JB.Introductionof soluble proteins into the MH C class I pathway by conjugation to an HIVtat peptide.J Immunol.199 7；159：1666-1668)。

经由HLA第I型分子而呈递的大部分抗原在被细胞质内的蛋白酶体分解后，被移送到TAP(transporter in antigen processing，抗原加工相关转运体)，在粗面内质网内，和缔合于TAP的HLA第I型分子与β2-微球蛋白的复合体结合，并经由高尔基体而利用胞吐作用(exocytosis)运送到细胞表面。通过使这些在一连串的抗原呈递路径中发挥作用的分子伴侣(chapero ne)HSP(heat shock prtein，热休克蛋白)70、HSP90或gp96与目标肽、蛋白融合，能使其有效率地进行抗原呈递(Basu S，Binder RJ，Ramaling am T，SrivastavaPK.CD91is a common receptor for heat shock protein s gp96，hsp90，hsp70，andcalreticulin.Immunity.2001；14：303-313)。

[编码表位肽的核酸]

编码表位肽的核酸对于使用基因重组技术使宿主内产生表位肽是重要。于此情形，因为氨基酸密码子在宿主间的密码子使用频率(codon usa ge)不同，因此优选变更氨基酸的密码子以使其适合产生宿主的密码子使用频率(codon usage)。编码表位肽的核酸就疫苗而言亦为重要，可以以裸露的核酸的形式移送，也可使用适当的病毒或细菌载体移送(Berzofsky J A，Ahlers JD，Janik J，Morris J，Oh S，Terabe M，Belyakov IM Progress on new vaccine strategies against chronic viral infections.J Clin Invest.2004；114：450-462、Berzofsky JA，Terabe M，Oh S，Belyakov IM，Ahlers JD，Janik JE，Morris JC.Progress on new vaccine strategies for t he immunotherapy andprevention of cancer.J Clin Invest.2004；113：15 15-1525)。适当的细菌载体为沙门氏菌属亚种的细菌。适当的病毒载体例如：反转录病毒载体、EBV载体、痘病毒载体、仙台病毒载体、慢病毒载体。适当的痘病毒载体的一例为改变安卡拉痘病毒(Vaccinia ankara)载体。

[CTL表位候选肽的选择]

1.使用计算机预测算法的分析

本发明的EBV特异性的CTL表位候选肽可参照能针对LMP2及EBN A1的氨基酸序列，检索对于目标HLA第I型分子具有结合基序的由8～10个氨基酸构成的肽的在因特网上公开的多个表位预测软件(Pingping Guan，Irini A.Doytchinova，Christianna Zygouri，andDarren R.Flower MHCPr ed：a server for quantitative prediction of peptide？MHCbinding Nucleic Acids Res.，2003；31：3621-3624、Karosiene E，Lundegaard C，Lund O，Nielsen M.NetMHCcons：a consensus method for the major histoco mpatibilitycomplex class I predictions.Immunogenetics.2012Mar；64(3)：177-86.、JorgensenKW，Rasmussen M，Buus S，Nielsen M.NetMHCsta b-predicting stability of peptide-MHC-I complexes；impacts for cytotoxi c T lymphocyte epitopediscovery.Immunology.2014Jan；141(1)：18-2 6.)进行选择。

2.使用锚定基序(anchor motif)的研究

HLA第I型分子主要有HLA-A、HLA-B、HLA-C，和它们结合并被呈递的表位肽由8～10个氨基酸构成。表位肽的N末端侧算起第2号、及第9或10号的氨基酸是对于与HLA第I型分子的结合最重要的氨基酸，称为锚定基序。此锚定基序据报告因各HLA第I型分子的种类而异。例如，作为与全世界研究最先进的HLA-A2结合的肽，最熟知的是在距N末端第2号的位置配置Leu，在第9或10号位置配置Leu或Val的肽、且是由9～10个氨基酸构成的肽(T Sudo，NKamikawaji，A Kimura，Y Date，CJ Savoi e，H Nakashima，E Furuichi，S Kuhara，and TSasazuki Differences in MHC class I self peptide repertoires among HLA-A2subtypes J.Immuno l.，1995；155：4749-4756)。另外，作为与包括日本人在内的东南亚人种常见的HLA-A11(Chang CX，Tan AT，Or MY，Toh KY，Lim PY，Chia AS，Froesig TM，Nadua KD，Oh HL，Leong HN，Hadrup SR，Gehring AJ，Tan YJ，Bertoletti A，GrotenbregGM.Conditional ligands for Asian HLA variants facilitate the definition ofCD8+T-cell responses in acute a nd chronic viral diseases.Eur J Immunol.2013Apr；43(4)：1109-20.)结合的肽，最熟知的是在距N末端起算第2号位置配置Ile、Met、Ser、Th r、或Val中的任一者，在第9或10号位置配置Lys或Arg的任一者的肽、且是由9～10个氨基酸构成的肽(Rapin N，Hoof I，Lund O，Nielsen M.The MHC motif viewer：avisualization tool for MHC binding motifs.Cur r Protoc Immunol.2010Feb；Chapter 18：Unit 18.17.)。可以从蛋白的氨基酸序列中有此锚定基序的8～10个氨基酸序列，并选择CTL表位候选肽。

3.肽文库的制作

合成构成EBV的蛋白中的网罗目标蛋白全体的由约20个氨基酸序列构成的肽文库。按照约20个氨基酸中有约10个氨基酸序列与前后肽重复的方式制作文库。由此，能全面地检索蛋白全体，只要制作文库一次，即可针对HLA限制性全面地进行研究。

[肽的合成]

本发明的序列编号：1～35所示的CTL表位候选肽可利用以往的各种肽合成方法制备。例如也可以使用固相肽合成法等有机化学的合成法、或制备编码肽的核酸、使用重组DNA技术进行制备。另外，也可利用市售的化学合成装置(例如Applied Biosystems公司的肽合成装置)合成。

[CTL表位候选肽的研究]

依前述方法选出的CTL表位候选肽不一定能成为CTL表位肽，可经过以下所示的研究而首次成为EBV LMP2特异性CTL表位肽及EBV EBNA1特异性CTL表位肽。

(1)使用了培养细胞株的研究

由蛋白酶体进行蛋白分解而生成的肽片段会通过TAP(transporter ass ociatedwith antigen processing，抗原加工相关转运体)分子而引导到内质网内腔，和HLA第I型分子与β2-微球蛋白的复合体结合并转运到细胞膜表面。缺少此TAP分子的TAP基因缺陷细胞株，内在性蛋白的分解产物即肽片段无法在细胞膜表面表达。另外，对于为代表性TAP基因缺陷细胞株人淋巴母细胞样细胞株T2、或将HLA-A11分子基因导入T2而得到的细胞株(T2-A11)的HLA分子在细胞膜表面上的表达非常不稳定。但是，当已和从外部供给的肽结合时，HLA分子在细胞膜表面上会稳定化。利用此性质，TAP基因缺陷细胞株可用在验证HLA分子与从外部供给的肽的结合性的实验中。具体而言，将TAP基因缺陷细胞株与CTL表位候选肽混合培养后，用抗HLA抗体染色，用流式细胞仪计算HLA分子的表达强度的变化，藉此可以研究目标HLA分子与CTL表位候选肽的结合性。当添加的CTL表位候选肽结合于TAP基因缺陷细胞株所表达的HLA分子时，HLA分子与肽的复合体在细胞膜表面上稳定化，用抗HLA抗体染色时，观察到HLA分子的表达增强。另一方面，添加的CTL表位候选肽和HLA分子不显示结合性时，细胞膜表面上的HLA分子不稳定，即使用抗HLA抗体染色仍未确认HLA分子的表达增强。可使用如此的方法，验证HLA分子与CTL表位候选肽的结合性。

(2)折叠试验

MHC-四聚物试剂是在试管内制造MHC(人的情形为HLA)与β2-微球蛋白及肽片段的3者复合体(MHC-单体)并将MHC-单体予以4聚体化而得到的试剂。MHC-四聚物试剂是能够选择性地检测显示MHC限制性的抗原特异性的细胞毒性T细胞(CTL)的唯一试剂。另外，MHC-四聚物试剂在和抗CD(cluster of differentiation)抗体、抗细胞因子抗体等共染色后，通过用流式细胞仪分析，不仅能够定量CTL的数目，还能就每一细胞逐一评价其活化状态、分化阶段。MHC-四聚物试剂制造的最初步骤，是从将原料MHC与β2-微球蛋白与肽在试管内的适当溶液中混合的折叠开始的。在折叠溶液中，由于此3种原料的缔合反应，形成3者复合体(MHC-单体)。此时，MHC与肽的结合力越高，此缔合反应会越顺利进行，通过用凝胶过滤柱分析，能够检测3种原料的复合体(MHC-单体)。另一方面，MHC与肽没有结合力时，几乎检测不到MHC-单体。因此，通过经时分析折叠溶液或进行热处理等，能够验证MHC与肽的结合性及稳定性。

(3)表位肽特异性CTL的检测

(3-1)表位肽决定方法

将从有EBV感染历史的人分离而得到的外周血单核细胞(peripheral b loodmononuclear cells；PBMC)、或从PBMC分离而得到的T细胞以0.1～2×10⁶/mL的细胞浓度悬浮在适当的培养基中。在其中加入从同一人预先分离培养而得到的EBV感染细胞1×10⁵/mL，在5％二氧化碳气体(CO₂)恒温箱中于37℃培养7日。培养7日后添加EBV感染细胞与白细胞介素2(IL-2)，之后通过每周用EBV感染细胞与IL-2进行刺激以诱导CTL。对于如此诱导而得到的CTL是否对于表位候选肽有特异性的研究，是以MHC-四聚物法、Elispot分析、铬释放分析法、细胞内细胞因子染色法等进行判定(Current Protocols in Immunology Editedby：John E.Coligan，Ada M.Kruisbeek，David H.Margulies，Ethan M.Shevach，WarrenStrober 6.19ELISPOT Assay to Detect Cytokine-Secreting Murine and Human Cells6.24 Detection of Intracellular Cytokines by Flow Cytometry published by John Wiley&Sons，Inc.)。

(3-2)表位肽决定方法2

将从有EBV感染历史的人分离而得到的PBMC以0.1～2×10⁶/mL的细胞浓度悬浮在适当的培养基中，在其中将表位候选肽的任意1种以0.01～100μg/mL的浓度添加。在5％CO₂恒温箱中于37℃进行培养，2日后添加IL-2。之后，通过每周1次或每2周1次重复进行利用前述肽与IL-2进行的刺激以诱导CTL。针对如此诱导而得到的CTL是否对于表位候选肽有特异性的研究，是以MHC-四聚物法、Elispot分析、铬释放分析、细胞内细胞因子染色法等进行判定。

(3-3)表位肽决定方法3

使从有EBV感染历史的人分离而得到的PBMC以0.1～2×10⁶/mL的细胞浓度悬浮在适当的培养基中，在其中加入以适当数量(例如各10种)合并(pooled)合成的肽文库者。以5％CO₂恒温箱以37℃进行培养，于2日后添加IL-2。之后，以每周1次或每2周1次重复进行利用合并肽与IL-2进行的刺激，以诱导CTL。针对如此诱导而得到的CTL是否对于表位候选肽有特异性的研究，是以MHC-四聚物法、Elispot分析、铬释放分析、细胞内细胞因子染色法等进行判定。对于显示良好结果的合并肽各加入1种肽并重复上述实验，则可选出有CTL诱导能力的肽。针对进行反应的肽按顺序缩短，最后获得由8～10个氨基酸构成的表位肽，作为本发明的表位肽。

[EBV LMP2与EBNA1特异性MHC-单体及MHC-四聚物试剂的制造]

使用了EBV LMP2特异性CTL表位候选肽与EBV EBNA1特异性CTL表位候选肽的MHC-单体及MHC-四聚物试剂，可依公知方法(US Patent Number 5,635,363、FrenchApplication Number FR9911133)制备。在折叠溶液内形成从蛋白表达用的基因重组宿主精制而得到的HLA第I型分子、β2-微球蛋白及本发明的LMP2特异性CTL表位候选肽、或EBNA1特异性CTL表位候选肽这3者的复合体即MHC-单体。在重组HLA第I型分子的C末端预先附加生物素结合部位，在MHC-单体形成后在此部位附加生物素。通过将市售的经色素标记的链霉亲和素与生物素化MHC-单体以摩尔比1：4进行混合，可以制造MHC-四聚物试剂。通过将MHC-四聚物试剂与抗细胞表面蛋白的抗体(CD62L、CCR7、CD45RA等)组合使用，可以检查CTL的分化阶段(Seder RA，Ahmed R.Similarities and differences in CD4+and CD8+effector and memory T cell generation.Nat Immunol.2003；4：835-842.)。或通过和细胞内细胞因子染色法组合，可以用于CTL的功能性评价。例如：存在针对HCV(Hepatitis Cvirus，丙型肝炎病毒)的CTL是丙型肝炎维持持续感染的原因之一，但是据报告CTL有可能不产生细胞因子等、或产生的CTL的比例极低而在免疫学上成为无反应性(anergy)(Gruener NH，Lechner F，Jung MC，Diepolder H，Gerlach T，Lauer G，Walker B，SullivanJ，Phillips R，Pape GR，Klenerman P.Sustained dysfunction of antiviral CD8+Tlymphocytes after infection with hepatitis C virus.J Virol.2001；75：5550-5558.)。另外，已开始有人认为对于针对骨髓移植后的CMV特异性CTL，不仅研究是否存在CTL，而且也研究细胞因子产生能力的强弱，这对于计算抗病毒药投予等的时机是有效的(Ozdemir E，St John LS，Gillespie G，Rowland-Jones S，Champlin RE，Molldrem JJ，Komanduri KV.Cytomegalovirus reactivation following allogeneic stem celltransplantation is associated with the presence of dysfunctional antigen-specific CD8+T cells.Blood.2002；100：3690-3697.)。如此鉴别特异性的CTL表位肽并制造MHC-四聚物试剂时，能够进行特异性的CTL的定量与定性，在获得诊断信息方面可能有重大贡献。

[主动免疫疫苗]

肽疫苗

本发明的CTL表位肽在主动免疫疗法中可以作为肽疫苗使用。也就是说，将含有本发明的CTL表位肽而成的疫苗对患者投予，使EBV LMP2特异性CTL或EBV EBNA1特异性CTL在体内增殖，在对于感染的预防、及对于传染病及EBV阳性肿瘤的治疗中可发挥效用。所使用的表位肽可只有1种，或可根据疫苗的使用目的而将2种以上的肽组合、混用。

利用抗原呈递细胞的疫苗

呈递本发明的CTL表位肽的抗原呈递细胞可在主动免疫疗法中作为疫苗使用。呈递CTL表位肽的抗原呈递细胞是指：

1.使抗原呈递细胞与CTL表位肽在适当的培养液中混合30分钟至1小时而得到的CTL表位肽脉冲抗原呈递细胞

2.使用编码CTL表位肽的核酸，通过基因导入等使抗原呈递细胞呈递CTL表位肽的细胞

3.具有人工制备的抗原呈递能力的人工抗原呈递细胞。

抗原呈递细胞是指，例如树突状细胞、B细胞、巨噬细胞、某种T细胞等，是在其细胞表面上表达该肽能结合的HLA分子的细胞，且有CTL刺激能力。具有人工制备的抗原呈递能力的人工抗原呈递细胞可通过例如将HLA分子与CTL表位肽与β2-微球蛋白的三者复合体固定在脂质双层膜、塑料或乳胶等珠粒上，并固定能够刺激CTL的CD80、CD83、CD86等共刺激分子，或固定对与共刺激分子结合的T细胞侧的配体即CD28具有激动作用的抗体等来制备(Oelke M，Maus MV，Didiano D，June CH，Mackensen A，Schneck JP.Ex vivo inductionand expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coatedartificial antigen-presenting cells.Nat Med.2003；9：619-624、Walter S，HerrgenL，Schoor O，Jung G，Wernet D，Buhring HJ，Rammensee HG，Stevanovic S.Cutting edge：predetermined avidity of human CD8T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres.J Immunol.2003；171：4974-4978、Oosten LE，Blokland E，van Halteren AG，Curtsinger J，Mescher MF，Falkenburg JH，Mutis T，GoulmyE.Artificial antigen-presenting constructs efficiently stimulate minorhistocompatibility antigen-specific cytotoxic T lymphocytes.Blood.2004；104：224-226)。

基因疫苗

本发明的CTL表位肽的核酸在主动免疫疗法可用于DNA疫苗、重组病毒载体疫苗等。于此情形，CTL表位肽的核酸序列优选变更为适合重组疫苗、产生重组病毒疫苗的宿主的密码子使用频率(codon usage)(Casimiro，D.R.et al.Comparative Immunogenicityin Rhesus Monkeys of DNA Plasmid，Recombinant Vaccinia Virus，and Replication-Defective Adenovirus Vectors Expressing a Human Immunodeficiency Virus Type1gag Gene J.Virol.，2003；77：6305-6313、Berzofsky JA，Ahlers JD，Janik J，Morris J，Oh S，Terabe M，Belyakov IM.Progress on new vaccine strategies against chronicviral infections.J Clin Invest.2004；114：450-462)。

