CN107666903A

CN107666903A - 多药脆性基质组合物

Info

Publication number: CN107666903A
Application number: CN201580080517.9A
Authority: CN
Inventors: R·威廉姆斯; A·沃兹; J·彼得斯
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 2015-05-01
Filing date: 2015-09-02
Publication date: 2018-02-06
Anticipated expiration: 2035-09-02
Also published as: KR20180003572A; EP3288541A1; JP2018514569A; JP2021080298A; JP2022069565A; WO2016178704A1; KR102356120B1; CA2983427C; BR112017023351A2; CA2983427A1; US20180147161A1; AU2021277656B2; AU2015393953B2; EP3288541B1; JP6940416B2; BR112017023351B1; AU2021277656A1; AU2015393953A1; CN107666903B

Abstract

本文提供了被配制成具有高表面积的脆性基质颗粒的药物的双重疗法组合和三联疗法组合。这些颗粒制剂可用于吸入或者气溶胶施用技术中以提供药物组合物至肺。在一些方面，这些组合物可用于治疗呼吸道疾病或病症，诸如哮喘或COPD。

Description

多药脆性基质组合物

本申请要求提交于2015年5月1日的美国临时申请号62/156,052的优先权权益，该专利的全部内容据此以引用方式并入本文。

发明背景

1.技术领域

本发明总体涉及药物组合物的领域。更具体地，其涉及具有被制备为脆性基质颗粒的两种或三种活性药物成分的药物组合物。

2.相关技术描述

哮喘是一项严重的健康问题，并且对世界各地的家庭造成了极大的负担。它对日常生活造成严重的限制，并且可能是致命的。各个年龄层的人都受到这种慢性呼吸道疾病的影响，并且哮喘的发病率在大多数国家，特别是儿童中持续增加(Bateman等人，2008年)。哮喘的指示治疗方法之一是具有或不具有长效β2-激动剂(LABA)的皮质类固醇(ICS)(Silvasti等人，1996年；Chowdhury和Pan，2010年)。此外，ICS/LABA组合是慢性阻塞性肺病(COPD)的有效疗法，该疗法与其他疗法相比，已经显示减少恶化、住院治疗、急诊室就诊和医疗成本(Mapel等人，2010)。

长效β2-激动剂引发糖皮质激素受体的能力改善了吸入的皮质类固醇的活性。重要的是，吸入的组合共沉积在肺内，这是因为这种协同作用是以细胞/分子水平发生的(Greening等人，1994)。此外，羟萘酸沙美特罗(SX，salmeterol xinafoate)是微溶的并且糠酸莫米松(MF，mometasome furoate)实际上不溶于水(Jouyban-Gharamaleki等人，2001年；Zitt等人，2007年)，并且它们的低溶解度限制了吸收和生物利用度，这影响了它们的临床使用。不同的晶体工程化策略已经有效地改善了特定化合物的物理化学性质且增强了特定化合物的口服生物利用度，所述特定化合物最近特别是共晶(Sowa等人，2014年；等人，2011年)和共非晶***(Lobmann等人，2013年；Shayanfar等人，2013年)，这可以实现由多于一种API组分组成的制剂的共沉积。

然而，目前没有市售供吸入的含有包含在相同颗粒内的SX和MF的固定剂量组合产品。在同一颗粒内具有SX和MF允许在肺内的相同靶位点处沉积API。含有两种API的目前可用产品通常分别微粉化，并在制剂和装置中保持为离散颗粒(Patil等人，2012年)。此外，微粉化的API颗粒可能具有不同的晶体学和形态，从而导致空气动力学性能的差异(Parikh等人，2012年)。研究人员已经提出了通过将多种药物工程化到单个颗粒中来解决传统共混物的问题的解决方案(Parikh等人，2012年；Weers和Tarara，2014年)。因此，需要使用相同颗粒含有多种活性药物成分的新组合物。

发明概述

本公开提供了配制成脆性基质颗粒以供通过吸入、通过气溶胶鼻内施用或施用于肺的药物组合物。在一些实施方案中，这些组合物包含长效β-激动剂和皮质类固醇，或长效β-激动剂、长效毒蕈碱拮抗剂和皮质类固醇。这些组合物可用于治疗呼吸道疾病或病症，包括但不限于哮喘或慢性阻塞性肺病(COPD)。

在一些方面，本公开提供包含以下中的任一种的药物组合物：

a.包含来自以下各组的治疗有效量的活性药物成分的三联疗法：

i.长效β-激动剂(LABA)；

ii.长效毒蕈碱拮抗剂(LAMA)；以及

iii.皮质类固醇(CS)；或

b.包含来自以下两组的治疗有效量的活性药物成分的双重疗法：

i.长效β-激动剂(LABA)；以及

ii.皮质类固醇(CS)；

其中药物组合物被配制成具有大于5m²/g的比表面积的脆性基质颗粒。在一些实施方案中，药物组合物进一步包含一种或多种赋形剂。可以使用的赋形剂包括糖、糖衍生物或氨基酸。赋形剂可以是糖或糖衍生物，诸如乳糖、甘露醇或海藻糖。在其他实施方案中，赋形剂是氨基酸，诸如甘氨酸。

在一些实施方案中，长效β-激动剂是沙美特罗盐或福莫特罗盐，例如羟萘酸沙美特罗或富马酸福莫特罗(salmeterol fumarate)。在一些实施方案中，皮质类固醇是糠酸莫米松或布***(budesomide)。在一些实施方案中，长效毒蕈碱拮抗剂是噻托溴铵(tiotropium)盐，诸如噻托溴铵。

双重疗法可以包括在组合物中约1∶0.1至约1∶100的长效β-激动剂比皮质类固醇的重量比。在一些实施方案中，双重疗法具有约5∶22的长效β激动剂比皮质类固醇的重量比。在其他实施例中，三联疗法包括在组合物中约1∶0.1∶0.1至约1∶100∶100的长效β-激动剂比长效毒蕈碱拮抗剂比皮质类固醇的重量比，诸如约1∶2∶35.5的长效β激动剂比长效毒蕈碱拮抗剂比皮质类固醇。在一些实施方案中，三联疗法包括在组合物中约1∶0.1至约1∶100的长效β-激动剂比长效毒蕈碱拮抗剂的重量比，诸如约1∶2的长效β激动剂比长效毒蕈碱拮抗剂。在一些实施方案中，三联疗法包括在组合物中约1∶0.1至约1∶100的长效β-激动剂比皮质类固醇的重量比，诸如约2∶70的长效β激动剂比皮质类固醇。在一些实施方案中，三联疗法包括在组合物中约1∶0.1至约1∶1000的长效毒蕈碱拮抗剂比皮质类固醇的重量比，诸如约4∶70的长效毒蕈碱拮抗剂比皮质类固醇。药物组合物可以具有在组合物中约1∶0至约1∶9的双重疗法或三联疗法比赋形剂的摩尔比，诸如约1∶1的双重疗法或三联疗法比赋形剂。

在一些方面，药物组合物被配制成单位剂量。药物组合物的单位剂量可以包含约1μg至约500μg的长效β-激动剂的剂量，例如当长效β-激动剂是羟萘酸沙美特罗时为约50μg或当长效β-激动剂是富马酸福莫特罗时为约4.5μg。在一些实施方案中，药物组合物的单位剂量包含约1μg至约100μg的长效毒蕈碱拮抗剂的剂量，诸如约9μg的单位剂量。在一些实施方案中，药物组合物的单位剂量包含约1μg至约1000μg的皮质类固醇的剂量，诸如当皮质类固醇是糠酸莫米松时为约220μg或当皮质类固醇是布***时为约160μg。

在一些方面，药物组合物被配制成通过气溶胶鼻内施用至肺，或通过吸入来施用。药物组合物可以配制成在吸入器中使用，所述吸入器包括定量吸入器、干粉吸入器，单剂量吸入器，多单位剂量吸入器、雾化器或加压定量吸入器。

在一些方面，药物组合物是包含羟萘酸沙美特罗和糠酸莫米松的双重疗法。在其他方面，药物组合物是包含富马酸福莫特罗，噻托溴铵和布***的三联疗法。

在一些实施方案中，药物组合物具有约5m²/g至约1000m²/g、约10m²/g至约500m²/g、或约20m²/g至约250m²/g的比表面积。在一些实施方案中，药物组合物具有大于85％的总喷射剂量(TED)，诸如从约90％至约100％。

在一些实施方案中，药物组合物不含任何杂质。药物组合物可以实质上不含聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇，聚丙烯酸酯或聚苯乙烯。药物组合物可以实质上不含聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇，聚丙烯酸酯或聚苯乙烯。在一些实施方案中，药物组合物实质上不含任何聚合物赋形剂。药物组合物可以实质上不含泊洛沙姆、聚乙二醇或聚丙二醇。药物组合物可以实质上不含泊洛沙姆、聚乙二醇或聚丙二醇。在一些实施方案中，药物组合物实质上不含任何表面活性剂。在一些实施方案中，药物组合物不含除了赋形剂和活性药物组合物以外的其它化合物。

在另一个方面，本公开提供了治疗或预防需要其的患者的呼吸道疾病或病症的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的本文所公开的药物组合物。能够被治疗的呼吸道疾病或病症包括涉及肺或窦发炎的病症。此外，呼吸道疾病或病症可以是哮喘或慢性阻塞性肺病。在一些实施方案中，通过吸入施用药物组合物。可以在一次吸入中或在2次或更多次吸入中向患者施用治疗有效量。在一些实施方案中，在2次、3次或4次吸入中施用治疗有效量。在一些实施方案中，该方法包括每天向患者施用治疗有效量一次。在其它实施方案中，该方法包括每天向患者施用两次或更多次治疗有效量。

在另一个方面，本公开提供了制备脆性基质药物组合物的方法，其包括：

(A)将两种或更多种活性药剂混合到溶剂中以形成药物组合物，其中溶剂包括有机溶剂和水，其中药物组合物包含溶剂中约0.01％至约10％(w/v)的活性药剂的量；

(B)将药物组合物涂覆至旋转表面，其中表面处于约-70℃至约-120℃的温度；以及

(C)冷冻药物组合物以形成脆性基质药物组合物。

在一些实施方案中，活性药物成分选自长效β-激动剂、长效毒蕈碱拮抗剂和皮质类固醇。该方法还可以进一步包括向药物组合物中加入一种或多种赋形剂。在一些实施方案中，所述方法进一步包括冻干脆性基质药物组合物。在一些实施方案中，该量为约0.01％(w/v)至约6％(w/v)。在一些实施方案中，该量为约0.1％(w/v)至约5％(w/v)。

在另一个方面，本公开提供了通过所述方法制备的脆性基质药物组合物，所述方法包括：

(C)冷冻药物组合物以形成脆性基质药物组合物。

在一些实施方案中，活性药物成分选自长效β-激动剂、长效毒蕈碱拮抗剂和皮质类固醇。所述方法还可以进一步包括向药物组合物中加入一种或多种赋形剂。在一些实施方案中，所述方法进一步包括冻干脆性基质药物组合物。在一些实施方案中，该量为约0.01％(w/v)至约6％(w/v)。在一些实施方案中，该量为约0.1％(w/v)至约5％(w/v)。

如本文在本说明书中所使用的，“一(a/an)”可以意味着一个或多个。如在权利要求中所使用的，当与字词“包含”一起使用时，字词“一”可以指一个或多于一个。

在权利要求中术语“或”的使用用于表示“和/或”，除非明确地指示仅是指替代方案或替代方案是相互排斥的，尽管本公开支持仅是指替代方案和“和/或”的定义。如本文所用，“另一个”可以意味着至少第二个或更多个。

在本申请中，术语“约”用于表示值包括用于确定该值的装置、方法的误差的固有变化，或存在于多个研究对象之间的变化。

术语“有效”如在本说明书和/或权利要求书中使用的，意味着足以完成所需的、期望的或预期的结果。当在用化合物治疗患者或受试者的情况下使用时，“有效量”、“治疗有效量”或“药学有效量”意味着当施用至受试者或患者以治疗疾病时，该化合物的量足以影响对疾病的这种治疗。

“预防(Prevention/preventing)包括：(1)抑制可能具有疾病风险和/或易感染疾病但尚未经历或表现出该疾病的任何或全部病理学或症状学的受试者或患者的疾病发作，和/或(2)减缓可能具有疾病风险和/或易感染疾病但尚未经历或表现出该疾病的任何或全部病理学或症状学的受试者或患者的疾病病理学或症状学发作。

术语“不含”用于表示包含至少95％的所列组分和少于5％的该组合物或颗粒所不含的组分的颗粒。术语“实质上不含”用于表示包含98％的所列组分和少于2％的组合物或颗粒实质上所不含的组分的颗粒。在一些实施方案中，术语“实质上不含”用于描述这样的颗粒或组合物，该颗粒或组合物包含至少99％的所列组分并且包含小于1％的所述颗粒或组合物实质上不含的组分中的任何一种。

如本文所用，术语双重疗法或三联疗法至少包括其中所列出的两种或三种活性药物成分。还设想的是，这些术语并不意味着表示这些疗法仅包含两种或三种活性药物成分，而是它们包含至少两种或至少三种活性药物成分。

本发明的其他目标、特征和优点将从以下详细描述显而易见。然而，应当理解，详细描述和具体实例，虽然指示本发明的优选实施方案，但是仅以说明方式给出，因为对于本领域的技术人员而言，本发明的精神和范围内的各种变化和修改将从此详细描述变得显而易见。

附图简述

以下附图形成本说明书的组成部分，并且被包括以进一步证明本发明的某些方面。通过结合本文给出的对具体实施方案的详细描述参考这些附图中的一个或多个可以更好地理解本发明。

图1示出了在从给药之前和之后BMP的几何粒度分布。

图2示出了使用微粉化(上)和BMP(下)制剂的三联组合气溶胶的空气动力学粒度分布，其中从左到右的各个位点示出了福莫特罗、噻托溴铵和布***的值。气溶胶是使用以51l/min生成的。

图3示出了调整的DSC曲线(自下而上)BMP SXMFTre、BMP SXMFGly、BMP SXMFMan、BMP SXMFLac和BMP SXMF。T_g在小窗口中示出。

