CN107686835A - 一种果皮基益生菌载体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种果皮基益生菌载体的制备方法，包括如下步骤：分别将果皮如橘皮、柠檬皮和黄秋葵皮除杂后进行灭菌处理，烘干后进行粉碎混合；将橘皮、柠檬皮和黄秋葵皮混合粉末添加于灭菌的去离子水中混匀，进行微射流处理后进行孵育，离心去除沉淀后进行真空浓缩；将益生菌菌体、壳聚糖‑血浆蛋白复合物与步骤2制得的浓缩液混匀后进行孵育；将混合液进行真空冷冻干燥处理；本发明有效解决了现有益生菌载体制备过程中物理吸附不牢固、制备过程对菌体损伤大，以及使用无机材料、有机高分子材料、添加剂和化学试剂，无法到达现代社会对绿色安全食品材料的要求、制备过程复杂且成本高等问题。

Description

一种果皮基益生菌载体的制备方法

技术领域

本发明涉及微生物细胞固定化技术领域，具体涉及一种果皮基益生菌载体的制备方法。

背景技术

根据益生菌应用效果的概念，只有活的生物才能产生益生功能。因此，在益生菌食品生产的整个过程中，都要考虑到益生菌活性的重要标准，以便达到并保持高活性。益生菌在被人体摄入时必须是活的，而且能够在胃肠道中保持它们的活性。一种保持益生菌活性的可行方法是将细胞包埋到保护性的结构中，使它们在不利环境下的存活得到改善。利用物理吸附和微胶囊包埋技术保护益生菌是目前国内外研究的热点。

吸附法的缺点是结合不牢固，菌体容易脱落。微胶囊包埋技术会形成高分子凝胶网络结构进而限制菌体的扩散，并且这种扩散阻力会导致菌体无法很好的与外界良好的接触。此外，制备过程对菌体损伤大。传统的微胶囊包埋载体主要包括无机材料和有机高分子材料，如陶瓷、海藻酸钠、琼脂和聚乙烯醇等。随着消费者对食品安全的要求越来越高，传统的固定化载体已不能满足人们的需求，寻找新型绿色安全的固定化载体成为研究热点，并且对风味和口感的改善也是考虑因素。目前的微囊化方法尽管有很多种，但是可以应用于益生菌的方法却不多，并且这些方法操作复杂，应用于工业生产仍存在着很多困难。现有技术通过将固定载体浸渍在事先接种菌体的培养基中，静置发酵培养过夜，通过长时间的生长增殖而吸附在载体的表面，完成固定过程。其缺点在于吸附力弱，菌体易从载体表面脱落，附着量少且无任何支撑保护方式。以壳聚糖等生物大分子为载体通过吸附制备微生物，微生物与载体之间的结合力弱，在使用过程中易从载体上脱落，因此，多数情况下用吸附-交联法以提高其稳定性。最常用的交联剂是对人体有害的甲醛和戊二醛以及其它化学试剂。

目前工业上主要采用酸法提取果胶，其原理是利用酸，例如盐酸，将植物细胞中的不溶于水的原果胶变成水溶性果胶，然后加入多价金属盐类或乙醇使果胶析出。缺点是在提取过程中果胶容易发生局部水解，从而降低了果胶的分子质量，提取条件对提取效果有较大影响，而且因提取液粘度大，导致生产周期较长，效率较低。此外高酯果胶在pH大于3.6时，半乳糖醛酸由于游离羧基的排斥作用，很难形成凝胶。因此在传统的果胶提取过程中会加入大量强酸以形成较强的酸度体系。而低酯果胶中的羧基相对较多，分子间的排斥作用大，所以难以通过自身结合，必须在体系中加入钙离子，通过静电相互作用与带负电的羧基结合，形成蛋盒模型，从而形成凝胶。

发明内容

本发明提出了一种果皮基益生菌载体的制备方法，本发明有效解决了现有益生菌载体制备过程中物理吸附不牢固、制备过程对菌体损伤大，以及使用无机材料、有机高分子材料、添加剂和化学试剂，无法达到现代社会对绿色安全食品材料的要求、制备过程复杂且成本高等问题。

本发明通过以下技术方案实现：

一种果皮基益生菌载体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）分别将果皮如橘皮、柠檬皮和黄秋葵皮除杂后进行灭菌处理，烘干后进行粉碎混合，粉碎后的橘皮、柠檬皮和黄秋葵皮粉的粉碎细度为50～200目，橘皮、柠檬皮和黄秋葵皮在混合粉末中的比例为1～3：1～3：2～6；