本发明的CTL表位肽、或含有呈递有CTL表位肽的抗原呈递细胞而成的疫苗可使用本领域公知的方法制备。例如，作为该疫苗，有含有本发明的CTL表位肽作为有效成分的注射剂或固体剂等。CTL表位肽可以中性或盐的形态配方，例如作为药学上可容许的盐，可列举盐酸、磷酸等无机盐、或乙酸、酒石酸等有机酸。另外，呈递有本发明的CTL表位肽的抗原呈递细胞可以使用制药上可容许，且和该肽或该细胞的活性有相容性的赋形剂，例如水、食盐水、葡萄糖、乙醇、甘油、DMSO(dimethyl sulphoxide，二甲基亚砜)、及其它佐剂等、或和它们的组合混合使用。此外，视需要也可以添加白蛋白、湿润剂、乳化剂等辅助剂。

本发明的疫苗可通过非经口投予及经口投予进行投予，一般而言以非经口投予较佳。作为非经口投予，有经鼻投予、皮下注射、肌肉内注射、静脉内注射等注射剂、栓剂等。另外，作为经口投予，可以制备成和淀粉、甘露醇、乳糖、硬脂酸镁、纤维素等赋形剂的混合物。

本发明的疫苗是以治疗上有效的量进行投予。投予量取决于治疗对象、免疫***，必要的投予量依临床医师的判断决定。通常适当投予量是每名患者，CTL表位肽为1～100mg，CTL表位肽刺激细胞为10⁶～10⁹个的含量。另外，投予间隔可依对象、目的来设定。

[被动免疫疫苗]

本发明的CTL表位肽可用于被动免疫治疗剂的制备。可使依以下方式获得的对于EBV LMP2为特异性的CTL或对于EBV EBNA1为特异性的CTL悬浮在含人白蛋白的PBS等中，制成针对EBV的被动免疫疗法剂。被动免疫疗法剂所含的对于EBV为特异性的CTL可依如以下的制备方法获得，为了提高CTL的纯度，也可以精制后使用。

CTL制备方法1

使PBMC和适当浓度的EBV特异性MHC-四聚物试剂反应。和MHC-四聚物试剂结合的EBV特异性CTL因为被标记色素染色，所以使用细胞分选仪、显微镜等只将已染色的CTL分离。使依此方式分离的EBV特异性的CTL被因抗CD3抗体、PHA、IL-2等T细胞刺激药剂、X射线照射或丝裂霉素处理等丧失了增殖能力的抗原呈递细胞刺激并增殖，确保被动免疫疗法所需的细胞数。

CTL制备方法2

将EBV特异性MHC-单体和/或MHC-四聚物试剂固相化于无菌细胞培养平板等，将PBMC在固相化细胞培养平板上培养。为了将与固相化于平板的MHC-单体和/或MHC-四聚物试剂结合的EBV特异性CTL分离，将未结合而是悬浮的其它细胞洗掉后，只将残留在平板上的特异性CTL悬浮于新的培养基。使如此分离得到的EBV特异性CTL被因抗CD3抗体、PHA、IL-2等T细胞刺激药剂、X射线照射或丝裂霉素处理等而丧失增殖能力的抗原呈递细胞刺激而增殖，确保被动免疫疗法所需的细胞数。

CTL制备方法3

将EBV特异性MHC-单体和/或MHC-四聚物试剂、以及CD80、CD83、CD86等共刺激分子、或对于与共刺激分子结合的T细胞侧的配体CD28具有激动作用的抗体等固相化于无菌细胞培养平板等，将PBMC在固相化细胞培养平板上培养。2日后添加IL-2到培养基中，在5％CO₂恒温箱中于37℃培养7～14日。回收培养后的细胞，在新的固相化细胞培养平板上继续培养。通过重复此操作，确保被动免疫疗法所需的细胞数的CTL。

CTL制备方法4

用本发明的CTL表位肽直接刺激PBMC或T细胞，或用已脉冲了该肽的抗原呈递细胞、经基因导入的抗原呈递细胞、或具有人工制备的抗原呈递能力的人工抗原呈递细胞进行刺激。刺激可离体(in vitro)进行，也可在体内(in vivo)进行。在离体(in vitro)进行刺激时，是将经刺激而诱导的CTL在5％CO₂恒温箱于37℃培养7～14日。在培养时每周1次重复进行利用CTL表位肽与IL-2、或抗原呈递细胞与IL-2进行的刺激，以确保被动免疫疗法所需的细胞数的CTL。

CTL的精制法

在CTL制备方法中，特异性CTL的比例低时，通过随时使用以下方法，能以高纯度回收特异性CTL。

利用MHC-四聚物试剂进行的精制

可使EBV特异性MHC-四聚物试剂和通过CTL制备方法诱导出的CTL反应，并将抗标记MHC-四聚物试剂的标记色素的抗体等用经磁性标记的2次抗体进行分离。如此的经磁性标记的2次抗体与磁性标记细胞分离装置，例如可以由Dynal公司、Miltenyi Biotec GmbH公司获得。依此方式分离而得到的EBV特异性CTL以抗CD3抗体、PHA、IL-2等T细胞刺激药剂刺激并使其增殖，确保被动免疫疗法所需的细胞数。

利用分泌的细胞因子进行的精制

EBV特异性CTL可利用释放的细胞因子等进行EBV特异性CTL的精制。例如，可通过使用可从Miltenyi Biotec GmbH公司获得的试剂盒，将从CTL释放的细胞因子在细胞表面用特异抗体捕捉，用抗细胞因子标记抗体进行染色，接着用经磁性标记的标记物质特异性的抗体反应后，使用磁性标记细胞分离装置进行精制。将如此分离而得到的EBV特异性CTL用抗CD3抗体、PHA、IL-2等T细胞刺激药剂刺激并使其增殖，确保被动免疫疗法所需的细胞数。

使用了细胞表面蛋白特异性抗体的精制

据报告在特异性CTL的细胞表面有在特异性刺激下表达增强的细胞表面蛋白(例如CD137、CD107a、CD107b、CD63、CD69等)(Betts MR，Brenchley JM，Price DA，De Rosa SC，Douek DC，Roederer M，Koup RA.Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation.J ImmunolMethods.2003；281：65-78、Trimble LA，Shankar P，Patterson M，Daily JP，LiebermanJ.Human immunodeficiency virus-specific circulating CD8 T lymphocytes havedown-modulated CD3zeta and CD28，key signaling molecules for T-cellactivation.J Virol.2000；74：7320-7330)。通过将抗这样的蛋白的特异抗体进行磁性标记，可使用磁性分离装置等将CTL精制。另外，通过将抗这样的特异抗体的抗IgG抗体等进行磁性标记，也同样可进行CTL的精制。或将这些特异抗体包被在培养用的塑料平板上，使用此平板来培养已施以刺激的PBMC，将未结合于平板的细胞团洗掉，由此也可将特异性CTL精制。使如此分离得到的EBV特异性CTL用抗CD3抗体、PHA、IL-2等T细胞刺激药剂刺激并使其增殖，确保被动免疫疗法所需的细胞数。

[EBV特异性CTL的定量]

了解EBV特异性CTL是否存在于癌患者的外周血或其量的变动，是用于预测EBV特异性CTL表位肽的重要信息。EBV特异性CTL的定量可通过使用了本发明的CTL表位肽的以下3种方法进行。

定量方法1(MHC-四聚物法)

可采用使用本发明的CTL表位肽而制得的MHC-四聚物试剂定量对于外周血中的EBV特异性的CTL。定量例如可如下实施。使外周血或PBMC和适当浓度的MHC-四聚物试剂反应。因为与该MHC-四聚物试剂结合的CTL可被标记色素染色，故可使用流式细胞仪、显微镜等计数。与MHC-四聚物试剂反应时，通过使其和用与MHC-四聚物试剂不同的色素标记的抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体等反应，也能同时判定EBV特异性的CTL的T细胞亚型。

定量方法2

其是通过用本发明的CTL表位肽刺激PBMC，定量CTL所产生的IFNγ(interferongamma，干扰素γ)、TNFα(tumor necrosis factor alpha，肿瘤坏死因子α)、白细胞介素等细胞因子和/或趋化因子的方法。以下举IFNγ为例，具体地示出方法。

2-1利用细胞因子定量进行的方法1(细胞内IFNγ产生细胞定量法)

将PBMC以约2×10⁶/mL的细胞浓度悬浮于适当培养基中，加入本发明的CTL表位肽。然后，加入细胞内蛋白转运抑制剂(例如Brefeldin A、Monensin等)，在5％CO₂恒温箱内于37℃培养5～16小时。培养后，使其和T细胞标记物抗体(抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体)或MHC-四聚物试剂反应，将细胞固定后，进行膜透过处理，使其和色素标记抗IFNγ抗体反应。使用流式细胞仪等进行解析，定量全部细胞中、T细胞中或MHC-四聚物试剂阳性细胞中的IFNγ阳性细胞率。

2-2利用细胞因子定量进行的方法2(Elispot分析)

于已固相化抗IFNγ抗体的96孔MultiScreen-HA平板(Millipore公司)上接种PBMC。之后，将CTL表位肽加入各孔，于37℃的5％CO₂恒温箱培养器中培养20小时。次日洗涤平板，按照抗IFNγ抗体、过氧化酶(peroxidase)标记抗IgG抗体的顺序使其反应。然后，加入过氧化酶的基质，利用发色使IFNγ点可见化，使用实体显微镜或是ELISPOT分析仪(C.T.L.公司)进行计数来定量。

2-3利用细胞因子定量进行的方法3(将分泌到培养上清中的IFNγ予以定量的方法)

将PBMC以约2×10⁶/mL的细胞浓度悬浮在适当的培养基中，加入本发明的CTL表位肽。于5％CO₂恒温箱中，于37℃培养24～48小时。培养后回收上清，将其中所含的IFNγ浓度使用市售ELISA试剂盒(例如R&DSystems公司的Quantikine ELISA Human IFNγImmunoassay)进行定量。

定量方法3

使用细胞表面蛋白特异性抗体进行定量。据报告对于CTL表位肽有特异性的CTL由于特异性刺激，细胞表面蛋白(例如CD137、CD107a、CD107b、CD63、CD69等)的表达会增强。因此，通过将经CTL表位肽等刺激的PBMC和特异性地识别细胞表面蛋白的标记抗体进行混合，CTL会和标记抗体结合并被标记色素染色。经染色的CTL可以使用流式细胞仪、显微镜等计数并定量。此外，通过添加用与标记抗体不同的色素标记的抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体等，也可同时判定特异性CTL的T细胞亚型。

[使用培养袋的CTL的大量培养]

本培养工序的特征为，在作为以往方法的抗原特异性的细胞毒性T细胞(CTL)的诱导中不使用树突状细胞，而使用自体血浆，因此能够以低廉且简便的操作制备大量CTL。技术的详情详细记载于发明人等的专利申请(日本专利申请第2009-166630号)。

用肝素(heparin)采血管收集HLA-A11阳性健康成人外周血20～200mL，于室温以3,000rpm进行10分钟离心处理。分取上清的血浆，进行灭活处理(56℃、20分钟)。再次于室温以3,000rpm进行10分钟离心处理，回收上清后，分注于小容器，保存于-30℃，准备随时溶解制成培养用血浆使用。分取上清血浆后的残余物加入等量RPMI1640培养基，以Ficoll比重离心分离法将PBMC分离。测量细胞数，使10/11量的细胞悬浮于RPMI1640培养基，加入培养用血浆使终浓度成为10％。接着添加CTL表位肽，使用Luer-Lock注射器注入到培养用袋(CultiLife215TAKARA BIO公司)中，于37℃、5％CO₂的CO₂恒温箱中静置(CTL诱导袋)。使1/11量的细胞悬浮于RPMI1640培养基，加入培养用血浆使终浓度成为10％，添加抗CD3抗体使终浓度成为1μg/mL后，使用Luer-Lock注射器注入到培养用袋，于37℃、5％CO₂的CO₂恒温箱中静置(抗原呈递细胞诱导袋)。2日后将等量的含IL-2的培养基(RPMI1640IL-2 100IU/mL)注入到培养用袋。于CO₂恒温箱内进行5日培养后，将等量的含IL-2的培养基(AlyS505N IL-2 100IU/mL)注入到培养用袋。之后每隔3日注入等量的含IL-2的培养基(AlyS505N IL-2100IU/mL)(在此的间隔不一定需要统一)。通过以上操作，能在培养开始起约14日的期间诱导抗原特异性CTL与抗原呈递细胞两者。约14日后回收抗原呈递细胞诱导袋的细胞，计数细胞数并进行离心处理后，悬浮于RPMI1640培养基，添加CTL表位肽，于室温培养1小时。离心后吸去上清，悬浮于含IL-2的培养基(AlyS505N IL-2 100IU/mL 10％血浆)(肽脉冲抗原呈递细胞)中。同样，回收CTL诱导袋的细胞，计数细胞数并进行离心处理后，吸去上清，将细胞悬浮于含IL-2的培养基(AlyS505N IL-2 100IU/mL 10％血浆)中。和与CTL诱导袋的细胞数等量的肽脉冲抗原呈递细胞混合，使用Luer-Lock注射器注入到培养用袋。之后，将培养用袋移到37℃、5％CO₂的CO₂恒温箱内，开始培养。1日后于培养用袋内追加增殖用培养基(AlyS505N IL-2 1000IU/mL)。于CO₂恒温箱内培养3日后，于培养用袋内追加增殖用培养基。之后每隔2日进行增殖用培养基的追加。通过以上操作，可于培养开始起约20～24日的短时间获得抗原特异性CTL。

[CTL表位候选肽的选择]

1.使用计算机的分析

本发明的CKAP4特异性的CTL表位候选肽可如下选择：针对CKAP4蛋白的氨基酸序列，参照能检索对于目标HLA第I型分子有结合基序的由8～12个氨基酸构成的肽的在因特网上公开的多个软件(Lundegaard C，Lund O，Buus S，Nielsen M，Majorhistocompatibility complex class I binding predictions as a tool in epitopediscovery.Immunology.，2010；130：309-318)进行选择。

2.使用锚定基序的研究

HLA第I型分子主要有HLA-A、HLA-B、HLA-C，和它们结合并被呈递的表位肽由8～10个氨基酸构成。自表位肽的N末端侧起第2号、及第9或10号的氨基酸是对于与HLA第I型分子的结合最重要的氨基酸，被称为锚定基序。此锚定基序据报告因各HLA第I型分子的种类而异。例如作为与全世界研究最进步的HLA-A2分子结合的肽，最熟知的是以在N末端起第2号的位置配置Leu，在第9或10号位置配置Leu或Val的肽、且是由9～10个氨基酸构成的肽(TSudo，N Kamikawaji，A Kimura，Y Date，CJ Savoie，H Nakashima，E Furuichi，S Kuhara，and T Sasazuki Differences in MHC class I self peptide repertoires among HLA-A2 subtypes.J.Immunol.，1995；155：4749-4756)。另外，作为和在包括日本人在内的亚洲人种常见的HLA-A24分子结合的肽，最熟知的是以自N末端起第2号位置配置Tyr、Phe、Met或Trp中任一者，在第9或10号位置配置Leu、Ile、Trp或Phe中任一者的肽、且是由9～10个氨基酸构成的肽(A Kondo，J Sidney，SSouthwood，MF del Guercio，E Appella，H Sakamoto，ECelis，HM Grey，RW Chesnut，and RT Kubo，Prominent roles of secondary anchorresidues in peptide binding to HLA-A24 human class I molecules.，J.Immunol.，1995；155：4307-4312)。可以从蛋白的氨基酸序列中检索由具有此锚定基序的8～12个氨基酸构成的序列并且选择CTL表位候选肽。

[肽的合成]

本发明的序列编号：36～47所示的CTL表位候选肽可通过以往的各种肽合成方法制备。例如，可使用固相肽合成法等有机化学合成法、或制备编码肽的核酸并使用重组DNA技术制备。另外，也可以利用市售的化学合成装置(例如Applied Biosystems公司的肽合成装置)合成。

[CTL表位候选肽的研究]

如上所述，通过使用预测软件，能于短时间分析构成蛋白的氨基酸序列，并且预测CTL表位候选肽与HLA的结合力、解离的半衰期。但是，使用这样的预测软件获得的候选肽不一定在生物体内会作为CTL表位发挥作用。

作为第一个理由，可列举这些分析软件几乎未考虑到因蛋白的分解所致的肽片段产生的效率。CTL表位由8～12个氨基酸残基长的肽片段构成，它们是在细胞内因抗原蛋白受到各种分解而产生。具体而言，首先抗原蛋白在细胞质内因为蛋白酶体而受分解，形成肽的C末端。之后，通过TAP(transporter associated with antigen processing，抗原加工相关转运体)分子而转运到内质网内腔，于此在称为ERAP1的蛋白酶作用下形成N末端后才成为8～12个氨基酸残基长的肽片段。CTL抗原表位候选肽的预测必需考虑在该等细胞内的肽片段的产生过程、效率，但目前还无法准确地进行预测。所以，使用预测软件获得的候选肽的中，实际上会包括在细胞内无法构成8～12个氨基酸残基长的肽片段者。

第二个理由是T细胞的选择性分化过程。癌抗原为自体抗原，对于来自自体抗原的肽片段强力反应的T细胞会因为负选择(negative selection)而在胸腺内被诱导细胞凋亡并排除。另一方面，对于外来抗原反应的T细胞会因正选择而被选择。由于如此的T细胞的分化过程，和来自自体抗原的肽片段反应的T细胞通常会在胸腺中被除去，据认为于外周血中仅有极少存在。另外，在全部的有核细胞、血小板的膜表面表达的HLA分子会呈递来自自体抗原的肽片段，和HLA结合的肽片段有无数种存在。即，在细胞膜表面上HLA所呈递的来自自体抗原的肽片段中，CTL会识别的只有非常少数，据认为通过预测软件得到的CTL表位候选肽大部分都无法被CTL识别。也就是说被认为无抗原性。

