CN104877937B - 一种促进辣椒生长的解淀粉芽孢杆菌菌肥及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进辣椒生长的解淀粉芽孢杆菌菌肥及其制备方法和应用，所述菌肥包括含菌量不低于2.4×10⁸ CFU/g的解淀粉芽孢杆菌HFJ‑7菌粉，且以腐熟有机物料为复配载体，解淀粉芽孢杆菌HFJ‑7菌株的保藏号是CGMCC No.10011。该菌株可拮抗立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、根腐病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌、辣椒疫霉病原菌等多种病原真菌，可溶解有机磷，可产生木聚糖酶、淀粉酶与蛋白酶，还可显著提高辣椒生长性能指标，如株高、茎粗、根干重、辣椒果重、辣椒亩产等。解淀粉芽孢杆菌HFJ‑7菌株还具有较强耐热性，其菌肥产品也具有较强的保存稳定性，半年内存活率达96%，1年存活率达91%。

Description

一种促进辣椒生长的解淀粉芽孢杆菌菌肥及其制备方法和 应用

技术领域

本发明属于生物肥料领域，涉及菌肥的制备与应用，具体涉及一种促进辣椒生长的解淀粉芽孢杆菌菌肥及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，国际上把土壤中能促进植物生长的根际自生细菌通称为植物促生根圈细菌。许多根际防病芽抱杆菌对植物生长有促进作用，它们或者本身具有解磷、固氮、解钾等特殊生理功能，可以将物质转化为植物所需的营养成分，如固氮菌、解磷菌或者产生多种生理活性物质刺激调节植物生长，如生防菌直接分泌生长素、细胞***素等植物激素、维生素和酚类物质等调节生长因子，或者通过刺激土壤中某些生理功能微生物的繁殖，加强土壤肥力，间接为寄主植物的生长提供更多养分，使植物处于良好的生长状态，从而增强了植物的抗病力。多种研究发现，枯草、地衣、胶冻样、巨大、短小、解淀粉等芽孢杆菌，对黄瓜、番茄、辣椒、西瓜等多种作为具有较强的促生作用。

菌肥的应用与菌株的选择密切相关，菌株具备的特性越多，越可简化菌肥制备的步骤，且可扩大应用的范围。本发明所述的一种促进辣椒生长的解淀粉芽孢杆菌菌肥，它选用的是自主筛选的菌株--解淀粉芽孢杆菌HFJ-7，经生理生化与分子鉴定后确定其种类，并在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为：CGMCC No.10011。该菌株筛选自辣椒根际土，可拮抗立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、根腐病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌、辣椒疫霉病原菌等多种病原真菌，可溶解有机磷，可产生木聚糖酶、淀粉酶与蛋白酶，还可显著提高辣椒生长性能指标，如株高、茎粗、根干重、辣椒果重、辣椒亩产等。解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌株还具有较强耐热性，在喷雾干燥热处理环节的存活率高达98.73％，其菌肥产品也具有较强的保存稳定性，半年内存活率达96％，1年存活率达91％。

发明内容

本发明提供了一种促进辣椒生长的解淀粉芽孢杆菌菌肥及其制备方法和应用，所述解淀粉芽孢杆菌菌肥为新型微生物肥料，可促进辣椒的多个生长指标。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌HFJ-7，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.10011。

所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7革兰氏染色阳性，在营养琼脂平板上形成的菌落直径3-3.5mm，边缘不整齐，中间褶皱，淡黄色；菌体形态呈杆状；芽孢椭圆形，端生，尺寸为0.84×0.5μ2m。

本发明还提供了含有所述的解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的解淀粉芽孢杆菌菌肥，所述解淀粉芽孢杆菌菌肥包括解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉和复配载体，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7在菌肥中的含菌量不低于2.4×10⁸CFU/g。

