CN104624054A - 一种控制膜生物污染杀菌剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种控制膜生物污染杀菌剂的制备方法。通过乳酸杆菌在常温下将Ag⁺还原为Ag⁰纳米颗粒，进而实现优异的膜生物污染抑制剂及膜清洗剂的制备。将乳酸杆菌菌粉制成菌悬液，调节碱度后再与银氨溶液混合，在10～70℃下反应12～48h，得到含微生物体和纳米银胶体的混合液，经初步离心去除大片生物残体，用超滤离心管进一步对生物银溶胶进行浓缩、去除Na⁺、Ag⁺、OH^-、NO₃ ^-等杂质离子，最后经真空冷冻干燥得到在水溶液中分散良好的生物纳米银。此纳米银有良好的抗菌、抑制生物膜及促进成熟生物膜脱落的效果。

Description

一种控制膜生物污染杀菌剂的制备方法

技术领域

本发明涉及水处理和膜分离技术领域，如膜生物反应器、微滤、超滤、纳滤和反渗透等分离工艺，应用领域涉及污水处理与资源化，饮用水净化，生物技术等。 

背景技术

膜分离技术应用广泛，然而由于膜污染引起的膜通量和分离性能的下降是膜分离技术所面临的最严重的问题。通常，膜污染可分为：有机污染、无机污染、胶体污染和生物污染。其中，由于生物膜形成而造成的生物污染被认为是最复杂、危害最大的一种膜污染。 

生物膜是指微生物细胞及其分泌的胞外聚合物在介质表面附着后形成的微生物聚集体。一旦形成生物污染，不仅会对公众健康产生危害，更会对水处理过程特别是膜处理过程造成负面影响。 

目前针对膜生物污染的主要措施有：强氧化性的消毒剂或者紫外辐照进行预处理以及物理化学清洗。然而成熟的生物膜结构坚固，对清洗过程有很强的抵抗力，很难完全去除。此外，频繁的物理、化学清洗不仅会增加运行成本更会对膜材料本身造成不可逆的破坏。基于以上问题，发展新型有效的杀菌剂来减轻生物污染的危害变得极为重要。 

纳米银优越的抗菌性使其成为最广泛应用的纳米材料之一。目前很多研究表明，纳米银能够有效地抑制生物膜的形成，促进成熟生物膜的脱落，因此有望发展成为一种有效的生物膜抑制剂或者膜清洗剂来减轻膜过滤***中生物污染的危害。 

纳米银的制备方法很多，物理法和化学法由于实验条件简单、易于调控等优点得到了广泛地应用。同时这些方法也面临着诸如纳米粒子团聚、高能耗、反应条件苛刻、难于规模化生产及难于从纳米银溶胶中分离出固体的单分散纳米银粉末、最终产品纳米银粉的再分散性差等问题。一般认为纳米银的抗菌性与粒径成反比，而普通化学法合成的纳米银在粒径很小或者浓度很高时很容易团聚，大大减少了纳米粒子的比表面积，这势必会影响纳米颗粒的性能及应用。 

