CN107604043B - 基因组隔离子的高通量鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基因组隔离子的高通量鉴定方法，包括：1)构建报告载体：报告载体依次具有启动子、ORF区、内含子和隔离子候选序列***区和增强子；增强子用于增强上游序列的表达，隔离子候选序列***区***有隔离子候选序列；2)将报告载体表达转录；3)检测转录序列的编辑后转录情况，确定隔离子候选序列是否为隔离子。该方法构建的报告载体库可以覆盖90％到99％的基因组非编码区，不需要蛋白位置信息，全部分析；将所构建的库转入细胞内，可以同时检测几乎整个基因组序列是否具有隔离子活性，可以大规模并行分析，避免单个、少量的分析；因为所构建库覆盖几乎所有位点，因此未知区域同样可以被检测分析。
Description
技术领域
本发明涉及基因组学，特别涉及基因组隔离子的高通量鉴定方法。
背景技术
随着人类基因组计划的完成，精准医疗概念的形成和逐渐成熟，人们对于基因组本身功能的知识有了越来越全面的要求，然而实际上科学家对于基因组功能的认识却远远落后于现实的需求，以致目前的精准医疗更多地流于概念而难以真正落实，或者落实下来基础不稳。
除基因之外，关于占人类基因组98％的非编码序列的功能知识严重缺乏，如何分析并确定基因组序列的潜在功能是生物学重大的理论问题，也是应用的基础。隔离子调控元件是真核生物基因组一类重要的DNA序列，它们最重要的功能之一是通过隔离增强子元件，从而使基因组实现特异地、有选择地激活靶基因。
现有隔离子的功能性鉴定是小规模，零散的少量DNA序列的分析；大规模的隔离子功能元件的鉴定技术未见报道，仅有通过结合蛋白进行预测的方法，这类方法因为不是根据功能进行的分析，因此具有极大的不确定性和不可靠性。其不足主要表现在如下3个方面：
第一，依赖现有隔离子蛋白结合位点信息来预测，如无蛋白结合信息，则无法预测；
第二，所预测的位点是否有功能，只能单个测定，无法大规模分析；
第三，对非隔离子蛋白结合的区域是否具有隔离子功能，既不能预测，也不能分析。
如何高效地鉴定出隔离子是亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基因组隔离子的高通量鉴定方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种鉴定基因组隔离子的方法，包括：
1)构建报告载体：报告载体依次具有启动子、ORF区、内含子和隔离子候选序列***区和增强子；增强子用于增强上游序列的表达，隔离子候选序列***区***有隔离子候选序列；
2)将报告载体表达转录；
3)检测转录序列的编辑后转录情况，确定隔离子候选序列是否为隔离子。
作为上述方法的进一步改进，隔离子候选序列***区和增强子之间还***有RNA稳定序列。进一步的，RNA稳定序列为poly-A序列。
作为上述方法的进一步改进，隔离子候选序列通过基因文库构建。
作为上述方法的进一步改进，报告载体以文库的方式转入细胞类进行表达转录。
作为上述方法的进一步改进，启动子选自人工合成启动子SCP。
作为上述方法的进一步改进，ORF区选自荧光蛋白基因、显色酶基因。
作为上述方法的进一步改进，内含子选自人工合成内含子序列。
作为上述方法的进一步改进，增强子选自病毒SV40增强子、CMV增强子。
本发明的有益效果是：
本发明方法具有如下有优点：
第一，构建的报告载体库可以覆盖90％到99％的基因组非编码区，不需要蛋白位置信息，全部分析；
第二，将所构建的库转入细胞内，可以同时检测几乎整个基因组序列是否具有隔离子活性，可以大规模并行分析，避免单个、少量的分析；
第三，因为所构建库覆盖几乎所有位点，因此未知区域同样可以被检测分析。
附图说明
图1是本发明技术的原理示意图；
图2是果蝇的部分染色体示意图。
具体实施方式
一种鉴定基因组隔离子的方法，包括：
1)构建报告载体：报告载体依次具有启动子、ORF区、内含子和隔离子候选序列***区和增强子；增强子用于增强上游序列的表达，隔离子候选序列***区***有隔离子候选序列；
2)将报告载体表达转录；
3)检测转录序列的编辑后转录情况，确定隔离子候选序列是否为隔离子。
作为上述方法的进一步改进，隔离子候选序列***区和增强子之间还***有RNA稳定序列。进一步的，RNA稳定序列为poly-A序列。通过增加稳定RNA的保护序列，可以使得转录得到的RNA能稳定存在更长的时间，便于后续的鉴定操作。
作为上述方法的进一步改进，隔离子候选序列通过基因文库构建。
作为上述方法的进一步改进，报告载体以文库的方式转入细胞类进行表达转录。