所述的解淀粉芽孢杆菌菌肥的制备方法具体包括以下步骤：

(1)将解淀粉芽孢杆菌HFJ-7接种到装有灭菌的种子培养基的种子罐中，37℃培养10h，形成种子培养液，所述种子培养基组分包括：糖蜜，24.5～25.0g/L；蛋白胨，13.5～13.7g/L；磷酸二氢钾，1.7～1.8g/L；柠檬酸钠，1.5～1.6g/L；硝酸铵，1.5～1.6g/L；硫酸镁，0.5～0.52g/L；调节起始pH至7.2；

(2)将所述种子培养液转接至装有发酵培养基的生产罐进行发酵培养，37℃培养24h，当孢子率超过95％时，停罐，获得发酵液，所述发酵培养基组成包括：豆粕粉，25.0～25.5g/L；玉米浆干粉，18.5～19.4g/L；氯化钠，4.0～4.2g/L；磷酸二氢钠，2.8～2.9g/L；磷酸氢二钾，1.2～1.3g/L；氯化镁，0.55～0.58g/L；硫酸锰，0.15～0.16g/L；中性蛋白酶，2.0～2.1g/L；糖化酶，1.5～1.6g/L；消泡剂，1.3～1.4g/L；调节起始pH至7.4，所述发酵液中解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的菌量达到450×10⁸CFU/g～500×10⁸CFU/g；

(3)将所述发酵液添加载体后进行喷雾干燥，获得含菌量为2000×10⁸～2200×10⁸CFU/g的解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉，所述载体为轻质碳酸钙，添加载体的量占所述发酵液的质量比为10％-15％；

(4)按菌粉与复配载体质量比1:750--1:800比例将所述解淀粉芽孢杆菌HJF-7菌粉添加到复配载体中，混合保证均匀，最终控制菌肥中解淀粉芽孢杆菌含菌量不低于2.4×10⁸CFU/g。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤(4)中的复配载体是由鸡粪与辅料以6:4的质量比混合后，接种腐熟剂进行发酵制备而成的腐熟有机物料。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤(3)喷雾干燥的进风温度145℃-150℃，出风温度65℃-70℃。

本发明还提供了所述的解淀粉芽孢杆菌菌肥在制备促进辣椒生长的肥料中的应用。

对上述技术方案的进一步改进：所述解淀粉芽孢杆菌能拮抗立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、根腐病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌和辣椒疫霉病原菌。

对上述技术方案的进一步改进：所述解淀粉芽孢杆菌菌肥能显著提高辣椒苗的株高、茎粗和根干重。

对上述技术方案的进一步改进：所述解淀粉芽孢杆菌菌肥能显著提高辣椒果重与辣椒亩产。

与现有技术相比，本发明方法的优点和技术效果是：

1、本发明筛选到一株解淀粉芽孢杆菌HFJ-7，它属于芽孢杆菌，对高热、极酸、紫外线、电磁辐射和一些化学药品有着很强的耐受力，其胞外分泌液中含有蛋白酶、淀粉酶、脂酶等酶类及其他活性代谢产物，能分解利用环境中一些其他微生物难以分解的矿物质。

2、采用所述分离筛选的解淀粉芽孢杆菌制备的解淀粉芽孢杆菌菌肥具有促进辣椒生长的功效，所述解淀粉芽孢杆菌分离自辣椒根际土，应用于辣椒生产，具有较强的原位增强效应与仿生菌株效果。

3、本发明所述促进辣椒生长的解淀粉芽孢杆菌菌肥菌株，具有溶解有机磷、产生木聚糖酶、淀粉酶与蛋白酶等多种酶，还可显著提高辣椒生长性能指标，如株高、茎粗、根干重、辣椒果重、辣椒亩产等，其在农业生产中的应用效果也经多批试验得到验证。

4、解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌株具有较强的耐热特性，在喷雾干燥热处理环节的存活率高达98.73％。该菌的菌肥产品具有较强的保存稳定性，半年内存活率达96％，1年存活率达91％。将解淀粉芽孢杆菌HFJ-7制成菌肥，便于储藏运输，利于实现大规模生产，具有很好的应用前景。