图4A和图4B示出了组合物的粉末X-射线衍射图。图4A示出了以下的X-射线粉末衍射图：微粉化的SXMF、BMP SXMF、微粉化的SXMFLac、BMP SXMFLac、微粉化的SXMFMan、BMPSXMFMan、微粉化的SXMFGly、BMP SXMFGly、微粉化的SXMFTre、TFF SXMFTre。图4B示出了在25℃/30％RH下储存6个月的以下BMP组合(自下而上)的X-射线粉末衍射图：BMP SXMF、BMPSXMFLac、BMP SXMFMan、BMP SXMFGly和BMP SXMFTre。

图5A和图5B示出了(图5A)微粉化SXMF和(图5B)BMP SXMF的SEM图像。

图6A和图6B示出了(图6A)微粉化的单一成分和(图6B)经TFF处理的共药物沉积无定形的傅里叶变换红外光谱。

图7示出了在一个循环后产生的(□)BMP SXMF、(◇)BMP SXMFLac、(△)BMPSXMFMan、(×)BMP SXMFGly和(○)BMP SXMFTre的在0％和90％之间的吸附(-)和解吸(---)等温线。

图8A至图8E示出了(图8A)微粉化的SXMF和BMP SXMF、(图8B)微粉化的SXMFLac和BMP SXMFLac、(图8C)微粉化的SXMFMan和BMP SXMFMan、(图8D)微粉化的SXMFGly和BMPSXMFGly以及(图8E)微粉化的SXMFTre和BMP SXMFTre在用Miat以90L/min产生后的SX和MF空气动力学直径分布。值可以表示为平均值±SD(n＝3)。

图9示出了微粉化的SXMF和TFF SXMF在由吹药器以51L/min产生后的SX和MF的空气动力学直径分布。

图10A至图10E示出了放大倍数为10.0K的(图10A)布***、(图10B)噻托溴铵和(图10C)富马酸福莫特罗、(图10D)甘露醇和(图10E)乳糖一水合物(1.0K)的SEM图像。

图11A至图11E示出了(图11A)气流粉碎的布***、(图11B)气流粉碎的噻托溴铵、(图11C)气流粉碎的福莫特罗以及物理混合物(图11D)BTF_Lac_PM和(图11E)BTF_Man_PM(5.0K)的SEM图像。

图12A至图12D示出了放大倍数为1.0K的TFF制剂(图12A)Bud_Lac、(图12B)Bud_Man、(图12C)Tio_Lac和(图12D)Tio_Man的SEM图像。

图13A至图13D示出了放大倍数为1.0K的TFF制剂(图13A)For_Lac、(图13B)For_Man、(图13C)BTF_Lac和(图13D)BTF_Man的SEM图像。

图14示出了未处理的乳糖一水合物、甘露醇、布***、噻托溴铵和福莫特罗，气流粉碎的布***、噻托溴铵和福莫特罗与甘露醇的物理混合物制剂(BTF_Man)和气流粉碎的布***、噻托溴铵和福莫特罗与乳糖的物理混合物制剂(BTF_Lac)，以及和气流粉碎的噻托溴铵、福莫特罗和布***的经调整的DSC热流热谱。

图15示出了未处理的乳糖一水合物、甘露醇、布***、福莫特罗和噻托溴铵、Bud_Man、For_Man、Tio_Man和BTF_Man的TFF制剂的经调整的DSC热流热谱。

图16示出了未处理的乳糖一水合物、甘露醇、布***、福莫特罗和噻托溴铵、BTF_Lac、Bud_Lac、For_Lac和Tio_Lac的TFF制剂的经调整的DSC热流热谱。

图17A至图17N示出了(图17A)甘露醇、(图17B)乳糖一水合物、(图17C)布***、(图17D)噻托溴铵、(图17E)福莫特罗、(图17F)Bud_Man、(图17G)Tio_Man、(图17H)For_Man、(图17I)BTF_Man、(图17J)Bud_Lac、(图17L)Tio_Lac、(图17M)For_Lac和(图17N)BTF_Lac的粉末x射线图。

图18A至图18H示出了(图18A)乳糖一水合物、(图18B)甘露醇、(图18C)布***、(图18D)气流粉碎的布***、(图18E)噻托溴铵、(图18F)气流粉碎的噻托溴铵、(图18G)福莫特罗和(图18H)气流粉碎的福莫特罗的粉末x射线图。

图19示出了对TFF福莫特罗_乳糖、TFF布***_乳糖、TFF噻托溴铵_乳糖、三联药物组合的物理混合物、TFF三联药物组合、福莫特罗、布***、噻托溴铵、TFF乳糖和乳糖的FTIR扫描。

图20示出了对TFF福莫特罗_甘露醇、TFF布***_甘露醇、TFF噻托溴铵_甘露醇、TFF三联药物组合、福莫特罗、布***、噻托溴铵、三联药物组合的物理混合物、TFF甘露醇和甘露醇的FTIR扫描。

图21A和图21B示出了(图21A)沉积在新一代级联撞击器上的TFF三联组合BTF_Lac制剂的空气动力学粒度分布和(图21B)沉积在新一代级联撞击器上的TFF三联组合BTF_Man制剂的空气动力学粒度分布。

图22A和图22B示出了(图22A)沉积在新一代级联撞击器上的TFF单一药物制剂For_Lac、Tio_Lac和Bud_Lac的空气动力学粒度分布和(图22B)沉积在新一代级联撞击器上的TFF单一药物制剂For_Man、Tio_Man和Bud_Man的空气动力学粒度分布。

图23A和图23B示出了(图23A)沉积在新一代级联撞击器上的三联组合物理混合物BTF_Lac_PM制剂的空气动力学粒度分布和(图23B)沉积在新一代级联撞击器上的三联组合物理混合物BTF_Man_PM制剂的空气动力学粒度分布。

示例性实施方案的描述

在一些方面，本公开提供了一种药物组合物，该药物组合物被配制成具有两种或更多种活性药物成分(API)的脆性基质颗粒以供通过吸入、通过气溶胶或将化合物递送至肺的其他方法施用。本文所述的药物组合物可以包括高表面积和高总喷射剂量。在一些实施方案中，这些药物组合物在向患者的肺递送两种或更多种活性药物成分方面具有增强的有效性。

I.脆性基质颗粒

在一些方面，本公开提供了脆性基质颗粒(BMP)的使用。本文可以使用的脆性基质颗粒的特征在于它们的具有高表面积和高孔隙率的低密度构型。这些脆性基质颗粒可以使用如本文所述以及在美国专利申请号2010/0221343和Watts等人，2013年中描述的常规方法如喷雾冻干或薄膜冷冻等制备，美国专利申请号2010/0221343和Watts等人，2013年两者都以引用方式并入本文。在一些实施方案中，使用薄膜冷冻来制备本文所述的脆性基质颗粒。在冷冻后，可以将这些颗粒进一步进行干燥以获得适用于气溶胶施用的干粉。脆性基质颗粒可以通过冻干法和本领域的技术人员已知的其他方法来干燥。不希望受任何理论约束，脆性基质颗粒和快速冻干法允许混合颗粒，同时保持混合物的均匀性以及同时防止不同组分的分离。在雾化过程中也可以表现出改善的均匀性。

在一些方面，使用薄膜冷冻(TFF)方法来制备脆性基质颗粒。这种制备可以以允许将两种或更多种活性药物成分(API)和一种或多种赋形剂共沉积以形成药物组合物的方式使用。在一些实施方案中，该方法包括将药物组合物溶解在溶剂中。可用于本文所述方法的一些溶剂包括水、有机溶剂或它们的混合物。本文可以使用的有机溶剂包括极性有机溶剂，诸如醇、杂环化合物、烷基腈或它们的混合物。极性有机溶剂的一些非限制性实例包括甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇(特丁醇)、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、1，4-二噁烷或乙腈。在一些方面，设想这些溶剂的混合物。这种混合物可以包含一种或多种有机溶剂以及水。这些混合物的一个非限制性实例包括叔丁醇、1，4-二噁烷、乙腈和水的溶剂混合物。该溶剂混合物可以包含2∶1∶3∶3(v/v)比例的叔丁醇、1，4-二噁烷、乙腈和纯化水的混合物。

在一些方面，本公开包括两种或更多种活性药物成分(API)的组合。这些组合可进一步包含一种或多种赋形剂。本文可以使用的一些赋形剂的一些非限制性实例包括糖或糖衍生物，诸如甘露醇、海藻糖或乳糖或氨基酸(诸如甘氨酸)。这些组合物可以溶解在如本文所述的溶剂中。在一些实施方案中，活性药物成分(API)包括但不限于吸入性皮质类固醇(ICS)、长效β-激动剂(LABA)或长效毒蕈碱拮抗剂(LAMA)。活性药物成分的一些非限制性实例包括羟萘酸沙美特罗、糠酸莫米松、富马酸福莫特罗、噻托溴铵或布***。这种试剂可以以从约1∶0.1至约1∶100的LABA比ICS的比例存在。在一些实施方案中，当使用羟萘酸沙美特罗和糠酸莫米松时，则LABA比ICS的比例为约1∶4.4。此比例以有效的临床剂量产生每种组分的量。

在一些方面，药物组合物包含赋形剂。在其他方面，将活性药物成分配制在没有赋形剂的药物组合物中。当组合物包含赋形剂时，赋形剂可以约无赋形剂至约1∶9摩尔比的活性药物成分比赋形剂存在。在一些实施方案中，活性药物成分比赋形剂的摩尔比来自约不包含赋形剂的组合物至包括约1∶1比例的活性药物成分比赋形剂的摩尔比。活性药物成分比赋形剂的摩尔比可以是约1∶1。

如上所述，组合物可以溶解在溶剂中。当组合物溶解在溶剂中时，溶剂中药物组合物的总量可以为约0.1％至约10％(w/v)。药物组合物的总量可以为约0.1％至约6％(w/v)。在一些方面，药物组合物的总量小于6％、5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2.0％、1.75％、1.5％、1 1.25％、1.0％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、或0.1％，或其中可导出的任何范围。溶剂中药物组合物的总量优选小于6％，更优选小于5％。在溶剂中使用少量的药物组合物被认为具有有利的特性，诸如导致形成脆性基质颗粒，并且因此推荐使用小于6％(w/v)且优选小于5％(w/v)。虽然较低量的化合物是有益的，但是低于0.01％(w/v)或更优选0.1％(w/v)的浓度可能导致溶液太稀而难以获得有用的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物的总量为约0.5％(w/v)。

在一些方面，使用薄膜装置来制备组合物。该装置可用于将溶液涂覆到诸如不锈钢的表面上，然后冷冻。此表面也可以旋转，使得不希望被任何理论约束，认为旋转促使将溶液均匀涂覆到表面上。该溶液可以在低温温度例如低于-50℃的温度下冷冻。低温温度包括形成约-50℃至约-270℃的、形成约-70℃至约-120℃、或形成约-75℃至约-100℃的温度。在一些实施方案中，低温温度为约90℃±3℃。在一些方面，将样品冷冻存储。在其他方面，将样品冻干以获得干粉。冻干是本领域的技术人员已知的，并且在美国专利号5,756,468、6,440,101、8,579,855和PCT专利申请公开号WO 2009/125986中已知，这些专利以引用方式并入本文。在一些方面，在室温下存储组合物可能是有利的。可以制备冻干样品，使得温度从小于-40℃的冻干温度逐渐增加到室温附近的温度如约25℃。此外，温度升高可以在真空下或在减压环境和/或具有降低的水分含量的环境如干燥器中进行。

本公开提供了与其它技术如气流粉碎或物理混合物相比具有高表面积的脆性基质颗粒。在一些方面，具有两种或更多种活性药物组合物的脆性基质颗粒具有大于5m²/g的比表面积。脆性基质颗粒可以具有约5m²/g至约1000m²/g、约10m²/g至约500m²/g、或约20m²/g至约250m²/g的比表面积。在一些实施方案中，比表面积为约5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900至约1000m²/g，或可从其中导出的任何范围。本文中在实施例部分中描述了组合物表面积的计算方法。

包含本文所述的药物组合物的脆性基质颗粒可以具有大于80％的活性药物成分的总喷射剂量(或喷射剂量)。总喷射剂量也可以为约80％至约100％、约85％至约100％、或约90％至约100％。本文所述的药物组合物的制剂可以具有大于80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，或可从其中导出的任何范围的总喷射剂量。在实施例部分中描述了计算总喷射剂量的方法。

本文所述的药物组合物可以包含一种或多种赋形剂。赋形剂是不具有治疗活性但可用于形成药物组合物的组分。本文所使用的赋形剂包括氨基酸、糖、糖衍生物或本领域的技术人员已知的其它赋形剂。具体地，本公开包括糖(诸如海藻糖、乳糖、葡萄糖、果糖或甘露糖)或糖衍生物(诸如氨基糖如葡糖胺或糖醇如甘露醇)的使用。可使用的其它赋形剂包括氨基酸，诸如丙氨酸或甘氨酸。

在一些方面，脆性基质颗粒组分含有两种或更多种药物分子以及一种或多种赋形剂以形成药物组合物。因此，药物组合物可以以无定形或特定结晶形式配制在脆性基质颗粒中。在一些实施方案中，药物组合物以无定形配制。另外，可以使用的脆性基质颗粒是低密度颗粒。

本公开提供了在药物组合物的气溶胶施用中利用脆性基质颗粒的方法。不希望被任何理论约束，据信脆性基质颗粒在雾化期间容易破裂，从而增强了药物组合物的递送。颗粒的破裂可用于增强组合物在施用期间雾化和分散的能力。

在某些实施方案中，药物组合物可以通过吸入和/或其它气溶胶递送载体递送。已经例如在美国专利号5,756,353和5,804,212(每篇专利全文以引用方式特别地并入本文)中描述了通过鼻气溶胶喷雾将组合物直接递送到肺的方法。同样，使用鼻内微粒树脂(Takenaga等人，1998年)和溶血磷脂酰-甘油化合物(美国专利号5,725,871，其全文以引用方式特别地并入本文)递送药物也是在制药领域中众所周知的并且可以在一些实施方案中使用。在美国专利号5,780,045(该专利全文以引用方式特别地并入本文)中描述了聚四氟乙烯支撑基质形式的经粘膜药物递送。

