CN107603989B - 发状念珠藻NfgalE抗旱基因及其氨基酸序列和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，特别涉及一种发状念珠藻NfgalE抗旱基因及其氨基酸序列和提高植物抗旱性的应用。发状念珠藻NfgalE抗旱基因，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。该基因的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。所述发状念珠藻NfgalE抗旱基因在提高植物抗旱性中的应用，尤其是在水稻中的应用。实验结果显示经过3天模拟干旱处理后，野生型植株全部卷曲干枯，而转NfgalE水稻长势良好，其中株系OE‑3卷曲率28.7％，株系OE‑4卷曲率为40.3％,说明在水稻中超表达NfgalE基因的确提高了转基因植株对干旱的耐性。

Description

发状念珠藻NfgalE抗旱基因及其氨基酸序列和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别涉及一种发状念珠藻NfgalE抗旱基因及其氨基酸序列和提高植物抗旱性的应用。

背景技术

发状念珠藻(Nostoc flagelliforme)主要分布在北半球的干旱或半干旱的荒漠地区，经常受到极度干旱、较大温差、高浓度盐碱、营养缺乏、UV-B辐射等非生物因素的胁迫。胁迫因子可能会对细胞产生一系列的损伤，包括核酸损伤、蛋白质损伤、膜脂损伤等，从而扰乱正常的细胞代谢。经过长期的环境选择和自身结构功能的适应，发状念珠藻已经进化出一系列的生理生态和分子的机制来抵抗各种逆境。因此，发状念珠藻已经成为研究逆境适应机制和发掘抗逆基因的最佳材料之一。

半乳糖是由乳类食物中的乳糖水解而来，其代谢主要是通过半乳糖激酶(galactokinase,GALK)、半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶(galactose-1-phosphate,uridyltransferase,GALT)、尿苷二磷酸半乳糖-4-差向酶(uridine diphosphate-4-galactose epimerase,GALE)及其所催化的酶促反应转变为葡萄糖而被利用。GALE是半乳糖代谢的最后一步，也是关键的一步，通过UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖之间的转化，偶联糖酵解和TCA循环而完成代谢过程。因此，生物中普遍存在参与到半乳糖代谢的这三个酶。除了参与基本的糖代谢途径，将来源于海滨毒稗的galE基因在水稻中超表达，可明显提高水稻的耐盐能力(Noboru et al.,2005)。在拟南芥中超表达水稻的galE基因，提高了转基因植株的棉子糖含量，从而更能抵抗非生物胁迫(Liu et al.,2007)。

我国是个自然灾害频发的国家，水资源相对贫乏，在地理和时空上分布极不均匀，使我国的农业经常遭受干旱而造成粮食减产。水稻是我国最重要的粮食作物之一，其生产消耗掉我国近一半的淡水资源，提高水稻等农作物的节水抗旱性能，是保障我国粮食安全和生态安全，保障农业可持续发展的重大需求(Luo，2010)。目前转基因技术已被广泛应用到抗旱水稻的培育中，所采用的策略就是在水稻中表达干旱诱导或抗旱相关基因。

因此，对发状念珠藻抗旱基因的克隆和挖掘，并应用在生物基因工程上具有非常重要意义。本发明中的Nfcupin1基因是基于发状念珠藻干旱胁迫转录组实验得到的，其在干旱胁迫下，表达量明显上升。鉴定其抗旱功能及其在提高水稻抗旱性方面所发挥的功能，对培育抗旱水稻新品种将具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种发状念珠藻NfgalE抗旱基因，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