2）将步骤1制得的橘皮、柠檬皮和黄秋葵皮混合粉末添加于灭菌的去离子水中混匀，去离子水的pH值范围是5.5～6.0，进行微射流处理后进行孵育，离心去除沉淀后进行真空浓缩；

3）将益生菌菌体、壳聚糖-血浆蛋白复合物与步骤2制得的浓缩液，在50～300rpm涡旋振荡5～30min混匀，后进行孵育；

4）将上述步骤3制得的混合液进行真空冷冻干燥处理，处理工艺条件为真空度10～30Pa，时间10～50h，即可制得。

本发明进一步解决的技术改进方案是：

所述步骤1灭菌处理的温度为100～120℃，时间为1～10min；烘干的温度为60～100℃，时间为0.5～1.5h。

本发明进一步解决的技术改进方案是：

所述步骤2的孵育条件为混合液pH为5.5～6.0，温度为20～30℃，转速30～100rpm/min，时间为1～5h。

本发明进一步解决的技术改进方案是：

所述步骤2的离心参数为5000～10000rpm/min，时间为5～20min，温度不高于30℃。

本发明进一步解决的技术改进方案是：

所述步骤2的真空浓缩是在30～50℃进行真空旋转蒸发，浓缩后的液体体积为浓缩前的10～30%。

本发明进一步解决的技术改进方案是：

所述步骤2中微射流处理压力为100～300MPa、处理次数3～6次，料液比1：（30～40g/mL）。

本发明进一步解决的技术改进方案是：

所述步骤3中益生菌的质量为橘皮、柠檬皮和黄秋葵皮混合粉总质量的1～10%。

本发明进一步解决的技术改进方案是：

所述步骤3的孵育条件为混合液pH为5.5～6.0，温度为20～30℃，转速30～50rpm/min，时间为1～10h。

本发明进一步解决的技术改进方案是：

所述步骤3的益生菌为乳杆菌类、或为双歧杆菌类、或为革兰氏阳性球菌类、或为酵母类。

本发明进一步解决的技术改进方案是：

所述步骤3的壳聚糖-血浆蛋白复合物是通过将质量浓度为1～3%的鸡血浆蛋白溶液和质量浓度为1～3%的壳聚糖溶液，按照0.01～0.3:1的比例进行混合，混合液pH为5.5～6.0，于90℃～100℃加热30～60min后干燥成固态粉末而得，其添加比例为橘皮、柠檬皮和黄秋葵皮混合粉总质量的1～10%。

本发明与现有技术相比，具有以下明显优点：

一、本发明采用的微射流技术通过剪切力、高速对撞、高频振荡和气穴等作用达到细微化和均质的目的，可使被加工物料达到亚微米级甚至纳米级，粉碎后颗粒分布均匀、粉碎效率高、安全无污染；样品在液体介质受到巨大外力作用后达到破碎细胞、释放细胞内有效成分的作用，黄秋葵中的果胶物质在从细胞中释放出的同时，提高了橘皮和柠檬皮中的酸性酚类物质（绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和香豆酸等）和柠檬酸等酸性物质的释放量。

二、本发明在整个制备过程中完全不使用无机材料、有机高分子材料和化学试剂，对环境没有污染，可以满足消费者对绿色安全食品材料的要求。

三、本发明工艺易于操作，通过酸性酚类物质和柠檬酸等酸性物质与黄秋葵皮粉末纳米颗粒充分接触，创造酸性微环境，进一步促进了果胶类物质的析出。

四、本发明制备的壳聚糖-血浆蛋白复合物的鸡血浆蛋白的等电点在pH 4.5附近，当处于pH5.5-6.0的溶液环境中时，其带有负电荷，无法与带有负电荷的果胶类物质形成稳定凝胶；通过制备鸡血浆蛋白-壳聚糖共价复合物之后，其等电点上升到6.0。这是由于由于接枝壳聚糖的亲水性链可以屏蔽吸附在鸡血浆蛋白质上的负电荷，导致复合物的zeta电位增大。此时在pH5.5-6.0的溶液环境中，共价复合物带有正电荷，可以与微射流处理后释放和酸性微环境诱导的果胶发生静电相互作用而形成凝胶复合物或者团聚体，进而将益生菌进行包埋固定。