在一些实施方案中，包含如本文所述的活性剂或药物的脆性基质颗粒组合物可以鼻内递送至肺或通过吸入或气溶胶递送。在一些实施方案中，包含活性剂或药物的脆性基质颗粒组合物可以通过吸入器(也称为吸药器)或定量吸入器递送。吸入器装置是本领域中众所周知的，并且可用于递送用于治疗哮喘或COPD的药物。

术语气溶胶是指分散在液化或加压的气体推进剂中的液体颗粒的细碎固体的胶体***。本发明的用于吸入的典型气溶胶将由活性成分在液体推进剂中的悬浮液或液体推进剂和合适溶剂的混合物组成。合适的推进剂包括烃和烃醚。合适的容器将根据推进剂的压力要求而变化。气溶胶的施用将根据受试者的年龄、体重以及症状的严重性和响应而变化。

II.活性药物成分

在一些方面，本公开提供了被配制成包含两种或更多种活性药物成分的脆性基质颗粒的药物组合物。这些活性药物成分可以选自短效β激动剂、长效β激动剂、长效毒蕈碱拮抗剂或皮质类固醇。设想任何短效β-激动剂、长效β-激动剂、长效毒蕈碱拮抗剂或皮质类固醇可用于本文制备的药物组合物中。在一些实施方案中，本公开提供了包含长效β-激动剂和皮质类固醇的组合物或具有长效β-激动剂、长效毒蕈碱拮抗剂和皮质类固醇的组合物。这些活性药物成分可以根据表1中所述的比例存在于本文所述的药物组合物中。

表1：本文所述组合物中活性药物成分的组成剂量和比例

活性药物成分(API)	比例	剂量
			长效β-激动剂	1	约1至约500μg
长效毒蕈碱拮抗剂	约0.1至约100	约1至约100μg
			皮质类固醇	约0.1至约100	约1至约1000μg

在一些方面，本文所使用的组合物可以包含约1∶0.1至约1∶100的长效β-激动剂比皮质类固醇的比例。另外，组合物可以通过长效β-激动剂比长效毒蕈碱拮抗剂的比例来表征，其中该比例为约1∶0.1至约1∶100。本文可以使用的组合物具有约0.1∶100至约100∶0.1的长效毒蕈碱拮抗剂比皮质类固醇的比例。当测量三联疗法的比例时，组合物可以包含约1∶0.1∶0.1至约1∶100∶100的长效β-激动剂、长效毒蕈碱拮抗剂和皮质类固醇的比例。当用于双重疗法或三联疗法时该比例的非限制性实例包括1∶4.4或1∶2∶35.5。在一些方面，药物组合物包含在该组合物中的活性药物成分的重量百分比为约10重量％至约100重量％。

这些药物组合物也可以被配制成单位剂量，具有约1μg至约500μg的长效β-激动剂剂量和约1μg至约1,000μg的皮质类固醇剂量。在一些实施方案中，药物组合物可以进一步包含约1μg至约100μg的长效毒蕈碱拮抗剂的剂量。

在一些方面，设想任何长效β-激动剂可用于本文所述的制剂中。长效β-激动剂的一些非限制性实例包括富马酸福莫特罗、羟萘酸沙美特罗、班布特罗、克仑特罗、茚达特罗、阿福特罗、卡莫特罗、GSK-159797、GSK-597901、GSK-159802、GSK-642444、GSK-678007，或本领域中已知的其它长效β-激动剂。长效β-激动剂可以以约1μg、5μg、10μg、20μg、40μg、60μg、80μg、100μg、120μg、140μg、160μg、180μg、200μg、225μg、250μg、275μg、300μg、325μg、350μg、400μg，450μg或500μg或可从其中导出的任何范围的剂量来配制。

在一些方面，设想在本文所述的制剂中可以使用任何长效毒蕈碱拮抗剂。长效毒蕈碱拮抗剂的一些非限制性实例包括噻托溴铵、阿地铵(aclidinium)、第若铵(dexpirronium)、异丙托铵、氧托溴铵、达托铵(darotropium)、格隆铵(glycopyrronium)或格隆溴铵(glycopyrrolate)衍生物或本领域中已知的其它长效毒蕈碱拮抗剂的盐，诸如由美国专利申请号2009/0181935、PCT专利申请号WO 2010/007561和PCT专利申请号WO 2008/035157教导的那些，这些专利以引用方式并入本文。长效毒蕈碱拮抗剂可以以约1μg、5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg或100μg或可从其中导出的任何范围的剂量来配制。

在一些方面，设想在本文所述的制剂中可以使用任何皮质类固醇。皮质类固醇的一些非限制性实例包括二丙酸倍氯米松、布***、氟尼缩松、丙酸氟替卡松、糠酸莫米松、环索奈德、棕榈酸罗氟萘德(rofleponide palmitate)、醋酸曲安奈德或其他本领域中已知的皮质类固醇。皮质类固醇可以以约1μg、5μg、10μg、25μg、50μg、75μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、350μg、400μg、450μg、500μg、550μg、600μg、650μg、700μg、750μg、800μg、850μg、900μg、950μg或1,000μg或可从其中导出的任何范围的剂量来配制。每种活性药物成分的具体剂量将取决于药物组合物中存在的具体化合物而变化。

在一些方面，设想每种活性药物成分可以单独被配制成单独的药物组合物。

III.呼吸适应症

在一些方面，本公开的组合物可以用于治疗呼吸道疾病和病症。呼吸道疾病和病症的一些非限制性实例包括哮喘、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性肺部炎症性疾病(COPD)、反应性气道功能障碍综合征(RADS)、气道高反应性、嗜酸性粒细胞性或间质性肺病(诸如结节病或嗜酸性粒细胞肉芽肿病(eosinophilic granulomatosis))、化学诱导的肺损伤、塑型性支气管炎、支气管炎、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺(气道)疾病、硅肺、吸入烟雾诱发的急性肺损伤(ISALI)，或免疫疾病和病状(诸如过敏性鼻炎和慢性鼻窦炎)。本文所述的药物组合物可用于治疗呼吸病状，诸如哮喘和慢性阻塞性肺病以及其他阻塞性气道疾病。

慢性阻塞性肺病(COPD)是一种以临床上较差的气流为特征的疾病，例如气流减少，这在若干个月内都没有改善。吸烟包括长期吸烟被认为是COPD的主要原因。COPD中的气流阻塞通常在继续吸烟的患者中渐进，最终导致伤残和存活时间缩短。戒烟已显示减缓了相较于非吸烟者的下降率，但吸烟造成的损害是不可逆的。其它病因因素(例如，气道高反应性或超敏性)、空气污染(例如，二氧化硫以及可能的二手烟)、职业化学品(例如，镉)和一般的过敏)已经在文献中被标识，但据信仅为少数COPD病例的原因。其他风险因素包括：遗传、二手烟、在工作和环境中暴露于空气污染，以及儿童呼吸道感染的病史。

COPD的一些非限制性实例包括慢性咳嗽、频繁的胸闷、呼吸急促、呼吸费力(increased effort to breathe)、粘液产生增加和频繁的清嗓。在COPD的一些情况下，气道阻塞是不完全可逆的，但是其他COPD患者确实因治疗而显示出对气道阻塞的某种改善。由于慢性和过度分泌异常气道粘液、炎症、支气管痉挛和感染的引起的气道阻塞被认为引起慢性支气管炎，从而导致慢性咳嗽、粘液产生或两者。而在肺气肿中，末端细支气管中的弹性蛋白被破坏，从而导致气道壁塌陷和不能呼气。肺气肿的特征在于肺泡的破坏和远离末端细支气管的气腔的异常永久性扩大，伴随着对气腔壁的破坏，但没有明显的纤维化。

哮喘是与特别是在气道中增加的炎症相关的慢性呼吸道疾病。哮喘症状的一些非限制性实例包括喘气、咳嗽、胸闷、呼吸急促和增加的呼吸困难性。哮喘通常不被认为是COPD的一种类型，因为哮喘通常是可逆的。咳嗽可能导致痰的产生，包括具有高水平嗜酸性粒细胞的痰的产生。哮喘症状的频率和严重性可能在触发物的存在下大大增加。哮喘触发物的一些非限制性实例包括运动、灰尘、污染、宠物皮屑和其他刺激物以及过敏原。哮喘通常通过观察症状的模式、对治疗的反应和肺活量测定法来诊断。在一些实施方案中，存在若干种特定的哮喘亚型，诸如职业性哮喘、咳嗽变异性哮喘、运动诱发性哮喘、阿司匹林诱发性哮喘或酒精诱发性哮喘。哮喘亚型的另一种非限制性实例是脆性哮喘，脆性哮喘的特征在于反复发作和严重发作。此外，哮喘可能与其他呼吸病症(诸如支气管炎或过敏)相关或因所述其他呼吸病症而具有增加的严重性。

哮喘的临床分类是基于症状的频率、第一秒用力呼气量(FEV₁)和峰值呼气流速分配的，或哮喘可以根据其起因(特应性或外源性，以及局部性(topic)或内源性)进行分类。特应性或外源性哮喘通常由过敏原或其它外部因素促成，而局部性或内源性哮喘不受过敏原或其他外部因素的影响。此外，基于症状的频率或严重性进行哮喘分类。临床分类包括间歇性、轻度持续性，中度持续性和严重持续性。对于间歇性分类，患者一般经历每周少于2次的症状发生、每月少于2次的夜间症状发生、大于或等于80％的FEV₁、具有小于20％的变异性，或需要每天使用短效β激动剂两次或更少次。对于轻度持续性分类，患者一般经历每周少于2次的症状发生、每月3至4次的夜间症状发生、大于或等于80％的FEV₁、具有20-30％的变异性，或需要每天使用短效β激动剂两次以上。对于中度持续性分类，患者每天经历症状、每周超过1次在夜间经历症状、约60％至约80％的FEV₁、具有大于30％的变异性，或需要每天使用短效β激动剂。对于严重持续性分类，患者连续地经历症状、频繁在夜间经历症状(通常每周大于7次)、小于60％的FEV₁、具有大于30％的变异性，或需要每天使用短效β激动剂超过两次。

此外，基于峰值呼气流速，哮喘发作或哮喘恶化被分类为轻度、中度或重度。对于轻度发作，峰值呼气流速大于预测最佳的50％或大于200L/min。对于中度发作，峰值呼气流速在预测最佳的25％与50％之间，或在80L/min与200L/min之间。对于严重发作，峰值呼气流速小于预测最佳的25％或小于80L/min。此外，严重发作也可能具有一种或多种附加症状或病状。严重发作可以进一步细分为三类：急性、危及生命或接近致命的。对于急性严重发作，患者可能经历每分钟多于25次呼吸的呼吸频率、每分钟多于110次的心率、或者不能一口气说出完整的句子。对于危及生命的严重发作，患者可能经历改变的意识水平、疲惫、心律失常、低血压、发绀、寂静胸、差的呼吸效应、小于92％的氧饱和度、小于8kPa的PaO₂、或正常至升高的PaCO₂。对于接近致命的严重发作，患者可能经历高或升高的PaCO₂或需要手控通气。

哮喘、慢性阻塞性肺病和其他呼吸道疾病和病症可以用β肾上腺素能受体激动剂治疗，因为已知这些化合物向患者提供支气管扩张药功效，从而导致对呼吸困难症状的缓解。虽然β激动剂可用于提供对患者的支气管收缩的症状缓解，但哮喘或慢性阻塞性肺病的另一部分是炎症，炎症通常需要单独的治疗。治疗由这些呼吸道疾病引起的炎症的一种非限制性方法是通过使用类固醇或皮质类固醇。在一些方面，施用在单一组合物中的类固醇、β肾上腺素能受体激动剂和毒蕈碱拮抗剂的组合已经在治疗呼吸道疾病(如哮喘和慢性阻塞性肺病)中气道的支气管收缩、炎症和粘液分泌方面显示出增强的协同效应。

IV.实施例

以下实施例被包括以说明本发明的优选实施方案。本领域的技术人员应当理解，下面的实施例中公开的技术表示发明人发现的技术在本发明的实践中作用良好，并且因此可被认为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案中进行许多改变，并且仍然获得相同或相似的结果。

实施例1-方法

用低温颗粒工程化技术TFF产生两种不同的组合疗法(Yang等人，2012年)，并且这两种不同的组合疗法表征为它们的空气动力学性质。第一种，羟萘酸沙美特罗(SX)和糠酸莫米松(MF)的双重组合疗法以5∶22的SX比MF质量比产生。BMP制剂生产为纯粉末并且具有稳定化赋形剂、乳糖和甘露醇，其中载药量总计50％。用TFF产生的第二种药物组合疗法是富马酸福莫特罗(FF)、噻托溴铵(TB)和布***(B)的1∶2∶35.5FF∶TB∶B质量比的三联组合。包括作为稳定化赋形剂的甘露醇，以使得总载药量为50％。为了比较，在双重和三联组合中，产生微粉化药物并与微粉化赋形剂共混。干粉气溶胶由装载到或干粉吸入器中的HPMC胶囊产生。气溶胶的特征在于新一代药用撞击器(NGI)，所述NGI以足以实现跨装置的4kPa压降的流量操作。这相当于的51L/min和的90L/min。

实施例2-结果

颗粒工程化技术，诸如喷雾干燥和TFF，允许将具有多种活性物质的制剂配制成单一可吸入颗粒。由TFF产生的BMP在干粉吸入中呈现典范转移(paradigm shift)。如图1所示，不是使用吸入能量使离散颗粒解聚，此平台使用由患者/DPI产生的能量来将BMP脆性破裂成可吸入的低密度颗粒。

由于TFF是从溶液开始的自下而上的生产方法，所以API和赋形剂在施加到低温表面进行速冻之前最初在分子水平上是均质的。通过使用这种独特的DPI制剂方法，组合疗法均匀地分散在气溶胶颗粒内，从而导致递送剂量的均匀性和每种API在组合产品内的共沉积。表2中呈现的数据显示，BMP组合制剂中SX和MF的气溶胶特性对于两种API非常相似。相反，在组合粉末共混物中递送的SX和MF的微粉化粉末表现出不同的细颗粒分数(FPF)和质量中值空气动力学直径(MMAD)。此外，不含赋形剂的BMP SX/MF制剂(净)能够递送几乎50％的两种加载的药物作为细颗粒。