5、本发明所述方法步骤简单合理，操作快捷，具有良好的工业化实施前景。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他优点将变得更加清楚。

附图说明

图1表明解淀粉芽孢杆菌HFJ-7对多种土传病害病原真菌的拮抗特性；

图2表明解淀粉芽孢杆菌HFJ-7具有溶解有机磷的特性；

图3表明解淀粉芽孢杆菌HFJ-7具有产生木聚糖酶的特性；

图4表明解淀粉芽孢杆菌HFJ-7具有产生淀粉酶与蛋白酶的特性，其中图4a为淀粉酶酶解平板，图4b为蛋白酶酶解平板；

图5表明腐熟有机物料复配载体的生产工艺流程；

图6表明解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉的生产工艺流程图；

图7表明淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌肥在1年内的保存稳定性。

图8表明盆栽体系下解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与枯草芽孢杆菌对比或组合对辣椒株高的影响；

图9表明盆栽体系下解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与枯草芽孢杆菌对比或组合对辣椒茎粗的影响；

图10表明盆栽体系下解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与枯草芽孢杆菌对比或组合对辣椒根干重的影响；

图11表明解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与对照组的辣椒盆栽与根系对比图；

具体实施方式

为更好地了解该解淀粉芽孢杆菌菌肥产品的功能，下面结合附图和具体实施例对本发明的产品引用特点做进一步详细的说明。

实施例1、解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的分离筛选与鉴定保藏

一、解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的分离筛选

2012年1月至2012年3月，从山东省潍坊市寿光市上口镇10家辣椒蔬菜大棚取30个辣椒根际土样本。土样分别充分研磨，于75℃水浴内加热处理20min，然后用无菌生理盐水中1000倍稀释，于营养琼脂NA平板上稀释涂布，挑取单菌落划线纯化，共筛选出68株纯菌，经镜检均为芽孢杆菌，其中包括菌株HFJ-7。

二、解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与其他菌株的病原真菌抗性能力比较

采用平板对峙的方法，以立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、根腐病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌、辣椒疫霉等土传病害病原真菌为靶标病原真菌，考察68株芽孢杆菌之间病原真菌拮抗特性的差异。先用打孔器获得6mm直径的病原菌菌块，接于PDA平板中央，在平皿四周，垂直据中心约3cm出，接种靶标菌菌线，长度约为1cm。考虑到不同病原真菌生长速度不同，立枯丝核菌预培养8h、尖孢镰刀菌、根腐病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌、辣椒疫霉病原菌预培养24h，然后每平皿接种4株待试菌株，28℃培养4d后，考察解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与其他芽孢杆菌相比，对多种土传病害病原真菌的拮抗特性。记录抑菌带宽度，即两种菌平行生长之间的无菌区域宽度。根据拮抗带的宽窄，选取对病原真菌有较强拮抗能力的菌株。

筛选结果显示，15株菌对立枯丝核菌有较强拮抗作用，13株菌对尖孢镰刀菌有较强拮抗作用，10株菌对根腐菌有较强拮抗作用，9株菌对黄瓜枯萎病病原菌有较强拮抗作用，7株菌对辣椒疫霉病原菌有较强拮抗作用。仅有4株菌同时对5种病原真菌靶标菌均具有拮抗作用，分别为：解淀粉芽孢杆菌HFJ-7、枯草芽孢杆菌G4和G11、地衣芽孢杆菌D2。