其序列长度为987bp，具体为：

ATGTCAACCATTTTAGTAACAGGAGGAGCCGGATATATTGGCTCCCATGCTGTATTAGCTCTGAAAAATGCAGGTTATGAAGTAATTGTTCTGGATAATCTATCCAATGGACATCGTGAACTTGTAGAAGATGTTTTGCAGATAAAGTTGATTGTTGGCGATATGAGCGATCGCGCCCTACTTGATAACATATTTTCAACTCACAGTATAGAAGCAGTAATGCATTTTGCTGCTTATATTGCCGTGGGTGAATCTGTTACCGACCCAGCTAAATATTACCAAAATAATGTTGCAGGTACTCTAACACTTTTAGAGGCAATGCTTGCTGCGTCAGTTAAGAAATTTATCTTTTCTTCTACCTGCGCTCTTTATGGTGTACCAAAGTTTGTTCCCCTTACCGAAGAACATCCGCAAGATCCCATTAGTCCCTACGCTACTAGCAAGTGGATGGTAGAACGAATTTTATCTGATTTTGATACAGCTTACAATTTAAAGTCTGTACGTTTCCGTTACTTTAACGCTGCCGGTGCTGACCCCAATGGATTGCTGGGTGAAGACCATGAACCTGAAACTCACCTGATACCATTAGTACTATTAGCTGCTTTGGGTAAACGCGAATCTATCTTTATTTTCGGCACTGATTACCCTACCCCAGACGGTACTTGTATCCGGGATTATATTCACGTAACTGATTTGGCACAAGCTCATATTTTGGGTTTAGAATATCTGCTCAAAGGCGGAGAAAGCGAAGTATTTAATCTCGGAAATGGCAGTGGTTTTTCAGTTCGAGAAGTGATAGAAACTGCTCAGGAAGTAACAGGTAAAGAAATCAAAATAGAGGAACGCGATCGCAGACCAGGCGACCCTCCTATTTTAGTTGGTAGCAGCGACAAAGCAACTAAAGTTTTGGGTTGGCATCCCCAATATCCCAACGTTAAGGAAATCCTTACCCATGCTTGGCAATGGCATCAGCGACGACATAGATAA

本发明的另一个目的是提供上述发状念珠藻Nfgal E抗旱基因的氨基酸序列，如序列表SEQ ID NO.2所示，

其氨基酸序列为328个，具体为：

Mstilvtggagyigshavlalknagyevivldnlsnghrelvedvlqiklivgdmsdralldnifsthsieavmhfaayiavgesvtdpakyyqnnvagtltlleamlaasvkkfifsstcalygvpkfvplteehpqdpispyatskwmverilsdfdtaynlksvrfryfnaagadpngllgedhepethliplvllaalgkresififgtdyptpdgtcirdyihvtdlaqahilgleyllkggesevfnlgngsgfsvrevietaqevtgkeikieerdrrpgdppilvgssdkatkvlgwhpqypnvkeilthawqwhqrrhr

本发明还提供了上述发状念珠藻NfgalE抗旱基因在提高植物抗旱性中的应用，尤其是在水稻中的应用。

本发明分离和应用一种包含NfgalE基因的DNA片段，该片段赋予大肠杆菌和水稻在干旱条件下的抗旱能力增强。可以根据本发明NfgalE基因序列，直接采用PCR(polymerase chain reaction)技术，从基因组，mRNA和cDNA中扩增得到本发明的NfgalE基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。携带本发明NfgalE基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入原核细菌细胞，植物细胞。

实验结果显示经过3天模拟干旱处理后，野生型植株全部卷曲干枯，而转NfgalE水稻长势良好，其中株系OE-3卷曲率28.7％，株系OE-4卷曲率为40.3％,说明在水稻中超表达NfgalE基因的确提高了转基因植株对干旱的耐性。

附图说明

图1是实施例1中NfgalE基因在发菜失水转录组的表达情况对比图。

图2是实施例2中NfgalE基因的原核表达SDS-PAGE电泳结果图，其中，CK为空载体阴性对照，1，2，3，4，5，6为6个重组质粒pGEX-NfgalE克隆。

图3是实施例2中原核表达胁迫结果。pGEX为空载体，pGEX：NfgalE为重组质粒。其中图3A为正常培养对照条件下实验结果图，图3B为添加山梨醇条件下实验结果图，图3C为同时添加IPTG和山梨醇的实验结果图。