基于这些理由，可以说仅通过预测软件获得CTL表位候选肽，和对担任免疫应答的CTL表位肽进行鉴定大不相同。发明人等通过使用MHC-四聚物试剂直接检测对于候选肽为特异性的生物体内的CTL的方法，进行CTL表位肽的鉴定。也就是说，从外周血等试样利用MHC-四聚物试剂来检测特异性CTL，是指在生物体内引发候选肽特异性的免疫应答，表示候选肽为CTL表位肽。

由以上，通过前述方法选择的CTL表位候选肽经以下所示的(1)～(3)的研究后才成为CKAP4特异性CTL表位肽。

(1)使用培养细胞株的研究

利用蛋白酶体进行的蛋白分解生成的肽片段通过TAP分子被引导到内质网内腔，结合于HLA第I型分子与β2-微球蛋白的复合体，并向细胞膜表面转运。此TAP分子缺损的TAP基因缺陷细胞株无法在细胞膜表面表达作为内在性蛋白的分解产物的肽片段。另外，在代表性的TAP基因缺陷细胞株即人淋巴母细胞样细胞株T2、或将HLA-A24分子基因导入至T2而得到的细胞株(T2-A24)的HLA分子，在细胞膜表面上的表达非常不稳定。但是，若和从外部供给的肽结合时，HLA分子会在细胞膜表面上稳定化。利用此性质，TAP基因缺陷细胞株可用于验证HLA分子与从外部供给的肽的结合性的实验中。具体而言，将TAP基因缺陷细胞株与CTL表位候选肽混合培养后，用抗HLA抗体染色，通过流式细胞仪算出HLA分子的表达强度的变化，可以研究目标HLA分子与CTL表位候选肽的结合性。当添加的CTL表位候选肽结合于TAP基因缺陷细胞株所表达的HLA分子时，HLA分子与肽的复合体会在细胞膜表面上稳定化，用抗HLA抗体染色时，观察到HLA分子的表达增强。另一方面，添加的CTL表位候选肽不显示和HLA分子的结合性时，细胞膜表面上的HLA分子不稳定，即使用抗HLA抗体染色，仍不能确认到HLA分子的表达增强。利用这样的方法可以验证HLA分子与CTL表位候选肽的结合性。

(2)折叠试验

MHC-四聚物试剂是于试管内制造MHC(人的情形为HLA)与β2-微球蛋白及肽片段的3者复合体(MHC-单体)并将MHC-单体予以4聚体化而得到的试剂。MHC-四聚物试剂是能够选择性地检测显示MHC限制性的抗原特异性的CTL的唯一试剂。另外，MHC-四聚物试剂在和抗CD(cluster of differentiation，分化抗原簇)抗体、抗细胞因子抗体等共染色后通过流式细胞仪分析，不仅能定量CTL的量，还能就每一细胞逐一评价其活化状态、分化阶段。MHC-四聚物试剂制造的最初步骤，是从将原料MHC与β2-微球蛋白与肽在试管内的适当溶液中混合的折叠开始的。在折叠溶液中，由于此3种原料的缔合反应，形成3者复合体(MHC-单体)。此时，MHC与肽的结合力越高，此缔合反应会越顺利进行，通过用凝胶过滤柱分析，能够检测3种原料的复合体(MHC-单体)。另一方面，MHC与肽没有结合力时，几乎不能检测到MHC-单体。因此通过经时分析折叠溶液，或进行热处理等，能够验证MHC与肽的结合性及稳定性。

(3)表位肽特异性CTL的检测

将从健康人分离而得到的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclearcells；PBMC)以1～3×10⁶/mL的细胞浓度悬浮在适当的培养基中，在其中加入所合成的CTL表位候选肽(序列编号：36～47)中任一者或数种，使其成为1～100μg/mL的浓度，分注于96孔培养平板，使其成为100μL/孔。在5％CO₂恒温箱于37℃进行培养，2日后添加IL-2。以后，每7～14日进行1次利用肽与IL-2进行的刺激以诱导CTL。针对如此诱导而得到的CTL是否对于CTL表位候选肽有特异性的研究，通过MHC-四聚物法进行判定。当检测到能以MHC-四聚物试剂染色的CTL时，使用的CTL表位候选肽可鉴别是有CTL诱导能力的抗原性肽(表位肽)。一般而言，从胸腺移出的T细胞(初始T细胞)是受到树突状细胞、巨噬细胞等抗原呈递细胞的抗原刺激方会活化而分化成效应T细胞。单纯将PBMC与肽混合培养的方法，尤其是因为没有使用人为制备的抗原呈递细胞，故外周血的初始T细胞分化的可能性低，据认为在PBMC存在的效应/记忆T细胞会因肽刺激而增殖。因此当检测到能用MHC-四聚物试剂染色的CTL时，是指原本供血者外周血PBMC中存在效应/记忆型的CTL，启示在生物体内稳态地引起介由抗原性肽的免疫应答。

[CKAP4特异性MHC-单体及MHC-四聚物试剂的制造]

使用CKAP4特异性CTL表位候选肽的MHC-单体及MHC-四聚物试剂可按照公知方法(US Patent Number 5,635,363、French Application Number FR9911133)制备。在折叠溶液内形成从蛋白表达用的基因重组宿主精制得到的HLA第I型分子、β2-微球蛋白及本发明的CKAP4特异性CTL表位候选肽的3者复合体即MHC-单体。在重组HLA第I型分子的C末端预先附加生物素结合部位，MHC-单体形成后此部位会附加生物素。将市售的经色素标记的链霉亲和素与生物素化MHC-单体以摩尔比1：4混合，藉此可以制造MHC-四聚物试剂。另外，通过组合使用抗细胞表面蛋白的抗体(CD62L、CCR7、CD45RA等)，能够研究CTL的分化阶段(SederRA，Ahmed R.Similarities and differences in CD4+and CD8+effector and memory Tcell generation.Nat Immunol.2003；4：835-842)。或通过和细胞内细胞因子染色法组合，能够用于CTL的功能性评价。例如，丙型肝炎维持持续感染的原因之一，据报告可能是虽存在对抗HCV(Hepatitis C virus)的CTL，但是CTL不产生细胞因子等、或产生的CTL的比例极低，成为免疫学上无反应性(anergy)(Gruener NH，Lechner F，Jung MC，Diepolder H，Gerlach T，Lauer G，Walker B，Sullivan J，Phillips R，Pape GR，KlenermanP.Sustained dysfunction of antiviral CD8+T lymphocytes after infection withhepatitis C virus.J Virol.2001；75：5550-5558)。另外，针对骨髓移植后的HCMV特异性CTL，不仅研究其CTL是否存在，也有人开始认为研究细胞因子产生能力的强弱对于为了计算抗病毒药投予等的时机是有效的(Ozdemir E，St John LS，Gillespie G，Rowland-JonesS，Champlin RE，Molldrem JJ，Komanduri KV.Cytomegalovirus reactivation followingallogeneic stem cell transplantation is associated with the presence ofdysfunctional antigen-specific CD8+T cells.Blood.2002；100：3690-3697)。依此方式鉴定特异性的CTL表位肽并制造MHC-四聚物试剂，能进行特异性的CTL的定量与定性，在获得诊断信息方面有巨大贡献。

[主动免疫疫苗]

肽疫苗

本发明的CTL表位肽在主动免疫疗法中可作为肽疫苗使用。也就是说，将含有本发明的CTL表位肽而成的疫苗对于患者投予，使CKAP4特异性CTL在体内增殖，能期待对恶性肿瘤的治疗。

利用了抗原呈递细胞的疫苗

呈递本发明的CTL表位肽的抗原呈递细胞在主动免疫疗法中可作为疫苗使用。呈递CTL表位肽的抗原呈递细胞是指：

1.使抗原呈递细胞与CTL表位肽在适当培养液中混合30分钟至1小时而得到的CTL表位肽脉冲抗原呈递细胞

3.具有人工制备的抗原呈递能力的人工抗原呈递细胞。

抗原呈递细胞是指，例如树突状细胞、B细胞、巨噬细胞、某种T细胞等，是在其细胞膜表面上表达该肽能结合的HLA分子的细胞，且有CTL刺激能力。具有人工制备的抗原呈递能力的人工抗原呈递细胞可通过例如将HLA分子与CTL表位肽与β2-微球蛋白的3者复合体固定在脂质双层膜、塑料或乳胶等珠粒上，并固定能刺激CTL的CD80、CD83、CD86等共刺激分子，或固定对与共刺激分子结合的T细胞侧的配体CD28具有激动作用的抗体等来制备(Oelke M，Maus MV，Didiano D，June CH，Mackensen A，Schneck JP.Ex vivo inductionand expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coatedartificial antigen-presenting cells.Nat Med.2003；9：619-624、Walter S，HerrgenL，Schoor O，Jung G，Wernet D，Buhring HJ，Rammensee HG，Stevanovic S.Cutting edge：predetermined avidity of human CD8T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres.J Immunol.2003；171：4974-4978、Oosten LE，Blokland E，van Halteren AG，Curtsinger J，Mescher MF，Falkenburg JH，Mutis T，GoulmyE.Artificial antigen-presenting constructs efficiently stimulate minorhistocompatibility antigen-specific cytotoxic T lymphocytes.Blood.2004；104：224-226)。

基因疫苗

本发明的CTL表位肽的核酸在主动免疫疗法中可用于DNA疫苗、重组病毒载体疫苗等。于此情形，CTL表位肽的核酸序列优选变更为适合重组疫苗、产生重组病毒疫苗的宿主的密码子使用频率(codon usage)(Casimiro，D.R.et al.Comparative Immunogenicityin Rhesus Monkeys of DNA Plasmid，Recombinant Vaccinia Virus，and Replication-Defective Adenovirus Vectors Expressing a Human Immunodeficiency Virus Type1gag Gene.J.Virol.，2003；77：6305-6313、Berzofsky JA，Ahlers JD，Janik J，Morris J，Oh S，Terabe M，Belyakov IM.Progress on new vaccine strategies against chronicviral infections.J Clin Invest.2004；114：450-462)。

本发明的CTL表位肽、或含有呈递CTL表位肽的抗原呈递细胞而成的疫苗可使用本领域公知的方法制备。例如，作为该疫苗，有含有本发明的CTL表位肽作为有效成分的注射剂或固体剂等。CTL表位肽可以中性或盐的形态配方，例如作为药学上可容许的盐，可列举盐酸、磷酸等无机盐、或乙酸、酒石酸等有机酸。另外，呈递本发明的CTL表位肽的抗原呈递细胞，可以使用制药上容许，且和该肽或该细胞的活性有相容性的赋形剂，例如水、食盐水、葡萄糖、乙醇、甘油、DMSO(dimethyl sulphoxide，二甲基亚砜)、及其它佐剂等、或将它们的组合混合使用。此外，视需要也可添加白蛋白、湿润剂、乳化剂等辅助剂。

本发明的疫苗可通过非经口投予及经口投予进行投予，一般而言以非经口投予较佳。作为非经口投予，有经鼻投予、皮下/皮内注射、肌肉内注射、静脉内注射等注射剂、栓剂等。另外，作为经口投予，可以制备成和淀粉、甘露醇、乳糖、硬脂酸镁、纤维素等赋形剂的混合物。

本发明的疫苗是以治疗上有效的量进行投予。投予量取决于治疗对象、免疫是，必要的投予量依临床医师的判断决定。通常适当投予量是每名患者，CTL表位肽为1～100mg、CTL表位肽刺激细胞为10⁶～10⁹个的含量。另外，投予间隔可依据对象、目的来设定。

[被动免疫疫苗]

本发明的CTL表位肽可以用于被动免疫治疗剂的制备。可将依以下方式获得的CKAP4特异性的CTL悬浮于含有人白蛋白的PBS等中，制成针对表达CKAP4的恶性肿瘤的被动免疫疗法剂。被动免疫疗法剂所含的对于CKAP4为特异性的CTL可依如下的制备方法获得，为了提高CTL的纯度，也可以精制后使用。

CTL制备方法1

使PBMC和适当浓度的CKAP4特异性MHC-四聚物试剂反应。和MHC-四聚物试剂结合的CKAP4特异性CTL因为被标记色素染色，所以使用细胞分选仪、显微镜等只将已染色的CTL分离。使依次方式分离的CKAP4特异性的CTL被经抗CD3抗体、PHA、IL-2等T细胞刺激药剂、X射线照射或丝裂霉素处理等而丧失了增殖能力的抗原呈递细胞刺激并增殖，确保被动免疫疗法所需的细胞数。

CTL制备方法2

将CKAP4特异性MHC-单体和/或MHC-四聚物试剂固相化于无菌细胞培养平板等，将PBMC在固相化细胞培养平板上培养。为了将和固相化于平板的MHC-单体和/或MHC-四聚物试剂结合的CKAP4特异性CTL分离，将未结合而是悬浮的其它细胞洗掉后，只将残留在平板上的CKAP4特异性CTL悬浮于新的培养基。使如此分离得到的CKAP4特异性CTL被因抗CD3抗体、PHA、IL-2等T细胞刺激药剂、X射线照射或丝裂霉素处理等而丧失增殖能力的抗原呈递细胞刺激而增殖，确保被动免疫疗法所需的细胞数。

CTL制备方法3

将CKAP4特异性MHC-单体和/或MHC-四聚物试剂、以及CD80、CD83、CD86等共刺激分子、或对于和共刺激分子结合的T细胞侧的配体即CD28具有激动作用的抗体等固相化于无菌细胞培养平板等，将PBMC在固相化细胞培养平板上培养。2日后添加IL-2到培养基中，在5％CO₂恒温箱中于37℃培养7～10日。回收培养后的细胞，在新的固相化细胞培养平板上继续培养。通过重复此操作，确保被动免疫疗法所需的细胞数的CTL。

CTL制备方法4

CTL的精制法

利用MHC-四聚物试剂进行的精制

可使CKAP4特异性MHC-四聚物试剂和通过CTL制备方法诱导出的CTL反应，并将抗标记MHC-四聚物试剂的标记色素的抗体等用经磁性标记的2次抗体进行分离。如此的经磁性标记的2次抗体与磁性标记细胞分离装置例如可以由Dynal公司、Miltenyi Biotec GmbH公司获得。依此方式分离而得到的CKAP4特异性CTL用抗CD3抗体、PHA、IL-2等T细胞刺激药剂刺激并使其增殖，确保被动免疫疗法所需的细胞数。

利用分泌的细胞因子进行的精制

CKAP4特异性CTL可利用释放的细胞因子等进行CKAP4特异性CTL的精制。例如，可通过使用可从Miltenyi Biotec GmbH公司获得的试剂盒，将从CTL释放的细胞因子在细胞表面用特异抗体捕捉，用抗细胞因子标记抗体进行染色，接着用经磁性标记的标记物质特异性的抗体反应后，使用磁性标记细胞分离装置进行精制。将如此分离而得到的CKAP4特异性CTL用抗CD3抗体、PHA、IL-2等T细胞刺激药剂刺激并使其增殖，确保被动免疫疗法所需的细胞数。

使用了细胞表面蛋白特异性抗体的精制

据报告在特异性CTL的细胞表面有在特异性刺激下表达增强的细胞表面蛋白(例如CD137、CD107a、CD107b、CD63、CD69等)(Betts MR，Brenchley JM，Price DA，De Rosa SC，Douek DC，Roederer M，Koup RA.Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation.J ImmunolMethods.2003；281：65-78、Trimble LA，Shankar P，Patterson M，Daily JP，LiebermanJ.Human immunodeficiency virus-specific circulating CD8T lymphocytes havedown-modulated CD3zeta and CD28，key signaling molecules for T-cellactivation.J Virol.2000；74：7320-7330、Watanabe K，Suzuki S，Kamei M，Toji S，Kawase T，Takahashi T，Kuzushima K，and Akatsuka Y.CD137-guided isolation andexpansion of antigen-specific CD8 cells for potential use in adoptiveimmunotherapy.Int J Hematol，2008；88；311-320)。通过将抗这样的蛋白的特异抗体进行磁性标记，可使用磁性分离装置等将CKAP4特异性CTL精制。另外，通过将对抗这样的特异抗体的抗IgG抗体等进行磁性标记，也同样可进行CKAP4特异性CTL的精制。或将这些特异抗体包被在培养用的塑料平板上，使用此平板来培养已施以刺激的PBMC，将未结合于平板的细胞团洗掉，由此也可将CKAP4特异性CTL精制。使如此分离得到的CKAP4特异性CTL用抗CD3抗体、PHA、IL-2等T细胞刺激药剂刺激并使其增殖，确保被动免疫疗法所需的细胞数。

[CKAP4特异性CTL的定量]

了解CKAP4特异性CTL是否存在于癌患者的外周血或其量的变动，是用于预测利用CKAP4特异性CTL表位肽的主动免疫及被动免疫疫苗的有效性的重要信息。另外在被动免疫疫苗中，制剂中的CKAP4特异性CTL的含量需预先测定。CKAP4特异性CTL的定量，可通过使用了本发明的CTL表位肽的以下3种方法进行。

定量方法1(MHC-四聚物法)

可采用使用本发明的CTL表位肽而制得的MHC-四聚物试剂定量对于外周血中的CKAP4特异性的CTL。定量例如可如下实施。使外周血或PBMC和适当浓度的MHC-四聚物试剂反应。因为和该MHC-四聚物试剂结合的CTL可被标记色素染色，故可使用流式细胞仪、显微镜等计数。与MHC-四聚物试剂反应时，通过使其和用与MHC-四聚物试剂不同的色素标记的抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体等反应，也能同时判定CKAP4特异性的CTL的T细胞亚型。