图1展示了解淀粉芽孢杆菌HFJ-7对多种土传病害病原真菌的拮抗特性，其中a-1图表示在解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的四面接种的拮抗下，病原真菌立枯丝核菌的生长受到明显抑制。a-2图表示，与枯草芽孢杆菌G4、地衣芽孢杆菌D5、侧孢芽孢杆菌M9相比，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7具有更强立枯丝核菌拮抗效果；b图表示与枯草芽孢杆菌G1、G11、地衣芽孢杆菌D2等相比，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7能更好地拮抗靶标病原菌-尖孢镰刀菌菌，且抑菌带宽度为6mm；c图表示与枯草芽孢杆菌G7、地衣芽孢杆菌D8相比，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7能更好地拮抗靶标病原菌-根腐病病原菌，且抑菌带宽度为5mm；d图表示与地衣芽孢杆菌D8相比，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7能更好地拮抗靶标病原菌-黄瓜枯萎病病原菌，且抑菌带宽度为8mm；e图表示与枯草芽孢杆菌G4相比，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7能更好地拮抗靶标病原菌-辣椒疫霉，且抑菌带宽度为6mm。

系列对比拮抗试验结果显示，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与枯草、地衣、侧孢等芽孢杆菌相比，可对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、根腐病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌、辣椒疫霉病原菌等多种土传病害病原真菌，产生明显的抑菌带，均大于等于5mm，其中对黄瓜枯萎病病原菌的抗性最强，抑菌带宽度高达8mm。

三、解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的生理理化与分子遗传学分类鉴定

分别采用生理生化法语分子遗传学方法，对解淀粉芽孢杆菌HFJ-7进行鉴定。

经细菌生理生化方法初步鉴定，菌株HFJ-7为芽孢杆菌属，其生物学特性：革兰氏染色阳性，在营养琼脂平板上形成的菌落直径约3-3.5mm，边缘不整齐，中间褶皱，淡黄色。菌体形态呈杆状，芽孢椭圆形，端生，尺寸为0.84×0.5μ2m。

接着采用分子遗传学方法，对菌株芽孢杆菌HFJ-7进一步分类鉴定。首先提取菌株HFJ-7的DNA，以该DNA为模板，16S rRNA通用引物为引物，对16S rRNA片段进行扩增，扩增片段进行序列测定。测序结果用Blast软件与GenBank中相关属种的16S rRNA序列进行比对，结果显示该菌株16S rRNA序列与GenBank基因库中芽孢杆菌属中的Bacillus pumilus的16s rRNA序列同源度最高，同源率达到99％。通过DNAMAN6.0对Genbank中已有的芽孢杆菌属的16S rRNA序列进行遗传进化分析，结果显示，菌株S316S rRNA与Bacillusamyloliquefaciens同源性最高，判定该菌株为芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌。

将筛选到的解淀粉芽孢杆菌HFJ-7进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2014年11月19日；解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens的保藏编号为CGMCC No.10011。

实施例2、解淀粉芽孢杆菌HFJ-7具有溶解有机磷的特性

在蛋黄培养基上测定解淀粉芽孢杆菌HFJ-7溶解有机磷的特性。蛋黄培养基配方：无菌条件下取鸡蛋蛋黄与等体积的0.9％的生理盐水混合均匀，制成蛋黄液；LB固体培养基加热融化，并冷却至45℃左右，100ml培养基中混入6ml的蛋黄，即为蛋黄培养基。点样法接种：用灭菌接种环点接解淀粉芽孢杆菌HFJ-7于蛋黄培养基上，于37℃恒温培养箱内，倒置培养24h。用直尺分别量取溶磷圈与菌落直径，并计算比值。

图2展示了解淀粉芽孢杆菌HFJ-7在蛋黄培养基上的溶磷特性，溶磷圈直径19.5mm，菌落直径12.0mm，溶磷圈比值1.625，结果表明解淀粉芽孢杆菌HFJ-7可在一定程度上溶解有机磷。近年来，由于磷肥类化肥、高磷养殖废弃物有机肥等的大量使用，土壤磷含量远超出正常值，但速效磷却需年年补充。在此背景下，具有溶磷解磷效果的微生物肥料，将会有广阔的应用前景。