图4是实施例3选用的植物超量表达载体ub-06载体图。

图5是实施例3中转NfgalE基因水稻株系的表达量检测图。

图6是实施例4中的转基因水稻田间干旱胁迫处理实验对照图，其中水稻株系OE-3,OE-4和野生型ck在20％PEG6000处理3天后的结果图。图6A为胁迫前长势图，图6B为胁迫3天后各株系的长势图，图6C为胁迫后卷曲干枯率的统计结果图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明：

下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

发状念珠藻NfgalE基因的克隆

(1)、发状念珠藻的培养

液体培养的发状念珠藻(天然野生样品采样于内蒙古自治区苏尼特左旗)。接种前用玻璃匀浆器匀浆藻种使藻丝分散，然后接种到300ml，BG11培养基中进行无菌培养，培养温度25℃，光强20±2μmol photons m^-2s^-1(24h连续光照)，每天早中晚摇藻三次，使藻细胞悬浮、均匀接受光照；

(2)DNA提取

将步骤(1)中培养的发状念珠藻样品在液氮中研磨，分装到1.5ml离心管中，加入1mL提取液(100mmol/L的Tris-HCl，500mmol/L的NaCl，50mmol/L的EDTA，PH8.0)，100微升20％SDS，10微升10mg/mL蛋白酶K，充分混匀；37℃裂解30min，每5min混匀一次；12000rpm离心10min，取上清加入等体积Tris饱和酚，充分混匀，室温静置2min；12000rpm离心10min，取上清加入等体积氯仿/异戊醇，充分混匀，室温静置2min；12000rpm离心10min，取上清加入等体积氯仿，充分混匀，室温静置2min；12000rpm离心10min，取上清加入等体积异丙醇，加入1/10体积的3M NaAc，充分混匀，可见白色丝状物；用10微升吸头挑取白色丝状沉淀，转入70％乙醇洗2次；空气中晾干，加入30微升Buffer EB溶解。

(3)NfgalE全长序列的扩增

在发状念珠藻失水转录组分析中，在失水10％，失水30％，失水50，失水70％，失水90％的条件下，NfgalE基因的表达都显著升。通过转录组测序获得NfgalE基因的全长序列，根据序列信息设计上下游引物(NfgalEF:5-TCCCCAATTATGTCAACCAT-3，NfgalER：5-GTCTTTATCTATGTCGTCGC-3)，如序列表SEQ ID NO.3-4所示。

从发状念珠藻基因组DNA中克隆获得了NfgalE基因，通过测序验证，扩增产物是本发明SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列(1-987bp)。

实施例2

发状念珠藻NfgalE蛋白的原核表达及胁迫鉴定

利用One Step Cloning Kit重组技术构建NfgalE的原核表达载体。以实施例1中已获得NfgalE基因为模板，用前引物NfgalEF2：5-TTCCAGGGGCCCCTGGGATCCTCCCCAATTATGTCAACCAT-3，后引物NfgalER2：5-GTCACGATGCGGCCGCTCGAGGTCTTTATCTATGTCGTCGC-3，引物如序列表SEQ ID NO.5-6所示，进行PCR扩增，产物经回收纯化后，通过One Step Cloning Kit重组反应，将扩增产物片段克隆到载体pGEX-6P-14984上。具体过程如下：

(1)、PCR扩增

20μL反应体系如下：

扩增程序：94℃预变性3min，94℃1min，56℃45sec，72℃1min，30个循环，72℃10min。反应结束后取5μL电泳检测。

(2)PCR产物的回收

采用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技有限公司)进行纯化回收。

(3)重组反应

采用南京诺唯赞生物科技有限公司的One Step Cloning Kit试剂盒进行重组反应。具体如下：

将2μg环状pGEX-6P-14984质粒加入到20μl酶切反应体系中，37℃酶切2hr。限制性内切酶使用量为BamHI和XhoI各1μl。酶切完成后，将酶切产物置于65℃加热20min，失活内切酶。

于冰水浴中配制如下反应体系。

体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，置于37℃反应30min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。然后取20μl冷却反应液，加入到200μl表达感受态BL21细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激45～90秒，冰水浴孵育2min。加入900μl LB培养基，37℃孵育10min充分复苏。37℃摇菌45min。取100μl菌液均匀涂布在含有抗生素Amp+的平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养，测序获得含Nfcupin1的重组质粒pGEX-NfgalE。

