CN113512117A

CN113512117A - 一种可结合cd206的抗体及其应用

Info

Publication number: CN113512117A
Application number: CN202110782069.4A
Authority: CN
Inventors: 曾锐; 廖文慧; 郭毅; 廖睿纯; 邓璇; 曾祥彬
Original assignee: Wuhan Maikaojin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2021-07-12
Filing date: 2021-07-12
Publication date: 2021-10-19
Anticipated expiration: 2041-07-12
Also published as: CN113512117B

Abstract

本发明涉及一种可结合CD206的抗体，包括轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区的CDR1‑3的序列如SEQ I D NO：14‑16所示，所述轻链可变区的CDR1‑3的序列如SEQ I D NO：17‑19所示；还涉及该抗体的制药用途以及包含该抗体的抗体偶联药物。本发明的抗体可特异性的结合M2型巨噬细胞表面分子标志CD206，并且可与血清白蛋白和细胞毒素PE结合，形成的抗体偶联药物既能够特异性识别M2型巨噬细胞，同时也保持了对细胞的杀伤作用。因此，可作为有效的抗肿瘤靶向药物。

Description

一种可结合CD206的抗体及其应用

技术领域

本发明属于抗肿瘤药物领域，具体涉及一种可结合人或鼠CD206的抗体及其应用。

背景技术

一些基因突变是肿瘤产生的原因。化疗虽然可以抑制肿瘤细胞的生长，但是往往也能对正常组织和细胞也有损伤，导致身体健康受损或诱发肿瘤基因突变，导致肿瘤复发。因此，靶向治疗成为研究热点。

抗体偶联药物(Antibody-Drug Conjugates，ADC)特异性抗体与具有细胞毒性的药物偶联，将药物靶向特定的抗原，从而使药物杀伤表达相应抗原的细胞。ADC一般由“弹头”药物(细胞毒性药物)、抗体以及偶联链3部分组成。稳定结合型的ADC能够将药物拉向靶细胞，防止其在外周血和正常细胞表面降解。因此，在同等给药剂量下，稳定型ADC像缓释剂一样能够长时间在体保持对靶细胞的有效杀伤浓度而不释放出多余的毒素，使得ADC在目标组织中具有更高效的杀伤效应和更少的不良反应。

为了实现对肿瘤细胞的有效且特异性的杀伤，一方面要确定与肿瘤细胞相关的抗原，另一方面要制备和筛选针对该抗原的特异性抗体，并且该抗体可用于偶联细胞毒性药物而不影响其特异性和亲和力。

肿瘤相关性巨噬细胞包括M1和M2两种亚型，其中，M2型肿瘤相关性巨噬细胞促进肿瘤生长与各类肿瘤的不良预后有关，而M1型肿瘤相关性巨噬细胞则有抗肿瘤功能。因此，可将M2型肿瘤相关性巨噬细胞作为特异性靶点进行干预，联合基于T细胞的肿瘤免疫治疗，并有效保留具有抗肿瘤活性的M1型巨噬细胞。

我们在研究过程中发现，M2型肿瘤相关性巨噬细胞表面特异性表达受体CD206，可作为靶抗原。为了实现针对M2型瘤相关性巨噬细胞的特异性杀伤，我们使用CD206制备了抗体，并构建了抗体偶联药物。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供了一种可结合CD206的抗体，包括轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区的CDR1-3的序列如SEQ ID NO：14-16所示，所述轻链可变区的CDR1-3的序列如SEQ ID NO：17-19所示。

在一个具体实施方案中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4或其突变体所示。

在一个具体实施方案中，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4或其突变体所示。

在一个具体实施方案中，所述抗体的序列如SEQ ID NO:10所示。

本发明还提供了上述抗体在制备抗肿瘤药物或特异性杀伤M2型巨噬细胞的药物中的应用。

本发明还提供了一种抗体偶联药物，包括上述抗体作为N端结构域。

在一个具体实施方案中，所述抗体偶联药物还包括具有细胞毒性的多肽作为C端结构域。

在一个具体实施方案中，所述具有细胞毒性的多肽的序列如SEQ ID NO:12所示。

在一个具体实施方案中，所述抗体偶联药物的序列如SEQ ID NO:13所示。

本发明筛选得到的抗体可特异性的结合M2型巨噬细胞表面分子标志CD206，并且可与血清白蛋白和细胞毒素PE结合，形成的抗体偶联药物既能够特异性识别M2型巨噬细胞，同时也保持了对细胞的杀伤作用。因此，可作为有效的抗肿瘤靶向药物。