表2：通过吸入器递送的SX/MF组合BMP制剂和微粉化制剂的空气动力学特性。

对FF、TB和B的BMP三联组合的空气动力学性能的评估产生了与BMP SX/MF制剂相似的结果。BMP制剂确保各个API以均匀的方式递送和沉积。如图2所示，BMP制剂的区域沉积对于所有三种API几乎相同。这种BMP三联组合可以改善对患者的治疗，其中β2-激动剂受体被下调并且长效毒蕈碱拮抗剂(LAMA)的敏感性增加(Williamson等人，2010年)。虽然对于所有三种BMP配制的API，为加载剂量百分比的FPF高于50％，但是需要进一步优化制剂/装置以减少这些制剂中的上气道(阶段1和2)沉积。

实施例3-材料和方法

A.材料

羟萘酸沙美特罗和糠酸莫米松购自Mascot I.E.CO.，LTD(中国常州)。α-乳糖一水合物和甘露醇购自Fisher Scientific(美国新泽西州)；D-海藻糖购自Acros Organics(美国新泽西州)，以及甘氨酸购自J.T.Baker(美国宾夕法尼亚州)。高效液相色谱(HPLC)级乙腈和甲醇购自Fisher Scientific(美国新泽西州)。水通过反渗透纯化(MilliQ，Millipore，法国)。

B.制剂制备

使用薄膜冷冻技术产生用于共沉积的BMP制剂。简而言之，将羟萘酸沙美特罗(SX)、糠酸莫米松(MF)以及药用赋形剂溶解在叔丁醇、1，4-二噁烷、乙腈和纯化水(2∶1∶3∶3，v/v)的共溶剂混合物中(Jouyban-Gharamaleki等人，2001年。将组合a.)羟萘酸沙美特罗、糠酸莫米松和乳糖(SXMFLac)，b.)羟萘酸沙美特罗、糠酸莫米松和甘露醇(SXMFMan)，c.)羟萘酸沙美特罗、糠酸莫米松和甘氨酸(SXMFGly)，d.)羟萘酸沙美特罗、糠酸莫米松和海藻糖(SXMFTre)以及e.)不含赋形剂的羟萘酸沙美特罗、糠酸莫米松(SXMF)溶于共溶剂溶液中。羟萘酸沙美特罗比糠酸莫米松的比例为按质量计50比220，对应于临床剂量；而API比赋形剂的比例被控制为1∶1的摩尔比。根据可溶性，共溶剂的总固体浓度为0.5％(w/v)。将共溶剂溶液在薄膜设备的低温冷却的(-90±3℃)旋转不锈钢表面上快速冷冻。在用刮刀去除后，然后将冷冻的膜收集在装有液氮的容器中以保持冷冻状态。将冷冻的样品转移到VirTis Advantage冻干器(VirTis Company Inc.，纽约州加德纳)中以获得干粉。将制剂在-40℃下以小于200mTorr的压力冻干24小时，然后将储存温度在另外24小时内逐渐升至25℃。将最终产物储存在室温下的真空干燥器中。

为了比较的目的，通过气流粉碎制备与BMP制剂中使用的相同比例的SX、MF和赋形剂的微粉化结晶物理共混物。将散装材料以80psi的进料压力和65psi的研磨压力进料到气流粉碎机(Aljet mill，Fluid Energy，Plusteadville，美国宾夕法尼亚州)中。处理每个散装材料，直到粒度达到可吸入范围(1-5μm)(Watts等人，2013年)，并且这种粒度在5-7次处理之间变化。从收集室收集和分析样品。使用配备有R3透镜的Sympatec Helos激光衍射仪器(Sympatec GmbH，德国)测量研磨前后的粒度。精确称量等量的微粉化的SX、MF和赋形剂，并使用几何稀释技术分别混合，然后置于不锈钢混合容器中，用湍流共混器T2F(Bachofen，瑞士)以48转/分钟(rpm)共混30分钟。

C.差示扫描量热法

使用装配有冷藏冷却***、耦合有TA通用分析2000软件(特拉华州纽卡斯尔)的调温DSC(2920型，TA Instruments，特拉华州纽卡斯尔)进行对BMP SXMF、BMP SXMFLac、BMPSXMFMan、BMP SXMFGly、BMP SXMFTre以及它们的微粉化组分中的每一种的热分析。使用铟作为标准进行DSC仪器的校准。将样品粉末(5-10mg)装载在铝盘中并用铝盖(PerkinElmer，马萨诸塞州沃尔瑟姆)压封。使用卷曲的空盘作为对照。每个空样品盘的质量与空对照盘的质量匹配至±0.1mg。在30-350℃的范围内以10℃/min的加热斜坡速率和1℃的调温幅度在通过DSC细胞的40mL/min的氮气流速下分析熔融吸热。通过调节的DSC但是以5℃/min的加热斜坡速率测量BMP制剂的玻璃化转变温度(T_g)。

D.粉末X-射线衍射

使用具有CuKα辐射的石墨单色器，利用图像板检测器通过广角XRD(Rigaku R-Axis Spider，日本)评估粉末样品的形态。使用40kV的加速电压和40mA的电流。将样品安装在Hampton Research CryoLoop上。使用Rigaku的2DP版本1.0数据转换程序将2维图像板数据转换为常规的1维粉末图案。在本研究中，在2θ步长为0.01°时，转换范围为2°至40°。使用Bruker Analytical的DiffracPLUS评估程序包EVA(V.2009)分析数据。用新鲜制备的BMP制剂和微粉化的共混物以及微粉化和BMP个别的API建立XRPD图形。

E.扫描电子显微术

采用扫描电子显微术(SEM)来评估微粉化和BMP制剂两者的表面形态。在成像之前，将样品加载到双面碳带上，并使用溅射涂布机208HR(Cressington ScientificInstruments，英国沃特福德)涂覆铂/钯以实现12nm的厚度。在具有5kV的操作电子高压(EHT)的高真空模式下，使用图形用户界面软件在Carl Zeiss 40VP(Carl Zeiss，德国上科亨)中捕获SEM图像。

F.比表面积分析

使用具有30％氮气在氦气中以作为吸附气体的Monosorb MS-22快速表面积分析仪(Quantachrome Instruments，佛罗里达州博因顿海滩)测量与粉末孔隙率相关的比表面积(SSA)。在分析前，使用氮气在Thermoflow^TM脱气器中于30℃下将粉末样品脱气至少2小时。Monosorb利用改进的BET方程进行对表面积的非常快速的单点测定(P/P0＝0.294)。

G.傅里叶变换红外光谱

使用装配有Polaris^TM长寿命IR源(Thermo Scientific，马塞诸塞州华森)和DLaTGS-KBr检测器的Nicolet^TM iS^TM50 FT-IR光谱仪(Thermo Scientific，马塞诸塞州华森)获得红外光谱。使用研钵和研杵将每种样品分散在KBr中，然后通过施加压力形成球粒。

在透射模式下进行FTIR测量。扫描范围为700cm^-1至3600cm^-1，分辨率为4cm^-1，对于每个光谱记录16次扫描，并针对本底光谱校正光谱。所有测量在室温下进行。

2.8.水吸附

使用动态蒸汽吸附(Surface Measurement Systems Ltd，英国伦敦)测定BMP制剂的水吸附曲线。考虑到玻璃样品管的容量(0.5mL)，根据颗粒密度加载3至6mg的样品。作为所有实验中的初始步骤，通过将样品在0％相对湿度(RH)下保持480分钟或直到质量的dm/dt改变小于0.002％达40分钟来去除在储存或装载中的环境暴露期间吸收的水。每种制剂在25℃下逐步以10％的相对湿度(RH)在0和90％的RH之间进行完全吸附/解吸循环。将仪器以dm/dt模式运行以决定何时达到平衡，如通过在5分钟的间隔内小于0.002％的dm/dt测定的。根据质量的百分比变化减去初始干制剂重量来计算吸附等温线并绘制曲线图。通过将由于水吸附(解吸)引起的质量增加(减少)除以在0％RH下初始平衡之后的干BMP制剂的质量并乘以100来计算吸附(解吸)的质量％。

H.空气动力学粒度分析

使用新一代药用撞击器(NGI)(MSP Corp.，明尼苏达州肖维)来确定DPI装置的影响并比较BMP制剂和结晶微粉化共混物的空气动力学特性。将约2mg粉末手动填充到3号尺寸的HPMC胶囊(Capsugel，新泽西州皮帕克)中，并使用Miat单剂量 DPI装置雾化，所述DPI装置通过模制的硅树脂接口适配器(mouthpiece adapter)连接到吸入口。为了表征BMP制剂和微粉化粉末的体外性能以用于动物研究，还将粉末填充到没有胶囊的吹药器室中。气溶胶对于Miat单剂量是以91L/min的气流速率在2.7s内产生的，而对于吹药器是以51L/min的气流速率在4s内产生的，以实现跨所述装置的4L吸入体积和4kPa压降(Wang等人，2014年；Watts等人，2013年)。两个装置的阶段截留粒度直径计算为在阶段1至7和微孔收集器(MOC)中为6.48、3.61、2.30、1.37、0.76、0.43、0.26和0.26μm(Marple等人，2003年)。在每次运行之前，用在乙醇中的1％(v/v)聚山梨醇酯80涂覆NGI收集表面，在乙醇中的1％(v/v)聚山梨醇酯80是欧洲药物气溶胶组织(EPAG)推荐的涂层材料，用以避免由颗粒反弹和二次夹带引起的偏差[41]。雾化后，将所有收集表面用已知体积的流动相冲洗。分别提取沉积在胶囊、装置、适配器、咽喉、预分离器和阶段1-MOC中的粉末。在穿过0.2μm的PTFE过滤器后，通过HPLC分析溶液的SX和MF含量。预分离器经装配用于DPI装置，而不是用于吹药器。对于每次测试，总喷射剂量(TED)被定义为从吸入器喷射的API相对于胶囊中的总加载剂量的百分比。基于在阶段1-MOC上沉积的剂量，根据USP 32-NF 27总章节601(DiNunzio等人，2008年)计算几何标准偏差(GSD)和质量中值空气动力学直径(MMAD)。细颗粒分数(FPF)被定义为喷射剂量中小于5.0μm的颗粒的质量分数。建立小于所述空气动力学直径的累积质量百分比对空气动力学直径(每个阶段的截留粒度)的曲线图，并使用Sigmaplot(Systat Software Inc.，加利福尼亚州圣荷西)与4参数逻辑曲线拟合。

I.色谱分析

过滤来自胶囊、装置、适配器、咽喉、预分离器和阶段1-MOC的所有冲洗的表面收集物，并通过高效液相色谱(HPLC)进行分析。HPLC用于定量所收集的SX和MF。使用装配有反相C₁₈柱5μm 150mm×4.60mm的Dionex 3000高效液相色谱(HPLC)***分析样品。所有测试在室温下以1.2mL/min的流速进行。流动相由用磷酸调节的pH 3.5的90/10(v/v)甲醇/水组成。注射体积为20μL，并且检测波长为250nm。线性测试溶液由SX和MF储备溶液以范围从1μg/mL至250μg/mL的七种浓度水平制备。

SX作为外消旋混合物销售，并且没有证据表明(S)-沙美特罗与相应的(R)-沙美特罗相比具有不同的效果，因此采用手性色谱分析来鉴定BMP制剂的手性。为了测定SX在吸入粉末中的光学活性，使用Dionex 3000HPLC和正常相手性柱Lux纤维素-4(5μm，250×4.60mm)进行手性色谱分析。使用含有具有0.1％DEA的正己烷/2-丙醇(90∶10，v/v)的流动相完成对(R)-沙美特罗和(S)-沙美特罗的立体化学分离。在250nm紫外线下使用1.0mL/min的流速在环境温度下进行分析。

J.体内药代动力学研究

动物研究由德克萨斯大学奥斯汀动物护理和使用委员会(IACUC)批准。将平均体重为270g、称重在250-300g之间的具有颈静脉预插管和无预插管的雄性和雌性SpragueDawley大鼠(Charles River Laboratories International，Inc.，马萨诸塞州威尔明顿)用于体内插管和干粉吹入程序。在一周的适应时间期间，每笼容纳两只大鼠，进行具有可随意获得食物和水的12小时光/暗循环。在研究前每3天用500单位/mL的肝素化生理盐水冲洗导管。将动物分成两组，并且每组包含12只未预插管的大鼠以用于肺样品收集以及4只预插管的大鼠以用于血液样品收集。

使用DP-4M干式吹入器^TM装置和AP-1气泵以及LS-2小型动物喉镜(Penn-Century，Inc.，宾夕法尼亚州温德摩尔)。称量BMP和微粉化的共混物，并装载到吹药器室中(靶SX剂量＝450μg/kg、靶MF剂量＝1980μg/kg)，然后将吹药器附接到可调节体积的气泵。将每只大鼠用经0.2微米过滤器过滤的***HCl/甲苯噻嗪HCl的混合物(80mg/kg的***HCl、6mg/kg的甲苯噻嗪HCl)进行腹膜内麻醉，基于重量施用约0.2至0.3mL的混合物。将大鼠麻醉后，将大鼠放置成背部呈45度角，并用小橡胶带固定门齿。使用喉镜将气管可视化，然后将吹药器装置***气管中，并将空气泵附接到该吹药器装置。从所附接的气泵分配所需体积的空气(对于大鼠为每泵2mL的空气)，以迫使粉末从吹药器装置的室通过PE管、带金属尖端的插管进入大鼠的气管(Morello等人，2009年)。使用4至7个泵将所有粉末致动到肺中。在粉末填充和施用前后对吹药器进行称重，以确认以质量计吹入的实际剂量。

在吹入后，在5min、15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h和24h的时间点从颈静脉导管取出血液样品，然后将等体积的温热生理盐水注射回大鼠体内并储存在BD血液收集管中。在每组中，在每个时间点(15min、1h、2h、6h和24小时)处死三只大鼠以进行肺收获。为了研究沉积在下呼吸道中的API的量，通过以下方式来进行改进的支气管肺泡灌洗(BAL)程序：用3mL无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤呼吸道两次，以在肺样品收集之前收集流体(Chougule等人，2007年)。得到约4-5mL BAL。将所有生物样品储存在-80℃冷冻器中直到分析。