(4)NfgalE蛋白的表达

将含NfgalE重组质粒的菌株单克隆置于2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃过夜培养。按1∶50比例稀释过夜菌，37℃震荡培养至OD600≌0.6，取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组，两组继续37℃震荡培养3hr。分别取菌体1ml，离心12000g×30s收获沉淀，用100μL 1％SDS重悬，混匀，70℃10min。离心12000g×1min，取上清作为样品，SDS-PAGE电泳检测，具体结果如图2所示。其中，CK为空载体阴性对照，1，2，3，4，5，6为6个重组质粒pGEX-NfgalE克隆。

(5)原核表达胁迫

按步骤(4)所述，摇菌待OD600处于0.4至0.6之间，pGEX空载体作为对照，调节各管的初始OD600一致，然后取一定量扩繁的菌液加入各种处理的含氨苄LB中，3种处理分别为不加任何额外的试剂、加入山梨醇(Sorbitol)、加入诱导剂(IPTG)与山梨醇试剂。每隔一段时间用分光光度计测定OD600(每隔1h测定)，统计结果绘制折线图，结果显示在未加IPTG诱导条件下，重组质粒和空载体对照菌长势没有差别，而诱导后，重组质粒pGEX-NfgalE在山梨醇胁迫下长势更好，具体结果如图3所示，其中图3A为正常培养对照条件下实验结果图，图3B为添加山梨醇条件下实验结果图，图3C为同时添加IPTG和山梨醇的实验结果图。

实施例3

发状念珠藻NfgalE超量表达转化水稻

以实施例1中已获得NfgalE基因为模板，用前引物NfgalEF3：5-caggtcgactctagaggatcc TCCCCAATTATGTCAACCAT-3，后引物NfgalER3：5-gggaaattcgagctggtcacc GTCTTTATCTATGTCGTCGC-3，引物如序列表SEQ ID NO.7-8所示，进行PCR扩增，产物经回收纯化后，通过One Step Cloning Kit重组反应，将扩增产物片段克隆至植物超量表达载体ub-06，ub-06载体图如图4所示。具体过程如下：

(1)PCR扩增，按实施案例1所述。

(2)PCR产物的回收，按实施案例2所述。

(3)重组反应

采用南京诺唯赞生物科技有限公司的One Step Cloning Kit试剂盒进行重组反应。具体如下：

将2μg环状ub-06质粒加入到20μl酶切反应体系中，37℃酶切2hr。限制性内切酶使用量为BamHI和XhoI各1μl。酶切完成后，将酶切产物置于65℃加热20min，失活内切酶。

于冰水浴中配制如下反应体系。

体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，置于37℃反应30min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。然后取20μl冷却反应液，加入到200μl表达感受态DH5α细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激45～90秒，冰水浴孵育2min。加入900μl LB培养基，37℃孵育10min充分复苏。37℃摇菌45min。取100μl菌液均匀涂布在含有抗生素Amp+的平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养，测序获得含NfgalE的质粒u6-NfgalE。

(4)农杆菌转化

将1μL u6-NfgalE质粒加入到100μL农杆菌EHA105感受态细胞中，轻轻混匀，冰水浴30min后，于液氮中速冻冷激2min；加入400-800μLYEP培养液(Kan⁺)，28℃，200r/min震荡培养3-5h；室温离心(5000r/min，5min)，保留100μL上清重悬菌体，涂布于LA固体培养基(Kan⁺)，28℃倒置培养2天直至长出合适大小的菌落，挑取单克隆进行PCR检测，获得阳性菌株。

(5)愈伤诱导：种子用无菌水漂洗15-20min，再用75％的乙醇消毒1min，然后用次氯酸钠(1.5％有效浓度)溶液振荡消毒20min。最后再用无菌水冲洗5遍。将洗好的种子用吸水纸吸干接种在诱导愈伤培养基中，25℃暗培养2周。

