CN105483270A - 一种应用于矮马遗传多样性检测的微卫星标记方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种应用于矮马遗传多样性检测的微卫星标记方法，该方法包括如下步骤：矮马基因组PCR文库创建；磁珠法进行微卫星序列筛选；矮马微卫星标记序列分类与验证。矮马基因组PCR文库创建时用获得的DNA片段作为模板，设计引物（5ˊ-GATCGTCGACGGTACCGAATTCT；5ˊ-GTCAAGAATTCGGTACCGTCGAC），进行PCR扩增，创建基因组PCR文库。本发明能够快速、有效、大量的获得应用于矮马遗传多样性检测的微卫星标记。
Description
技术领域
本发明属于动物分子遗传学技术领域,具体涉及矮马的微卫星DNA标记技术。
背景技术
微卫星是近十几年来发展起来的一种新的分子标记，它是指以少数几个核苷酸(1~6个)为单位多次重复的简单序列，其中以双核苷酸重复最为常见。应用于相关种群的遗传多样性检测和遗传图谱的构建。目前微卫星序列的获得主要有两种途径：一种是用经典的分子生物学方法构建富含有微卫星位点的基因组文库，通过杂交筛选出含有微卫星序列的阳性克隆，但是筛选过程较复杂，筛选效率低，需要大量的人力和资金的投入；另一种是从已知的核酸序列中进行检索，但是可检索的资源相对有限。中国矮马是我国的珍稀濒危物种，对其遗传多样性的评价具有重要意义。目前，涉及矮马的微卫星分离制备方法还十分少见。因此，寻求新的矮马微卫星分离方法十分重要。
目前本领域技术人员能够获知的比较相近的已公开技术主要有如下这些：
1、申请号号为01106477.3，名称为适用于猪品种分类的猪微卫星DNA标记的公开中国发明专利文献，该发明的特征是,构建部分小***片段基因组文库,分离鉴定猪新微卫星标记,筛选其中适用于猪品种分类的猪微卫星标记HAU01、HAU02、HAU03,确定了该三个微卫星标记DNA顺序,设计了三个位点的引物。该发明为猪的品种分类、亲缘鉴定和标记辅助育种提供新的分子标记。
2、申请号为201410022080.0，名称为草鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法的中国公开专利文献，该发明利用微卫星标记与多重荧光PCR技术结合，筛选了13个高度多态性微卫星位点，组建3个多重荧光PCR体系，通过测序仪分型，对草鱼家系进行高通量个体识别和亲子关系分析；本发明的建立为草鱼种质鉴定、家系管理和增殖放流效果评估提供了一种新的技术手段。
以上这些这些技术的缺点是：应用多种内切酶共同切割基因组DNA的方法。此方法可以产生比较理想的片段，得到足够的侧翼序列来设计引物，但是如果用多酶切会产生不是平端的酶切产物，产物需要进行末端补平。
发明内容
本发明拟通过构建微卫星DNA文库、微卫星序列筛选、引物设计与优化和微卫星检测等步骤来实现来获得可靠的微卫星标记序列，为中国矮马的遗传多样性检测提供分子标记手段。
本发明是这样实现的：
一种应用于矮马遗传多样性检测的微卫星标记方法，该方法包括如下步骤：
步骤1：矮马基因组PCR文库创建；
步骤2：磁珠法进行微卫星序列筛选；
步骤3：矮马微卫星标记序列分类与验证。
其中，步骤1中矮马基因组PCR文库创建包括如下步骤：
步骤1.1：矮马基因组DNA的提取；
步骤1.2：超声波破碎基因组DNA；
步骤1.3：根据目的片段的大小调整样本处理仪参数；
步骤1.4：超声波破碎后的DNA电泳检测；
步骤1.5：创建基因组PCR文库。