定量方法2

其是通过用本发明的CTL表位肽刺激PBMC，定量CTL所产生的IFNγ(interferongamma)、TNFα(tumor necrosis factor alpha)、白细胞介素等细胞因子和/或趋化因子的方法。以下举IFNγ为例，具体地示出方法。

2-2利用细胞因子定量进行的方法2(Elispot分析)

于已固相化抗IFNγ抗体的96孔MultiScreen-HA平板(Millipore公司)上接种PBMC。之后，将CTL表位肽放入各孔，于37℃的5％CO₂恒温箱培养器培养20小时。次日洗涤平板，按照抗IFNγ抗体、过氧化酶(peroxidase)标记抗IgG抗体的顺序使其反应。然后，加入过氧化酶的基质，利用发色使IFNγ点可见化，使用实体显微镜或是ELISPOT分析仪(C.T.L.公司)进行计数来定量。

定量方法3

使用细胞表面蛋白特异性抗体进行定量。据报告对于CTL表位肽有特异性的CTL由于特异性刺激，细胞表面蛋白(例如CD137、CD107a、CD107b、CD63、CD69等)的表达会增强(Watanabe K，Suzuki S，Kamei M，Toji S，Kawase T，Takahashi T，Kuzushima K，andAkatsuka Y.CD137-guided isolation and expansion of antigen-specific CD8 cellsfor potential use in adoptive immunotherapy.Int J Hematol，2008；88；311-320)。因此通过将经CTL表位肽等刺激的PBMC和特异性地识别细胞表面蛋白的标记抗体进行混合，CTL会和标记抗体结合并被标记色素染色。经染色的CTL可以使用流式细胞仪、显微镜等计数并定量。此外，通过添加用与标记抗体不同的色素标记的抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体等，也可同时判定特异性CTL的T细胞亚型。

[对于肽-MHC复合体有特异性的抗体]

针对已鉴定的癌抗原表位肽与MHC的复合体有特异性的单克隆抗体(以下称为pMHC抗体)能够特异性地检测将表位肽呈递在细胞膜表面的癌细胞。所以，pMHC抗体能作为癌免疫疗法的诊断药使用，此外，通过抗体依赖性细胞毒性(以下ADCC活性)或使其和抗癌剂结合等，作为特异性高的治疗用抗体也是有用的。pMHC抗体的获得一般是利用噬菌体展示法进行。噬菌体展示法是指以不使噬菌体的感染力丧失的方式，使外来基因表达为融合蛋白的***。已知利用此***，使噬菌体表达抗体可变区并筛选，可以将特异性的单克隆抗体分离(Tsukahara T，Emori M，Murata K，Hirano T，Muroi N，Kyono M，Toji S，WatanabeK，Torigoe T，Kochin V，Asanuma H，Matsumiya H，Yamashita K，Himi T，Ichimiya S，WadaT，Yamashita T，Hasegawa T，Sato N.Specific targeting of a naturally presentedosteosarcoma antigen，papillomavirus binding factor peptide，using anartificial monoclonal antibody.J Biol Chem.2014；289(32)：22035-22047)。pMHC抗体的获得是按照抗体文库的制作、淘选、抗体分离、评价的流程进行的。淘选是将癌抗原表位肽与MHC的复合体(MHC-单体)固相化在ELISA平板等上，或使用用生物素-抗生物素蛋白(biotin-avidin)结合固定者，使其和噬菌体库反应，重复进行洗涤、洗脱，可将对于表位肽与MHC的复合体有特异性的结合力高的抗体分离。于前述TAP基因缺陷株T2添加表位肽并使抗体反应，以FCM测定平均荧光强度等，可以评价获得的抗体。

需要说明的是，本说明书引用的全部现有技术文献作为参考纳入于本说明书中。

实施例

以下举实施例对本发明具体地进行说明，但本发明不限定于这些。若无特别指明，实验法是参考成书(免疫实验操作法，右田俊介、绀田进、本庶佑、滨冈利的、南江堂，1995)进行的。

[实施例1]

[EBV特异性CTL表位候选肽的选择]

EBV依表达的蛋白的差异等而分类为1型与2型。感染、潜伏于人的大部分是1型，以AG876为主的2型的感染在亚洲不多(Dambaugh T，Hennessy K，Chamnankit L，KieffE.U2region of Epstein-Barr virus DNA may encode Epstein-Barr nuclear antigen2.Proc Natl Acad Sci U S A.1984Dec；81(23)：7632-6)。但是，也有人报告于同一个体的EBV共感染例，也有人报告EBV感染株的人种、地区相关的多样性(Apolloni A，SculleyTB.Detection of A-type and B-type Epstein-Barr virus in throat washings andlymphocytes.Virology.1994Aug 1；202(2)：978-81、Correa RM，Fellner MD，Alonio LV，Durand K，Teyssie AR，Picconi MA.Epstein-barr viruS(EBV)in healthy carriers：Distribution of genotypes and 30 bp deletion in latent membrane protein-1(LMP-1)oncogene.J Med Virol.2004Aug；73(4)：583-8、Klemenc P，Marin J，Soba E，GaleN，Koren S，Strojan P.Distribution of Epstein-Barr virus genotypes in throatwashings，sera，peripheral blood lymphocytes and in EBV positive tumor biopsiesfrom Slovenian patients with nasopharyngeal carcinoma.J Med Virol.2006Aug；78(8)：1083-90、Trimeche M，Bonnet C，Korbi S，Boniver J，de Leval L.Associationbetween Epstein-Barr virus and Hodgkin's lymphoma in Belgium：a pathologicaland virological study.Leuk Lymphoma.2007 Jul；48(7)：1323-31、Tiwawech D，Srivatanakul P，Karalak A，Ishida T.Association between EBNA2 and LMP1 subtypesof Epstein-Barr virus and nasopharyngeal carcinoma in Thais.

J Clin Virol.2008May；42(1)：1-6.)。迄今为止，已分离出多数EBV株，但是因为共感染、病毒株多样性的问题，碱基序列的解析遇到困难，全部碱基序列已确定的只有B95.8、AG876、MUTU、GD1、GD2、HKNPC1及AKATA共计7种病毒株(Baer R，Bankier AT，BigginMD，Deininger PL，Farrell PJ，Gibson TJ，Hatfull G，Hudson GS，Satchwell SC，SeguinC，et al.DNA sequence and expression of the B95-8Epstein-Barr virusgenome.Nature.1984Jul 19-25；310(5974)：207-11、Zeng MS，Li DJ，Liu QL，Song LB，LiMZ，Zhang RH，Yu XJ，Wang HM，Ernberg I，Zeng YX.Genomic sequence analysis ofEpstein-Barr virus strain GD1from a nasopharyngeal carcinoma patient.JVirol.2005Dec；79(24)：15323-30、Dolan A，Addison C，Gatherer D，Davison AJ，McGeochDJ.The genome of Epstein-Barr virus type 2 strain AG876.

Virology.2006Jun 20；350(1)：164-70、Liu P，Fang X，Feng Z，Guo YM，Peng RJ，Liu T，Huang Z，Feng Y，Sun X，Xiong Z，Guo X，Pang SS，Wang B，Lv X，Feng FT，Li DJ，Chen LZ，Feng QS，Huang WL，Zeng MS，Bei JX，Zhang Y，Zeng YX.Direct sequencing andcharacterization of a clinical isolate of Epstein-Barr virus fromnasopharyngeal carcinoma tissue by using next-generation sequencingtechnology.J Virol.2011Nov；85(21)：11291-9.、Kwok H，Tong AH，Lin CH，Lok S，Farrell PJ，Kwong DL，Chiang AK.Genomic sequencing and comparative analysis ofEpstein-Barr virus genome isolated from primary nasopharyngeal carcinomabiopsy.PLoS One.2012；7(5)：e36939.、Lin Z，Wang X，Strong MJ，Concha M，Baddoo M，XuG，Baribault C，Fewell C，Hulme W，Hedges D，Taylor CM，Flemington EK.Whole-genomesequencing of the Akata and Mutu Epstein-Barr virus strains.J Virol.2013Jan；87(2)：1172-82.)。

这些病毒株间的主要蛋白的表达差异、氨基酸序列的差异已部分解析出来，针对LMP2与EBNA1也已有一些报告(Midgley RS，Bell AI，Yao QY，Croom-Carter D，Hislop AD，Whitney BM，Chan AT，Johnson PJ，Rickinson AB.HLA-A11-restricted epitopepolymorphism among Epstein-Barr virus strains in the highly HLA-A11-positiveChinese population：incidence and immunogenicity of variant epitopesequences.J Virol.2003 Nov；77(21)：11507-16、Wang X，Liu X，Jia Y，Chao Y，Xing X，Wang Y，Luo B.Widespread sequence variation in the Epstein-Barr virus latentmembrane protein 2A gene among northern Chinese isolates.J Gen Virol.2010Oct；91(Pt 10)：2564-73.、Han J，Chen JN，Zhang ZG，Li HG，Ding YG，Du H，ShaoCK.Sequence variations of latent membrane protein 2A in Epstein-Barr virus-associated gastric carcinomas from Guangzhou，southern China.PLoS One.2012；7(3)：e34276.)。

本发明的LMP2及EBNA1特异性的CTL表位候选肽的选择是以属于EBV1型的最有代表性的病毒株B95.8(GenBank：V01555.2)的氨基酸序列为基础，参考其它病毒株的氨基酸的突变而实施的。具体而言，是参照能够检索对于HLA-A11分子具有结合基序(motif)的由8～10个氨基酸所构成的CTL表位候选肽的在因特网上公开的多个软件而实施。其结果，选择从EBV LMP2及EBNA1的氨基酸序列选出具HLA-A11分子的结合基序的由9个或10个氨基酸所构成的CTL表位候选肽，LMP2为22种、EBNA1为11种，合计33种，合成这些肽，并于以下作为CTL表位候选肽示出。将不同EBV株中的氨基酸突变部位用下划线表示。本发明中，B95.8株称为野生株，其它病毒株中的氨基酸的取代称为突变。作为阳性对照用的肽，合成来自人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，CMV)的pp65蛋白的HLA-A*11：01限制性表位肽(ATVQGQNLK、序列编号：34)。作为阴性对照用肽，合成survivin-2B的HLA-A*24：02限制性表位肽(AYACNTSTL、序列编号：35)。

(1)合成的来自EBV LMP2的HLA-A*11：01限制性CTL表位肽候选

Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys(序列编号：1)

Ala Asn Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys(序列编号：2)

Ala Ser Ser Ser Ala Ala Ala Gln Arg Lys(序列编号：3)

Ala Asn Ser Ser Ala Ala Ala Gln Arg Lys(序列编号：4)

Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg(序列编号：5)

Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys(序列编号：6)

Val Met Leu Val Leu Leu Ile Leu Ala Tyr(序列编号：7)

Leu Val Leu Leu Ile Leu Ala Tyr Arg(序列编号：8)

Leu Val Leu Leu Ile Leu Ala Tyr Arg Arg(序列编号：9)

Leu Ala Tyr Arg Arg Arg Trp Arg Arg(序列编号：10)

Thr Thr Met Phe Leu Leu Met Leu Leu(序列编号：11)

Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr(序列编号：12)

Lys Val Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr(序列编号：13)

Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr(序列编号：14)

Val Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr(序列编号：15)

Gly Ser Ile Leu Gln Thr Asn Phe Lys(序列编号：16)

Leu Thr Glu Trp Gly Ser Gly Asn Arg(序列编号：17)

Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys Leu(序列编号：18)

Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Ser Leu(序列编号：19)

Thr Val Met Ser Asn Thr Leu Leu Ser(序列编号：20)

Thr Val Met Thr Asn Thr Leu Leu Ser(序列编号：21)

Ala Leu Phe Gly Val Ile Arg Cys Cys Arg(序列编号：22)

(2)合成的来自EBV EBNA1的HLA-A*11：01限制性CTL表位候选肽

Gly Pro Gly Asn Gly Leu Gly Glu Lys(序列编号：23)

Ser Ser Ser Ser Gly Ser Pro Pro Arg Arg(序列编号：24)

Gly Gln Gly Asp Gly Gly Arg Arg Lys(序列编号：25)

His Arg Gly Gln Gly Gly Ser Asn Pro Lys(序列编号：26)

His Arg Gly Glu Gly Gly Ser Ser Gln Lys(序列编号：27)

His Arg Gly Gln Gly Gly Ser Asn Gln Lys(序列编号：28)

Gly Val Phe Val Tyr Gly Gly Ser Lys(序列编号：29)

Lys Thr Ser Leu Tyr Asn Leu Arg Arg(序列编号：30)

Gln Thr His Ile Phe Ala Glu Val Leu Lys(序列编号：31)

Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Glu Lys(序列编号：32)

Ala Ile Lys Asp Leu Val Met Thr Lys(序列编号：33)

(3)为对照用合成的肽

Ala Thr Val Gln Gly Gln Asn Leu Lys(序列编号：34)

Ala Tyr Ala Cys Asn Thr Ser Thr Leu(序列编号：35)

表1、表2、表3示出了合成的LMP2及EBNA1的HLA-A11：01限制性CTL表位候选肽与为对照用合成的肽的特征。肽名称用从合成的肽的N末端侧起3个氨基酸序列表示。从左边起，肽名(表中a)、氨基酸序列(表中b)、来源蛋白的氨基酸序列上的位置、氨基酸数、用解析所使用的NetMHC3.4(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)的HLA Peptide BindingPredictionS(Nielsen M，Lundegaard C，Worning P，Lauemoller SL，Lamberth K，Buus S，Brunak S，Lund O.Reliable prediction of T-cell epitopes using neural networkswith novel sequence representations.Protein Sci.2003May；12(5)：1007-17、Lundegaard C，Lamberth K，Harndahl M，Buus S，Lund O，Nielsen M.NetMHC-3.0：accurate web accessible predictions of human，mouse and monkey MHC class Iaffinities for peptides of length 8-11.Nucleic Acids Res.2008Jul 1；36(WebServer issue)：W509-12.、Lundegaard C，Lund O，Nielsen M.Accurate approximationmethod for prediction of class I MHC affinities for peptides of length 8，10and 11using prediction tools trained on 9mers.Bioinformatics.2008Jun 1；24(11)：1397-8.)算出的得分(表中c)按从高至低的顺序显示。此得分是预测HLA-A11与肽的亲和性的数值，得分越高，代表HLA与肽形成稳定的复合体的可能性越高。另外，表1、表2与表3所示的NetMHC 3.4的得分作为通过分析所使用的11种分析软件获得的代表例表示。

表1

HLA-A*11：01限制性LMP2特异性CTL表位候选肽一览表

表2

HLA-A*11：01限制性EBNA1特异性CTL表位候选肽一览表

表3

为对照用合成的肽

[EBV特异性CTL表位候选肽的折叠试验]

发明者们使用表1、表2与表3中记载的35种肽实施折叠试验。具体而言，将利用大肠杆菌表达***表达精制的HLA-A*11：01与β2-微球蛋白、及合成肽添加到折叠溶液并混合后，经时分取折叠溶液，用凝胶过滤柱进行分析。通过凝胶过滤柱分析可见形成了HLA-A*11：01与β2-微球蛋白、及EBV特异性CTL表位候选肽的3者复合体(MHC-单体)时，由于MHC-单体比原料的分子量较大，在凝胶过滤柱分析中的洗脱时间较快。另外，MHC-单体形成量可由在280nm的吸收波长获得的峰部面积算出。另一方面，和HLA分子没有结合性的候选肽则未确认到MHC-单体形成。将可见MHC-单体形成时的代表性凝胶过滤柱分析例示于图1。

凝胶过滤柱分析的结果中，当HLA分子与β2-微球蛋白利用大肠杆菌表达***进行表达精制时，以封入体的形式将不溶性级分精制后溶解于8M尿素中，但难溶性的HLA分子未形成MHC-单体者以凝聚体的形式于7～8分钟被检测出。但是，凝聚体大多在凝胶过滤柱分析的前处理工序即滤器过滤中被除去。β2-微球蛋白是可溶性蛋白，在折叠溶液中溶解，使用Superdex75 10/300GL(GE Healthcare公司)时，会在14分钟附近检测出。15分钟以后，检测到折叠溶液的组合物、肽。折叠试验开始时(第0天)未确认到MHC-单体的峰部，但是1日后(第1天)、3日后(第3天)，峰部增大，显示MHC-单体的形成顺利地进行。

图2及图3示出了对于35种肽实施的折叠试验的1、3、7日后的分析结果。作为阳性对照肽，使用来自CMV的pp65蛋白的HLA-A*11：01限制性表位肽(ATVQGQNLK、序列编号：34)，作为阴性对照，使用来自survivin-2B的HLA-A*24：02限制性表位肽(AYACNTSTL、序列编号：35)作为比较对象。将显示MHC-单体形成的峰部的面积用条图表示。序列编号：1～22(LMP2)与序列编号：23～33(EBNA1)和为阳性对照肽及阴性对照的序列编号：34～35比较的结果分别示于表4与表5。

