CN115820540A

CN115820540A - 一种间充质干细胞内皮分化诱导剂

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Publication number: CN115820540A
Application number: CN202211648480.3A
Authority: CN
Inventors: 张炳强; 陈梦梦; 韩丽辉; 赵毅; 张昱; 周阳
Original assignee: Qingdao Restore Biotechnology Co ltd
Current assignee: Qingdao Restore Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-12-21
Filing date: 2022-12-21
Publication date: 2023-03-21

Abstract

本发明一种间充质干细胞内皮分化诱导剂，由血管内皮生长因子、骨形成蛋白‑4、肿瘤坏死因子α、***、淫羊藿苷、雷帕霉素、睾酮、二甲双胍、曲美替尼组成，在加入完全培养基后，各成分作用浓度依次为血管内皮生长因子20‑40μg/L、骨形成蛋白‑4 20‑40μg/L、肿瘤坏死因子α5‑10μg/L、***5‑10μg/L、淫羊藿苷5‑10mg/L、雷帕霉素5‑10μg/L、睾酮20‑40μg/L、二甲双胍20‑40μg/L、曲美替尼20‑40μg/L。本发明的间充质干细胞内皮分化诱导剂，采用细胞因子联合小分子化合物，高效诱导间充质干细胞分化为内皮细胞，诱导分化效率极大提高，诱导后细胞活性强，无伦理问题，安全性高。

Description

一种间充质干细胞内皮分化诱导剂

技术领域

本发明属于干细胞诱导分化技术领域，具体涉及一种间充质干细胞定向分化诱导剂。

背景技术

内皮细胞属于上皮细胞类型，构成整个循环血管***的最内层，除作为外周血液与血管管壁的屏障之外，内皮细胞还具备分泌、代谢、合成、免疫调控等重要生理功能。目前国外学者应用内皮细胞治疗缺血性疾病，已取得了一定的效果，但由于内皮细胞获取困难，且为终末分化细胞，不能大量扩增，因此不能满足移植或构建组织工程血管所需的大量细胞，故选择一种临床上易获取、体外培养易扩增的种子细胞已成为血管组织工程研究的热点。

间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的干细胞，在胚胎发育中来源于中胚层，具有分化为多种中胚层细胞系的潜能，包括成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、肝脏细胞、胰岛细胞、表皮细胞、内皮细胞等。间充质干细胞来源广泛且没有伦理限制，易于分离和体外扩增，在经过多次***传代后仍保持多向分化潜能，至今为止的临床试验研究未发现间充质干细胞有严重副作用，是一种非常理想的细胞治疗和再生医学的种子细胞。

目前文献报道的运用间充质干细胞体外诱导内皮干细胞分化的研究报道不多，诱导方法也比较类似，分化获得率也较低。包括在培养基中添加血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白-4等因子及低氧环境、明胶包被培养板诱导分化等方法。还没有大规模的高效体外诱导获得内皮细胞的方法，限制了细胞治疗临床应用的发展，迫切需要一种新的诱导分化的方法。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供间充质干细胞内皮分化诱导剂，该诱导剂能够将间充质干细胞定向诱导分化为内皮细胞。目前多数间充质干细胞内皮分化诱导剂存在诱导时间过长，诱导效率低，诱导后获得内皮细胞活性差。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种间充质干细胞内皮分化诱导剂，由血管内皮生长因子、骨形成蛋白-4、肿瘤坏死因子α、***、淫羊藿苷、雷帕霉素、睾酮、二甲双胍、曲美替尼组成，在加入完全培养基后,各成分作用浓度依次为血管内皮生长因子20-40μg/L、骨形成蛋白-4 20-40μg/L、肿瘤坏死因子α 5-10μg/L、***5-10μg/L、淫羊藿苷5-10mg/L、雷帕霉素5-10μg/L、睾酮20-40μg/L、二甲双胍20-40μg/L、曲美替尼20-40μg/L。所述的完全培养基为Keratinocyte-SFM、人间充质干细胞专用无血清培养基或者DMEM/F12+10%FBS。

优选的，一种间充质干细胞内皮分化诱导剂，在加入完全培养基后，各成分作用浓度依次为血管内皮生长因子30μg/L、骨形成蛋白-4 30μg/L、肿瘤坏死因子α 8μg/L、***8μg/L、淫羊藿苷8mg/L、雷帕霉素7μg/L、睾酮30μg/L、二甲双胍30μg/L、曲美替尼30μg/L。所述的完全培养基为Keratinocyte-SFM、人间充质干细胞专用无血清培养基或者DMEM/F12+10%FBS。

本发明的间充质干细胞内皮分化诱导剂，采用细胞因子联合小分子化合物，高效诱导间充质干细胞分化为内皮细胞，诱导分化效率极大提高，诱导后细胞活性强，无伦理问题，安全性高。