步骤1.5中，用获得的DNA片段作为模板，设计引物（5'-GATCGTCGACGGTACCGAATTCT；5'-GTCAAGAATTCGGTACCGTCGAC），进行PCR扩增，创建基因组PCR文库。
步骤2中磁珠法进行微卫星序列筛选包括如下步骤：
步骤2.1：用生物素标记的微卫星探针和Dynal磁珠与微卫星文库杂交；
步骤2.2：磁珠的平衡；
步骤2.3：磁珠吸附富集；
步骤2.4：捕获含有微卫星序列的单链DNA并进行PCR扩增；
步骤2.5：连接T-载体，克隆；
步骤2.6：原位杂交，用同位素探针进行二次筛选。
步骤2.1采用以下方法实现：根据实验材料建立50μL反应体系,1.5μL生物素标记的(CA)15探针、5μL(50μmol/L)引物、15μL20×SSC、0.5μL10%SDS和16μLddH2O，混合，68℃预热；将12μL(276ng)DNA95℃变性5min，加入预热的杂交混合液，68℃杂交1h；杂交过程中平衡磁珠。
步骤2.4采用以下方法实现：用200μL0.1×TE在室温快速洗2次，加入50μL0.1×TE95℃变性10min,释放出含有微卫星序列的单链DNA，放在磁力架上吸出备用；PCR反应体系25μL，内含4种dNTP的混合PCR缓冲液18μL,引物0.5μL,TaqDNA聚合酶0.5μL,根据DNA模板的浓度加入不多于4μL的模板，加无菌水补足PCR仪进行扩增；反应完毕后，过旋离柱以去除多余的引物和没有参加反应的dNTP，并浓缩到15μL左右，电泳检测。
步骤2.5采用以下方法实现：建立10μL连接反应体系：2×连接酶缓冲液5μL,pGEM-Tvector1μL，***DNA片段2μL，T4DNA连接酶1μL(3U/μL)，加无菌去离子水补足10μL，同时T载体自身连接作为对照，4℃连接过夜；用CaCl2制备的感受态大肠杆菌DH5a进行转化，得到微卫星基因组文库。
步骤2.6采用以下方法实现：通过原位杂交对微卫星文库进行二次筛选；将转化所得的克隆转化到杂交膜上，同时保留完全相同大小的菌板，以待杂交结果出来后挑取阳性克隆；用同位素标记的(CA)15进行杂交，压X光片，70℃放射自显影7d；挑取阳性克隆进行测序分析。
步骤3中矮马微卫星标记序列分类与验证包括如下步骤：
步骤3.1：序列分类；
步骤3.2：微卫星标记序列的重复性、稳定性、多态性检验。
本发明的技术效果是能够快速、有效、大量的获得应用于矮马遗传多样性检测的微卫星标记。此方法所获得的矮马微卫星标记还可应用于矮马遗传图谱的构建和其它分子生物学、分子生态学检测。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，实施例中有关数量份数、百分比、数量比例等，若无特殊说明，均指质量单位。
实施例1：
具体步骤如下：
一、矮马基因组PCR文库创建：
1、矮马基因组DNA的提取：
将5ml新鲜矮马血液或经EDTA抗凝的冷冻矮马血样（或肌肉组织），应用基因组试剂盒提取基因组DNA,然后用分光光度计检测定量。
2、超声波破碎基因组DNA：
将100μL、2μg基因组DNA放入自动聚焦声波样本处理仪Covaris220（美国Covaris公司）专用小玻璃管(520045)中，盖好备用。
3、根据目的片段的大小调整样本处理仪参数：
目的片段为300~500bp之间，Covaris220操作软件中参数设置如下：Dutyfactor10%,peakincidentpower140W,CycleperBrust200,Tim80s.