附图说明

图1为8个杂交瘤细胞株上清经流式检测的荧光强度统计图；

图2为不同处理的巨噬细胞系经流式检测的流式图；

图3为4℃下用荧光标记的细胞毒素与M1型和M2型巨噬细胞孵育后的流式细胞检测MFI统计截图；

图4为37℃下用荧光标记的细胞毒素与M1型和M2型巨噬细胞孵育后的流式细胞检测MFI统计截图；

图5为六孔板细胞毒性试验的显微照片；

图6为CCK-8实验中OD450的统计图。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1、抗体的筛选与制备

固相合成法按相应序列合成CD206多肽，HPLC及MASS质检结果表明，合成的多肽序列正确，纯度大于90％，总量满足要求。将CD206与MBS-KLH连接物进行交联，形成CD206-KLH共价复合物，作为免疫原。

使用上述免疫原免疫小鼠，用量如下：初免时每只小鼠注射100μg抗原+等体积的弗氏完全佐剂；加强免疫时每只小鼠注射50μg抗原+等体积的弗氏不完全佐剂。进行了5次加强免疫后，从小鼠尾静脉取血制备抗血清，进ELISA检测显示，抗血清具有较高效价，取小鼠脾细胞进行融合筛选。

将免疫小鼠的脾细胞与复苏的SP2/0细胞融合，方法如下：按1:3-1:10的比例混合骨髓瘤细胞和脾细胞，标准流程进行细胞融合操作，随后用HAT-DMEM完全培养基培养，融合后3天即可以看到杂交瘤细胞，第7天换1/2HAT完全培养基，第8天换1/2HT培养基。融合后10天左右开始进行筛选检测。吸取细胞上清100ul/孔，进行间接ELISA检测。根据ELISA结果，判断阳性孔。进行第二次复检，进一步确认阳性孔。

对复筛的阳性孔细胞做两轮亚克隆。检测出稳定阳性的杂交瘤细胞株，作为最终制备单抗的细胞，并扩大培养。使用美国Southern Biotech的单抗亚型鉴定试剂盒，分别测各个上清的亚型。经过两轮亚克隆及复检，确定阳性细胞株及其亚型，进一步鉴定阳性细胞株上清液所含抗体与CD206的结合力以及与CD206结合后的内吞能力。确定8个阳性细胞株及其所属亚型。使用杂交瘤上清与IL-4诱导分化的M2型肿瘤相关性巨噬细胞孵育，通过过流式检测荧光强度，结果显示，8#细胞株(6D5，IgG1)具有较高的荧光强度，可以用于靶向M2型肿瘤相关性巨噬细胞(图1)。分别使用未分化的巨噬细胞系(RAW)、IL-4孵育的RAW以及IL-4和6D5的上清孵育的RAW进行流式检测，得出的流式图如图2所示，显示出杂交瘤上清中的抗体对M2型肿瘤相关性巨噬细胞具有较强的亲和力。

培养杂交瘤细胞株6D5，提取RNA，反转录制备cDNA。用设计合成的小鼠IgG特异引物组测序。

结果显示，细胞株6D5对应的抗体重链的DNA编码序列如SEQ ID NO:1所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，其中，重链可变区的DNA编码序列如SEQ ID NO:3所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示(其中，第26-33位氨基酸为CDR1，序列如SEQ ID NO:14所示；第51-58位氨基酸为CDR2，序列如SEQ ID NO:15所示；第97-104位氨基酸为CDR3，序列如SEQ ID NO:16所示)。抗体轻链的DNA编码序列如SEQ ID NO:5所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，其中，轻链可变区的DNA编码序列如SEQ ID NO:7所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示(其中，第27-32位氨基酸为CDR1，序列如SEQ ID NO:17所示；第50-62位氨基酸为CDR2，序列如SEQ ID NO:18所示；第89-97位氨基酸为CDR3，序列如SEQ ID NO:19所示)。