表4

EBV LMP2特异性CTL表位候选肽的HLA-A*11：01结合性

表5

EBV EBNA1特异性CTL表位候选肽的HLA-A*11：01结合性

表4与表5示出了肽候选的HLA-A*11：01结合性。就结合性的有无而言，在折叠试验中，超过阴性对照的结合性的最高值(135,674μV*秒)者判为有结合性，记为○，不及时判为无结合性，记为×。如此根据实验值判定的HLA-A*11：01结合性不一定和计算机算法获得的预测值一致，折叠试验的实验值是代表在离体(in vitro)时的候选肽与HLA-A*11：01的结合性。以计算机算法预测的下位(预测值<0.400)8个侯选肽的任一者在折叠试验的实验的结果中皆显示HLA-A*11：01结合性。另一方面，折叠试验的实验的结果中未显示HLA-A*11：01结合性的4个肽的预测值如下。VML：0.417；LVL(9mer)：0.439；TTM：0.477；KIL：0.602。可知尽管任一预测值皆高于0.400，但未与HLA-A*11：01结合。依此方式，只通过计算机算法无法判断表位候选肽与HLA分子间的结合性。

[EBV LMP2特异性MHC-四聚物试剂的制造]

依折叠试验的结果，使用HLA-A*11：01结合性的EBV LMP2特异性或EBV EBNA1特异性CTL表位候选肽制造PE标记MHC-四聚物试剂。本发明制造的MHC-四聚物试剂例如以ASS(10mer)-Tet简单表示，其是使用HLA-A*11：01与ASS(10mer)肽(ASSYAAAQRK、序列编号：1)与β2-微球蛋白的3者复合体制造的。使从蛋白表达用的基因重组宿主精制而得到的HLA第I型分子、β2-微球蛋白及本发明的EBV LMP2或EBVEBNA1特异性CTL表位候选肽的复合体即MHC-单体在适当的折叠溶液中形成。在重组HLA第I型分子的C末端预先附加生物素(biotin)结合部位，于MHC-单体形成后在此部位附加生物素。可通过将市售的经色素标记的链霉亲和素(streptavidin)与生物素化MHC-单体以摩尔比1：4混合，来制造MHC-四聚物试剂。

[EBV特异性CTL表位肽的鉴定]

(试样的HLA型的选定)

EBV特异性CTL表位候选肽是对于HLA-A*11：01选择有结合基序的33种候选肽。另外，利用折叠试验已解明在试管内，HLA-A*11：01与β2-微球蛋白与29种EBV特异性CTL表位候选肽结合并形成MHC-单体。实际上，为了确认此29种EBV LMP2特异性或EBNA1特异性CTL表位候选肽是否会与HLA-A*11：01结合，并且在生物体内是否存在识别其的CTL，需要使用保持HLA-A*11：01的供血者的外周血，研究将外周血中存在的EBV特异性CTL扩增是否可能。最初，供血者是否保持HLA-A*11：01，是使用Genosearch(商标)HLA-A Ver.2(MBL公司)通过HLA-A的基因型判定来确认。以后的研究是使用保有HLA-A*11：01的5名健康成人的PBMC进行。

[抗原呈递细胞的制备]

(1)EBV感染B细胞株的制备

依标准方法(Kuzushima K，Yamamoto M，Kimura H，Ando Y，Kudo T，Tsuge I，Morishima T.Establishment of anti-Epstein-Barr viruS(EBV)cellular immunity byadoptive transfer of virus-specific cytotoxic T lymphocytes from an HLA-matched sibling to a patient with severe chronic active EBV infection.ClinExp Immunol.1996；103：192-198)，将EBV产生细胞株B95.8细胞株(从JCRB Cell Bank获得)的培养上清(包括活EBV病毒)与PBMC进行混合培养，建立EBV感染B细胞株(Lymphoblastoid cell line，以下称为EBV感染LCL)。约2周后，确认HLA分子的表达、CD80、CD83、CD86及CD20的表达。

(2)CD40-B细胞的制备

将导入人CD40L基因并使其稳定表达的NIH3T3细胞(NIH-CD40L)与PBMC在IL-4存在下共培养。NIH-CD40L利用96Gy的X射线照射进行妨碍增殖，每3～4日反复进行共培养(Kondo E，Topp MS，Kiem HP，Obata Y，Morishima Y，Kuzushima K，Tanimoto M，Harada M，Takahashi T，Akatsuka Y.Efficient generation of antigen-specific cytotoxic Tcells using retrovirally transduced CD40-activated B cells.J Immunol.2002；169：2164-2171)。约2周后确认到HLA分子的表达、CD80、CD83与CD86的表达。

(3)树突状细胞的制备

将PBMC在塑料制培养皿中于37℃、5％CO₂恒温箱内进行2小时培养，对未粘附于培养皿的细胞进行轻轻流洗。于其中添加GM-CSF与IL-4并培养24小时后，接着加入TNFα与IL-1β及PGE2(Prostaglandin E2)，并培养24～48小时。将用适当培养基等轻轻流洗而回收得到的细胞作为树突状细胞(Kondo E，Topp MS，Kiem HP，Obata Y，Morishima Y，KuzushimaK，Tanimoto M，Harada M，Takahashi T，Akatsuka Y.Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated Bcells.J Immunol.2002；169：2164-2171)。48小时后确认到HLA分子的表达、CD80、CD83与CD86的表达。

[EBV特异性CTL的诱导]

1)利用了抗原呈递细胞的诱导

利用保持HLA-A*11：01的PBMC，预先制备前述抗原呈递细胞(EBV感染LCL、CD40-B细胞、树突状细胞)。使抗原呈递细胞悬浮在刺激用培养基(0.1％人血清白蛋白/55μM 2-巯基乙醇/RPMI 1640)或AIM-V培养基(Invitrogen公司)中，以10μg/mL的浓度添加CTL表位候选肽，约隔15分钟边穏定地混合边于室温放置30～60分钟后，以过量的洗涤液(2％胎牛血清(FCS)/PBS)进行3次洗涤，流洗去未与HLA分子结合的肽。通过进行此操作，据认为CTL表位候选肽与在抗原呈递细胞上的HLA分子结合。进行此操作的抗原呈递细胞称为肽刺激抗原呈递细胞。为了使肽脉冲抗原呈递细胞丧失增殖能力，进行致死量的X射线照射、或丝裂霉素C处理。将其和从同一人物分离而得到的PBMC、或CD8阳性或CD4阳性T细胞混合，并于37℃、5％CO₂恒温箱中进行培养。使用的培养基已进行了含10％FCS的RPMI1640培养基、或含10％人血清的RPMI1640培养基、或含1～10％的人血浆的RPMI1640培养基等的研究，但本方法中，以含10％人血清的RPMI1640培养基可获得良好结果。为了T细胞的生存维持及帮助增殖，添加了IL-2(盐野义制药公司)，但很多报告其时机通常是混合培养开始后第7～14日，本发明中，进行在培养开始时、培养开始2日后、6日后等的IL-2的研究，结果培养开始2日后投予时获得了良好结果，因此在培养开始2日后以50U/mL的浓度添加。培养开始10～14日后再次使用肽脉冲抗原呈递细胞增加刺激。每10～14日使用肽脉冲抗原呈递细胞增加刺激，CTL诱导的评价约在2周后与4周后实施。能确认EBV特异性CTL的诱导时，再使用肽脉冲抗原呈递细胞脉冲增加刺激并建立CTL细胞株。

2)未利用抗原呈递细胞的诱导法

本诱导法是于PBMC培养液中投入肽而诱导CTL的方法。据认为PBMC中存在的抗原呈递细胞，例如树突状细胞、B细胞、巨噬细胞、某种T细胞呈递肽，PBMC所含的CTL前驱细胞受到刺激并增殖。和前述利用抗原呈递细胞的诱导法不同，区别是无需事前制备抗原呈递细胞，优点是可简便地实施。是特意不利用抗原呈递细胞而刺激在外周血中循环的记忆/效应型CTL并使其增殖的***。

将从保持HLA-A*11：01的健康成人采集的外周血以3,000rpm进行5～10分钟离心处理，并回收上清的血浆部分。血浆部分以外按照以往方法将PBMC分离。特征为在诱导所使用的培养基中添加数％的血浆。本发明中，加入5％的血浆时可获得良好结果。培养基在一般用于细胞培养的培养基中添加适当的添加物及抗生素。本发明使用的CTL诱导培养基使用在RPMI1640 Hepes modify(Sigma公司)中添加了2-巯基乙醇、L-谷氨酰胺、作为抗生素的链霉素与盘尼西林的培养基。除此以外，也可以添加胰岛素、转铁蛋白、***、丙酮酸、人血清白蛋白、非必须氨基酸溶液等。使1～3×10⁶个PBMC悬浮于培养基1～2.5mL中。于其中以1～20μg/mL的浓度添加候选肽。肽浓度可根据肽的溶解度而变更。本发明中，以10μg/mL实施。2日后以20～100U/mL的最终浓度进行IL-2的添加。PBMC与肽的混合培养优选使用能进行二氧化碳气体交换的圆底的培养皿，本发明中，使用聚丙烯制14mL的圆底管(BDBiosciences公司)或96孔U底细胞培养用微孔平板(BD Biosciences公司)。EBV特异性CTL的确认以培养2周及4周后为目标实施。以培养2周后为目标，再次用10μg/mL的肽进行刺激。在能够确认EBV特异性CTL的诱导时，使用肽脉冲抗原呈递细胞增加刺激，并建立CTL细胞株。

[EBV特异性CTL的确认]

针对以前述方法培养的细胞团是否存在EBV特异性的CTL的研究，利用细胞内IFNγ产生细胞定量法、MHC-四聚物法研究实施。

利用细胞内IFNγ产生细胞定量法进行的特异性CTL诱导的确认

将通过前述方法诱导得到的细胞团的约1/10～全量移到96孔U底细胞培养用微孔平板，添加诱导所使用的肽、使最终为0.01～0.05μg/mL的浓度。进一步添加细胞内蛋白转运抑制剂(例如Brefeldin A、Monensin等)，用5％CO₂恒温箱在37℃培养5～16小时。培养后将细胞洗涤，加入PE(phycoerythrin，藻红蛋白)标记MHC-四聚物试剂与PC5(phycoerythrin-Cy5，藻红蛋白-Cy5)标记抗CD8抗体(Beckman Coulter公司)，于室温放置15～30分钟。洗涤后用4％甲醛于4℃固定15分钟后，用过量的洗涤液清洗。以0.1％皂素进行透膜处理后，添加FITC标记抗IFNγ抗体(Beckman Coulter公司)，于室温反应15～30分钟。洗涤后使用流式细胞仪，定量T细胞中的IFNγ阳性细胞率或MHC-四聚物试剂阳性细胞中的IFNγ阳性细胞率。

图4显示使用阳性对照肽，通过不利用抗原呈递细胞的诱导法诱导特异性CTL，并通过细胞内IFNγ产生细胞定量法研究得到的结果。将从保持HLA-A*11：01而未保持HLA-A*24：02的健康成人外周血分离而得到的PBMC用来自HLA-A*11：01限制性CMV pp65的表位肽(ATVQGQNLK，序列编号：34)或作为阴性对照肽的来自HLA-A*24：02限制性survivin-2B的表位肽(AYACNTSTL，序列编号：35)刺激13日后，使用用于刺激的各肽于Brefeldin A存在下进行14小时再刺激。示出将其用PE标记MHC-四聚物试剂(MBL公司)、PC5标记抗CD8抗体、FITC标记抗IFNγ抗体进行3重染色，并使用流式细胞仪解析得到的结果。散点图展开图中的数字表示存在于四分割区域的细胞占全部活细胞的比例(％)。四分割的区域于下文记载为UL(左上)、UR(右上)、LL(左下)、LR(右下)。在X轴将CD8以log尺度表示、Y轴将相对于INFγ的荧光强度以log尺度表示的散点图展开图中，用阳性对照肽进行再刺激时，UR出现IFNγ阳性CD8阳性细胞，而即使用阴性对照肽进行再刺激，也几乎不出现。用阳性对照肽进行13日刺激培养得到的细胞团中存在CMV pp65特异性CTL可从在X轴将CD8以log尺度表示、Y轴将相对于MHC-四聚物试剂的荧光强度以log尺度表示的散点图展开图中、在UR存在CD8阳性MHC-四聚物试剂阳性细胞团得知。另一方面，也得知添加了和捐赠者等位基因不同的限制性阴性对照肽的细胞团并未出现survivin-2B特异性CTL。也就是说，在添加了来自HLA-A*11：01限制性CMV pp65的表位肽的细胞团中，诱导出29.37％的特异性CTL，在添加了来自survivin-2B的HLA-A*24：02限制性表位肽的细胞团则未诱导出特异性CTL。此结果和上述IFNγ的测定结果一致。另外，可知在X轴将IFNγ以log尺度表示、Y轴将相对于MHC-四聚物试剂的荧光强度以log尺度表示的散点图展开图中，添加阴性对照肽时，几乎不存在MHC-四聚物试剂阳性且IFNγ阳性的细胞，但是通过来自HLA-A*11：01限制性CMV pp65的阳性对照肽的刺激而诱导得到的特异性CTL占全部细胞团的29.39％，其中，73％产生IFNγ(UR)，换言之，具有细胞毒性活性。

由此结果可知，添加捐赠者所保持的HLA限制性CTL表位肽而培养的PBMC中，通过再刺激而诱导出产生IFNγ的细胞，此细胞会被MHC-四聚物试剂染色，因此其是对于添加的CTL表位肽有特异性的CTL。如此，是否诱导了特异性的CTL，也可通过细胞内IFNγ产生细胞定量法进行判断。同样，针对使用EBV LMP2特异性CTL表位候选肽是否会诱导IFNγ产生细胞的研究，在5名健康成人中实施。将CD8阳性细胞中存在的IFNγ产生活细胞的比例予以数值化，并示于图5。图6显示将细胞内IFNγ产生细胞定量而得到的代表性结果。

图5中，使用5名健康成人(捐赠者ID编号：*11-13、*11-16、*11-8、*11-11、*11-2)的外周血，用21种肽对细胞内IFNγ产生细胞进行定量。X轴将CD8阳性IFNγ阳性细胞数占PBMC的比例(％)用数值表示。和阴性对照进行比较，呈阳性的肽候选为ASS(10mer)(序列编号：1)和阳性对照肽CMV pp65。呈阳性的肽的详细结果于图6中说明。

图6在X轴将CD8以log尺度表示、Y轴将相对于IFNγ的荧光强度以log尺度表示的散点图展开图中，示出了使用和诱导所使用的肽相同的肽进行再刺激而对细胞内IFNγ产生细胞予以定量的结果。UR中将CD8阳性IFNγ阳性细胞数占PBMC的比例(％)以数值表示。

阳性对照的CMV pp65中，UR检测到28.0％的CD8阳性IFNγ阳性(产生)细胞。相较于阴性对照的survivin-2B时的阳性率(8.67％)，可见显著性差异。根据这些结果，合成MHC-四聚物试剂，并实施关于其有用性的研究。

[使用了EBV特异性MHC-四聚物试剂的研究]

(MHC-四聚物试剂的合成)

发明人等使用EBV特异性的CTL表位肽与HLA-A*11：01分子制作PE标记MHC-四聚物试剂。本发明制作的MHC-四聚物试剂例如用ASS(10mer)-Tet的简称表示，其表示使用HLA-A*11：01分子与肽ASS(10mer)(ASSYAAAQRK、序列编号：1)与β2-微球蛋白的3者复合体而合成者。

[使用了MHC-四聚物试剂的定量法]

采用使用本发明的CTL表位肽制作的MHC-四聚物试剂，向外周血或从外周血分离而得到的PBMC添加CTL表位肽，将诱导而得到的CTL细胞株当作试样，实施EBV特异性的CTL的定量。以下以使用PE标记MHC-四聚物试剂的情况为例，示出实施例。根据使用的流式细胞仪的机种，标记色素可适当组合使用，不限于下列。

外周血的情况

对于所采集的外周血200μL，加入10μL的PE标记MHC-四聚物试剂和20μL的FITC标记抗T细胞表面抗体(例如CD8、CD4、CD3)等。此外，为了将已混入的红血球导致的非特异性的荧光排除，可以添加用PC5等标记的抗CD45抗体。温和地混合并于室温放置30分钟。加入OptiLyse B(Beckam coulter公司)，按照包装内说明书进行溶血固定处理。加入2mL的PBS并搅拌后，以400×g进行5分钟离心分离。吸取上清并废弃后，将细胞再悬浮于500μL的PBS中，于24小时以内通过流式细胞仪进行解析。

使用PBMC或CTL表位肽进行诱导得到的CTL细胞株的情况

对于使用适量的PBMC(10⁵～10⁶个)或CTL表位肽诱导而得到的适量CTL细胞株，添加10μL的PE标记MHC-四聚物试剂、与20μL的FITC标记抗T细胞表面抗体(例如CD8、CD4、CD3)等。此外，为了将已混入的红血球导致的非特异性的荧光排除，可以添加用PC5等标记的抗CD45抗体。温和地混合并于室温放置30分钟。加入3mL的PBS并搅拌后，以400×g进行5分钟离心分离。吸取上清并废弃后，将细胞再悬浮于500μL的PBS中。为CTL细胞株时，为了排除死细胞导致的非特异性的荧光，可以添加7-AAD viability Dye(死细胞检测试剂，MBL公司)。24小时以内通过流式细胞仪进行解析。

[利用MHC-四聚物试剂进行的健康成人外周血中的EBV LMP2特异性CTL的检测]