实施例3、解淀粉芽孢杆菌HFJ-7具有产生木聚糖酶的特性

在木聚糖酶活性检测培养基上测定解淀粉芽孢杆菌HFJ-7产生木聚糖酶的能力，并与本实验室自主分离保存的解淀粉芽孢杆菌HFJ-2、枯草芽孢杆菌G4、枯草芽孢杆菌G7进行对比。木聚糖酶活性检测培养基：木聚糖酶底物桦木1％；酵母膏1％；PH调节至5.5；116℃灭菌30min。DNS显色剂，即3，5-二硝基水杨酸溶液配制方法如下：称取氢氧化钠10.4g，溶于130ml水中，加入3g 3，5-二硝基水杨酸(DNS)配制溶液A；称取酒石酸钾钠91g，溶于250ml水中，加2.5g重蒸苯酚和2.5g无水亚硫酸钠配制溶液B；将A、B溶液混合，移入500ml容量瓶中，加120ml水定容，充分混匀，贮存于棕色瓶中，室温暗处放置一周后使用。

点接4株芽孢杆菌于该培养基上，37℃培养48h；滴加DNS显色液，蔓延至全皿，观察并记录酶解圈与菌落直径大小，计算比值，以比较这4株菌产木聚糖酶的能力。图3展示了解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与其他三株菌在木聚糖酶活性检测培养基上的产酶特性，酶解比值记录如下表1：

表1.解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与其他3株菌在木聚糖酶活性检测培养基上的酶解比值

图3与表1表明，与枯草芽孢杆菌相比，解淀粉芽孢杆杆菌具有更强的产生木聚糖酶能力，其中解淀粉芽孢杆菌HFJ-7木聚糖酶酶解圈与菌落的直径比值可达4.89，更利于其对土壤中木质素、纤维素、半纤维素等营养物质的分解与利用。

实施例4、解淀粉芽孢杆菌HFJ-7具有产生淀粉酶与蛋白酶的特性

分别在淀粉酶与蛋白酶活性检测培养基上测定解淀粉芽孢杆菌HFJ-7产生淀粉酶与蛋白酶的能力，并与解淀粉芽孢杆菌HFJ-8、枯草芽孢杆菌G4与G7、地衣芽孢杆菌D2、侧孢芽孢杆菌M9等进行对比。

淀粉酶活性检测培养基：可溶性淀粉2g，蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠5g，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL，调节PH调节至7.2，121℃灭菌30min。卢哥氏碘液配制方法：碘片1g，碘化钾2g，加蒸馏水定容至250ml。试验过程如下：于90mm灭菌培养皿内分装培养基，每皿20mL，凝固后于37℃下恒温预培养24h，确定无污染方可使用。将90mm平皿分为6个扇形区域，每个区域正中心距离平皿中间点约30mm处，分别点接6株芽孢菌于该培养基上，37℃恒温培养箱内倒置培养培养24h，测定淀粉酶解圈大小。在平皿菌落周围滴加卢哥氏碘液，轻摇平皿，使碘液铺满培养基表明，等待片刻，若有水解圈说明此菌株具有产生淀粉酶活性，观察并记录酶解圈与菌落直径大小，计算比值，以比较这6株菌产淀粉酶的能力。

蛋白酶活性检测培养基：干酪素10g，酵母膏1g，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL，调节PH调节至7.3，116℃灭菌30min。酸性汞试剂配制方法：HgCl₂15g，浓盐酸20mL，加蒸馏水定容至100mL。试验过程如下：于90mm灭菌培养皿内分装培养基，每皿20mL，凝固后于37℃下恒温预培养24h，确定无污染方可使用。将90mm平皿分为6个扇形区域，每个区域正中心距离平皿中间点约30mm处，分别点接6株芽孢菌于该培养基上，37℃恒温培养箱内倒置培养培养24h，取出培养皿，在菌落周围滴加酸性汞试剂，放置10s，可产生蛋白酶的菌落周围会出现透明圈，观察并记录酶解圈与菌落直径大小，计算比值，以比较这6株菌产蛋白酶的能力。

图4展示了解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与其他5株菌在淀粉酶与蛋白酶活性检测培养基上的产酶特性，酶解比值记录如下表2：