愈伤诱导培养基：采用表1的诱导培养基，加入0.3g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2.5ml 2,4-D(浓度1mg/ml)，配成1L溶液，调pH至5.9，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

(6)继代培养：把胚性愈伤组织切下，接入继代培养基中，25℃暗培养2周。

继代培养基：采用表1的继代培养基，加入0.5g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2ml 2,4-D(浓度1mg/ml)，配成1L溶液，调pH至5.9，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

(7)农杆菌浸染和愈伤组织共培养：培养农杆菌，挑取阳性单菌落，在1ml农杆菌培养液(含抗生素)中，28℃培养过夜；取以上培养物，加入50ml农杆菌培养液(含抗生素)中，28℃培养至OD600＝0.6-1.0。将获得的农杆菌菌液离心，将收集到的菌体加入悬浮培养液中，震荡培养30min至OD600＝0.6-1.0。然后将愈伤组织放入含有农杆菌菌液的悬浮培养液中，振荡培养20min左右。将愈伤组织在灭菌滤纸上晾干，转入共培养培养基中，25℃暗培养5d。

悬浮培养液：采用表1的悬浮培养液，加入0.08g水解酪蛋白酶、2g蔗糖和0.2ml 2,4-D(浓度1mg/ml)，配成100ml溶液，调pH至5.4，分成两瓶(每瓶50ml)，高温高压灭菌。使用之前加入1ml 50％的葡萄糖和100μL AS(100mM)。

共培养培养基：采用表1的共培养培养基，加入0.8g水解酪蛋白酶、20g蔗糖和3.0ml 2,4-D(浓度1mg/ml)，配成1L溶液，调pH至5.6，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入20ml 50％的葡萄糖和1ml AS(100mmol/L)。

(8)筛选培养：共培养3d后，选取好的愈伤组织，转入筛选培养基中，25℃暗培养2周，筛选两次。

筛选培养基：采用表2的筛选培养基，加入0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2.5ml 2,4-D(浓度1mg/ml)，配成1L溶液，调pH至6.0，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入1ml Hn和1ml Cn(100ppm)。

(9)分化培养：挑取胚性愈伤组织接入分化培养基，24℃，16h/8h光暗培养诱导分化芽(4-6周)。

分化培养基：采用表2的分化培养基，加入2.0mg/L 6-BA、2.0mg/L KT、0.2mg/LNAA、0.2mg/L IAA、1.0g水解酪蛋白酶和30g蔗糖，配成1L溶液，调pH至6.0，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

(10)生根培养：待芽长至2cm左右时，将幼芽切下，***生根培养基中，25℃左右，16h/8h光暗培养，诱导生根。

生根培养基：采用表2的生根培养基，加入30g蔗糖，配成1L溶液，调pH至5.8，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

(11)转化植株培养：待根系发达后，打开试管口，加入无菌水炼苗2-3d后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始遮荫避风，待植株健壮后进行常规田间或温室管理培养。

表1基本培养基成分1

表2基本培养基成分2

(12)超量表达植株的阳性检测

剪取再生植株叶片，利用CTAB法抽提DNA，利用hpt特异引物(hptF：ACACTACATGGCGTGATTTCAT；hptR：TCCACTATCGGCGAGTACTTCT，引物如序列表SEQ ID NO.9-10所示)进行PCR检测。

PCR体系：

PCR反应程序：

(13)超量表达阳性植株中目的基因的表达水平检测

取T₀代水稻叶片，置于液氮研磨，提取RNA。具体如下：

RNA的提取：所取样品在研钵中用液氮冷冻后研磨成粉状，加入盛有1ml TRNzol-A⁺试剂(天根生化科技有限公司)的2mL EP管，充分振荡后，室温放置5min，之后加0.2ml氯仿，剧烈震荡15s后，室温放置3min；后于4℃，12000rpm离心10min后，上清液移至新的2mLEP管中，加等体积异丙醇沉淀RNA，加100μl RNase-free ddH₂O溶解。电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