K.对肺组织、BAL和血液中SX和MF浓度的定量

通过液相色谱质谱法(LC/MS/MS)来定量肺组织、BAL和血浆中的SX和MF浓度。使用氯卡色林(LOR)作为内标。LC/MS/MS***由Shimadzu CBM-20A控制器、两个LC-20AD泵、SIL-20AC自动进样器、CTO-20AC柱温箱以及具有涡轮离子喷雾的AB Sciex API 4000-QTrap质谱仪组成。使用购自MacMod(宾西法尼亚州的查兹佛德)的Ace Excel 3Super C18(3×75mm，3μ)实现色谱分离，并在色谱运行期间保持在40℃。流动相A含有在Millipore H₂O中的0.1％甲酸，而流动相B含有在乙腈中的0.1％甲酸。流动相的流速为0.7mL/min。将SX和MF进行阶梯梯度洗脱。用60％的流动相B平衡柱。在注射后2.5分钟，将***切换至95％的流动相B。在6min时，将***切换回60％的流动相B以准备下次注射。监测以下Q1/Q3转变：对于SX为m/z 416.1→232.0，对于MF为m/z 521.9→355.2，以及对于LOR(IS)为m/z 196.0→129.1。加下划线的转变用于定量。

血浆中SX和MF的定量：在血浆(EDTA)中定量SX/MF。简言之，将100μL校准器和未知血浆样品与10μL的LOR工作储备溶液(内标)以及300μL的流动相B(在乙腈中的0.1％甲酸)混合。将样品剧烈涡旋2分钟，然后在23℃下以3200g离心20分钟。将上清液转移至1.5mL微滤离心管，离心，然后将50μL最终提取物注入LC/MS/MS中。在0、0.5、1、10、50、100、500、1000ng/mL，将每个未知样品的SX和MF的峰面积与内标LOR的峰面积的比例(响应比)与校准物响应比的线性回归进行比较以定量SX和MF。每种分析物的浓度表示为ng/mL血浆。

肺组织中SX和MF的定量：肺的重量平均为1.6克。简言之，将校准物、对照和未知组织样品与10倍体积的流动相B混合，并用组织均化器均化。将样品在3200g离心20分钟，然后将100μL上清液转入1.5mL微过滤离心管，并加入10μL LOR工作储备溶液加标。将样品剧烈涡旋2分钟，转移入1.5mL微过滤离心管中，离心，然后将10μL的最终提取物注入LC/MS/MS中。在0、10、100、1000、2500、5000、7500、10000ng/mL，将每个未知样品的SX和MF的峰面积与内标氯卡色林的峰面积的比例(响应比)与校准物响应比的线性回归进行比较以定量SX和MF。将SX和MF的浓度标准化为蛋白质含量，并表示为μg/g组织(百万分之一)。

BAL中SX和MF的定量：通过用300μL的流动相B涡旋来混合100μL的校准物、对照和未知样品。在涡旋后，将样品转移到1.5ml微过滤离心管中，然后在23℃下以3200g离心15分钟。将滤液转移到自动进样器管中，并将10μL的最终提取物注入LC/MS/MS中。在0、0.5、1.0、5、10、50、100、1000、5000、10000ng/mL，将每种未知样品的SX和MF的峰面积与校准物峰面积的线性回归进行比较以定量SX和MF。SX和MF的浓度表示为ng/mL BAL。

实施例4-SX和MF组合的结果

A.差示扫描量热法

图3所示的结果表明，BMP制剂未表现出熔融吸热，然而通过调整的DSC分别观察到了在101.77℃至124.43℃的温度范围内的单一玻璃化转变温度(T_g)，之后是在138.85℃至147.32℃的温度范围内的单一重结晶峰。

B.X-射线粉末衍射

在图4A中因固定剂量组合BMP SXMF、BMP SXMFLac和BMP SXMFTre在冻干后的衍射图中存在晕图案而确认没有结晶性。然而，固定剂量组合药物混合物中的赋形剂表现出不同的结晶特性，如XRPD所证明的。观察到了BMP SXMFGly和BMP SXMFMan的Gly和Man峰。微粉化药物的物理共混物分别表现出SX和MF的特征结晶峰。

图4B中示出的对用TFF制备的固定剂量组合进行的在25℃/30％RH下的6个月稳定性结果显示BMP SXMF和BMP SXMFTre的XRPD峰强度在6个月内没有变化，并且粉末保持非晶形。相比之下，XRPD衍射图显示，在相同的时间段内观察到了BMP SXMFLac、BMP SXMFMan和BMP SXMFGly的对应于SX(4.21 2θ)的小结晶峰。

C.扫描电子显微术和比表面积分析

如图5A和图5B所示，BMP固定剂量组合表现为多孔微粒聚集体，所述多孔微粒聚集体与相邻聚集体松散连接以形成海绵状结构，所述海绵状结构看起来是均质和脆性的。相比之下，微粉化药物物理共混物是非均质的。

BET表面积测量的结果示于表3中。发现微粉化SXMF的比表面积为0.89m²/g。通常，用于共沉积的BMP固定剂量组合的比表面积在约26.87m²/g至35.61 m²/g的范围内。与其他BMP制剂相比，BMP SXMFLac和BMP SXMFTre显示为具有更大的表面积。然而，BMP制剂的各值之间没有显著差异。

表3：微粉化的SXMF、BMP SXMF、BMP SXMFLac、BMP SXMFMan、BMP SXMFGly和BMPSXMFTre的比表面积(SSA)。值表示为平均值±SD(n＝3)。

制剂	SSA(m²/g)
		微粉化的SXMF	0.89±0.01
BMP SXMF	28.18±1.038

制剂	SSA(m²/g)
		BMP SXMFLac	35.61±1.682
BMP SXMFMan	29.87±0.588
		BMP SXMFGly	26.87±1.255
BMP SXMFTre	32.41±0.456

D.傅里叶变换红外光谱

如图6A和图6B所示，研究和检查了各个组分和TFF处理粉末的傅里叶变换红外光谱学(FTIR)光谱。对于所有BMP，都可以观察到在1724 cm^-1处的-C＝O拉伸拉伸的峰，也包括单个SX和MF。位于3200 cm^-1至3700 cm^-1区域中的强峰可以对应于-OH或-NH，这在所有单一材料中观察到。单个SX在3278 cm^-1处显示出强峰(如图6A所示)，这归因于仲酰胺的-NH拉伸。SX的-C-N拉伸通过在1268cm^-1处存在相对尖锐的峰而得到证实。在羰基区域中，与固定剂量组合相比，单个结晶形式显示出宽峰。与结晶MF相比，在所有固定剂量组合中在1724cm^-1处的-C＝O拉伸峰处没有观察到谱带位移。对于单一材料，特别是对于赋形剂，观察到了在3200cm^-1与3400cm^-1的区域中的强和宽的-NH和-OH峰。总体上，在TFF处理后，固定剂量组合的-C＝O或-NH和-OH的波数没有改变。这种改变的缺乏表明没有H键的证据。

E.水吸收

图7示出了在一个循环后用DVS测定的BMP固定剂量组合的吸附和解吸等温线的结果。在吸附测试期间从BMP SXMFLac和BMP SXMFTre观察到了缓慢的水分摄取。完成吸附/解吸循环所需的时间分别为22h和19h，因为缓慢的水吸收(和相应缓慢的基线稳定)意味着与BMP SXMFMan(12h)、BMP SXMFGly(11.5h)和BMP SXMF(11h)相比较长的循环时间。通过增重(％)测量的水分摄取是BMP SXMFLac(约35％)、BMP SXMFTre(约30％)、BMP SXMFMan(约5％)、BMP SXMFGly(约4％)和BMP SXMF(约2％)。这表明BMP SXMFLac和BMP SXMFTre比其他组合物具有更强的吸水性。

F.体外气溶胶性能

固定剂量BMP制剂和微粉化的API共混物的NGI分散数据被绘制成曲线并显示在表4中。用Miat单剂量施用的所有固定剂量组合的气溶胶特性显示为高FPF(38％-57％)和小MMAD(约4μm)。

然而，SX的气溶胶特性与固定剂量BMP制剂的MF相当。微粉化共混物SXMF的FPF对于SX为59.51±7.07％相对于对于MF为34.29±5.78％，而BMP SXMF的FPF对于SX为55.52±4.78％相对于对于MF为52.08±4.40％，这是相似的。令人惊讶的是，两种制剂的MMAD都显示出在3-5μm范围内的类似值。然而，对于固定剂量组合，两种API的MMAD是接近的。相反，SX和MF的微粉化共混物显示出不同的MMAD。此外，BMP制剂的两种API的TED大致高于93％，并且微粉化共混物的TED低于82％。

对图8A至图8E中的NGI数据的检查显示，在SX和MF之间的不同阶段中的沉积百分比类似于BMP制剂。用于共沉积的BMP固定剂量组合产生SX与等效性能的其它组分MF的按沉积百分比计的剂量比例气溶胶。微粉化的共混物在具有如图8A至图8E所示的相同组分的SX和MF之间表现出不均匀的分布。此外，微粉化的共混物主要沉积在胶囊和咽喉中，而BMP制剂主要沉积在预分离器和阶段1中。BMP SXMF和BMP SXMFGly表现出较高的FPF和较低的MMAD。

在图9中报道了通过使用经由NGI装置的51L/min气流速率，用吹药器测定的BMPSXMF和微粉化的SXMF的空气动力学特性。BMP SXMF的FPF对于SX为46.02±4.77％且对于MF为45.65±6.43％，而微粉化的SXMF的FPF为23.15±0.01％和21.11±0.01％。尽管两种制剂的MMAD和GSD值接近，但是BMP SXMF的TED几乎为99％。

G.色谱法

SX和MF的线性测试溶液是以在1μg/mL至250μg/mL的范围内的七个浓度进行的(r>0.99)。回收率(％)在85％至105％之间被认为是可靠的，否则需重复测试。

在手性色谱中，对于所有固定剂量组合都观察到了两个峰，并且峰面积相似，这表明在冻干后手性不改变，并且SX手性的保留时间为约18分钟和21分钟。

实施例4-对SX和MF组合疗法的讨论

用TFF产生SX和MF的组合BMP(质量比为5∶22)，以使得能够在整个气道中以一致的比例共沉积两种API。使用气流粉碎以制备微粉化对照共混物进行比较。使用乳糖(Lac)、甘露醇(Man)、甘氨酸(Gly)和海藻糖(Tre)制备SX和MF BMP制剂。与使用赋形剂作为载体颗粒的粗共混DPI产物不同，BMP中的药用赋形剂形成基质结构并稳定化非晶的API。乳糖、甘露醇和甘氨酸由美国食品和药物管理局(FDA)批准作为供吸入的赋形剂并且以不同量(例如，至多25mg的乳糖)(Watts等人，2013年)、0.051％的甘露醇和0.01％的甘氨酸)用于DPI中。海藻糖广泛用于药物制剂中作为冻干保护剂，因为其具有相对高的T_g和低的结晶倾向(Simperler等人，2006年)。在分子水平上，本文使用的SX、MF和赋形剂具有提供氢键供体和受体的官能团，例如羧酸、酰胺和醇，所述官能团已经显示为当组合使用时改善非晶***的稳定性(Jeffrey G.A，1997年)。

为了配制用于共沉积的BMP组合，期望在TFF处理后SX和MF在热力学上可互溶。单个T_g和重结晶峰的出现以及不存在BMP制剂的两种API的熔融峰证实了API-API均质非晶相的形成，其中一种API溶解在另一种API或赋形剂中。基于DSC热谱，建议将BMP SXMF转换成共非晶态。由于API降解，赋形剂的热特性不足以明确估计。然而，个别组分的形态在XRPD研究中更清楚。BMP的XRPD图形指示与DSC热谱一致的非晶形API。还清楚地观察到了赋形剂的结晶学。如图4A所示，在BMP制剂中不存在特征性SX和MF结晶峰和出现典型的晕衍射图案表明了SX和MF的非晶形形态。这些结果表明非晶形二元(BMP SXMF)或三元(BMP SXMFLac或BMP SXMFTre)固态分散体是通过引入高T_g组分而形成的，其中MF、Lac和Tre的T_g为约150℃、116℃(Craig等人，2000年)和94℃(Simperler等人，2006年)。尽管在含有结晶Gly和Man的BMP制剂中SX和MF是非晶形的，但是API的结晶可以随时间推移而由于成核和引晶发生(Sun等人，2012年)。

产生共非晶形固体以增加溶解度、稳定性和生物利用度，因此非晶形API必须抵抗它们的热力学结晶倾向，以保持这些优点。非晶形体系的增加的稳定性通常由增加的T_g解释，增加的T_g可以降低在某些储存温度下结晶所需的分子迁移率(Janssens和Van denMooter，2009年)。在这项研究中，BMP SXMF和BMP SXMFTre在25℃/30％RH储存6个月后仍然保持良好的共晶条件。然而，在相同的时间段内，对于BMP SXMFLac、BMP SXMFMan和BMPSXMFGly观察到了在4.21 2θ处的小SX结晶峰。

不希望受任何理论约束，据信API颗粒的比表面积和形态可以通过动力学和热力学效应两者来显著影响API的释放特性(DiNunzio等人，2008年)。尺寸、密度、比表面积和形态的差异可归因于颗粒形成的过程(Ali和Lamprecht，2014年)。与不规则和粘性微粉化共混物不同，BMP制剂的优点是多孔和脆性的结构促进了API在肺液中快速溶解的潜能(Janssens和Van den Mooter，2009年)。由于多孔基质结构，BMP制剂的SSA与微粉化制剂相比大大增加。所有TFF处理的粉末表现出非常低的体积密度，并且预期轻易地雾化。

水分吸附在BMP制剂的气溶胶特性中起关键作用。据报道，用乳糖作为赋形剂而通过TFF制备的可吸入BMP对水分诱导的基质塌陷和吸湿性敏感；相比之下，当用甘露醇处理时，BMP的雾化特性不受高湿度的影响(Watts等人，2013年)。不希望受任何理论约束，据信吸湿性赋形剂可能增加共非晶形BMP制剂的不稳定性风险(基于稳定性研究)，而用非吸湿性赋形剂处理或无赋形剂的BMP制剂更稳健(如从体外气溶胶性能所显示)。