表2.解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与其他5株菌在淀粉酶与蛋白酶活性检测培养基上的酶解比值

图4与表2表明，与枯草芽孢杆菌G4、G11，地衣芽孢杆菌D2侧孢芽孢杆菌M9相比，解淀粉芽孢杆杆菌具有更强的产生淀粉酶与蛋白酶能力(图4a和图4b所示)，其中解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的产酶能力最强，淀粉酶酶解圈与菌落的直径比值可达5.34，蛋白酶酶解圈与菌落的直径比值可达5.11，显著强于其他菌株，这将促进其对土壤中淀粉类碳源、蛋白类氮源的迅速利用，该特性也将有利于解淀粉芽孢杆菌HFJ-7液体发酵增殖培养与成本降低。

实施例5、促进辣椒生长的解淀粉芽孢杆菌菌肥的制备

本发明所述促进辣椒生长的解淀粉芽孢杆菌菌肥，是由解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉与载体复配而成，复配载体为腐熟有机物料。本发明所使用的腐熟有机物料为根源生物集团分公司潍坊根源生物科技有限公司提供，为市售商品化生物有机肥，主要是以鸡粪为主料，将主料鸡粪与辅料蘑菇棒等混合后，接种市售起到腐熟剂作用的普通腐熟剂，如强微99新系列发酵床复合菌，采用条垛式发酵工艺进行发酵，之后进行后熟与养分调配形成自主发酵产品。

腐熟有机物料复配载体的生产流程图如图5所示，具体为：鸡粪作为主要原料进场，水分一般为60％-70％之间，辅料多选用蘑菇棒、锯末等，以主料：辅料＝6:4的质量比进行原辅料混合，配合后水分含量介于50％-55％，堆积成长10米、高1米的条垛，采用条垛式发酵工艺进行发酵。一般发酵15d左右，发酵过程中，采用LYFP280专用翻抛机、每3天翻抛一次，然后进入后熟处理。后熟处理是为了使得有机物料更好地实现腐殖化，一般时间为冬季30d，夏季20d，之后进行摊开晾晒，保证水分低于15％，然后进行养分调配，保证有机质含量超过53％，氮、磷、钾三者相加不低于10％，然后进行筛选与质检，合格产品才能包装入库或进入其他产品生产程序。

本发明所述解淀粉芽孢杆菌菌粉是由自主分离筛选的菌株，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7发酵后喷雾而成，其生产工艺流程图如图6所示。

所述解淀粉芽孢杆菌菌肥的制备方法包括以下步骤：

(1)种子罐培养

将不低于99％孢子率的解淀粉芽孢杆菌HFJ-7一级种子，接种到装有种子培养基的灭菌种子罐中，37℃培养10h，形成大量营养体，作为二级种子培养液。所述种子培养基组分包括(g/L)：糖蜜，24.5～25.0；蛋白胨，13.5～13.7；磷酸二氢钾，1.7～1.8；柠檬酸钠，1.5～1.6；硝酸铵，1.5～1.6；硫酸镁，0.5～0.52；调节起始pH至7.2。种子罐体积为500L，培养基定容至300L，实消条件：恒温121℃保持30min；培养条件：恒温37℃+1℃，罐压0.05Mpa，转速0-6h 130rpm、6-10h 160rpm；通风量0-6h 5.1m³/h、6-10h 8.8m³/h。

(2)发酵罐培养

将种子罐中种子培养液转接至装有发酵培养基的30吨生产罐进行发酵培养，37℃培养24h，当孢子率超过95％时，停罐，获得发酵液；所述发酵培养基组成(g/L)：豆粕粉，25.0；玉米浆干粉，18.5；氯化钠，4.0；磷酸二氢钠，2.8；磷酸氢二钾，1.2；氯化镁，0.55；硫酸锰，0.15；中性蛋白酶，2.0；糖化酶，1.5；消泡剂，1.3；用50％氢氧化钠流加，调节起始pH至7.4；种子罐体积为30000L，培养基定容至21000L，实消条件：恒温116℃保持30min；培养条件：恒温37℃+1℃，罐压0.05Mpa，转速0-10h 140rpm、10-18h 180rpm、18-24h160rpm；通风量0-10h 165m³/h、10-18h 215m³/h、18-24h 180m³/h。所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7发酵液在放罐时的菌量一般达到450×10⁸CFU/g～500×10⁸CFU/g。