2、单链抗体的构建

根据上述序列，我们将重链可变区第44位丝氨酸和轻链可变区第100位甘氨酸均突变成半胱氨酸，通过该突变，增加了最后形成的单链抗体的稳定性。然后将突变后的重链可变区和轻链可变区用柔性多肽链连接(SEQ ID NO:9)起来，得到单链抗体，序列如SEQ IDNO:10所示。根据ELISA实验显示，单链抗体对CD206具有良好的亲和力和特异性。

3、靶向药物的偶联

使用白蛋白结合结构域(ABD，序列如SEQ ID NO:11所示)以延长血清半衰期。铜绿假单胞菌PE38的外毒素PE38X8，通过催化伸长因子2的不可逆性核糖基化阻止核糖体功能抑制蛋白质功能，从而在细胞质中发挥细胞毒性作用，介导靶细胞死亡。删除PE38X8天然细胞结合域并去掉T细胞表位，得到截短形式的PE38X8，以下简称PE(SEQ ID NO:12)，降低了免疫原性，以利于对肿瘤部位多次给药。

将柔性连接肽将单链抗体与PE按从N端到C端的方向连接，得到αCD206-PE。

使用柔性连接肽将单链抗体、ABD和截短形式的PE38X8按从N端到C端的方向依次连接起来，得到靶向M2型肿瘤相关性巨噬细胞的抗体偶联药物(氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示)，αCD206-ABD-PE。

以上蛋白(PE、αCD206-PE和αCD206-ABD-PE)构建表达载体，使用大肠杆菌进行表达。

4、细胞内吞与结合

将构建好的蛋白PE和αCD206-PE用Zip Alexa Fluor^TM488Rapid AntibodyLabeling Kit(Thermo Fisher Scientific)标记；将巨噬细胞系RAW接种于两个12孔板中，其中一个12孔板加入LPS诱导M1型巨噬细胞分化，另外一个12孔板加入IL-4诱导M2型巨噬细胞分化；分化完全后，将标记的PE、αCD206-PE分别加入到12孔板的六个孔中并加入含0.1％胎牛血清的PBS，放入4℃孵育30min；然后加入PBS中止反应，1200rpm离心6min，清洗两次。然后用流式细胞仪测定孵育混合物的MFI。结果如图3所示，αCD206-PE发生细胞表面结合但抑制内化。孵育后，M1巨噬细胞的平均荧光强度(MFI)小于M2巨噬细胞。相反，用标记的“PE”孵育的M1和M2巨噬细胞具有更低的MFI。

同样的实验重复一遍，不同之处在于细胞毒素的孵育温度为37℃。结果如图4所示，αCD206-PE与M1型、M2型巨噬细胞表面结合和内化可同时进行。孵育后，M1巨噬细胞的平均荧光强度(MFI)小于M2巨噬细胞。相反，用标记的“PE”孵育的M1和M2巨噬细胞具有更低的MFI。

以上结果显示，αCD206-PE比PE更倾向于M2型巨噬细胞结合，并且内化37℃下不受影响。

5、细胞毒性实验

5.1六孔板实验

方法如下：将巨噬细胞系RAW接种于两个六孔板中，于37℃下培养8h贴壁，然后六孔板的第一排孔中分别加入2.5μL IL-4(20ng/μL)刺激48小时，使其分化成M2型巨噬细胞。向两个六孔板中的一个加入PE，另一个加入αCD206-PE。图5示出了加入细胞毒素后第三天和第四天的情况，结果显示，未加IL-4的孔中，细胞数比较稳定，而IL-4诱导的孔中，随着时间推移被杀伤的细胞越多。由于加入细胞毒素之前，只诱导了8小时，RAW细胞尚未被诱导成M2型细胞，因此，αCD206-PE对这些细胞不具有杀伤作用。但是，随着时间推移，越来越多的细胞被诱导成M2型细胞而被αCD206-PE。在加PE的六孔板里，不存在该现象。可见，αCD206与PE的偶联既没有影响PE杀伤力，有没有影响抗体的特异性，两者构成的偶联药物可特异性地杀伤M2型巨噬细胞，而对未分化的RAW细胞未显示出明显的杀伤作用。