进行傅里叶变换红外光谱学(FTIR)测量以获得对BMP制剂中SX、MF和赋形剂之间可能的分子水平相互作用的了解。分析结晶单独成分以便在本研究中进行容易的比较(Heinz等人，2009年)。由于在对应于-OH拉伸的3000cm^-1与3500cm^-1区域中的氢键相互作用，不可能确定是否存在偏移，这是由于热激发对赋形剂的这些振动模式的影响。

尽管对于单种材料，在3200cm^-1与3400cm^-1的区域中的强-NH和-OH峰改变形状，但是对于所有BMP固定剂量组合中的-C＝O或-NH和-OH没有检测到显著的峰位移。因此，不希望被任何理论约束，据信没有发生相互作用。尽管通常在共非晶形制剂中，特别是在由使用潜在氢受体和供体结构化的材料组成的制剂中观察到了氢键相互作用，但是氢键相互作用的发生不是不可避免的，并且对于改善制剂的生理化学特性不是必需的(Dengale等人，2014年；Lobmann等人，2012年)。

空气动力学特性是测量吸入性干粉制剂的性能的一个因素，因为它与肺沉积相关(Ali和Lamprecht，2014年)。虽然BMP制剂产生大几何直径，但是低颗粒密度允许足够低的空气动力学直径以进行有效的肺沉积(Carvalho等人，2014年；Watts等人，2013年)。本文采用Miat单剂量其提供将脆性基质分解成可吸入颗粒所必需的剪切力。此外，在用于体内研究的制备中表征了从粉末吹药器递送的粉末。

更多的BMP制剂从胶囊和适配器而不是微粉化共混物排空，如较高的TED所证明的。与用抗溶剂沉淀制备的先前研究的SX组合制剂相比，BMP制剂中SX的FPF(递送％)提高了25％(Murnane等人，2009年)。对于单一疗法MF Twisthaler，已经报道200μg强度的FPF为27.9％(Berger和Berger，2013年)，因此在本研究中MF-DPI的FPF也显著增加。表4中呈现的数据显示，BMP制剂的SX和MF的气溶胶特性相似，这表明两种API都在体外吸入后共沉积。相反，以组合粉末共混物递送的微粉化的SX和MF显示出不同的FPF和MMAD。

如图8A至图8E所示的NGI内的空气动力学粒度分布表明，BMP制剂的API以高度一致性递送到所有阶段，而微粉化的共混物导致差异。已经报道，在从单一吸入器施用SX和皮质类固醇丙酸氟替卡松后，在细胞水平上的共定位提供了增加临床效力的潜能(Nelson等人，2003年)。因此，可能这种固定剂量组合提供了与相同剂量的两个单独吸入器相比增加的发生协同相互作用的机会。

使用非吸水性赋形剂配制或不含赋形剂的粉末与吸水性粉末相比显示出升高的FPF，例如如表4所示的BMP SXMF对BMP SXMFLac。基于SX和MF的沉积百分比的比较，不希望受任何理论约束，据信BMP制剂的降低的表面凝聚力导致了低胶囊保留，这在传统制剂中通常由范德华力、毛细管和静电力引起(Watts等人，2013年)。虽然对于所有两种TFF配制的API，FPF作为加载剂量百分比为约38％至57％，但是需要进一步优化制剂/装置以减少这些制剂中的上气道(阶段1和2)沉积。由于BMP SXMF粉末的稳定性和良好的空气动力学性能而选择该BMP SXMF粉末进行体内研究，同时使用结晶微粒化SXMF共混物作为对照。此外，体外气溶胶性能研究表明，吹药器可以产生细气溶胶颗粒以使用两种制剂进行动物研究。

固定剂量组合BMP SXMF在肺组织中表现出两种API的增加的沉积量，以及在肺和血液中显著增加的生物利用度。可以考虑另外的制剂方法来降低MF全身吸收的程度。由于长效β2-激动剂(LABA)具有引发糖皮质类固醇受体和改善吸入的皮质类固醇活性的能力，所以固定剂量组合BMP SXMF具有比传统结晶微粉化SXMF共混物潜在更好的药效学。

实施例5-用于三联疗法的方法和材料

A.材料

布***、富马酸福莫特罗和噻托溴铵购自Chemieliva Pharmaceutical Co.(中国重庆)。D-(+)-甘露醇购自Acrōs Organics(比利时赫尔)，而乳糖一水合物(LH 200)由Friesland Foods Domo(荷兰兹沃勒)友情捐赠。高效液相色谱(HPLC)级乙腈购自Fisher Scientific(新泽西州费尔劳恩)，并且8％w/v的高氯酸水溶液购自RiccaChemicals(德克萨斯阿灵顿)。水通过反渗透纯化(MilliQ，Millipore，法国)。

B.制剂制备

使用薄膜冷冻技术来制备低密度干粉，如本文所述和在Overhoff等人(2007年)中所述。分别使用重量比为1∶2∶35.5的福莫特罗、噻托溴铵和布***来制备三联组合制剂。所选的比例是根据针对慢性阻塞性肺部疾病(GOLD)的全球计划，基于用于治疗COPD患者的典型剂量。以下混合物是通过将以下组分溶解在三份的乙腈和2份的水的共溶剂混合物而制备的：布***/噻托溴铵/福莫特罗和甘露醇(BTF_Man)、布***和甘露醇(Bud_Man)、噻托溴铵和甘露醇(Tio_Man)、福莫特罗和甘露醇(For_Man)、布***/噻托溴铵/福莫特罗和乳糖(BTF_Lac)、布***和乳糖(Bud_Lac)、噻托溴铵和乳糖(Tio_Lac)、福莫特罗和乳糖(For_Lac)。药物与糖赋形剂的比例为1比1，并且最终固体负载浓度为0.50％(w/v)。

使用薄膜冷冻设备在低温冷却(-80℃)不锈钢表面上快速冷冻溶液。将冷冻的盘收集在装有液氮的容器中以避免融化。将冷冻的制剂转移至-70℃冷冻器中，直到液氮完全蒸发，然后转移到VirTis Advantage冻干器(VirTis Company Inc.，纽约州加德纳)中用于溶剂去除。将制剂在-40℃下在400mTorr的压力下冻干24小时，使用小于200mTorr的压力将温度在24小时内逐渐升温至25℃，并在25℃下保持24小时。

为了比较的目的，使用与前述相同的重量比制备布***/噻托溴铵/富马酸福莫特罗和甘露醇(BTF_Man_PM)和布***/噻托溴铵/富马酸福莫特罗和乳糖(BTF_Lac_PM)的等效物理混合物。使用具有设定在80psi的推动器压力和设定在100psi的网格化压力的流体能量实验室喷射器(Fluid Energy，宾夕法尼亚州特尔福德)将活性物微粉化。称量精确量的微粉化粉末，并使用几何稀释技术混合，然后转移到不锈钢容器中。将所述容器置于湍流混合器(Glen greston Ltd.，英国米德尔塞克斯)中，并以45转/分钟(rpm)进行混合20分钟。在混合之前和之后将制剂筛过100和45μm的筛孔。

C.热分析

使用装配有冷藏冷却***的TA Instruments调整的差示扫描量热计(mDSC 2920)(特拉华州纽卡斯尔)来分析粉末的热特性和结晶度。使用干燥氮气作为流速为40mL/min的mDSC池吹扫气体。将4至10mg的样品重量置于敞开的铝盘中并密封(套件0219-0041，Perkin-Elmer Instruments，康涅狄格州诺沃克)。在10℃至350℃的范围内以10℃/min的加热速率和1℃/min的调温幅度进行实验。使用TA通用分析2000软件(TA Instruments，特拉华州纽卡斯尔)分析数据。

D.粉末X-射线衍射(PXRD)

使用Philips 1710X-射线衍射仪(Philips Electronic Instruments Inc.，新泽西州莫沃)研究所购买的原料活性物质的干粉以及经气流粉碎和TFF粉末制剂的结晶特性。测量是在2-θ标度上以0.03°/s的步长和5s的停留时间从5°至35°进行的。

E.粒度分析

通过激光衍射(HELOS，Sympatec GmbH，德国克劳斯塔尔)测量气流粉碎前后布***、噻托溴铵和富马酸福莫特罗的粒度分布的测量值。将少量富马酸福莫特罗和噻托溴铵分别分散在10mL0.01％吐温80的矿物油溶液中，并将少量布***分散在去离子水中的10mL 0.01％吐温80中。将样品超声处理5分钟，并用足够的溶剂稀释以产生在15-20％范围内的光遮蔽。所报告的大小是至少3次测量的平均值。结果表示为D_(x)和跨度，其中X是所提及尺寸下颗粒的累积百分位(例如，D₍₅₀₎对应于颗粒的中值粒径)。跨度是计算为[(D₍₉₀₎-D₍₁₀₎]/D₍₅₀₎的粒度分布的量度。

F.扫描电子显微术(SEM)

使用SEM测定粉末形态和粒度估计。将样品置于碳带上，并在高真空下使用Cressington 208台式溅射涂布机(英国沃特福德)用金/钯(60/40)涂覆20秒。在真空下在19mm的工作距离和5kV的电子高压(EHT)下，使用图形用户界面软件在CarlZeiss 40VP(Carl Zeiss，德国上科亨)中捕获SEM图像。

G.布鲁瑙尔一爱梅特一泰勒(Brunauer-Emmett-Teller，BET)比表面积(SSA)分析

通过使用Monosorb MS-22快速表面积分析仪(Quantachrome Instruments，佛罗里达州博因顿海滩)测量比表面积(SSA)来测定粉末孔隙率。该仪器使用改进的BET方程来进行SSA测定。将样品在Thermoflow^TM脱气器中使用氦气中的30％氮气作为解吸气体在25℃下脱气至少2小时。

H.傅里叶变换红外光谱学(FTIR)

使用FTIR光谱来表征每种样品的化学相互作用和/或非晶和结晶多晶型。在装配有氘化硫酸三甘氨酸酯(dTGS)检测器的Nicolet IR100光谱仪(Thermo FisherScientific，宾夕法尼亚州匹兹堡)上收集对干样品的FTIR扫描。使用具有约1％(w/w)的样品负载的KBr盘方法。在4000cm^-1至600cm^-1的区域中以4cm^-1的分辨率累积总共32次扫描。

I.体外气溶胶性能

用新一代级联撞击器(NGI)(MSP Corporation，明尼苏达州肖尔维尤)，使用通过由硅制成的接口适配器附接到吸入口的装置来评估空气动力学粒度分布和沉积均匀性。所述级联撞击器根据USP总章节<601>气溶胶、鼻用喷雾、定量吸入器和干粉吸入器而组装和操作的。将装置在跨装置的对应于54L/min流率的4kPa压降下运行4.4秒，该流率是使用TSI质量流量计(型号4000，TSI Inc.，明尼苏达州圣保罗)校准的。将NGI收集板用在己烷中的1％(v/v)硅油涂覆以防止颗粒反弹、破裂和二次夹带。将三个胶囊依次向NGI中发射，并且对于所研究的每种制剂进行一式三份的实验。在雾化后，使用已知体积的稀释剂收集样品，并通过高效液相色谱(HPLC)进行分析。

喷射剂量(ED)计算为从DPI喷射的药物的百分比。细颗粒分数(FPF)计算为在对应于具有4.46μm的空气动力学直径和空气动力学直径≤4.46μm的颗粒的阶段2至微孔收集器(MOC)上沉积的测定剂量的总和。通过累积百分比对截留粒度直径的对数概率图的回归计算质量中值空气动力学直径(MMAD)，并且将几何标准偏差(GSD)计算为第84百分位/第16百分位的平方根。

J.HPLC测定

使用装配有设置在230nm波长的紫外线检测器的Dionex 3000 HPLC***进行对所有药物的化学分析。将20μL注射体积注射到保持在26℃的Inertisil C₈ 5μm 150×4.6mm反相柱(Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)中。使用梯度洗脱，并且流动相由0.2％v/v高氯酸溶液作为溶剂-A和乙腈作为溶剂-B，以1.2mL/min的流速运行，并且运行时间为10分钟，如别处所述(17)。该方法在变异性、回收率、线性、检测限和范围方面进行测试，并且显示为适用于本研究。

K.统计分析

数据表示为平均值±标准偏差(SD)。使用NCSS/PASS软件Dawson版进行统计分析。使用单因素方差分析(One-way ANOVA)来分析制剂之间以及所有三种药物在各NGI阶段上的百分比分布之间的显著差异(p<0.05)。

实施例6-三联疗法的结果和讨论

A.制剂的粒度和形态

通过对原料药和赋形剂粉末的激光衍射和扫描电子显微镜图像进行的粒度分析显示颗粒的粒度不适合肺递送。布***和噻托溴铵的SEM图像显示出不规则形状，分别具有22.11±16.92μm和5.14±0.03μm的D₅₀值，以及由2.31和2.14的大跨度值证实的广泛粒度分布(表5以及图10A和10B)。另一方面，福莫特罗显示为板状形状，具有6.27±0.97μm的D₅₀值，以及7.75的较大跨度值(表5和图10C)。此外，比表面积测量(SSA)对于布***给出3.05±0.21m²/g的小表面积值，对于噻托溴铵给出2.08±0.13m²/g的小表面积值，以及对于福莫特罗给出2.97±0.05m²/g的小表面积值，从而表明散装粉末含有大颗粒。

表5：原料药和赋形剂、气流粉碎的药物和TFF制剂的粒度分布和比表面积。

粗乳糖和甘露醇用作载体以增强雾化时的粉末分散。两种粉末的SEM图像都显示出不规则形状，其中乳糖的D₅₀值为39.78±1.32μm并且甘露醇的D₅₀值为52.70±0.59μm。虽然乳糖和甘露醇的粒度大于原料药物的那些粒度，但是粒度分布是类似的，分别具有2.43和1.80的跨度值(表5以及图10D和图10E)。