逆转录合成第一链cDNA

反转录之前需用DNaseI消化所提取RNA样品，反应体系如下：

37℃反应15min后，加入0.25μL 0.1M EDTA(保证终浓度>2mM)，70℃温育10min终止反应，短暂离心后置于冰上备用。

第一链cDNA的合成参照Promega反转录***A3500操作手册，具体步骤如下：

DNaseI消化过的样品中依次加入下列各试剂配制20μL的反应体系：

将上反应体系于42℃温育15min；然后95℃加热5min，使AMV反转录酶失活并阻止其与DNA结合；4℃或冰上放置5min。制备好的cDNA可以立即使用或存放于-20℃备用。

基因表达的定量分析使用Takara公司的

Premix Ex Taq^TM(Perfect RealTime)试剂盒，和美国ABI

7000定量PCR仪进行。根据NfgalE序列设计定量引物(NfgalEQF：5-GCACTGATTACCCTACCCC-3；NfgalEQR：5-TACTTCGCTTTCTCCGCCT-3)，引物如序列表SEQ ID NO.11-12所示)。以水稻持家基因actin(GenBank accession No.AY212324)为参照基因，根据其cDNA序列设计引物。20μl反应体系的配制：

反应条件为：95℃30s，然后在95℃5s，60℃31s，循环40次，并增设DissociationStage。设定在每个循环中60℃31s时收集数据，其它具体操作按仪器使用说明书进行。计算目的基因与参照基因的平均CT值以及△CT值，利用2^-ΔΔCT法进行结果分析，最后将数据导入GraphPad Prism5.0做出目的基因的相对表达量柱状图，如图5所示，OE-6表达量极低；OE-3、OE-4两个表达量高。

实施例4

转基因水稻田间干旱胁迫处理

将超量表达转基因家系种子去壳消毒(75％酒精处理1min，1.5％NaClO处理20min，无菌水清洗5次)，在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上发芽，野生型对照晚一天播于不含潮霉素的1/2MS培养基上。待发芽2～3天后挑选发芽好且长势一致的种子，转移到96孔平板进行水培(采用国际水稻所营养液配方)。在三叶一心期加入20％的PEG6000进行模拟干旱胁迫。实验结果显示经过3天模拟干旱处理后，野生型植株全部卷曲干枯，而转NfgalE水稻长势良好，株系OE-3卷曲率28.7％，株系OE-4卷曲率为40.3％(见图6)，说明在水稻中超表达NfgalE基因的确提高了转基因植株对干旱的耐性。