5.2CCK8试剂酶标仪检测实验

方法如下：将RAW细胞接种到96孔板(每孔10,000个细胞)中，加入IL-4刺激48h，加入细胞毒素孵育48h，然后每孔加入10μl CCK8试剂孵育48h。使用酶标仪测定450nm下的吸光度。结果如图6所示，偶联单链抗体和ABD不会影响PE的毒性。

以上实验说明，本发明的单链抗体与ABD和PE之间不会产生相互影响，所构建的ADC在体外可以特异性地杀伤M2型巨噬细胞。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉麦考津生物科技有限公司

<120> 一种可结合CD206的抗体及其应用

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1320

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaggttcggc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60

tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaatacacca tgcactgggt gaagcagagc 120

catggaaaga gccttgagtg gattggaggt attaatccta acaatggtgg tactagctac 180

aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240

atggacctcc gcagcctgac atctgaggat tctgcagtct attactgtgc ctccactacg 300

gctggggagt actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctcggctaa aacgacaccc 360

ccatctgtct atccactggc ccctggatct gctgcccaaa ctaactccat ggtgaccctg 420

ggatgcctgg tcaagggcta tttccctgag ccagtgacag tgacctggaa ctctggatcc 480

ctgtccagcg gtgtgcacac cttcccagct gtcctgcagt ctgacctcta cactctgagc 540

agctcagtga ctgtcccctc cagcacctgg cccagcgaga ccgtcacctg caacgttgcc 600

cacccggcca gcagcaccaa ggtggacaag aaaattgtgc ccagggattg tggttgtaag 660

ccttgcatat gtacagtccc agaagtatca tctgtcttca tcttcccccc aaagcccaag 720

gatgtgctca ccattactct gactcctaag gtcacgtgtg ttgtggtaga catcagcaag 780

gatgatcccg aggtccagtt cagctggttt gtagatgatg tggaggtgca cacagctcag 840

acgcaacccc gggaggagca gttcaacagc actttccgct cagtcagtga acttcccatc 900

atgcaccagg actggctcaa tggcaaggag ttcaaatgca gggtcaacag tgcagctttc 960

cctgccccca tcgagaaaac catctccaaa accaaaggca gaccgaaggc tccgcaggtg 1020

tacaccattc cacctcccaa ggagcagatg gccaaggata aagtcagtct gacctgcatg 1080

ataacagact tcttccctga agacattact gtggagtggc agtggaatgg gcagccagcg 1140

gagaactaca agaacactca gcccatcatg gacacagatg gctcttactt cgtctacagc 1200

aagctcaatg tgcagaagag caactgggag gcaggaaata ctttcacctg ctctgtgtta 1260

catgagggcc tgcacaacca ccatactgag aagagcctct cccactctcc tggtaaatga 1320

<210> 2

<211> 438

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Val Arg Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser

1 5 10 15

Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr

20 25 30

Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

50 55 60

Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met

65 70 75 80

Asp Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ser Thr Thr Ala Gly Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val

100 105 110

Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly

115 120 125

Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys

130 135 140

Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu

145 150 155 160

Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr

165 170 175

Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu

180 185 190

Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp

195 200 205

Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr

210 215 220

Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

225 230 235 240

Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp

245 250 255

Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp

260 265 270

Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

275 280 285

Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp

290 295 300

Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro

305 310 315 320

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala

325 330 335

Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp

340 345 350

Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile

355 360 365

Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn

370 375 380

Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys

385 390 395 400

Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys

405 410 415

Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu

420 425 430

Ser His Ser Pro Gly Lys

435

<210> 3

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaggttcggc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60

tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaatacacca tgcactgggt gaagcagagc 120

catggaaaga gccttgagtg gattggaggt attaatccta acaatggtgg tactagctac 180

aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240

atggacctcc gcagcctgac atctgaggat tctgcagtct attactgtgc ctccactacg 300

gctggggagt actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctcg 345

<210> 4

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Val Arg Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser

1 5 10 15

Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr

20 25 30

Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

50 55 60

Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met

65 70 75 80

Asp Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ser Thr Thr Ala Gly Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 5

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gatgttgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60

atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120

ggacaatctc ctaaactact gatttactcg gcatcctacc ggtacactgg agtccctgat 180

cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240

gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatagta ctccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaatgaa acgcgcagat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 360

tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 420

cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 480

aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 540

ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 600

tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag 645

<210> 6

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Asp Val Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

130 135 140

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu

145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210

<210> 7

<211> 321

<212> DNA

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<400> 7

gatgttgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60

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gggaccaagc tggaaatgaa a 321

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Asp Val Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Tyr

85 90 95

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100 105

<210> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 10

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Glu Val Arg Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Asp Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Thr Thr Ala Gly Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser

130 135 140

Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser

145 150 155 160

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu

165 170 175

Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe

180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Pro Tyr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys

225 230 235

<210> 11

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly

1 5 10 15

Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asn Lys Ala Lys Thr Val Glu

20 25 30

Gly Val Glu Ala Leu Lys Leu His Ile Leu Ala Ala Leu Pro

35 40 45

<210> 12

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser

1 5 10 15

Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His

20 25 30

Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr

35 40 45

Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg

50 55 60

Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp

65 70 75 80

Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg

85 90 95

Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser

100 105 110

Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu

115 120 125

Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg

130 135 140

Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr

145 150 155 160

Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala

165 170 175

Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser

180 185 190

Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser

195 200 205

Gln Pro Gly Lys Pro Pro Lys Asp Glu Leu

210 215

<210> 13

<211> 531

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Glu Val Arg Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Asp Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Thr Thr Ala Gly Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser

130 135 140

Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser

145 150 155 160

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu

165 170 175

Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe

180 185 190

Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val

195 200 205

Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr

210 215 220

Pro Tyr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys Gly Gly Gly

225 230 235 240

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ala Glu Ala

245 250 255

Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Phe

260 265 270

Tyr Lys Arg Leu Ile Asn Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Glu Ala

275 280 285

Leu Lys Leu His Ile Leu Ala Ala Leu Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly

290 295 300

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu

305 310 315 320

Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp

325 330 335

Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly

340 345 350

Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser

355 360 365

Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile

370 375 380

Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr

385 390 395 400

Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala

405 410 415

Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg

420 425 430

Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg

435 440 445

Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro

450 455 460

Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala

465 470 475 480

Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn

485 490 495

Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala

500 505 510

Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Lys

515 520 525

Asp Glu Leu

530

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr

1 5

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr

1 5

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Ala Ser Thr Thr Ala Gly Glu Tyr

1 5

<210> 17

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Gln Asp Val Ser Thr Ala

1 5

<210> 18

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Ser Ala Ser

1

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr

1 5

Claims

1.一种可结合CD206的抗体，包括轻链可变区和重链可变区，其特征在于，所述重链可变区的CDR1-3的序列如SEQ ID NO：14-16所示，所述轻链可变区的CDR1-3的序列如SEQ IDNO：17-19所示。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:4或其突变体所示。

3.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:4或其突变体所示。

4.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，序列如SEQ ID NO:10所示。

5.权利要求1-4中任一项所述的抗体在制备抗肿瘤药物或特异性杀伤M2型巨噬细胞的药物中的应用。

6.一种抗体偶联药物，其特征在于，包括权利要求1-4中任一项所述的抗体作为N端结构域。

7.根据权利要求6所述的抗体偶联药物，其特征在于，还包括具有细胞毒性的多肽作为C端结构域。

8.根据权利要求7所述的抗体偶联药物，其特征在于，所述具有细胞毒性的多肽的序列如SEQ ID NO:12所示。

9.根据权利要求6-8中任一项所述的抗体偶联药物，其特征在于，序列如SEQ ID NO:13所示。