了解因某种原因而免疫能力降低的人、先天性免疫缺陷症患者、或为了预防接受骨髓移植、造血干细胞移植、脐带血移植、固体脏器移植的排斥而接受免疫抑制剂的投予的患者、慢性病毒感染症患者、艾滋病患者、高龄者、幼儿、孕妇等高风险的患者、或移植捐赠者的外周血中是否存在EBV特异性CTL，对于包括抗病毒剂、免疫抑制剂的适当使用的传染病管理方面是重要的。但是这些患者的免疫能力低，所以EBV特异性CTL的存在也减少，因此难以用现有方法了解EBV特异性CTL存在。使用EBV特异性MHC-四聚物试剂，则能够于采血后1小时左右即判定EBV特异性CTL的存在。所以我们研究是否能使用健康成人外周血检测EBV特异性CTL。将其结果示于图7。使用捐赠者ID*11-11的外周血，用3种EBV特异性MHC-四聚物试剂与阳性对照CMV pp65MHC-四聚物试剂(MBL公司)及阴性对照survivin-2B HLA-A*24：02 MHC-四聚物试剂(MBL公司)进行染色。用X轴是将CD8以log尺度表示、Y轴是将相对于MHC-四聚物试剂的荧光强度以log尺度解析的散点图展开图示出。散点图展开图中的数值，是将CD8阳性MHC-四聚物试剂阳性细胞占CD8阳性细胞中的比例作为阳性率(％)显示。其结果，在刚采血时(第0天)，CD8阳性MHC-四聚物试剂阳性的细胞团相较于阴性对照无法说有显著性差异。此现象的原因可列举所使用的外周血均为健康成人，由于EBV或CMV导致传染病伺机性发病的可能性低。接着，将PBMC用各肽进行14日刺激培养后(第14天)，同样以MHC-四聚物试剂染色。其结果，通过14日的培养，检测到ASS(10mer)为44.47％、CMV pp65为40.52％的阳性率。根据阴性对照HLA-A*24：02限制性survivin-2B MHC-四聚物试剂获得的阳性率为0.17％，可以说呈阳性的细胞团是对于各肽有特异性的CTL团。由这些结果可知，EBV LMP2特异性CTL存在于健康成人外周血中，通过2周培养可增殖到能判定是否有CTL存在的程度。这意味着本发明实施的不利用抗原呈递细胞的诱导法对于检测EBV特异性CTL是有效的。另外，本发明中鉴定的来自EBV LMP2的ASS(10mer)(序列编号：1)具有使外周血中的EBV LMP2特异性CTL增殖的作用，这些细胞团能用ASS(10mer)-Tet进行检测，因此判别是HLA-A*11：01限制性的EBV LMP2特异性CTL表位肽。

[利用MHC-四聚物试剂进行的健康成人外周血中的EBV EBNA1特异性CTL的检测]

接着，发明人等实施来自EBV EBNA1的HLA-A*11：01限制性的CTL表位的鉴定。从之前LMP2获得的验证结果可知，在细胞内IFNγ产生细胞定量法中，如图6所示，即使是阴性对照的survivin-2B也检测到8.67％的非特异反应。另一方面，如图7所示可知，使用了MHC-四聚物试剂的CTL的检测中几乎没有非特异反应。

过去没有来自HLA-A*11：01限制性EBV EBNA1的CTL表位的报告，因此通过非特异染色更少的MHC-四聚物染色法进行验证。

如表5所示，折叠试验的结果是，11个EBV EBNA1特异性CTL表位候选肽均显示HLA*11：01结合性。所以，发明人等为了鉴定EBV EBNA1特异性CTL表位肽，使用11个EBV EBNA1的CTL表位候选肽制作MHC-四聚物试剂。接着研究使用健康成人外周血是否能够检测EBNA1特异性CTL。将其结果示于图8与图9。首先，使用各3种混合的肽，使用5名健康成人(捐赠者ID编号：*11-13、*11-16、*11-8、*11-11、*11-2)的外周血进行CTL诱导。2周后，使用相应于诱导用肽的3种混合MHC-四聚物试剂进行检测。图8中，示出了X轴将CD8以log尺度表示、Y轴将相对于四聚物的荧光强度以log尺度解析的散点图展开图。散点图展开图中的数值是将CD8阳性细胞中的MHC-四聚物试剂阳性细胞占活细胞中的比例作为阳性率(％)表示。其结果，捐赠者*11-8中，当将使用(HRG+GVF+KTS)的3种混合肽诱导而得到的细胞团用使用相同的3种肽的各个合成的3种MHC-四聚物试剂的混合试剂(HRG-Tet+GVF-Tet+KTS-Tet)染色时，检测到0.38％的阳性细胞。为了验证对于3种肽中的哪种肽有特异性，图9使用3种的MHC-四聚物试剂的各个分别实施检测。其结果，用HRG-Tet单独染色时，以0.42％的阳性率检测出HRG-Tet阳性细胞。由于Tet-GVF-Tet与KTS-Tet中完全未检测到阳性细胞，所以显示HRG(序列编号：26)是表示HLA-A*11：01限制性的EBV EBNA1特异性CTL表位肽。

[利用细胞内IFNγ产生细胞定量法进行的EBV EBNA1特异性CTL诱导的确认]

细胞内IFNγ的产生是作为CTL的细胞毒性活性的一个标记物使用。发明者们为了评价使用利用上述MHC-四聚物试剂鉴定的EBV EBNA1特异性CTL表位肽诱导的CTL的功能性，实施细胞内IFNγ产生细胞定量。其结果示于图10。

图10的上一行显示在X轴将CD8以log尺度表示、Y轴将相对于IFNγ的荧光强度以log尺度表示的散点图展开图中，用和诱导所使用的肽相同的肽进行再刺激，并验证IFNγ产生能力的结果。UR中，将CD8阳性细胞中的IFNγ阳性细胞数占PBMC的比例(％)以数值表示。图10的下一行是验证IFNγ产生能力时用四聚物染色的结果。在X轴将CD8以log尺度表示、Y轴将相对于四聚物的荧光强度以log尺度表示的散点图展开图中，UR中，将CD8阳性细胞中的四聚物阳性细胞数占PBMC的比例(％)以数值表示。

对于经HRG诱导而得到的CTL，使用HRG肽或阴性对照的survivin-2B肽进行14小时再刺激。其结果，经阴性对照的survivin-2B进行再刺激时与未刺激时，几乎未出现CD8阳性IFNγ阳性(产生)细胞(再刺激：0.08％；未刺激：0.06％)，而使用了HRG(序列编号：26)肽的再刺激中，UR中出现了0.68％的CD8阳性IFNγ阳性(产生)细胞(0.98％的CD8阳性四聚物阳性细胞)。

由以上可知，本发明中鉴定的来自EBV EBNA1的HRG(序列编号：26)具有使外周血中的EBV EBNA1特异性CTL增殖的作用，这些细胞团有细胞毒性活性且能用HRG-Tet检测，故判别为HLA-A*11：01限制性的EBV EBNA1特异性CTL表位肽。

[有关ASS(10mer)序列N末端与C末端的氨基酸的重要性的研究]

HLA第I型分子所呈递的CTL表位肽由8～10个氨基酸构成，N末端侧起第2号及第9或10号氨基酸是对于和HLA第I型分子的结合最重要的氨基酸，称为锚定基序。作为与HLA-A11分子结合的肽，在从N末端起第2号位置配置有Ile、Met、Ser、Thr、或Val中的任一者，在第9或10号位置配置有Lys或Arg中的任一者，且由9～10个氨基酸构成的肽最为人所熟知(Chang CX，Tan AT，Or MY，Toh KY，Lim PY，Chia AS，Froesig TM，Nadua KD，Oh HL，LeongHN，Hadrup SR，Gehring AJ，Tan YJ，Bertoletti A，Grotenbreg GM.Conditional ligandsfor Asian HLA variants facilitate the definition of CD8+T-cell responses inacute and chronic viral diseases.Eur J Immunol.2013Apr；43(4)：1109-20.)。本发明提供的HLA-A*11：01限制性EBV LMP2特异性CTL表位肽ASS(10mer)是由Ala Ser Ser TyrAla Ala Ala Gln Arg Lys(序列编号：1)这10个氨基酸构成，作为锚定基序，自N末端侧起在第2号与第3号具有Ser，在第9号具有Arg与在第10号具有Lys。所以，为了使本发明的实施形态更为明确，合成自N末端侧、或C末端1削去1个氨基酸残基的肽来进行验证。N末端侧的Ala削除了的序列编号：6的氨基酸序列为Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys，C末端侧的Lys削除了的序列编号：5的氨基酸序列为Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg。使用了它们的比较实验的结果示于第11、12、13图。

Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys ASS(10mer)序列编号：1

Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg ASS(9mer)序列编号：5

Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys SSY序列编号：6

图11中，为了检查和HLA-A*11：01形成复合体的能力，实施折叠试验。其结果，7日的折叠试验的结果为，MHC-单体形成率从高至低的顺序为ASS(9mer)(337,803μV*秒)、SSY(294,932μV*秒)、ASS(10mer)(238,655μV*秒)，而从任一序列与阴性对照(83,587μV*秒)的肽的比较，确认具有MHC-单体的形成能力。

图12的实验中，是通过前述不利用抗原呈递细胞的诱导法、使用3种肽来实施各CTL诱导实验。诱导起14日后使用3种MHC-四聚物试剂分别实施特异性的CTL的检测。图12的上一行使用ASS(10mer)诱导CTL，并将其用ASS(10mer)-Tet、ASS(9mer)-Tet、SSY-Tet染色。其结果，用ASS(10mer)-Tet染色时，检测到53.31％的ASS(10mer)-Tet阳性CD8阳性的特异性CTL，但未检测到ASS(9mer)-Tet或SSY-Tet阳性CD8阳性的特异性CTL(上段中央及上段左)。上段的细胞团尽管有53.31％的ASS(10mer)-Tet阳性CD8阳性的细胞团存在，但这些细胞团不能用ASS(9mer)-Tet或SSY-Tet检出，故判别ASS(10mer)-Tet阳性CD8阳性的细胞团无法识别HLA-A*11：01分子所呈递的ASS(9mer)与SSY。同样实验对于经ASS(9mer)与SSY的肽诱导了CTL的细胞团实施，任一细胞团皆未检测到对ASS(10mer)-Tet、ASS(9mer)-Tet、SSY-Tet显示反应性的细胞团(中间行及下一行)。此现象表示如图11所示，ASS(9mer)与SSY这两肽虽然具有和HLA-A*11：01分子结合的能力，但没有刺激血中存在的EBV LMP2特异性CTL前体(效应/记忆细胞)使其增殖的能力，可知ASS(10mer)若N末端侧的Ala残基、或C末端侧的Lys残基中的任一者缺损，则CTL诱导能力与CTL检测能力消失。

图13中示出了检测对使用ASS(10mer)、ASS(9mer)、SSY的各肽诱导CTL而得到的细胞团，使用和诱导所使用的肽相同的肽再刺激时的IFNγ的产出能力的结果。使用阳性对照用的来自肽CMV pp65蛋白的HLA-A*11：01限制性表位肽(ATVQGQNLK、序列编号：34)诱导得到的细胞团中，存在40.52％的ATV-Tet阳性细胞，利用ATV肽进行再刺激时，28％的细胞产生了IFNγ。

另一方面，在作为阴性对照用肽使用的survivin-2B的HLA-A*24：02限制性表位肽(AYACNTSTL、序列编号：35)的情形下，检测到0.17％的AYA-Tet阳性细胞，但此细胞团并非作为明确的点检出，考虑是非特异性的反应。另外，使用AYA肽的再刺激中，检测到8.67％的IFNγ阳性细胞，但其是细胞内IFNγ染色法时的一般的非特异染色的水平。使用本发明鉴定的来自EBV LMP2的HLA-A*11：01限制性ASS(10mer)诱导得到的细胞团中，存在53.31％的ASS(10mer)-Tet特异性CTL，且利用ASS(10mer)的再刺激，有68％的细胞团产生了IFNγ。而在N末端的Ala残基缺失的SSY的情形下，未检测到SSY-Tet阳性细胞，IFNγ的产生也比起阴性对照还低。由此显示在为具有属于锚定基序的氨基酸的肽且形成MHC-单体的情形下，仍不一定可以作为表位肽而特异性地诱导CTL，且能特异性地诱导CTL的表位肽并非可容易想到。

[利用EBV株多样性进行的CTL表位的氨基酸的突变到肽鸡尾酒疗法]

(EBV株间的ASS(10mer)的CTL表位的氨基酸突变)

因EBV株的多样性引起的CTL表位的氨基酸突变会引起免疫应答降低、免疫逃避，而成为使用了CTL表位的免疫疗法的潜在问题。为了解决此问题，已有人开始提出将数种CTL表位混合的肽鸡尾酒疗法。此疗法可说是期望在使用1种表位时，若因为突变等原因而有免疫不应答时，能用其它表位补充的解决方式。此解决方式据认为有针对1种HLA型使用多数种CTL表位的方法，及针对多个HLA型使用的各个CTL表位的方法，但优选将两者组合。例如，当成为对象的患者保持HLA-A2与HLA-A11时，优选治疗时各自选择HLA限制性的多个CTL表位。此课题是本发明欲解决的课题之一。

如前所述，迄今许多研究团队的研究已解明在NPC患者中，HLA-A11保持者最多。但是LMP2及EBNA1的HLA-A11限制性CTL表位的报告迄今只有SSC一种。

发明人等针对来自HLA-A*11：01限制性LMP2的CTL表位ASS(10mer)及来自HLA-A*11：01限制性EBNA1的CTL表位HRG，研究了株间的氨基酸的突变，将其结果示于图14。判明新型的表位ASS(10mer)是GD2(来自中国广东省)与HKNPC1(来自香港NPC患者)，第2号的Ser残基与第4号的Tyr残基分别突变为Asn残基与Ser残基(S2N Y4S)。此外，判明新型表位HRG为2株间的突变。AG876(来自西非，2型)中，第4号的Gln残基突变为Glu残基，第8号的Asn残基突变为Ser残基，第9号的Pro残基突变为Gln残基。Mutu(来自亚洲)中，第9号的Pro残基突变为Gln残基。

[各试样的ASS(10mer)CTL表位的测序]

为了详细研究本发明中新鉴定的ASS(10mer)的CTL表位的突变，发明人等对本发明采用的5名捐赠者(*11-2、*11-8、*11-11、*11-13、*11-16)实施包括ASS(10mer)在内的来自EBV LMP2的DNA序列的解析。DNA序列解析用的引物设计在LMP2的Exon 2内，扩增的基因产物为292bp。

5'引物：TTGCTCTATTCACCCTTACT(序列编号：50)

3'引物：ATGCATTGTAAATGGTGCGT(序列编号：51)

从5名捐赠者的PBMC或B95.8细胞株(ATCC公司)使用GeneJET Viral DNA and RNAPurification Kit(Thermo scientific公司)提取EBV基因组DNA。将其作为模板，使用上述引物通过PCR反应将Exon 2片段扩增，并使用TOPO(注册商标)TA cloning Kit(Lifetechnologies公司)进行克隆(coloning)。从各试样分别使用3个集落进行测序分析。测序结果如图15与表6所示。图15中，将在EBV病毒株间见到的ASSYAAAQRK(序列编号：1)(碱基序列：GCCAGCTCATATGCCGCTGCACAAAGGAAA(序列编号：48)、GCCAGCTCATATGCCGCTGCACAGAGGAAA(序列编号：49))的突变位置特写表示。表6是ASS(10mer)的测序结果。相较于B95.8，捐赠者*11-11在DNA序列上可见一个碱基的取代(从CAA突变成CAG)，但氨基酸未取代。另外，其它4名和B95.8为相同的序列。由此结果，本发明使用的日本人捐赠者5名感染分布最广泛的B95.8株，未能检测出ASS(10mer)CTL表位的突变。依据上述测序的结果，发明者们研究了在EBV病毒株间可见的ASS(10mer)CTL表位的突变对CTL诱导能力的影响。使用合成的肽ASS(10mer)(序列编号：1)、ANS(S2N)(序列编号：2)、ASS(Y4S)(序列编号：3)、ANS(S2N；Y4S)(序列编号：4)及作为阴性对照肽的survivin-2B，并使用捐赠者*11-11的PBMC进行CTL诱导。其结果示于图16。使用了ASS(10mer)的诱导中，检测到ASS(10mer)-Tet阳性细胞为27.63％，但各突变肽中未确认到CTL的诱导。据认为这是因为捐赠者*11-11根据EBV LMP2的测序解析为B95.8株的感染者，ASS(10mer)未见有氨基酸的突变。即使对于B95.8株感染者使用ANS(S2N)(序列编号：2)、ASS(Y4S)(序列编号：3)及GD2株与HKNPC1株的ANS(S2N；Y4S)，仍无法诱导特异性CTL，所以可知S2N与Y4S的突变对于TCR的识别是重要的突变。因此，当进行EBV特异性CTL的诱导时，预先研究在ASS(10mer)的区域是否无突变是重要的，若有突变，考虑优选使用ANS(S2N)、ASS(Y4S)、ANS(S2N；Y4S)。

表6

ASS(10mer)CTL表位的测序结果

[ASS(10mer)CTL表位的突变所致的CTL诱导能力与TCR结合性的差异]

为了详细研究S2N与Y4S的突变对TCR结合能力造成的影响，发明者们使用3种突变序列肽，制作ANS(S2N)-Tet、ASS(Y4S)-Tet、ANS(S2N，Y4S)-Tet这3种MHC四聚物试剂。对于使用本发明提供的ASS(10mer)表位肽(序列编号：1)而从PBMC诱导的HLA-A*11：01限制性EBV LMP2特异性CTL实施四聚物染色。结果显示于图17。