为了制备三联组合物理混合物制剂以与TFF制剂进行比较，需要减小三种药物粉末的粒度。激光衍射结果表明，粒度减小过程仅对于具有3.40±0.09μm的D₅₀值和跨度值为2.58的广泛粒度分布的散装布***粉末是重要的。无论粒度减小如何，散装布***的SSA降低至2.75±0.13m²/g(表5)。不希望受任何理论约束，据信这可能是由于微米粒度的颗粒的聚集，所述聚集可能由在不受控制的研磨过程期间产生的内聚力引起，从而导致具有异质形状的带静电颗粒，如图11A所示。噻托溴铵和福莫特罗的激光衍射结果显示，研磨过程后粒度略有减小，D₅₀值分别为4.65±0.04μm和4.51±0.02μm。此外，噻托溴铵的粒度分布在跨度值为2.0时显示出较小的减小，而福莫特罗在跨度值为1.96时显示出显著的粒度范围减小(表5)。噻托溴铵和福莫特罗的SEM图像显示具有不规则形状的聚集的微粉化粉末，并且SSA结果使用分别到2.86±0.11m²/g和5.08±0.26m²/g的增大值来证实粒度减小(图11B和图11C)。微粉化药物与粗乳糖和粗甘露醇的物理混合物的SEM图像显示在图11D和图11E中。图像显示粘附到粗乳糖和甘露醇表面的微粉化药物粉末，这可以在吸入时改善粉末分散和雾化。由于混合物含有粗乳糖和甘露醇，物理混合物制剂产生0.43±0.05m²/g和0.32±0.03m²/g的小SSA值(表5)。

TFF粉末制剂的SSA测量值显示由于冷冻盘冻干后形成的高孔隙度饼粉，表面积显著增加(表5)。噻托溴铵制剂产生最少的多孔饼，其中Tio_Man的SSA值为38.79±0.81m²/g，而Tio_Lac的SSA值为48.90±2.42m²/g。布***的SSA值比噻托溴铵制剂的那些SSA值高得多，其中Bud_Man的SSA值为46.97±2.22m²/g，而Bud_Lac的SSA值为90.39±6.15m²/g。然而，福莫特罗制剂对于For_Man呈现64.14±0.68m²/g的最大SSA值，而对于For_Lac呈现193.86±10.63m²/g的最大SSA值。三联疗法制剂还产生针对BTF_Man的54.55±1.10m²/g的大SSA值和针对BTF_Lac的81.31±1.71m²/g的大SSA值。这些值与布***制剂的SSA值非常相似，因为三联疗法制剂在制剂中具有高百分比的布***(表5)。粉末密度和孔隙度的差异可以在SEM图像中看到。具有越大SSA值的粉末制剂还显示越多孔的饼状结构，如图12A至图12D和图13A至图13D所示。

B.结晶性评估

1.布***

布***作为微粉化粉末供应。布***的PXRD图案在2θ的11.81°、15.2°、15.77°、18.14°和22.46°处显示高强度峰，这表明了布***的晶体结构与Tajber等人报道的数据一致，如图18C所示(Tajber等人，2009年)。散装布***粉末的mDSC曲线显示在251.4℃下的单一吸热熔融峰(图14)类似于Velaga等人报道的数据，从而证实了散装布***粉末的晶体性质(Velaga等人，2002年)。在气流粉碎过程之后，微粉化的布***粉末保持结晶，如mDSC峰曲线(图14)和PXRD图案(图18C)所示。mDSC曲线显示吸热熔融峰的轻微偏移，其中峰最大值在252.6℃处。因此，PXRD图案显示峰强度的降低，但是样品主要保持结晶。观察到的吸热峰的偏移和PXRD峰强度的降低可能是粉碎时粉末晶体结构变化的结果。研磨过程破坏颗粒表面上的晶体结构并产生非晶形结构域(Rasenack和Muller，2004年)。

对用甘露醇制备的布***制剂的薄膜冷冻(TFF)产生部分结晶粉末，如mDSC(图15)和PXRD(图17F)结果所证实的。Bud_Man的PXRD图形显示具有小强度的峰，从而表征部分结晶的制剂。根据mDSC曲线，Bud_Man在126.2℃显示一个放热重结晶峰，并且显示两个吸热熔融峰，一个吸热熔融峰在167.4℃处、对应于甘露醇的熔点，而第二个吸热熔融峰在242.3℃处、对应于布***的熔点。这些结果表明了Bud_Man制剂的部分非晶形性质。Kim等人研究了甘露醇冻干后的物理化学特性，并报道了冻干的甘露醇由于纯非晶形粉末的低玻璃化转变温度而产生部分结晶粉末，这是在13℃下观察到的。本公开还表明，为了通过PXRD进行检测，制剂中结晶甘露醇的相对浓度应高于30％(w/w)(Watts等人，2013年)。

关于TFF Bud_Lac制剂的PXRD图案，如图17J所示，存在宽且扩散的晕圈，但不存在特征性结晶峰，这表明为非晶形结构。图16示出了调整的DSC热谱，所述调整的DSC热谱指示了两个重结晶事件，其中第一个峰可以表示乳糖在131.4℃下的重结晶，而第二个峰可以表示布***在180.2℃的重结晶。重结晶事件证实了非晶形结构是由超快速冷冻过程形成的。还观察到了两个吸热熔融峰，这两个吸热熔融峰可能对应于乳糖在212.8℃下的熔化和布***在245.7℃下的熔化。两个放热和吸热峰可以指示固体分散体系的形成以及在分析时布***与乳糖的后相分离(Overhoff等人，2007年)。

2.噻托溴铵

噻托溴铵的PXRD图案在2θ的5.81°、16.13°、19.79°和26.6°处显示结晶高强度峰(图18E)。此样品的结晶度由散装噻托溴铵粉末的mDSC曲线证实，散装噻托溴铵粉末在219.0℃显示单一吸热熔融峰(图14)。通过气流粉碎获得的微粉化噻托溴铵粉末保持结晶，这由在mDSC曲线中不存在放热重结晶峰和在219.3℃下存在吸热熔融峰指示(图14)。然而，PXRD图形显示结晶峰衍射的强度的显著降低，这可能是由于粉末结晶性损失和非晶形结构域形成的结果(Alhalaweh等人，2012年)。

用甘露醇作为稳定化糖制备的TFF Tio_Man制剂也显示为部分结晶，如在PXRD上观察到的与噻托溴铵和甘露醇类似的较不强烈的结晶峰衍射(图17G)。Tio_Man的部分结晶性通过在134.3℃下的放热重结晶峰，继之以158.8℃下的吸热熔融峰来证实(图15)。存在仅单个重结晶和熔融峰。在图17L中示出TFF Tio_Lac制剂的PXRD图形。与Bud_Lac类似，Tio_Lac粉末显示出宽且扩散的晕圈，而没有特征性结晶峰，这指示非晶形结构。粉末的非晶形形式由mDSC热谱证实(图16)。热谱曲线显示在67.9℃的放热重结晶事件，并且对于两个吸热熔融峰，在119.7℃的吸热熔融峰最可能是由于乳糖的结果并且在189.2℃处的吸热熔融峰最可能是由于噻托溴铵的结果。

3.富马酸福莫特罗

富马酸福莫特罗的PXRD图形如图18G所示，其中可以在2θ的5.75°、15.29°、16.10°、18.38°、19.76°和26.60°处看到结晶高强度峰。PXRD图形表明所分析的材料是富马酸福莫特罗的二水合物多晶型，如Tajber等人和Jarring等人所报道的(Vehring等人，2012年；Trivedi等人，2012年)。福莫特罗的调整的DSC热流热热谱显示在118.2℃和143.54℃处存在两个吸热熔融峰，如图14所示。当通过mDSC反向热流分析时，富马酸福莫特罗的热谱在111.4℃、123.1℃和139.1℃处显示三个吸热峰。Tajber等人还已经研究了富马酸福莫特罗的热力学特性，并报道了对三个熔融峰的发现。第一和最大峰存在于约122℃，预期为脱水事件。后两个峰出现在约130℃和150℃处。气流粉粹的福莫特罗的PXRD图形显示该材料主要保持结晶形式，其中峰值衍射仅表现出轻微的强度降低，如图18H所示。mDSC曲线证实了微粉化材料的结晶状态，显示在118.3℃处的第一峰和在142.3℃处的第二峰(图14)。

当进行PXRD分析时，TFF For_Man粉末显示出小峰衍射，从而指示存在晶体结构(图17H)。材料的结晶性还通过在161.2℃下存在单一吸热熔融峰来证实，这可能与甘露醇的熔化有关。没有观察到福莫特罗的熔融峰，这表明材料处于非晶形状态(图15)。对TFFFor_Lac粉末的mDSC反向热谱分析显示在152.9℃的重结晶峰和在163.8℃的跟随(following)熔融峰。mDSC热流热谱显示在158.4℃处的熔融峰以及在67.19℃处的峰，67.19℃处的峰可以表示制剂的玻璃化转变温度(图16)。PXRD证实了显示出晕图形、不存在结晶峰的的粉末的非晶形特征(图17M)。

4.三联药物组合

与TFF单一药物制剂非常相似，TFF BTF_Man的PXRD图形已经显示为表现出小强度衍射峰的晶体(图17I)。BTF_Man粉末的mDSC热谱显示在141.2℃处的放热重结晶峰，继之以是两个吸热峰。第一和最大峰存在于165.4℃处，最可能对应于甘露醇的熔化，并且第二峰存在于236.5℃处，可能表示布***的熔化(图15)。此外，TFF BTF_Lac粉末表现出宽且扩散的晕圈，但没有特征性结晶峰，这指示非晶形结构。mDSC热谱曲线具有非晶形制剂的特征，在130.9℃和170.0℃处显示两个放热重结晶峰。这之后是两个吸热熔融峰，在207.2℃的吸热熔融峰可能与乳糖的熔化相关，而在245.7℃的吸热熔融峰对应于布***的熔化。不希望受任何理论约束，据信由于在制剂中存在最大量的乳糖和布***这些材料，乳糖和布***峰将在三联组合制剂的表征中更加明显。

C.通过FTIR分析样品

OH拉伸振动的IR频率受这些基团的氢键键合的影响。然而，药物的二元和三元混合物的OH拉伸区域由来自热激发对乳糖和甘露醇的这些振动模式的影响的宽包络(envelope)支配。因此，难以确定是否由于该光谱区域中的氢键键合相互作用而存在偏移。相比之下，IR光谱的羰基拉伸区域提供了对药物的这些官能团的可能氢键键合相互作用的某种了解。在噻托溴铵的情况下，在二元Tio_Lac制剂中存在酯羰基拉伸频率的从1749cm^-1到1729cm^-1的显著20cm^-1偏移。在二元Tio_Man制剂中观察到了从1749cm^-1到1734cm^-1的约15cm^-1的较小羰基偏移。这些偏移与氢键键合相互作用相当，这导致羰基拉伸频率降低，如图19所示。除了如通过该羰基拉伸频率偏移所证明的噻托溴铵和乳糖之间明显较强的氢键键合相互作用外，相互作用的进一步证据来自对IR光谱的较低频率区域的分析。该区域中最显著的特征是在Tio_Lac制剂中明显不存在乳糖的约900cm^-1至870cm^-1条带。这些条带在原料乳糖中消除，但在TFF过程乳糖中表现为单个宽条带。在二元混合物中，这些条带可能偏移到约860cm^-1，尽管在单独的噻托溴铵的光谱中也出现860cm^-1条带，但是没有来自二元制剂的条带那么强烈。因为IR光谱的该区域由具有实质耦合的跃迁组成，所以难以对该带的起源进行确定的分配，并且因此难以对导致其光谱变化的相互作用的性质进行确定的分配。然而，鉴于噻托溴铵羰基氢键的证据，不希望受任何理论约束，据信这种变化是由于与乳糖的氢键键合相互作用(图19)。

二元For_Lac和Bud_Lac制剂的IR光谱显示在羰基区域中更适度的偏移。在福莫特罗的情况下，1687cm^-1处的羰基拉伸带略微偏移至1660cm^-1，伴随着强度的显著降低。布***的饱和酮羰基拉伸带在二元制剂中从1722cm^-1略微移动到1712cm^-1。类似地，二烯酮羰基也在所述二元制剂中从1666cm^-1稍微移动到1650cm^-1。这些偏移表明在所述二元制剂中存在与这些羰基的最小氢键键合。

BTF_Lac制剂的IR光谱由主要组分布***支配，并且相对于对应的二元药物-乳糖制剂在羰基拉伸峰位置几乎没有变化。

在具有甘露醇的制剂的情况下，出现与IR光谱的分析略微不同的图像。在二元药物-甘露醇混合物中，当与单独的药物的光谱相比时，羰基拉伸带存在轻微变化，如图20所示。例如，噻托溴铵羰基带从1749cm^-1偏移到1734cm^-1，福莫特罗甲酰胺羰基带从1687cm^-1偏移到1664cm^-1，但是布***饱和酮羰基带在1723cm^-1处保持不变。相比之下，在三元制剂中，布***的饱和酮羰基带甚至进一步偏移到比二元混合物的情况下更低的频率，从1717cm^-1至1710cm^-1。相比之下，布***的二烯酮羰基带与二元混合物相比保持不变。共同地，与乳糖三元混合物的情况(其几乎没有相互作用的证据)相反，这些IR带偏移表明在甘露醇中的三元混合物中存在涉及布***的显著的氢键相互作用。

用乳糖制备的物理混合物制剂(BTF_Lac_PM)的IR光谱由福莫特罗的条带支配，尽管事实上福莫特罗是制剂中按重量计的最少组分。不希望被任何理论束缚，据信该结果可能是由于粉末制剂的低含量均匀度，这可能产生同样不均匀的KBr盘。因此，KBr盘的在FTIR光束中的部分主要是福莫特罗，从而产生类似于福莫特罗光谱的光谱。相比之下，含有甘露醇的物理混合物具有与预期的原始药物相比不变的羰基带。显示所有TFF制剂的羰基拉伸频率偏移的FTIR光谱变化的汇总呈现于表6中。