五、本发明反应过程温和，对菌体不会产生机械损伤，益生菌在最适pH范围内参与反应过程，最大程度上保持了菌体的生理活性，能提高菌体的操作稳定性。

六、本发明在连续发酵、低温长时间贮藏和逆境环境存活实验中，固定化细胞比游离细胞更为稳定，载体对于菌体具有保护作用。

七、本发明通过固定化，将菌体均匀的分布于载体的内部和外部，易于菌体在培养液中发酵利用。

八、本发明载体通过静电成胶作用将益生菌牢固的包埋固定，载体固定稳定性高。

九、本发明由于使用了水果皮，固定化菌体发酵产物中具有芳香气味的酮基类物质含量较高，提高了发酵产物的果香风味，产品的接受度更高。

十、本发明在整个制备过程中利用的原料均为水果和动物加工废弃物，不仅解决了废弃物的处理问题，还降低了经济成本。

附图说明

图1为本发明固定化益生菌载体负载干酪乳杆菌的扫描电子显微镜图像；

图2为本发明固定化益生菌载体负载双歧杆菌的扫描电子显微镜图像；

图3为本发明固定化益生菌载体负载嗜热链球菌的扫描电子显微镜图像。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明技术解决方案作进一步描述：

实施例一、

制备步骤如下：

1、分别将橘皮、柠檬皮和黄秋葵皮除杂后进行100℃，10min的灭菌处理，随后在80℃，进行1.0h烘干处理后进行粉碎，橘皮、柠檬皮和黄秋葵皮粉的粉碎细度为100目；

2、将10g橘皮粉、10g柠檬皮粉和30g黄秋葵皮粉的混合粉末添加于灭菌的1500mL、pH5.5去离子水中，以300rpm涡旋振荡30min混匀，进行100MPa、3次微射流处理后进行孵育，随后在20℃，以5000rpm/min，离心10min去除沉淀后在30℃进行真空旋转蒸发浓缩后，得到400mL的浓缩液；

3、将质量浓度1%鸡血浆蛋白溶液和质量浓度1%壳聚糖溶液按照0.02：1的比例进行混合，调节混合液pH为5.5，于100℃加热60min后干燥成壳聚糖-鸡血浆蛋白复合物固态粉末，随后各取0.5g干酪乳杆菌、4g壳聚糖-血浆蛋白复合物与上述浓缩液以100rpm涡旋振荡10min混匀后调节混合液pH=5.5，在20℃，转速50rpm/min的条件下，孵育2h；

4、将上述混合液在真空度10Pa，时间30h的条件下进行真空冷冻干燥处理制得。

实施例二、

制备步骤如下：

1、分别将橘皮、柠檬皮和黄秋葵皮除杂后进行110℃，8min的灭菌处理，随后在90℃，进行0.8h烘干后进行粉碎，橘皮、柠檬皮和黄秋葵皮粉的粉碎细度为150目；

2、将10g橘皮粉、20g柠檬皮粉和30g黄秋葵皮粉的混合粉末添加于灭菌的2000mL、pH5.7去离子水中，以260rpm涡旋振荡23min混匀，进行200MPa、4次微射流处理后调整溶液pH为5.5-6.0，在23℃，转速40rpm/min的条件下孵育2h，随后在20℃，以6000rpm/min，离心15min去除沉淀后在44℃进行真空旋转蒸发浓缩后，得到600mL的浓缩液；

3、将质量浓度1%鸡血浆蛋白溶液和质量浓度2%壳聚糖溶液按照0.1:1的比例进行混合，调节混合液pH为5.8，于95℃加热60min后干燥成壳聚糖-血浆蛋白复合物固态粉末，随后各取1.2g双歧杆菌、4.5g壳聚糖-鸡血浆蛋白复合物与上述浓缩液以120rpm涡旋振荡7min混匀后调节混合液pH=5.5,在26℃，转速60rpm/min的条件下，孵育3h；

4、将上述混合液在真空度20Pa，时间38h的条件下进行真空冷冻干燥处理制得。

实施例三、

制备步骤如下：

1、分别将橘皮、柠檬皮和黄秋葵皮除杂后进行120℃，时间为6min的灭菌处理，随后在100℃，0.4h进行烘干后进行粉碎，橘皮、柠檬皮和黄秋葵皮粉的粉碎细度为200目；

2、将20g橘皮粉、20g柠檬皮粉和30g黄秋葵皮粉的混合粉末添加于灭菌的2600mL、pH6.0去离子水中,以300rpm涡旋振荡20min混匀，进行300MPa、5次微射流处理后进行调整溶液pH为6.0，在30℃，转速30rpm/min的条件下孵育4h，随后在10℃，以10000rpm/min，离心12min去除沉淀后在50℃进行真空旋转蒸发浓缩后，得到520mL的浓缩液；

3、将质量浓度2%鸡血浆蛋白溶液和质量浓度3%壳聚糖溶液按照0.2:1的比例进行混合，调节混合液pH为6.0，于100℃加热50min后干燥成壳聚糖-鸡血浆蛋白复合物固态粉末，随后各取2.1g嗜热链球菌、5.0g壳聚糖-鸡血浆蛋白复合物与上述浓缩液以150rpm涡旋振荡5min混匀后调节混合液pH=6.0，在26℃，转速80rpm/min的条件下，孵育4h；