HLA-A*11：01限制性EBV LMP2ASS(10mer)特异性CTL如图17所示，因为用ANS(S2N)-Tet检测到，ANS(S2N)-Tet保持了和ASS(10mer)-Tet的交叉反应性(26.87％对27.63％)，而ASS(Y4S)-Tet则几乎未能检测到阳性细胞，和TCR的结合性几乎丧失(0.49％)。ASN(S2N，Y4S)-Tet中，保持着些许与TCR的结合能力(5.93％)。原因据认为是因为S2N与Y4S的两取代及Y4S的单独取代所致的氨基酸的疏水性·亲水性的变化程度及侧链立体配置的差异所致。针对此2个氨基酸突变，在EBV病毒株间并无单独取代，只见到共取代(GD2、HKNPC1)。但是应注意，本发明提供的ASS(10mer)的突变只在GD2株与HKNPC1株见到。所以，此表位在功能上互补，也就是说，据认为两者混合使用，能够避免由于GD2株及HKNPC1株与除它们以外的感染EBV病毒株的差异所致氨基酸突变导致免疫应答降低。

此外，关于来自HLA-A*11：01限制性EBV EBNA1的新型表位HRG(序列编号：26)，包括来自AG876株的HRG(Q4E，N8S，P9Q)与来自Mutu株的HRG(P9Q)在内，如图3所示，成功地合成了对HLA-A*11：01有结合性的各自的MHC-四聚物试剂。通过进行和ASS(10mer)同样的验证，可知取决于各感染株，诱导效率明显有别。

[使用培养袋的CTL的大量培养]

本发明中，成功地鉴定出EBV LMP2特异性或EBV EBNA1特异性的新型CTL表位，能实现以HLA-A11保持者作为对象的抗原特异性细胞毒性T细胞疗法(CTL疗法)。CTL疗法期待作为下一代的免疫疗法。但是，为了在生物体外制备抗原特异性CTL，会伴随复杂且烦杂的操作，因此必需依赖开放系培养***。所以，医疗用等级的培养细胞加工中心(CPC)内必需具备保持Class100级的洁净环境的设施并必须进行管理，需要庞大的费用。

另外，由于现有方法使用各种细胞因子，因此制备时需耗费相当大的费用。此外，虽是在保持Class100级的设施内进行制备，但利用开放体系进行培养在安全方面会伴随风险。如此，以往的抗原特异性CTL制备法的操作性、经济性及安全性成为实用化的严重妨碍，只能在受限的设施内实施。为了解决上述问题点，发明者们钻研了CTL的大量培养方法，并研究出兼具简便性与安全性且能以低成本实施的EBV特异性CTL培养***。使用市售的气体通气性培养用袋，仅以三周左右成功地大量培养出EBVLMP2特异性CTL。

图18是以显微镜观察培养期间中的细胞所得的结果。经抗CD3抗体刺激的PBMC在第7天、经肽刺激的PBMC在第14天观察到活化的T细胞块，于混合培养开始1周后(第21天)，显示活化T细胞块进一步增殖。

如前述，混合肽的使用是提高癌免疫疗法的有效性的一种解决方式。本实施例中，将新鉴定出的CTL表位ASS(10mer)(序列编号：1)与其突变序列ASN(S2N)(序列编号：2)的4种肽混杂并实施CTL的大量培养。其结果显示于图19与20。

图19显示培养期间中的总细胞及在4种肽诱导下增殖的CTL数。CTL数由图20的四聚物染色结果算出。图19是X轴将CD8以log尺度表示、Y轴将相对于四聚物的荧光强度以log尺度表示的散点图展开图，用和诱导使用的肽相同的肽的四聚物进行了染色。散点图展开图中的数值是将CD8阳性细胞中的MHC-四聚物试剂阳性细胞占活细胞中的比例作为阳性率(％)表示。

针对ASS(10mer)与ANS(S2N)，大量培养前，分离的PBMC中的MHC-四聚物试剂阳性细胞数仅为0.04％以下，但从可检测到阳性细胞的第7天至第24天的期间，确认到ASS(10mer)从1.3×10³个增殖到2.3×10⁵，ANS从3.2×10³个增殖到3.1×10⁵个，约有100倍的增殖。由此，显示出使用新型CTL表位肽的前述肽鸡尾酒疗法的有效性。此外，成功地将使用新CTL表位肽的CTL大量增殖，显示出在临床上的实用性。

发明者们所研究的上述培养***的特征为，并非在以往的开放体系而是在密闭体系中进行。所以，据认为可实现抗原特异性CTL的制备的操作性、经济性及安全性，且能促进CTL疗法的实用化。

迄今的癌免疫疗法的临床试验中，常是对1种HLA型使用1种表位进行，虽可确认有效性但无法否定有个人差异。如前述，鸡尾酒肽疗法是解决方式之一。但是迄今只鉴定出1个EBV LMP2抗原特异性及EBNA1抗原特异性HLA-A11限制性表位肽。因为在EBV病毒株间可能发生的氨基酸突变导致的免疫应答降低，被指出在临床上存在潜在问题。据认为无法忽视此问题，本发明努力研究的结果是，鉴别出新的表位ASS(10mer)(序列编号：1)及HRG(序列编号：26)。该新的CTL表位据认为对于EBV相关癌/免疫缺陷，尤其是HLA-A11患者常患的NPC的治疗，在今后应可发挥重大贡献。

[疫苗注射剂]

在DMSO中溶解序列编号：1的肽，使其最终浓度达到20mg/ml并进行过滤灭菌。将获得的含肽的溶液各分注1mL到灭菌小玻璃瓶并盖紧，制成疫苗注射剂。

[实施例2]

[CKAP4特异性HLA-A*24：02限制性表位肽的预测]

CKAP4是由全长602个氨基酸构成的II型膜蛋白，无同功型的报告。本发明的CKAP4特异性CTL表位候选肽的选择是对约60％日本人保有的HLA-A*24：02实施的。具体而言，参照能检索对于HLA-A*24：02有结合基序的由8～12个氨基酸构成的CTL表位候选肽的在因特网上公开的多个软件并实施。其结果，从CKAP4的氨基酸序列选出有HLA-A*24：02的结合基序的由9～10个氨基酸所构成的CTL表位候选肽10种，并合成肽。以下显示合成的CTL表位候选肽。

合成的HLA-A*24：02结合性CKAP4特异性CTL表位候选肽

Arg Leu Gly Arg Ala Leu Asn Phe Leu Phe(序列编号：36)

Phe Tyr Leu Ala Leu Val Ala Ala Ala Ala(序列编号：37)

Tyr Leu Ala Leu Val Ala Ala Ala Ala Phe(序列编号：38)

Asp Phe Ser Arg Gln Arg Glu Glu Leu(序列编号：39)

Lys Val Gln Ser Leu Gln Ala Thr Phe(序列编号：40)

Ser Leu Gln Ala Thr Phe Gly Thr Phe(序列编号：41)

Thr Phe Gly Thr Phe Glu Ser Ile Leu(序列编号：42)

Ile Tyr Thr Glu Val Arg Glu Leu Val(序列编号：43)

Lys Val Gln Glu Gln Val His Thr Leu Leu(序列编号：44)

Asp Phe Leu Asp Arg Leu Ser Ser Leu(序列编号：45)

表7显示出合成的HLA-A*24：02结合性CKAP4特异性CTL表位候选肽的特征。合成的CKAP4特异性CTL表位候选肽的N末端侧起3个或4个氨基酸序列用简称表示肽名称。从左起显示出肽名、氨基酸序列、CKAP4氨基酸序列上的位置、氨基酸数、分析所使用的BIMAS(BioInf ormatics&Molecular Analysis Section/http：//thr.cit.nih.gov/index.shtml)的HLA Peptide Binding PredictionS(http：//thr.cit.nih.gov/molbio/hla_bin d/)算出的得分。此得分是预测HLA-A*24：02与肽的亲和性的数值，得分越高，意味着HLA分子与肽越可能形成稳定的复合体。发明者们除了表7记载的分析软件BIMAS以外，也使用SYFPEITHI、Rankpep、IEDBBind prediction、NetCTL等分析软件，选出了10种CTL表位候选肽(序列编号：36～45)。

表7

HLA-A*24：02结合性CKAP4特异性CTL表位候选肽一览表

[CKAP4特异性CTL表位候选肽的折叠试验]

发明人使用人工合成的10种CKAP4特异性CTL表位候选肽实施折叠试验。具体而言，将利用大肠杆菌表达***表达精制的HLA-A*24：02与β2-微球蛋白、及CKAP4特异性CTL表位候选肽添加到折叠溶液中并混合后，经时地分取折叠溶液，用凝胶过滤柱进行分析。凝胶过滤柱分析中，可见已形成HLA-A*24：02与β2-微球蛋白、及CKAP4特异性CTL表位候选肽的3者复合体(MHC-单体)时，由于MHC-单体的分子量比原料大，在凝胶过滤柱分析的洗脱时间会加快。另外，MHC-单体形成量可由利用280nm的吸收波长获得的峰部面积算出。另一方面，和HLA分子无结合性的候选肽未见MHC-单体形成。可见形成MHC-单体形成时的代表性凝胶过滤柱分析例显示于图21。

对于HLA分子与β2-微球蛋白，当利用大肠杆菌表达***表达精制时，以不溶性级分即封入体的形式精制，并可溶于8M尿素，但凝胶过滤柱分析的结果中，在7～8分钟时检测到难溶性HLA分子未形成MHC-单体而成为凝聚体。但是，多数凝聚体可利用凝胶过滤柱分析前的滤器过滤处理除去。β2-微球蛋白是可溶性蛋白，在折叠溶液中可溶，可于14分钟附近检测到。15分钟以后检测到折叠溶液的组合物、肽。折叠试验刚开始时(第0天)未确认到MHC-单体的峰部，但1日后(第1天)、3日后(第3天)，峰部增大，显示出MHC-单体形成顺利进行。

图22显示对10种CKAP4特异性CTL表位候选肽实施的折叠试验4日后的分析结果。同时，将由9个氨基酸构成的阳性对照肽(序列编号：46)与阴性对照(序列编号：47)作为比较对象。

折叠试验使用的对照肽

Ala Tyr Ala Cys Asn Thr Ser Thr Leu(序列编号：46)

Ser Ser Tyr Arg Arg Pro Val Gly Ile(序列编号：47)

图中，表示MHC-单体形成的峰部面积以条图示出。序列编号：36～45和阳性对照肽与阴性对照(79,031μV*秒)比较的结果为，序列编号：36、40、42、43的MHC-单体形成良好，进行之后的解析。

[CKAP4特异性MHC-四聚物试剂的制造]

基于折叠试验的结果，使用序列编号：36、40、42、43的CKAP4特异性CTL表位候选肽与HLA-A*24：02、及β2-微球蛋白制造PE(phycoerythrin，藻红蛋白)标记MHC-四聚物试剂。本发明制造的MHC-四聚物试剂例如用KVQE-Tet与简称表示，其表示使用HLA-A*24：02与肽KVQE(KVQEQVHTLL(序列编号：44))与β2-微球蛋白的3者复合体所制造者。使从蛋白表达用的基因重组宿主精制的HLA第I型分子、β2-微球蛋白及本发明的CKAP4特异性CTL表位候选肽的复合体、MHC-单体在适当的折叠溶液中形成。在重组HLA第I型分子的C末端预先附加生物素结合部位，MHC-单体形成后在此部位附加生物素。通过将市售的经色素标记的链霉亲和素与生物素化MHC-单体以摩尔比1：4混合，可制造MHC-四聚物试剂。

[CKAP4特异性CTL表位肽的鉴定]

(试样的HLA型的选定)

关于CKAP4特异性CTL表位候选肽，选择对于HLA-A*24：02有结合基序的10种候选肽。并利用折叠试验，明白了HLA-A*24：02与β2-微球蛋白与4种CKAP4特异性CTL表位候选肽(序列编号：36、40、42、43)在试管内结合，并良好地形成MHC-单体。为了实际上确认此4种CKAP4特异性CTL表位候选肽是否与HLA-A*24：02结合、并且识别其的CTL在生物体内是否存在，优选使用保有HLA-A*24：02的供血者的外周血进行验证。最初，供血者是否保有HLA-A*24：02是使用Genosearch(商标)HLA-A Ver.2(MBL公司)、通过HLA-A的基因型判定确认。以下的研究使用保有HLA-A*24：02的7名健康成人的PBMC进行。

[CKAP4特异性CTL的诱导]

[使用MLPC(Mixed Lymphocyte-Peptide Cultures)法的CKAP4特异性CTL的诱导]

MLPC法是在PBMC培养液中添加肽并诱导CTL的方法(Karanikas V，Lurquin C，Colau D，van Baren N，De Smet C，Lethe B，Connerotte T，Corbiere V，Demoitie MA，Lienard D，Dreno B，Velu T，Boon T，Coulie PG.Monoclonal anti-MAGE-3 CTLresponses in melanoma patients displaying tumor regression after vaccinationwith a recombinant canarypox virus.J Immunol.2003；171(9)：4898-904、TsukaharaT，Kawaguchi S，Torigoe T，Takahashi A，Murase M，Kano M，Wada T，Kaya M，Nagoya S，Yamashita T，Sato N.HLA-A*0201-restricted CTL epitope of a novel osteosarcomaantigen,papillomavirus binding factor.J Transl Med.2009；7：44)。据认为使PBMC含有的记忆型CTL受PBMC中存在的抗原呈递细胞、例如树突状细胞、B细胞、巨噬细胞、某种T细胞呈递肽而进行的刺激并增殖。将从保有HLA-A*24：02的健康成人采集的外周血以3,000rpm进行5～10分钟离心处理，回收上清的血浆部分。除血浆部分以外使用以往方法即密度梯度离心法将PBMC分离。本发明中，使用添加了5％血浆的培养基，获得良好结果。培养基是在一般细胞培养使用的培养基中添加有适当的添加物与抗生素者。本发明使用的CTL诱导培养基是使用在RPMI1640 Hepes modify(Sigam公司)添加了2-巯基乙醇、L-谷氨酰胺、作为抗生素的链霉素与盘尼西林的培养基。除此以外也可添加胰岛素、转铁蛋白、***、丙酮酸、人血清白蛋白、非必须氨基酸溶液等。使约3×10⁷个PBMC悬浮于10mL培养基中。向其中各以10μg/mL的浓度添加4种CKAP4特异性CTL表位候选肽(序列编号：36、40、42、43)中的1～2种肽。肽浓度可根据肽的溶解度而变更。本发明中，以10μg/mL实施。PBMC与肽的混合培养使用96孔U底细胞培养用微孔平板(BECTON DICKINSON公司)。细胞于37℃、5％CO₂恒温箱中培养。2日后以20～100U/mL的最终浓度进行IL-2的添加。之后适当进行IL-2添加CTL诱导培养基的交换。CKAP4特异性CTL的确认以培养2周为目标实施。想能够确认CKAP4特异性CTL的诱导时，使用肽脉冲抗原呈递细胞进行刺激或直接以肽刺激，并尝试建立CTL细胞株。

[CKAP4特异性CTL的确认]

针对以前述方法培养的细胞团是否存在CKAP4特异性的CTL的研究，通过MHC-四聚物法实施。培养后对于适量细胞数加入10μL的PE标记MHC-四聚物试剂、20μL的FITC(fluorescein isothiocyanate，异硫氰酸荧光素)标记T细胞表面抗体(例如CD8，CD4，CD3)等。此外，为了排除因混入的红血球所致的非特异性的荧光，也可添加用PC5(phycoerythrin-Cy5，藻红蛋白-Cy5)等标记的CD45抗体。之后，温和地混合并于2～8℃于60分钟静置或于室温静置30分钟。加入1.5mL的PBS并搅拌后，以3,000rpm进行5分钟离心分离。吸除上清并废弃后，将细胞再悬浮于400μL的PBS。此时，为了排除死细胞所致的非特异性的荧光，也可以加入7-AAD viability Dye(死细胞检测试剂、MBL公司)。24小时以内用流式细胞仪进行解析。

CKAP4特异性CTL的确认以2阶段进行。首先，第1阶段将96孔U底细胞培养用微孔平板的纵列的8孔各一部分细胞回收，合并成为1个样品(条带合并(lane pool))，以MHC-四聚物法确认是否有CKAP4特异性CTL的诱导。第2阶段于在第1阶段已确认CKAP4特异性CTL的诱导的条带合并，将各孔细胞分别回收并以MHC-四聚物法确认是否有CKAP4特异性CTL诱导。通过使用如此的方法，可确认在96孔U底细胞培养用微孔平板的某孔是否诱导出CKAP4特异性CTL。

图23、图25显示出以MLPC法诱导CKAP4特异性CTL后，进行第1阶段的确认的代表性结果。将试样编号A24-37(图23)及A24-39(图25)的PBMC以CKAP4特异性CTL表位候选肽的序列编号：43培养14日。当将展开图分成四部分的区域表示记为UL(左上)、UR(右上)、LL(左下)、LR(右下)时，散点图展开图中的数字表示(UR+LR)部分的UR的百分率。在X轴将CD8以log尺度表示、Y轴将相对于MHC-四聚物试剂的荧光强度以log尺度表示的散点图展开图中表示。用IYT-Tet确认序列编号：43的特异性CTL的诱导，结果，试样编号A24-37在lane7、A24-39在lane 11的UR，检测到明显的CD8阳性IYT-Tet阳性的细胞团。这表示序列编号：43为CKAP4特异性CTL表位肽，试样编号A24-37及A24-39的外周血中存在记忆型的CKAP4特异性CTL。图24、图26示出了用MLPC法诱导序列编号：43特异性CTL，并用MHC-四聚物法检测到的第2阶段的结果。图23、图25示出了在已确认有CKAP4特异性CTL的诱导的各lane中、用MHC-四聚物法确认各孔是否诱导了CKAP4特异性CTL的结果。其结果，图24所示的试样编号A24-37 lane 7的G孔(7-G)，及图26所示的试样编号A24-39lane 11的B孔(11-B)中检测到序列编号：43特异性CTL。这些证明序列编号：43是显示HLA-A*24：02限制性的CKAP4特异性CTL表位肽。试样编号A24-37及、A24-39中，各在96孔中的1孔检测到序列编号：43特异性CTL，因此用下式算出序列编号：43特异性CTL在外周血PBMC中的存在比率。