近年来，生物还原作为一种绿色制备纳米银的方法得到了越来越多的关注。细菌、真菌、藻类及植物提取物等都可以作为生物还原的“纳米工厂”。研究者研究了几种乳酸菌还原合成生物纳米银的能力。将培养成熟的新鲜菌体配制成一定浓度的菌悬液，碱化处理后与一定浓度的银氨溶液反应，发现乳酸杆菌（Lactobacillus  fermentum  LMG 8900）具有最强的还原合成生物纳米银的能力，可以在细胞壁上合成约为11.2 nm、粒径分布窄的小粒径纳米银。作者主要研究了分布在细胞表面的纳米银，此生物纳米银在微生物细胞的保护下可以有效地减少团聚，但是较多的细胞成分使干燥后的生物纳米银粉在水溶液中很难均匀分散，同时对此生物纳米银抗菌机制研究表明，大量的生物质成分也许会阻碍纳米粒子和受试细菌的直接接触，从而在某种程度上降低了纳米银的抗菌性能。本申请中同样使用乳酸杆菌（Lactobacillus  fermentum  LMG 8900）为原料，通过对已有报道的方法进行修饰和改进，可以得到含有丰富的、更小粒径（约6 nm）纳米银的生物银溶胶。此外，生物法制备的纳米银溶胶也面临着后续浓缩纯化的问题。例如已有报道（申请号200710008639.4）采用加热蒸发初步浓缩纳米银溶胶，进一步加入大量有机溶剂(乙醇或丙酮)破坏银溶胶表面水膜稳定性，使其脱水沉淀，用含水有机溶剂多次洗涤来初步去除杂质离子，再在30-60℃下真空干燥得到纳米银粉。然而加热蒸发易使纳米银在容器中贴壁团聚结块，会使产量大大降低；反复用有机溶剂洗涤纳米粒子也会加大纳米粒子团聚的几率。同时大量有机溶剂的使用会对环境造成不良影响。 

而本申请就是克服以上缺陷，提供一种清洁、无毒、环境友好的生物还原制备、超滤离心收集纯化在水溶液中高度分散的小粒径（均值6 nm）生物纳米银抗菌剂的方法。 

发明内容

本发明的目的旨在提供一种新型纳米银杀菌剂的制备方法，作为一种预处理方法或者膜清洗剂应用于膜过滤***中，提高整个***的抗生物污染性能，延长膜组件的使用寿命。 

本发明涉及的新型杀菌剂是利用一种微生物细胞成分为还原剂和保护剂来制备的生物纳米银粉末。所制得的纳米银粉粒径很小（平均粒径6纳米），在水溶液中有很好的再分散性和稳定性。通过小粒径纳米银与细菌（大肠杆菌、铜绿假单胞菌）相互作用，有效地降低受试细菌的成活率，明显减少细菌在膜材料表面的附着及成膜量；生物纳米银与成熟生物膜作用后也能有效地促进生物膜从膜材料表面的脱落。 

本发明所述的水溶性纳米银粉的制备方法如下：

将扩大培养的乳酸杆菌（Lactobacillus  fermentum  LMG 8900）菌泥冷冻干燥，研磨制成干菌粉备用；

将微生物干菌粉配置成1～20 g/L菌悬液，加入NaOH调节pH，使菌悬液[OH]^-1终浓度为0.2～0.4 mol L^-1，再与银氨溶液混合，银氨溶液终浓度为1～20 g/L，在10～70 ℃摇床中振荡培养12～48 h，得到含微生物体和纳米银胶体的混合液；将微生物体和纳米银胶体的混合液初步离心分离，弃去大块微生物残片，收集上清液得到稳定的深黄色至黑色的生物质银溶胶；进一步用截流分子量在1000-10000的超滤离心管离心分离生物质银溶胶中大部分水分及Na⁺ 、Ag⁺ 、OH^- 、NO₃ ^-等离子，得到高度浓缩纯化的生物质银溶胶；将上述高浓度生物质银溶胶在高真空下冷冻干燥，研磨得到生物纳米银粉。

本发明工艺简单，绿色环保，不需要添加除银氨溶液、氢氧化钠以外的化学试剂，超滤离心法可以有效地去除体系中的杂离子及水份，清洗和浓缩一步实现。所制得的生物纳米银粉末中银的含量在50%（W%）以上，粒径分布均匀，在水溶液中有高度的再分散性和稳定性。该生物纳米银粉具有良好的抑菌、抑制生物膜及促进成熟生物膜脱落的作用，针对膜生物污染难题，在膜分离技术领域具有良好的应用前景。 