文库可以使用现有方法制备得到，如抽提纯化基因组DNA，超声打断并回收500～600bp大小范围的片段，修复后通过同源重组的方式克隆进入质粒载体。小量转化大肠杆菌，确定转化效率达到约10^7～10^8/μg(克隆数/质粒量)后大批量转化大肠杆菌，在液态培养基中增长到对数扩增前期收集细菌并抽提质粒。以少量质粒扩增***片段区进行二代测序确定质粒库的复杂性(无质粒的大量重复扩增)和对基因组覆盖程度(超过85％或更高)。达到要求的质粒文库可以用来下一步实验。
启动子的序列无特殊要求，只要可以正常启动基因的转录即可。考虑到启动子来源的简便性，作为上述方法的进一步改进，启动子选自人工合成启动子SCP。
作为上述方法的进一步改进，ORF区选自荧光蛋白基因、显色酶基因。这样可以方便地根据显色反应，如荧光，或底物的显色反应，初步判断出隔离子候选序列是否具有隔离子功能。
内含子序列无特殊要求，可以天然存在的，也可以是人工合成的，只要能在所转染的细胞中被剪切即可。作为上述方法的进一步改进，内含子选自人工合成内含子序列。
增强子的序列无特殊要求，只要能增强启动子的活性即可。考虑到来源和操作的简便性等，作为上述方法的进一步改进，增强子选自病毒SV40增强子、CMV增强子。
Insulator candidate(隔离子候选序列)为随机***的基因组片段，这需要10^8-9(一亿到数十亿)的独立片段***其余部分相同的载体骨架内，从而构建覆盖整个基因组非重复区的报告载体库。
下面结合图1，进一步说明本发明技术的原理。
在候选序列不具有隔离子活性时，由ORF序列-Intron(内含子)-隔离子候选序列-多聚A位点序列会在增强子的作用下发生转录，转录出来的RNA拷贝和载体拷贝数正相关，转录之后会剪切掉内含子，从而变为虚线箭头指向的状态，转录编辑后的序列；
如果候选序列具有隔离子活性，则会阻隔下游增强子对启动区域的激活(红色STOP标记所示)，从而使转录出来的RNA拷贝数下降。
因为隔离子候选序列会存在所转录出来的RNA内部，所以相当于自我转录并充当自己的序列标记，从而可以知道RNA和DNA载体间的一一对应关系。
分离纯化所转的报告载体DNA，分离纯化转录剪切后的RNA，构建可以用于大规模测序的库，测序，并分析，实现高通量的隔离子鉴定。
下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。
如图2所示，上方黄色部分为所分析的果蝇基因组2号染色体R臂5172760-5193360这一20kb范围内的基因，中间为RNA测序的拷贝数，高低显示所对应区域从载体转录出来的多少，下面为载体内隔离子候选序列对应该区域的拷贝数，比较RNA和候选序列拷贝数可以发现大部分区域有着非常好的正相关的关系，但是在两条红色竖虚线中间的位置，载体候选序列的拷贝数明显高于所转录出来的RNA拷贝数，这说明含有这段序列在报告载体中阻断了下游增强子的活性，从而导致转录下降，使得对应这段序列的RNA拷贝数明显下降。
实验结果表明本发明的方法可以很好地鉴定出基因组中的隔离子。
Claims (8)
1.一种鉴定基因组隔离子的方法，包括：
1)构建报告载体：报告载体依次具有启动子、ORF区、内含子、隔离子候选序列***区、RNA稳定序列和增强子；增强子用于增强上游序列的表达，隔离子候选序列***区***有隔离子候选序列；
2)将报告载体表达转录；
3)检测转录序列的编辑后转录情况，确定隔离子候选序列是否为隔离子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：RNA稳定序列为poly-A序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：隔离子候选序列通过基因文库构建。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：报告载体以文库的方式转入细胞类进行表达转录。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：启动子选自人工合成启动子SCP。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：ORF区选自荧光蛋白基因、显色酶基因。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：内含子选自人工合成内含子序列。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：增强子选自病毒SV40增强子、CMV增强子。
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