附图说明

图1 间充质干细胞诱导后CD31阳性的内皮细胞（×200）；

图2 间充质干细胞诱导后CD144阳性的内皮细胞（×200）；

图3 间充质干细胞诱导后的KDR（血管内皮细胞生长因子受体）阳性的内皮细胞（×200）；

图4本发明诱导剂与传统方法诱导人脂肪间充质干细胞诱导效率的比较；

图5本发明诱导剂与传统方法诱导人脐带间充质干细胞诱导效率的比较。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实验所用器具仪器试剂皆可通过商业途径获得。

实施例1间充质干细胞内皮分化诱导剂，将下列原料按其各自特性进行溶解，以人间充质干细胞无血清培养基（LONZA，货号00190632）为基质，使各组分含量如下列定容至1000ml：血管内皮生长因子（VEGF，品牌PeproTech，货号96-100-20-2）20μg、骨形成蛋白-4（BMP-4，品牌Sigma，货号SRP3016-10μg）20μg、肿瘤坏死因子α（TNF-α，品牌PeproTech，货号96-100-00AB-10μg）5μg、***（EPO，品牌PeproTech ，货号CYT-201）5μg、淫羊藿苷（上海微晶生物, 489-32-7,20mg）5μg、雷帕霉素（品牌TargetMol，货号T1537）5μg、睾酮（品牌Sigma, 货号T1500）20μg、二甲双胍（品牌Sigma，货号D150959-5G）20μg，曲美替尼（品牌美仑生物，货号MB5401）20μg，混匀后过滤除菌。

实施例2 间充质干细胞内皮分化诱导剂，将下列原料按其各自特性进行溶解，以DMEM/F12+10%FBS为基质，使各组分含量如下列定容至1000ml：VEGF 40μg、 BMP-4 40μg、TNF-α 10μg、 EPO 10μg、淫羊藿苷 10μg、雷帕霉素 10μg、睾酮40μg、二甲双胍40μg，曲美替尼40μg，混匀后过滤除菌。

实施例3 间充质干细胞内皮分化诱导剂，将下列原料按其各自特性进行溶解，以Keratinocyte-SFM（品牌Gibco，货号：17005042）为基质，使各组分含量如下列定容至1000ml：VEGF 30μg、 BMP-4 30μg、TNF-α 8μg、 EPO 8μg、淫羊藿苷8μg、雷帕霉素7μg、睾酮30μg、二甲双胍30μg，曲美替尼30μg，混匀后过滤除菌。

实施例4 间充质干细胞内皮分化诱导剂，将下列原料按其各自特性进行溶解，以人间充质干细胞无血清培养基（LONZA，货号00190632）为基质，使各组分含量如下列定容至1000ml：VEGF 30μg、 BMP-4 30μg、TNF-α 8μg、 EPO 8μg、淫羊藿苷8μg、雷帕霉素7μg、睾酮30μg、二甲双胍30μg，曲美替尼30μg，混匀后过滤除菌。

实施例5 采用实施例4制备的诱导剂，对人脂肪间充质干细胞（AD-MSCs）进行内皮细胞诱导分化实验

1、脂肪间充质干细胞体外原代培养：将脂肪抽吸术后液体800r/min离心3min，留上层漂浮的脂肪组织，磷酸缓冲液(PBS)漂洗，800r/min离心5min 2次，留上层脂肪；加入等体积0.2％胶原酶，37℃摇床消化30min；将糊状消化液用100目不锈钢滤网过滤，1500r/min离心5min，沉淀物以1ml DME/F12重悬，PBS漂洗，1000r/min离心8min，细胞培养基重悬，5×10⁵/ml接种；置37℃、5％CO₂培养箱孵育，静置3d后酌情换液。细胞长至80％融合时，0.25％胰酶消化传代。

2、脂肪间充质干细胞的鉴定

（1）取P4代AD-MSCs，流式检测细胞表面标记，流式结果如表1。

表1 AD-MSCs表面标记物的检测

其中，阳性标记物CD29、CD73、CD90、CD49d表达大于95%，阴性标记物CD31、CD34、CD45、HLA-DR表达低于2%，证明为该细胞为脂肪间充质干细胞（MSCs）。

3、脂肪间充质干细胞向内皮细胞诱导分化：取P4的AD-MSCs以5*10⁵/孔接种于6孔板中，过夜贴壁后换成本发明的诱导培养基连续诱导8d,同时设置空白对照组和阳性对照组。分组如表2所示。

表2 诱导分化分组

4、细胞免疫组化检测CD31、CD144、KDR的表达：每组细胞爬片均随机选取5个光镜下(×200)视野下计数CD31、CD144、KDR染色阳性的细胞数目。试验重复3次。

结果：细胞免疫组化染色发现，空白对照组无CD31、CD144、KDR染色阳性的细胞。本发明诱导剂CD31、CD144、KDR染色阳性细胞数目均明显多于实验组二(阳性对照)，说明本发明诱导剂明显优于传统诱导剂，如附图4示，结果有统计学意义。附图1、2、3分别示CD31、CD144、KDR染色阳性的细胞。