附图说明

图1为本发明制备的生物纳米银粉在水中分散的TEM图。图中标尺为20nm。

图2-1为未经生物纳米银处理的大肠杆菌饱满完整的杆状形貌图；图2-2为生物纳米银处理后TEM观察到的大肠杆菌图，细胞出现不同程度地质壁分离、扭曲变形。 

具体实施方式

实施例1： 

乳酸杆菌菌悬液的配制：称取2.0 g 研细的干菌粉加入60 mL去离子水，搅拌振荡混合均匀备用；银氨溶液的配制：称取15.74 g硝酸银，加入适量去离子水溶解，滴加5%的氨水直到产生的棕褐色沉淀刚好消失，用去离子水定容至100 mL; 配制2 mol L^-1的氢氧化钠溶液。

在250 mL 的锥形瓶中将菌悬液60 mL、NaOH溶液 20 mL、银氨溶液20 mL混合均匀，最终反应体系中菌粉浓度为20 g/L，Ag⁺ 浓度为20 g/L，[OH]^-1浓度为0.4 mol L^-1。将混合液置于30℃摇床中（180rpm）振荡培养24h，得到含有微生物残体和纳米银溶胶的混合液；将混合液初步离心分离（7000 rpm），弃去菌体残片，收集上清液得到生物质银溶胶。 

将生物质银溶胶用超滤离心管（截流分子量在5000）在7000 rpm离心，在离心力作用下，水分及杂质离子（Na⁺ 、Ag⁺ 、OH^- 、NO₃ ^-）透过超滤膜，生物银则被截留，同步实现生物质银溶胶的浓缩与纯化。银溶胶浓缩至约20 mL左右，用高真空冷冻干燥机进行干燥，研磨得到含生物质的水溶性纳米银粉。 

银粉中银的质量分数约为60%。在透射电镜下观察水中再次分散的纳米银粉（如图1），大部分银颗粒呈球形，分散性良好。借助Gatan Pleasanton 软件对纳米银图片进行测量，获得图片中每个颗粒的粒径，用SPSS 18.0 软件进行粒径分布统计，结果表明生物银的平均粒径约为6.0nm。 用一定浓度的生物纳米银对大肠杆菌进行混合接触后，投射电镜（TEM）观察可见空白对照样（图2-1）中，大肠杆菌细胞饱满完整，呈现典型的杆状结构，而经处理后的细胞（图2-2）出现不同程度的质壁分离、扭曲变形，部分细胞内物质流失严重。 

虽然本发明通过优选实例来对本发明进行公开，但是在不偏离所附的权利要求书中限定的本发明的领域和范围的情况下，所描述的实施例的许多修改、变化和改变是可行的。因此，意图的是本发明不限于所描述的实施例，而是本发明具有所附的权利要求书的语言及其等效物所限定的全部范围。 

Claims (5)

1.一种能够有效控制膜生物污染的杀菌剂的微生物还原制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将扩大培养的乳酸杆菌（Lactobacillus  fermentum  LMG 8900）冷冻干燥研磨成干菌粉备用；

2）将乳酸菌菌粉配制成菌悬液，加入NaOH调节pH, 再与银氨溶液混合，在10～70 ℃下振荡反应，得到含有微生物菌体和纳米银溶胶的混合液；

3）将含有乳酸菌和纳米银溶胶的混合液在500-7000rpm离心分离，除去微生物残片，收集上清液得到生物质银溶胶；

4）用截流分子量在1000-10000的超滤离心管在500-7000 rpm对生物质银溶胶进行离心，在离心力作用下，水分及杂质离子透过超滤膜渗出，实现浓缩和去除杂质离子，浓缩液经真空冷冻干燥后，经研磨得到含生物质的水溶性生物纳米银粉。

2.如权利要求1所述的控制生物污染杀菌剂的制备方法，其特征在于步骤2中菌悬液终浓度为1～20 g/L。

3.如权利要求1所述的控制生物污染杀菌剂的制备方法，其特征在于步骤2中银氨溶液的终浓度（以Ag⁺浓度表示）为1～20 g/L。

4.如权利要求1所述的控制生物污染杀菌剂的制备方法，其特征在于步骤2中[OH]^-1终浓度为0.2～0.4 mol L^-1。

5.如权利要求1所述的控制生物污染杀菌剂的制备方法，其特征在于步骤2振荡反应时间为12～48h。