表6：对显示所有TFF制剂的羰基拉伸频率偏移的FTIR光谱变化的汇总。

D.制剂的体外气溶胶性能和NGI上的沉积均匀

使用54L/min的NGI和干粉吸入器装置评估TFF制剂和物理混合物的空气动力学粒度分布。用乳糖制备的三联组合粉末制剂(BTF_Lac)的粒度分布示于图21A中。重要的是，对制剂中存在的所有三种药物的百分比逐阶段分配的分析没有统计学差异。从稀释的药物溶液制备薄膜冷冻粉末，其被快速冷冻，然后冻干(Parikh等人，2012年)。所得的饼粉末是均质和多孔的，其在吸入气流下能够容易地分散。因此，结果与以下假设一致：制剂的每个组分将均匀分布在整个冻干饼中，并因此在雾化时均质地分散。注意到了所有三种组分的以FPF百分比计的值的较小差异，对于福莫特罗、噻托溴铵和布***，分别为31.65±10.25、26.18±0.67和33.08±9.19％，如表7所示。

表7：所有三联疗法制剂中每种药物的喷射剂量和细颗粒分数。

用甘露醇制备的三联组合制剂(BTF_Man)的空气动力学粒度分布示于图21B中。对制剂中存在的三种药物的百分比逐阶段粉末沉淀没有统计学差异。还在FPF百分比值中观察到了分布相似性，对于福莫特罗、噻托溴铵和布***，FPF百分比值分别为52.95±3.91％、52.96±3.48％、和53.60±2.89％(表7)。BTF_Man制剂呈现最大FPF百分比，而不管BTF_Lac制剂的较高比表面积(SSA)和孔隙度。不希望受任何理论约束，据信BTF_Lac的劣质性能可能与颗粒表面的水吸附有关，其在非晶形粉末上起到增塑剂的作用。在一些情况下，当制备TFF制剂时，可能需要在受控的低湿度环境中处理粉末以及乳糖。由于事实上脆饼粉末容易分散并从干粉吸入器和胶囊中排出(Watts等人，2013年)，两种TFF三联组合制剂的喷射剂量高于90％。

当单独雾化时，用单一药物制备的每种TFF制剂的阶段分布和气溶胶性能在统计学上不同。阶段1的差异特别显著，其中对于乳糖和甘露醇制剂，沉积的噻托溴铵的量几乎是福莫特罗和布***的量的两倍，如图22A和图22B所示。单一药物TFF制剂之间的气溶胶性能差异也由FPF值证实，如表8所示。用乳糖制备的福莫特罗、噻托溴铵和布***制剂(For_Lac、Tio_Lac和Bud_Lac)的FPF百分比分别为55.51±5.79％、22.56±5.75％和58.67±4.28％。此外，用甘露醇制备的福莫特罗、噻托溴铵和布***(For_Man、Tio_Man和Bud_Man)的FPF沉积百分比分别为58.32±5.99％、37.45±0.71％和64.62±1.28％，显示出了显著的差异。用甘露醇制备的单一药物比用乳糖制备的制剂呈现更大的FPF百分比。这种现象符合以下假设：吸湿性乳糖制剂对粉表面的水吸附和冻干饼结构的后塌陷敏感。用噻托溴铵制备的TFF制剂呈现最小的FPF和SSA值，这可能与粉末物理化学特性相关。

表8：所有单一药物制剂的喷射剂量和细颗粒分数百分比。

因此，噻托溴铵可负责由三联组合制剂产生的低雾化性能和FPF值。这些结果意味着当患者用多次施用单一药物制剂治疗时，他们可能不会受益于药物在肺中的共沉积和潜在的协同作用(Sin和Man，2007年；Nelson等人，2003年)。与三联组合TFF制剂类似，对于所有单一药物制剂，观察到来自吸入器的喷射剂量的高百分比值，这是TFF粉末的特征(表8)。

还研究了通过将气流粉碎的药物粉末与粗乳糖或甘露醇(BTF_Lac_PM和BTF_Man_PM)颗粒物理共混制备的三联组合制剂的阶段分布和气溶胶性能的差异。BTF_Man_PM制剂的逐阶段粉末沉积显著不同，如图23B所示。三种药物呈现彼此不同的沉积百分比，其中高百分比的粉末沉积在吸入口中。虽然所有三种药物在级联撞击器阶段的沉积百分比显著不同，但是BTF_Man_PM制剂的所有三种药物的FPF百分比类似，对于福莫特罗、噻托溴铵和布***分别呈现值26.36±03.84％、28.65±0.30％和25.80±1.96％(表7)。此外，由于在BTF_Man_PM和BTF_Lac_PM两种制剂雾化后的胶囊中剩余大量粉末，所以对于BTF_Man_PM和BTF_Lac_PM，喷射的剂量百分比值从大于90％降低至约70％至80％，如表7所示。物理混合物制剂的较低喷射剂量和较高颈部沉积可能促进具有过低或过高剂量可能性的可变剂量。如果粉末混合物由强效药物组成，则这一事实增强(Weers等人，2010年；French等人，1996年)。

BTF_Lac_PM制剂的逐阶段粉末沉积没有统计学上的差异，如图23A所示。BTF_Lac_PM还显示出低雾化性能，对于福莫特罗、噻托溴铵和布***分别呈现28.64±3.89％、25.22±3.56％和25.05±5.82％的FPF百分比值。然而，阶段3至5的沉积(其粒度在1-3μm沉积物之间并且具有到达深肺的最高概率)对于TFF制剂比对于BTF_Lac_PM更均质。此外，用乳糖和甘露醇制备的物理混合物之间的粉末雾化性能差异表明制备过程缺乏稳健性。不希望受任何理论约束，据信物理混合物制剂的低气溶胶性能可能与颗粒的粒度和表面特性有关，并导致不完全的粉末分散和气溶胶性能的变化，这可能影响肺部药物递送(Hickey等人，2007年；Zeng等人，1998年)。

***

本文公开和要求保护的所有组合物和方法可以根据本公开在没有不适当的实验的情况下进行和执行。虽然已经根据优选实施方案描述了本公开的组合物和方法，但是对于本领域的技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下，可以对所述组合物或方法以及本文所述的方法的步骤或步骤序列施以改变。更具体地，显然本文所述的试剂可以用化学和生理上相关的某些试剂代替，而实现相同或相似的结果。对本领域的技术人员显而易见的所有此类类似的替代和修改被认为在如由随附权利要求书定义的发明的精神、范围和构思内。

参考文献

以下参考文献，以其提供补充本文所阐述的那些程序或细节的示例性程序或其他细节的程度，以引用方式特别地并入本文。

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Claims

1.一种药物组合物，包含以下中的任一种：

i.长效β-激动剂(LABA)；

ii.长效毒蕈碱拮抗剂(LAMA)；以及

iii.皮质类固醇(CS)；或

i.长效β-激动剂(LABA)；以及

ii.皮质类固醇(CS)；

其中所述药物组合物被配制成具有大于5m²/g的比表面积的脆性基质颗粒。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其进一步包括一种或多种赋形剂。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述赋形剂是糖、糖衍生物或者氨基酸。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述赋形剂是糖或者糖衍生物。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述赋形剂是乳糖、甘露醇或者海藻糖。

6.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述赋形剂是氨基酸。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述赋形剂是甘氨酸。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的药物组合物，其中所述长效β-激动剂是沙美特罗盐或者福莫特罗盐。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述长效β-激动剂是羟萘酸沙美特罗。

10.根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述长效β-激动剂是富马酸福莫特罗。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的药物组合物，其中所述皮质类固醇是糠酸莫米松或者布***。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的药物组合物，其中所述长效毒蕈碱拮抗剂是噻托溴铵盐。

13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述长效毒蕈碱拮抗剂是噻托溴铵。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的药物组合物，其中所述双重疗法包括在所述组合物中约1:0.1至约1:100的所述长效β-激动剂比所述皮质类固醇的重量比。

15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述双重疗法具有约5:22的所述长效β-激动剂比所述皮质类固醇的重量比。

16.根据权利要求1至12中任一项所述的药物组合物，其中所述三联疗法包括在所述组合物中约1:0.1:0.1至约1:100:100的所述长效β-激动剂比所述长效毒蕈碱拮抗剂比所述皮质类固醇的重量比。

17.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述三联疗法重量比是约1:2:35.5的所述长效β-激动剂比所述长效毒蕈碱拮抗剂比所述皮质类固醇。

18.根据权利要求1至12、16或17中任一项所述的药物组合物，其中所述三联疗法包括在所述组合物中约1:0.1至约1:100的所述长效β-激动剂比所述长效毒蕈碱拮抗剂的重量比。

19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述三联疗法重量比为约1:2的所述长效β-激动剂比所述长效毒蕈碱拮抗剂。

20.根据权利要求1至12或16或19中任一项所述的药物组合物，其中所述三联疗法包括在所述组合物中约1:0.1至约1:100的所述长效β-激动剂比所述皮质类固醇的重量比。

21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述三联疗法重量比为约2:70的所述长效β-激动剂比所述皮质类固醇。

22.根据权利要求1至12或16或21中任一项所述的药物组合物，其中所述三联疗法包括在所述组合物中约1:0.1至约1:1000的所述长效毒蕈碱拮抗剂比所述皮质类固醇的重量比。

23.根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述三联疗法重量比是约4:70的所述长效毒蕈碱拮抗剂比所述皮质类固醇。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物具有在所述组合物中约1:0至约1:9的所述双重疗法或所述三联疗法比所述赋形剂的摩尔比。

25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述摩尔比是约1:1的所述双重疗法或所述三联疗法比所述赋形剂。

26.根据权利要求1至25中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制成单位剂量。

27.根据权利要求1至25中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物的所述单位剂量包括约1至约500μg的所述长效β-激动剂的剂量。

28.根据权利要求27所述的药物组合物，其中当所述长效β-激动剂是羟萘酸沙美特罗时，所述长效β-激动剂的所述剂量是约50μg。

29.根据权利要求27所述的药物组合物，其中当所述长效β-激动剂是富马酸福莫特罗时，所述长效β-激动剂的所述剂量是约4.5μg。

30.根据权利要求1至25中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物的所述单位剂量包含约1至约100μg的所述长效毒蕈碱拮抗剂的剂量。

31.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述长效毒蕈碱拮抗剂的所述剂量是约9μg。

32.根据权利要求1至25中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物的所述单位剂量包含约1至约1000μg的所述皮质类固醇的剂量。

33.根据权利要求32所述的药物组合物，其中当所述皮质类固醇是糠酸莫米松时，所述皮质类固醇的所述剂量是约220μg。

34.根据权利要求32所述的药物组合物，其中当所述皮质类固醇是布***时，所述皮质类固醇的所述剂量是约160μg。

35.根据权利要求1至33中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制成通过气溶胶鼻内施用至肺，或者通过吸入来施用。

36.根据权利要求1至33中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制成在吸入器中使用。

37.根据权利要求36所述的药物组合物，其中所述吸入器是定量吸入器、干粉吸入器、单剂量吸入器、多单位剂量吸入器、雾化器、或者加压定量吸入器。

38.根据权利要求1至37中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物是包含羟萘酸沙美特罗和糠酸莫米松的所述双重疗法。

39.根据权利要求1至37中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物是包含富马酸福莫特罗、噻托溴铵和布***的所述三联疗法。

40.根据权利要求1至39中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物具有约5m²/g至约1000m²/g的比表面积。

41.根据权利要求40所述的药物组合物，其中所述药物组合物具有约10m²/g至约500m²/g的比表面积。

42.根据权利要求41所述的药物组合物，其中所述药物组合物具有约20m²/g至约250m²/g的比表面积。

43.根据权利要求1至42中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物具有大于85％的总喷射剂量(TED)。

44.根据权利要求43所述的药物组合物，其中所述总喷射剂量(TED)为约90％至约100％。

45.根据权利要求1至44中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物不含任何杂质。

46.根据权利要求1至45中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物实质上不含聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯或者聚苯乙烯。

47.根据权利要求1至46中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物实质上不含任何聚合物赋形剂。

48.根据权利要求1至47中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物实质上不含泊洛沙姆、聚乙二醇或者聚丙二醇。

49.根据权利要求1至48中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物实质上不含任何表面活性剂。

50.根据权利要求1至44中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物不含除了所述赋形剂和所述活性药物组合物以外的其它化合物。

51.一种治疗或预防需要其的患者的呼吸道疾病或病症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的根据权利要求1至39中任一项所述的药物组合物。

52.根据权利要求51所述的方法，其中所述呼吸道疾病或病症是涉及肺或窦发炎的病症。

53.根据权利要求51所述的方法，其中所述呼吸道疾病或病症是哮喘。

54.根据权利要求51所述的方法，其中所述呼吸道疾病或病症是慢性阻塞性肺病。

55.根据权利要求51至54中任一项所述的方法，其中通过吸入施用所述药物组合物。

56.根据权利要求55所述的方法，其中在一次吸入中向所述患者施用所述治疗有效量。

57.根据权利要求55所述的方法，其中在2次或更多次吸入中向所述患者施用所述治疗有效量。

58.根据权利要求57所述的方法，其中在2次、3次或4次吸入中施用所述治疗有效量。

59.根据权利要求51至58中任一项所述的方法，其中所述方法包括每天向所述患者施用一次所述治疗有效量。

60.根据权利要求51至58中任一项所述的方法，其中所述方法包括每天向所述患者施用两次或更多次所述治疗有效量。

61.一种制备脆性基质药物组合物的方法，其包括：

(A)将两种或更多种活性药剂混合到溶剂中以形成药物组合物，其中所述溶剂包括有机溶剂和水，其中所述药物组合物包含所述溶剂中约0.01％至约10％(w/v)的所述活性药剂的量；

(B)将所述药物组合物涂覆至旋转表面，其中所述表面处于约-70℃至约-120℃的温度；以及

(C)冷冻所述药物组合物以形成脆性基质药物组合物。

62.根据权利要求61所述的方法，其中所述活性药物成分选自长效β-激动剂、长效毒蕈碱拮抗剂、和皮质类固醇。

63.根据权利要求61或权利要求62所述的方法，其中所述药物组合物进一步包含一种或多种赋形剂。

64.根据权利要求61至63中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括冻干所述脆性基质药物组合物。

65.根据权利要求61至64中任一项所述的方法，其中所述量为约0.01％(w/v)至约6％(w/v)。

66.根据权利要求65所述的方法，其中所述量为约0.1％(w/v)至约5％(w/v)。

67.一种根据权利要求61所述的方法制备的药物组合物。