试样编号A24-37的序列编号：43特异性CTL的频率

＝(MHC-四聚物试剂阳性孔数)/(实验使用的PBMC的数×诱导前

的CD8阳性率)

＝1/(3×10⁷×0.311)

＝1.07×10^-7

试样编号A24-39的序列编号：43特异性CTL的频率

＝1/(3×10⁷×0.155)

＝2.15×10^-7

通常以96孔的MLPC法能够检测的特异性CTL的界限，在假定诱导前的CD8阳性细胞率为10～20％时，为1.6～3.3×10^-7。换言之，此时的96孔的MLPC法中，检测到的特异性CTL的标准比例是每3～6×10⁶个CD8阳性细胞有1个。

表8

CKAP4特异性CTL的诱导结果

○:确认到四聚物(+)、CD8(+)细胞的诱导

×：无四聚物(+)、CD8(+)细胞的诱导

此外，本发明如表8所示，使用序列编号36、40、42、43将7人的供血者作为对象，实施同样的研究，但是除序列编号：43以外未能检测特异性CTL。序列编号：43也只在7名中的2名检测到。原因是CKAP4特异性HLA-A*24：02限制性表位肽的预测困难，要预测此表位肽是否有特异性CTL的诱导能力更困难。

[抗原呈递细胞的制备]

EBV感染B细胞株的制备

按照标准方法(Kuzushima K，Yamamoto M，Kimura H，Ando Y，Kudo T，Tsuge I，Morishima T.Establishment of anti-Epstein-Barr viruS(EBV)cellular immunity byadoptive transfer of virus-specific cytotoxic T lymphocytes from an HLA-matched sibling to a patient with severe chronic active EBV infection.ClinExp Immunol.1996；103：192-198)，将为EBV产生细胞株B95-8细胞(从JCRB Cell Bank获得)的培养上清(包括活EBV病毒)与PBMC混合培养，并建立EBV感染B细胞株(Lymphoblastoid cell line，以下称为EBV感染LCL)。

[使用抗原呈递细胞的特异性CTL的扩增]

使前述抗原呈递细胞(EBV感染LCL)悬浮在刺激用培养基(0.5％人血清白蛋白/RPMI1640)或AIM-V培养基(Invitrogen公司)中，以10μg/mL的浓度添加CTL表位候选肽，以约15分钟的间隔边温和地混合边于室温下放置30～60分钟，然后以过量的刺激用培养基进行3次洗涤，并洗掉未和HLA分子结合的肽。据认为通过此操作，CTL表位候选肽会结合于抗原呈递细胞上的HLA分子。已实施此操作的抗原呈递细胞称为肽脉冲抗原呈递细胞。为了使肽脉冲抗原呈递细胞丧失增殖能力，进行致死量的X射线照射、或丝裂霉素处理。将其和从同一人诱导出的含CKAP4特异性CTL的细胞团混合，于37℃、5％CO₂恒温箱培养。已有人进行使用的培养基是含有含10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养基、或含有10％人血清的RPMI1640培养基、或含有1～10％的人血浆的RPMI1640培养基等的研究，但本方法中，在含5％人血浆的RPMI1640培养基中获得良好结果。为了T细胞生存的维持和辅助增殖，以50U/mL添加IL-2(盐野义制药公司)。培养开始10～16日后实施CKAP4特异性CTL诱导的评价。能确认CKAP4特异性CTL的诱导时，进一步使用肽脉冲抗原呈递细胞进行刺激，并建立CTL株。

[利用细胞内IFNγ产生细胞定量法进行的特异性CTL的功能解析]

将以前述方法诱导的含CKAP4特异性CTL的细胞团的约1/10～全量移到96孔U底细胞培养用微孔平板，添加诱导使用的肽，使最终达到0.1～10μg/mL的浓度。再添加细胞内蛋白转运抑制剂(例如：布雷菲德菌素A(Brefeldin A)、莫能菌酸(Monensin)等)，在5％CO₂恒温箱中于37℃进行5～16小时培养。培养后将细胞洗涤，添加PE标记MHC-四聚物试剂与PC5标记CD8抗体(Beckman Coulter公司)，于室温放置15～30分钟。洗涤后用4％甲醛于4℃固定15分钟后，用过量的洗涤液清洗。用0.1％皂素进行透膜处理后，加入FITC标记抗IFNγ抗体(MBL公司制)，于室温反应15～30分钟。洗涤后使用流式细胞仪定量T细胞中的IFNγ阳性细胞率或MHC-四聚物试剂阳性细胞中的IFNγ阳性细胞率。

图27显示经诱导的CKAP4特异性CTL利用细胞内IFNγ产生细胞定量法研究的结果。将试样编号A24-39的PBMC用HLA-A*24：02限制性CKAP4特异性CTL表位肽即序列编号：43刺激。示出将其使用PE标记MHC-四聚物试剂(MBL公司)、PC5标记CD8抗体、FITC标记IFNγ抗体进行3重染色、并使用流式细胞仪进行解析的结果。散点图展开图中的数字表示存在于分成四部分的区域的细胞占全部活细胞的百分率。图27中，只有用特异性肽刺激时，在UR出现IFNγ阳性MHC-四聚物试剂阳性细胞，未添加肽时，几乎未出现。但是，已添加肽与未添加时细胞团均存在IYT-t-Tet特异性CTL存在，这可从下述情况得知：在X轴将CD8以log尺度表示、Y轴将相对于MHC-四聚物试剂的荧光强度以log尺度表示的散点图展开图中，UR可见到CD8阳性MHC-四聚物试剂阳性细胞团。

由此结果可知，添加CKAP4特异性CTL表位肽而培养的PBMC中，通过再刺激可诱导产生IFNγ的具有细胞毒性的CKAP4特异性CTL，此细胞可被MHC-四聚物试剂染色，因此是对于来自HLA-A*24：02限制性CKAP4的肽IYTEVRELV(序列编号：43)有特异性的CTL。

[产业上的可利用性]

根据本发明，可使用对于EB病毒(EBV)有特异性的细胞毒性T细胞表位肽治疗或预防EBV的感染及该病毒阳性的癌。另外，可定量EBV特异性的CTL。另外，通过使用由本发明的IYTEVRELV(序列编号：43)的序列构成的HLA-A*24：02限制性表位肽，可治疗高度表达CKAP4的恶性肿瘤细胞相关的疾病。

序列表

<110> 株式会社医学生物学研究所

<120> 细胞毒性T细胞表位肽及其用途

<130> M3-A1501P

<160> 51

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 1

Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys

1 5 10

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 2

Ala Asn Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys

1 5 10

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 3

Ala Ser Ser Ser Ala Ala Ala Gln Arg Lys

1 5 10

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 4

Ala Asn Ser Ser Ala Ala Ala Gln Arg Lys

1 5 10

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 5

Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 6

Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys

1 5

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 7

Val Met Leu Val Leu Leu Ile Leu Ala Tyr

1 5 10

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 8

Leu Val Leu Leu Ile Leu Ala Tyr Arg

1 5

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 9

Leu Val Leu Leu Ile Leu Ala Tyr Arg Arg

1 5 10

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 10

Leu Ala Tyr Arg Arg Arg Trp Arg Arg

1 5

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 11

Thr Thr Met Phe Leu Leu Met Leu Leu

1 5

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 12

Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr

1 5 10

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 13

Lys Val Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr

1 5 10

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 14

Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 15

Val Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 16

Gly Ser Ile Leu Gln Thr Asn Phe Lys

1 5

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 17

Leu Thr Glu Trp Gly Ser Gly Asn Arg

1 5

<210> 18

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 18

Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Ser Leu

1 5 10

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 19

Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys Leu

1 5 10

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 20

Thr Val Met Ser Asn Thr Leu Leu Ser

1 5

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 21

Thr Val Met Thr Asn Thr Leu Leu Ser

1 5

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 22

Ala Leu Phe Gly Val Ile Arg Cys Cys Arg

1 5 10

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 23

Gly Pro Gly Asn Gly Leu Gly Glu Lys

1 5

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 24

Ser Ser Ser Ser Gly Ser Pro Pro Arg Arg

1 5 10

<210> 25

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 25

Gly Gln Gly Asp Gly Gly Arg Arg Lys

1 5

<210> 26

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 26

His Arg Gly Gln Gly Gly Ser Asn Pro Lys

1 5 10

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 27

His Arg Gly Glu Gly Gly Ser Ser Gln Lys

1 5 10

<210> 28

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 28

His Arg Gly Gln Gly Gly Ser Asn Gln Lys

1 5 10

<210> 29

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 29

Gly Val Phe Val Tyr Gly Gly Ser Lys

1 5

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 30

Lys Thr Ser Leu Tyr Asn Leu Arg Arg

1 5

<210> 31

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 31

Gln Thr His Ile Phe Ala Glu Val Leu Lys

1 5 10

<210> 32

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 32

Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Glu Lys

1 5

<210> 33

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 33

Ala Ile Lys Asp Leu Val Met Thr Lys

1 5

<210> 34

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 34

Ala Thr Val Gln Gly Gln Asn Leu Lys

1 5

<210> 35

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 35

Ala Tyr Ala Cys Asn Thr Ser Thr Leu

1 5

<210> 36

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 36

Arg Leu Gly Arg Ala Leu Asn Phe Leu Phe

1 5 10

<210> 37

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 37

Phe Tyr Leu Ala Leu Val Ala Ala Ala Ala

1 5 10

<210> 38

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 38

Tyr Leu Ala Leu Val Ala Ala Ala Ala Phe

1 5 10

<210> 39

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 39

Asp Phe Ser Arg Gln Arg Glu Glu Leu

1 5

<210> 40

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 40

Lys Val Gln Ser Leu Gln Ala Thr Phe

1 5

<210> 41

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 41

Ser Leu Gln Ala Thr Phe Gly Thr Phe

1 5

<210> 42

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 42

Thr Phe Gly Thr Phe Glu Ser Ile Leu

1 5

<210> 43

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 43

Ile Tyr Thr Glu Val Arg Glu Leu Val

1 5

<210> 44

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 44

Lys Val Gln Glu Gln Val His Thr Leu Leu

1 5 10

<210> 45

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 45

Asp Phe Leu Asp Arg Leu Ser Ser Leu

1 5

<210> 46

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 46

Ala Tyr Ala Cys Asn Thr Ser Thr Leu

1 5

<210> 47

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 47

Ser Ser Tyr Arg Arg Pro Val Gly Ile

1 5

<210> 48

<211> 30

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 48

gccagctcat atgccgctgc acaaaggaaa 30

<210> 49

<211> 30

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 人造序列

<400> 49

gccagctcat atgccgctgc acagaggaaa 30

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 定序引子

<400> 50

ttgctctatt cacccttact 20

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 定序引子

<400> 51

atgcattgta aatggtgcgt 20

Claims

1.一种表位肽，其具有对于EB病毒即EBV有特异性的细胞毒性T细胞的诱导活性，其中，该表位肽由选自由序列编号：1、序列编号：2、序列编号：3、序列编号：4、序列编号：5、序列编号：6、序列编号：26、序列编号：27及序列编号：28组成的组中的氨基酸序列构成。

2.一种表位肽，其具有对于EB病毒即EBV有特异性的细胞毒性T细胞的诱导活性，其中，该表位肽在序列编号：1、序列编号：2、序列编号：3、序列编号：4、序列编号：5、序列编号：6、序列编号：26、序列编号：27或序列编号：28记载的氨基酸序列中取代、缺失、***和/或添加有1个或多个氨基酸。

3.一种核酸，其编码权利要求1或2所述的表位肽。

4.一种表达载体，其包含编码权利要求1或2所述的表位肽的核酸。

5.一种用于治疗或预防EBV的感染或EBV阳性的癌的疫苗，其包含权利要求1或2所述的表位肽作为有效成分。

6.根据权利要求5所述的疫苗，其中，EBV选自AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。

7.一种用于治疗或预防EBV的感染或EBV阳性的癌的疫苗，其包含权利要求3～4中任一项所述的核酸或表达载体作为有效成分。

8.根据权利要求7所述的疫苗，其中，EBV选自AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。

9.一种用于治疗或预防EBV的感染或EBV病毒阳性的癌的疫苗，其包含将权利要求1或2所述的表位肽呈递至HLA的抗原呈递细胞作为有效成分。

10.根据权利要求9所述的疫苗，其中，EBV选自AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。

11.一种针对EBV的被动免疫疗法剂，其包含EBV特异性的细胞毒性T细胞，该EBV特异性的细胞毒性T细胞是利用权利要求1或2所述的表位肽或将该表位肽呈递至HLA的抗原呈递细胞刺激外周血淋巴细胞而得到的。

12.一种针对EBV的被动免疫疗法剂，其包含细胞毒性T细胞，该细胞毒性T细胞是通过使从权利要求1或2所述的表位肽制备而得的主要组织相容性抗原复合体和/或主要组织相容性抗原复合体-四聚物和外周血淋巴细胞接触，形成细胞毒性T细胞结合于该主要组织相容性抗原复合体和/或主要组织相容性抗原复合体-四聚物的结合体，然后从该结合体分离而得到的。

13.一种EBV特异性的细胞毒性T细胞的定量方法，其包含：

用权利要求1或2所述的表位肽刺激来自对象的外周血的工序；

14.一种外周血中的EBV特异性的细胞毒性T细胞的定量方法，其包含：

将权利要求1或2所述的表位肽与主要组织相容性抗原复合体与β2-微球蛋白混合的工序；及

15.一种EBV特异性的细胞毒性T细胞的诱导方法，其包含使权利要求1或2所述的表位肽和抗原呈递细胞接触的工序。

16.一种用于诱导细胞毒性T细胞的试剂盒，其包含权利要求1或2所述的表位肽作为构成要素。

17.一种生产EBV特异性CTL的方法，其包含使权利要求1或2所述的表位肽和外周血单核细胞在含血浆的培养基中接触的工序。

18.一种CKAP4特异性的CTL表位肽，其由序列编号：43记载的氨基酸序列构成。

19.一种CKAP4特异性的CTL表位肽，其在序列编号：43记载的氨基酸序列中取代、缺失、***和/或添加有1个或多个氨基酸。

20.根据权利要求18或19所述的表位肽，其特征在于，其是HLA-A*24：02分子限制性的抗原肽，其诱导具有T细胞受体的CTL，所述T细胞受体特异性地识别在细胞表面呈递和HLA-A*24：02分子形成的复合体的细胞。

21.一种核酸，其编码权利要求18或19所述的表位肽。

22.一种表达载体，其包含编码权利要求18或19所述的表位肽的核酸。

23.一种用于癌治疗或预防的疫苗，其包含权利要求18或19所述的表位肽作为有效成分。

24.一种用于癌治疗或预防的疫苗，其包含权利要求21或22所述的核酸或表达载体作为有效成分。

25.一种用于癌治疗或预防的疫苗，其包含将权利要求18或19所述的表位肽呈递至HLA的抗原呈递细胞作为有效成分。

26.一种用于癌治疗的被动免疫疗法剂，其包含CKAP4特异性的CTL作为有效成分，所述CKAP4特异性的CTL是利用权利要求18或19所述的表位肽或将该表位肽呈递至了HLA的抗原呈递细胞刺激外周血淋巴细胞而得到的。

27.一种用于癌治疗的被动免疫疗法剂，其包含CTL作为有效成分，所述CTL是使从权利要求18或19所述的表位肽制备的主要组织相容性抗原复合体和/或主要组织相容性抗原复合体-四聚物和外周血淋巴细胞接触，形成CTL结合于该主要组织相容性抗原复合体和/或主要组织相容性抗原复合体-四聚物的结合体，然后从该结合体进行分离而得到的。

28.一种CKAP4特异性的CTL的定量方法，其包含：

用权利要求18或19所述的表位肽刺激来自对象的外周血的工序；

获得对于由前述工序产生的CKAP4特异性的CTL的工序；及

29.一种外周血中的CKAP4特异性的CTL的定量方法，其包含：

从权利要求18或19所述的表位肽制备主要组织相容性抗原复合体-四聚物的工序；及

30.一种CKAP4特异性CTL的诱导方法，其包含使权利要求18或19所述的表位肽和来自对象的外周血单核细胞接触的工序。

31.一种用于癌治疗的被动免疫疗法剂的制造方法，其包含：

利用权利要求18或19所述的表位肽或将该表位肽呈递至了HLA的抗原呈递细胞刺激外周血淋巴细胞而获得CKAP4特异性的CTL的工序。

32.一种用于癌治疗的被动免疫疗法剂的制造方法，其包含：

使从权利要求18或19所述的表位肽制备的主要组织相容性抗原复合体和/或主要组织相容性抗原复合体-四聚物和外周血淋巴细胞接触的工序；

获得从该结合体分离而得到的CTL的工序。

33.一种对于主要组织相容性抗原复合体有特异性的抗体，其是从权利要求18或19所述的表位肽制备的。