4、超声波破碎后的DNA电泳检测：
将破碎后的DNA用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，然后用凝胶成像***进行观察分析，将峰值在300bp左右的DNA，用生物分析仪进行DNA破碎效果检测。
5、创建基因组PCR文库：
用获得的DNA片段作为模板，设计引物（5'-GATCGTCGACGGTACCGAATTCT；5'-GTCAAGAATTCGGTACCGTCGAC），进行PCR扩增，创建基因组PCR文库。PCR反应体系为：94℃预变性3min，94℃1min，58℃1min，72℃1min，30个循环，最后72℃延伸10min。反应完毕后，过旋离柱以去除多余的引物和没有参加反应dNTP，并浓缩到15μL左右。电泳检测。
二、磁珠法进行微卫星序列筛选：
1、用生物素标记的微卫星探针和Dynal磁珠与微卫星文库杂交：
根据实验材料建立50μL反应体系,1.5μL(10μmol/L)生物素标记的(CA)15探针、5μL(50μmol/L)引物、15μL20×SSC、0.5μL10%SDS和16μLddH2O，混合，68℃预热。将12μL(276ng)DNA95℃变性5min，加入预热的杂交混合液，68℃杂交1h。杂交过程中平衡磁珠。
2、磁珠的平衡：
将磁珠轻轻摇匀，吸出100μL到500μL的硅化离心管中，放在磁力架上1~2min，轻轻吸出盐溶液。用200μLB&W洗液洗涤2次,再用200μL洗液Ｉ（6×SSC和0.1%SDS）反复洗涤平衡，直到磁珠表面变得顺滑易洗脱。加入200μL洗液Ⅰ，室温放置直到杂交完毕。
3、磁珠吸附富集：
将杂交完毕的杂交液加入已平衡好的新鲜磁珠中，25℃温育20min，并轻轻摇动使生物素和链霉亲和素充分结合。温育结束后，将离心管放置到磁力架上，去除溶液。依次用洗液Ｉ，洗液II，洗液III洗涤磁珠，去除不含有微卫星的序列。洗涤方法是：洗液I在室温洗2次，每次静置10min；洗液II在68℃洗2次，每次静置15min；洗液III在室温快速洗2次，即可基本将不含微卫星的序列去除干净。
4、捕获含有微卫星序列的单链DNA并进行PCR扩增：
用200μL0.1×TE在室温快速洗2次，加入50μL0.1×TE95℃变性10min,释放出含有微卫星序列的单链DNA，放在磁力架上吸出备用。PCR反应体系25μL，内含4种dNTP的混合PCR缓冲液18μL,引物0.5μL,TaqDNA聚合酶0.5μL,根据DNA模板的浓度加入不多于4μL的模板，加无菌水补足PCR仪进行扩增。反应完毕后，过旋离柱以去除多余的引物和没有参加反应的dNTP，并浓缩到15μL左右，电泳检测。
5、连接T-载体，克隆：
建立10μL连接反应体系：2×连接酶缓冲液5μL,pGEM-Tvector1μL，***DNA片段2μL，T4DNA连接酶1μL(3U/μL)，加无菌去离子水补足10μL，同时T载体自身连接作为对照，4℃连接过夜。用CaCl2制备的感受态大肠杆菌DH5a进行转化，得到微卫星基因组文库。
6、原位杂交，用同位素探针进行二次筛选：
通过原位杂交对微卫星文库进行二次筛选。将转化所得的克隆转化到杂交膜上，同时保留完全相同大小的菌板，以待杂交结果出来后挑取阳性克隆。用同位素标记的(CA)15进行杂交，压X光片，70℃放射自显影7d(可视信号强弱增减放射自显影的时间)。挑取阳性克隆进行测序分析。
三、矮马微卫星标记序列分类与验证
1、序列分类：
将上述实验中获得的阳性克隆进行测序分析，按照Weber(1990)提出的测序标准进行分类，计算出完美型、非完美型和混合型的比例，其中完美型的微卫星序列比例应达到60%以上。此外，重复次数10次以上的比例应超过60%。
2、微卫星标记序列的重复性、稳定性、多态性检验：
（1）采集中国五个品种（贵州、云南、陕西、四川、广西）矮马血样每个品种60份，每份5-10ml,EDTA抗凝，-20低温保存备用。矮马的选择标准是5周岁时身高为106cm以下。
（2）根据上述所获得的微卫星标记序列两端互补序列合成引物，进行PCR扩增，根据获得的不同DNA片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)进行区分，AgNo3染色。
（3）根据PAGE结果在凝胶成像***中进行分型，对不同品种矮马的各微卫星标记扩增结果，应用Microsat,Phylip等软件进行有效等位基因数（Ne),杂合度（He)、多态信息含量（PIC)等值计算，综合分析。
（4）对上述获得的微卫星标记在不同矮马品种之间进行重复扩增，通过所获得的目的条带大小、有无扩增结果来评价其微卫星标记的稳定性和重复性。最终选择重复性好、稳定性强、多态信息含量值高的矮马微卫星标记。