以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

序列表

<110> 上海市农业生物基因中心

<120> 发状念珠藻NfgalE抗旱基因及其氨基酸序列和应用

<141> 2017-10-23

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 987

<212> DNA

<213> Nostoc flagelliforme

<400> 1

atgtcaacca ttttagtaac aggaggagcc ggatatattg gctcccatgc tgtattagct 60

ctgaaaaatg caggttatga agtaattgtt ctggataatc tatccaatgg acatcgtgaa 120

cttgtagaag atgttttgca gataaagttg attgttggcg atatgagcga tcgcgcccta 180

cttgataaca tattttcaac tcacagtata gaagcagtaa tgcattttgc tgcttatatt 240

gccgtgggtg aatctgttac cgacccagct aaatattacc aaaataatgt tgcaggtact 300

ctaacacttt tagaggcaat gcttgctgcg tcagttaaga aatttatctt ttcttctacc 360

tgcgctcttt atggtgtacc aaagtttgtt ccccttaccg aagaacatcc gcaagatccc 420

attagtccct acgctactag caagtggatg gtagaacgaa ttttatctga ttttgataca 480

gcttacaatt taaagtctgt acgtttccgt tactttaacg ctgccggtgc tgaccccaat 540

ggattgctgg gtgaagacca tgaacctgaa actcacctga taccattagt actattagct 600

gctttgggta aacgcgaatc tatctttatt ttcggcactg attaccctac cccagacggt 660

acttgtatcc gggattatat tcacgtaact gatttggcac aagctcatat tttgggttta 720

gaatatctgc tcaaaggcgg agaaagcgaa gtatttaatc tcggaaatgg cagtggtttt 780

tcagttcgag aagtgataga aactgctcag gaagtaacag gtaaagaaat caaaatagag 840

gaacgcgatc gcagaccagg cgaccctcct attttagttg gtagcagcga caaagcaact 900

aaagttttgg gttggcatcc ccaatatccc aacgttaagg aaatccttac ccatgcttgg 960

caatggcatc agcgacgaca tagataa 987

<210> 2

<211> 328

<212> PRT

<213> Nostoc flagelliforme

<400> 2

Met Ser Thr Ile Leu Val Thr Gly Gly Ala Gly Tyr Ile Gly Ser His

1 5 10 15

Ala Val Leu Ala Leu Lys Asn Ala Gly Tyr Glu Val Ile Val Leu Asp

20 25 30

Asn Leu Ser Asn Gly His Arg Glu Leu Val Glu Asp Val Leu Gln Ile

35 40 45

Lys Leu Ile Val Gly Asp Met Ser Asp Arg Ala Leu Leu Asp Asn Ile

50 55 60

Phe Ser Thr His Ser Ile Glu Ala Val Met His Phe Ala Ala Tyr Ile

65 70 75 80

Ala Val Gly Glu Ser Val Thr Asp Pro Ala Lys Tyr Tyr Gln Asn Asn

85 90 95

Val Ala Gly Thr Leu Thr Leu Leu Glu Ala Met Leu Ala Ala Ser Val

100 105 110

Lys Lys Phe Ile Phe Ser Ser Thr Cys Ala Leu Tyr Gly Val Pro Lys

115 120 125

Phe Val Pro Leu Thr Glu Glu His Pro Gln Asp Pro Ile Ser Pro Tyr

130 135 140

Ala Thr Ser Lys Trp Met Val Glu Arg Ile Leu Ser Asp Phe Asp Thr

145 150 155 160

Ala Tyr Asn Leu Lys Ser Val Arg Phe Arg Tyr Phe Asn Ala Ala Gly

165 170 175

Ala Asp Pro Asn Gly Leu Leu Gly Glu Asp His Glu Pro Glu Thr His

180 185 190

Leu Ile Pro Leu Val Leu Leu Ala Ala Leu Gly Lys Arg Glu Ser Ile

195 200 205

Phe Ile Phe Gly Thr Asp Tyr Pro Thr Pro Asp Gly Thr Cys Ile Arg

210 215 220

Asp Tyr Ile His Val Thr Asp Leu Ala Gln Ala His Ile Leu Gly Leu

225 230 235 240

Glu Tyr Leu Leu Lys Gly Gly Glu Ser Glu Val Phe Asn Leu Gly Asn

245 250 255

Gly Ser Gly Phe Ser Val Arg Glu Val Ile Glu Thr Ala Gln Glu Val

260 265 270

Thr Gly Lys Glu Ile Lys Ile Glu Glu Arg Asp Arg Arg Pro Gly Asp

275 280 285

Pro Pro Ile Leu Val Gly Ser Ser Asp Lys Ala Thr Lys Val Leu Gly

290 295 300

Trp His Pro Gln Tyr Pro Asn Val Lys Glu Ile Leu Thr His Ala Trp

305 310 315 320

Gln Trp His Gln Arg Arg His Arg

325

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

tccccaatta tgtcaaccat 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gtctttatct atgtcgtcgc 20

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ttccaggggc ccctgggatc ctccccaatt atgtcaacca t 41

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gtcacgatgc ggccgctcga ggtctttatc tatgtcgtcg c 41

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

caggtcgact ctagaggatc ctccccaatt atgtcaacca t 41

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gggaaattcg agctggtcac cgtctttatc tatgtcgtcg c 41

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

acactacatg gcgtgatttc at 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

tccactatcg gcgagtactt ct 22

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

gcactgatta ccctacccc 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

tacttcgctt tctccgcct 19

Claims (2)

1.一种发状念珠藻NfgalE抗旱基因在提高水稻抗旱性中的应用，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的发状念珠藻NfgalE抗旱基因在提高水稻抗旱性中的应用，其特征在于：该基因的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

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