(3)将发酵液与载体混合进行后处理与筛分质检，获得合格的解淀粉芽孢杆菌菌菌粉。

所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7后处理过程：喷雾干燥塔，LPG-6000型，进风145℃-150℃，出风65℃-70℃，载体为轻质碳酸钙，添加载体占发酵液的质量比例为：10％-15％。所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7筛分与质检过程：超过90％菌粉均过80目筛，并参考国标GBT26428-2010饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测，测定解淀粉芽孢杆菌菌量，质检合格，制备为解淀粉芽孢杆菌菌粉。所述解淀粉芽孢杆菌HJF-7菌粉中含菌量范围2000×10⁸～2200×10⁸CFU/g。

(4)按质量比1:750--1:800比例将所述解淀粉芽孢杆菌HJF-7菌粉添加到腐熟有机物料载体中，采用SLHSJ双轴桨叶式高效混合机，混合12min～15min，保证均匀度，最终控制菌肥中解淀粉芽孢杆菌菌量不低于2.4×10⁸CFU/g。

实施例6、解淀粉芽孢杆菌HFJ-7具有较强耐热特性

解淀粉芽孢杆菌菌粉生产过程，需通过喷雾干燥法将发酵液制备为菌粉。以轻质碳酸钙为载体，将解淀粉芽孢杆菌发酵液与载体混合物放入塔内，进风150℃，出风65℃，维持1.5s。参考国标GB/T 6435-2006饲料中水分和其他挥发性物质含量的测定，测定喷雾干燥前后物料的水分；参考国标GBT 26428-2010饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测，测定测定喷雾干燥前后物料的解淀粉芽孢杆菌菌量。根据水分与菌量测定值，折合为干级菌量(亿/g)，并计算喷雾干燥过程解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的存活率，以考察其耐热特性。

表3.解淀粉芽孢杆菌HFJ-7不同生产批次在喷雾干燥过程中的存活率

解淀粉芽孢杆菌HFJ-7作为芽孢杆菌，产品以孢子状态存在，具有较好的热耐受性，多批次结果显示，喷雾干燥后期存活率均值为98.73％，生产效率较高。

实施例7、促进辣椒生长的解淀粉芽孢杆菌菌肥的保藏稳定性

解淀粉芽孢杆菌菌粉与腐熟有机物料组合，稀释菌量至2.4×10⁸CFU/g左右，按照国标GB20287-2006农用微生物菌剂，制备成微生物菌肥。参考国标GB/T 6435-2006饲料中水分和其他挥发性物质含量的测定，测定菌肥水分；参考国标GBT 26428-2010饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测，测定菌肥中解淀粉芽孢杆菌菌量。根据水分与菌量测定值，折合为干级菌量(×10⁸CFU/g)。在室温下保存，每2个月测定解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的干级菌量，跟踪1年，以考察其稳定性。

图7显示了淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌肥在1年内的保存稳定性，结果显示该菌具有较好的保存稳定性，半年内存活率达96％，1年存活率达91％，均达到国家关于菌肥的菌量标准。