4、将上述混合液在真空度26Pa，时间45h的条件下进行真空冷冻干燥处理制得。

下面结合实验数据进一步说明本发明：

通过电子扫描显微镜进行观察，三种实施例中的益生菌菌体均已紧密附着于混合果皮基载体之上，图1所示为实施例1，图2所示为实施例2，图3所示为实施例3。

通过固定化和游离态益生菌在37 ℃下于模拟胃液和模拟肠液中孵育120分钟过程中活性菌落数量（log cfu/mL）的变化分析，发现三种实施例中的活性菌落数量经过120分钟的模拟胃液孵育和模拟肠液孵育，均显著高于游离态的益生菌。如表1所示：

表1（表格中上标字母为a、b由于插图尺寸限制可能有些模糊，但是轮廓基本可以判断）

通过固定化和游离态益生菌在0℃贮藏时菌落总数（log cfu/mL）的变化分析，发现三种实施例中的活性菌落数量经过30天的低温贮藏之后，均显著高于游离态的益生菌。如表2所示：

表2（表格中上标字母为a、b由于插图尺寸限制可能有些模糊，但是轮廓基本可以判断）

需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述技术方案的基础上所做出的等同替换或替代，均属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种果皮基益生菌载体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）分别将果皮如橘皮、柠檬皮和黄秋葵皮除杂后进行灭菌处理，烘干后进行粉碎混合，粉碎后的橘皮、柠檬皮和黄秋葵皮粉的粉碎细度为50～200目，橘皮、柠檬皮和黄秋葵皮在混合粉末中的比例为1～3：1～3：2～6；

2）将步骤1制得的橘皮、柠檬皮和黄秋葵皮混合粉末添加于灭菌的去离子水中混匀，去离子水的pH值范围是5.5～6.0，进行微射流处理后进行孵育，离心去除沉淀后进行真空浓缩；

3）将益生菌菌体、壳聚糖-血浆蛋白复合物与步骤2制得的浓缩液，在50～300rpm涡旋振荡5～30min混匀，后进行孵育；

4）将上述步骤3制得的混合液进行真空冷冻干燥处理，处理工艺条件为真空度10～30Pa，时间10～50h，即可制得。

2.根据权利要求1所述的一种果皮基益生菌载体的制备方法，其特征在于：所述步骤1灭菌处理的温度为100～120℃，时间为1～10min；烘干的温度为60～100℃，时间为0.5～1.5h。

3.根据权利要求1所述的一种果皮基益生菌载体的制备方法，其特征在于：所述步骤2的孵育条件为混合液pH为5.5～6.0，温度为20～30℃，转速30～100rpm/min，时间为1～5h。

4.根据权利要求1所述的一种果皮基益生菌载体的制备方法，其特征在于：所述步骤2的离心参数为5000～10000rpm/min，时间为5～20min，温度不高于30℃。

5.根据权利要求1所述的一种果皮基益生菌载体的制备方法，其特征在于：所述步骤2的真空浓缩是在30～50℃进行真空旋转蒸发，浓缩后的液体体积为浓缩前的10～30%。

6.根据权利要求1所述的一种果皮基益生菌载体的制备方法，其特征在于：所述步骤2中微射流处理压力为100～300MPa、处理次数3～6次，料液比1：（30～40g/mL）。

7.根据权利要求1所述的一种果皮基益生菌载体的制备方法，其特征在于：所述步骤3中益生菌的质量为橘皮、柠檬皮和黄秋葵皮混合粉总质量的1～10%。

8.根据权利要求1所述的一种果皮基益生菌载体的制备方法，其特征在于：所述步骤3的孵育条件为混合液pH为5.5～6.0，温度为20～30℃，转速30～50rpm/min，时间为1～10h。

9.根据权利要求1所述的一种果皮基益生菌载体的制备方法，其特征在于：所述步骤3的益生菌为乳杆菌类、或为双歧杆菌类、或为革兰氏阳性球菌类、或为酵母类。

10.根据权利要求1所述的一种果皮基益生菌载体的制备方法，其特征在于：所述步骤3的壳聚糖-血浆蛋白复合物是通过将质量浓度为1～3%的鸡血浆蛋白溶液和质量浓度为1～3%的壳聚糖溶液，按照0.01～0.3:1的比例进行混合，混合液pH为5.5～6.0，于90℃～100℃加热30～60min后干燥成固态粉末而得，其添加比例为橘皮、柠檬皮和黄秋葵皮混合粉总质量的1～10%。