实施例6 采用实施例4制备的诱导剂，对人脐带间充质干细胞（UC-MSCs）进行内皮细胞诱导分化实验

1、脐带间充质干细胞的分离培养（组织块培养法）

（1）向脐带采集瓶中加入30ml生理盐水，初步洗涤脐带。

（2）无菌镊子转移脐带至10cm无菌培养皿中，无菌手术剪将脐带剪成约2cm数段，加入生理盐水洗涤血凝块，直至基本去除血渍洗涤液较清澈。

（3）剔除血管：按血管螺旋走式剔除两条动脉，一条静脉。

（4）分离华通氏胶：位于羊膜与血管之间的白色***即为华尔通氏胶，用长柄有齿镊将其撕下，放入无菌平皿中。

（5）洗涤红细胞：向无菌平皿中加入10ml注射用水，洗涤胶体1min，共洗涤2次。

（6）胶体称重：将洗涤后的华通氏胶移入到50ml离心管中，称重记录。

（7）组织匀浆：用无菌长柄手术剪，在离心管中将组织剪切成1mm³左右的组织匀浆块，剪切时间15～20min。

（8）定容种瓶：根据胶体重量，加入适量脐带MSC专用培养基，定容组织匀浆浓度为0.4g/ml，电动移液器吹打匀浆均匀后，每75cm²接种1ml组织匀浆（即0.4g/75cm²），T75培养瓶中加入15ml脐带MSC无血清培养基（LONZA， 00190632），晃动培养瓶混匀后培养。

（9）培养条件：二氧化碳恒温恒湿培养箱，参数：（37±0.5）℃，二氧化碳体积分数为（5±0.2）%。

（10）原代培养：原代4～5d半量换液一次，（拟采用平板离心机，在培养瓶中初步离心后，移除半量培养基，加入半量新鲜培养基，重悬浮组织块培养），原代培养14～16d之后，P0代细胞密度达到80%～90%，消化传代。

（11）P0代细胞传代：消化酶为0.125%Trypsin-0.01％ EDTA溶液，每75 cm²加入1～1.5ml消化酶溶液，消化时间为40～60秒，加入无血清培养基2～3ml反复吹打瓶底，移入50ml离心管中，原培养瓶中加入5ml生理盐水冲洗瓶壁，加入离心管中定容至50ml，统计细胞总量。

（12）洗涤接种传代：离心参数，250g/min,10min，去除上清液后，加入新鲜培养液定容后接种新培养瓶中，传代细胞密度为(6～8)×10⁵/75cm²。

（13）细胞培养与传代：P1代后，每周换液2次，每3～4天传代，传代时细胞融合应在80%～90%，传代细胞密度为（6～8）×10⁵/75cm²。

2、脐带间充质干细胞的鉴定

（1）取P4代脐带间充质干细胞，流式检测细胞表面标记，流式结果如表3。

表3 UC-MSCs表面标记物的检测

其中，阳性标记物CD29、CD73、CD90、CD105表达大于95%，阴性标记物CD14、CD34、CD45、HLA-DR表达低于2%，证明该细胞为MSCs。

3、脐带间充质干细胞向内皮细胞诱导分化：取P4的UC-MSCs以5*10⁵/孔接种于6孔板中，过夜贴壁后换成本发明的诱导培养基连续诱导8d。同时设置空白对照组和阳性对照组。分组如表4所示。

表4 诱导分化分组

4、细胞免疫组化染色检测各组CD31、CD144、KDR的表达：每组细胞爬片均随机选取5个光镜下(×200)视野下分别计数CD31、CD144、KDR免疫组化染色阳性的细胞数目，试验重复3次。

结果：细胞免疫组化染色发现，空白对照组无CD31、CD144、KDR染色阳性的细胞，而本发明诱导剂CD31、CD144、KDR染色阳性细胞数目均明显多于实验组二(阳性对照)，表明本发明诱导剂明显优于传统诱导剂，如附图5示，结果有统计学意义。

Claims

1.一种间充质干细胞内皮分化诱导剂，其特征在于：一种间充质干细胞内皮分化诱导剂，由血管内皮生长因子、骨形成蛋白-4、肿瘤坏死因子α、***、淫羊藿苷、雷帕霉素、睾酮、二甲双胍、曲美替尼组成。

2.根据权利要求1所述的间充质干细胞内皮分化诱导剂，其特征在于：在加入完全培养基后，各成分作用浓度依次为：血管内皮生长因子20-40μg/L、骨形成蛋白-4 20-40μg/L、肿瘤坏死因子α 5-10μg/L、***5-10μg/L、淫羊藿苷5-10mg/L、雷帕霉素5-10μg/L、睾酮20-40μg/L、二甲双胍20-40μg/L、曲美替尼20-40μg/L。

3.根据权利要求2所述的间充质干细胞内皮分化诱导剂，其特征在于：所述的完全培养基为Keratinocyte-SFM、人间充质干细胞专用无血清培养基或者DMEM/F12+10%FBS。