当然，以上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。
序列表
SEQUENCELISTING
<110>贵州大学
<120>一种应用于矮马遗传多样性检测的微卫星标记方法
<130>nm:
<160>2
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核苷酸保守序列而设计，用于矮马基因组DNA的PCR扩增
<400>1
gatcgtcgacggtaccgaattct23
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核苷酸保守序列而设计，用于矮马基因组DNA的PCR扩增
<400>2
gtcaagaattcggtaccgtcgac23
Claims (9)
1.一种应用于矮马遗传多样性检测的微卫星标记方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
步骤1：矮马基因组PCR文库创建；
步骤2：磁珠法进行微卫星序列筛选；
步骤3：矮马微卫星标记序列分类与验证。
2.根据权利要求1所述的应用于矮马遗传多样性检测的微卫星标记方法，其特征在于：所述矮马基因组PCR文库创建包括如下步骤：
步骤1.1：矮马基因组DNA的提取；
步骤1.2：超声波破碎基因组DNA；
步骤1.3：根据目的片段的大小调整样本处理仪参数；
步骤1.4：超声波破碎后的DNA电泳检测；
步骤1.5：创建基因组PCR文库。
3.根据权利要求2所述的应用于矮马遗传多样性检测的微卫星标记方法，其特征在于：步骤1.5中，用获得的DNA片段作为模板，设计引物（5'-GATCGTCGACGGTACCGAATTCT；5'-GTCAAGAATTCGGTACCGTCGAC），进行PCR扩增，创建基因组PCR文库。
4.根据权利要求1所述的应用于矮马遗传多样性检测的微卫星标记方法，其特征在于：所述磁珠法进行微卫星序列筛选包括如下步骤：
步骤2.1：用生物素标记的微卫星探针和Dynal磁珠与微卫星文库杂交；
步骤2.2：磁珠的平衡；
步骤2.3：磁珠吸附富集；
步骤2.4：捕获含有微卫星序列的单链DNA并进行PCR扩增；
步骤2.5：连接T-载体，克隆；
步骤2.6：原位杂交，用同位素探针进行二次筛选。
5.根据权利要求4所述的应用于矮马遗传多样性检测的微卫星标记方法，其特征在于：步骤2.1采用以下方法实现：根据实验材料建立50μL反应体系,1.5μL生物素标记的(CA)15探针、5μL(50μmol/L)引物、15μL20×SSC、0.5μL10%SDS和16μLddH2O，混合，68℃预热；将12μL(276ng)DNA95℃变性5min，加入预热的杂交混合液，68℃杂交1h；杂交过程中平衡磁珠。
6.根据权利要求4所述的应用于矮马遗传多样性检测的微卫星标记方法，其特征在于：步骤2.4采用以下方法实现：用200μL0.1×TE在室温快速洗2次，加入50μL0.1×TE95℃变性10min,释放出含有微卫星序列的单链DNA，放在磁力架上吸出备用；PCR反应体系25μL，内含4种dNTP的混合PCR缓冲液18μL,引物0.5μL,TaqDNA聚合酶0.5μL,根据DNA模板的浓度加入不多于4μL的模板，加无菌水补足PCR仪进行扩增；反应完毕后，过旋离柱以去除多余的引物和没有参加反应的dNTP，并浓缩到15μL左右，电泳检测。
7.根据权利要求4所述的应用于矮马遗传多样性检测的微卫星标记方法，其特征在于：步骤2.5采用以下方法实现：建立10μL连接反应体系：2×连接酶缓冲液5μL,pGEM-Tvector1μL，***DNA片段2μL，T4DNA连接酶1μL(3U/μL)，加无菌去离子水补足10μL，同时T载体自身连接作为对照，4℃连接过夜；用CaCl2制备的感受态大肠杆菌DH5a进行转化，得到微卫星基因组文库。
8.根据权利要求4所述的应用于矮马遗传多样性检测的微卫星标记方法，其特征在于：步骤2.6采用以下方法实现：通过原位杂交对微卫星文库进行二次筛选；将转化所得的克隆转化到杂交膜上，同时保留完全相同大小的菌板，以待杂交结果出来后挑取阳性克隆；用同位素标记的(CA)15进行杂交，压X光片，70℃放射自显影7d；挑取阳性克隆进行测序分析。
9.根据权利要求1所述的应用于矮马遗传多样性检测的微卫星标记方法，其特征在于：所述矮马微卫星标记序列分类与验证包括如下步骤：
步骤3.1：序列分类；
步骤3.2：微卫星标记序列的重复性、稳定性、多态性检验。
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