实施例8、促进辣椒生长的解淀粉芽孢杆菌菌肥在盆栽体系下的促生长效果验证

在平度市海峡两岸合作区龙力生物蔬菜大棚进行不同菌肥处理下的辣椒苗盆栽试验，试验时间：2013年1月11日--2013年3月11日。试验用盆钵为18cm×20cm的聚乙烯塑料盆，每盆装风干土1.5kg。统一按照10g/盆剂量施用有机肥，按照0.5g/盆剂量、不同处理组施用菌肥，试验分组见表4。每个处理组设定20个花盆，每盆种植1棵辣椒，日常浇水、温控、换位置等步骤按照温室常规管理。试验结束，统计根干重、茎粗等指标。从与根相接的茎基部到最高生长点，采用直尺，测定株高；采用MC 0-200mm游标卡尺，测定茎粗。取根部，105℃杀青2h，60℃烘干12h至重，采用AL104万分之一天平，测定根干重。

表4.盆栽体系下不同菌肥对辣椒生长影响的试验分组

图8展示了盆栽体系下解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与枯草芽孢杆菌对比或组合对辣椒株高的影响。与单用腐熟有机物料对照组相比，枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、两菌复配，该三个加菌组可极其显著促进植株伸长(p<0.01)，其中解淀粉芽孢杆菌组略强于其他，但三者无显著差异(p>0.05)。

图9展示了盆栽体系下解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与枯草芽孢杆菌对比或组合对辣椒茎粗的影响。与单用腐熟物料相比，解淀粉芽孢杆菌、两菌复配，该两组可显著增加茎粗(p<0.05)，其中两菌复配组略强，两者间无显著差异(p>0.05)；枯草芽孢杆菌组茎粗也略高于对照组，但未达到显著差异水平(p>0.05)。

图10展示了盆栽体系下解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与枯草芽孢杆菌对比或组合对辣椒根干重的影响；图11展示了解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与对照组的辣椒盆栽与根系对比图。与单用腐熟物料相比，解淀粉芽孢杆菌可显著促进根干重增加(p<0.05)，两菌复配与枯草芽孢杆菌组也可略微促进根干重增加，但均未达到显著性差异水平(p>0.05)。

由此可见，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7对辣椒苗的促生长作用，主要表现在提高株高、增加茎粗、增加根干重等指标上。地上部分增加，可增强植株光合作用，促进养分的由上向下累积；地下部分的增强，可促进根系发展与延伸，进而有利于对土壤中养分的吸收与利用。

实施例9、促进辣椒生长的解淀粉芽孢杆菌菌肥在日光温室内的促生长效果验证

在寿光稻田镇田苑果菜生产有限公司种植基地日光温室，进行不同菌肥处理的大棚蔬菜试验，选用大羊角椒作为试验对象，试验时间：2013年12月-2014年5月，在寿光稻田镇田苑果菜生产有限公司种植基地日光温室内进行。统一按照1吨/亩剂量施用有机肥，按照50公斤/亩剂量、不同处理组施用菌肥，其中：对照组不使用菌肥，试验组-1使用枯草芽孢杆菌菌肥，试验组-2使用解淀粉芽孢杆菌菌肥。每个处理组3个日光温室，每个温室占地1.2亩，日常光照、水分、温度控制等管理按照温室常规方式进行。试验结束，统计辣椒果重与辣椒亩产。

表5.日光温室内不同菌肥对辣椒果重与亩产的影响

表5展示了日光温室内不同菌肥对辣椒果重与亩产的影响，其中解淀粉芽孢杆菌增产效果比较显著。与不使用菌肥的对照组相比，使用枯草芽孢杆菌菌肥的试验组-1，辣椒果重与辣椒亩产都显著增加，达显著差异水平(p<0.05)。与枯草芽孢杆菌菌肥相比，使用解淀粉芽孢杆菌菌肥，辣椒果重有增加趋势，但二者无显著差异(p>0.05)；辣椒亩产显著增加(p<0.05)，增幅超过6％。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (4)

1.含有解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的解淀粉芽孢杆菌菌肥，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌菌肥包括解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉和复配载体，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7在菌肥中的含菌量不低于2.4×10⁸ CFU/g；

所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的分类命名为解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.10011；所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7革兰氏染色阳性，在营养琼脂平板上形成的菌落直径3-3.5mm，边缘不整齐，中间褶皱，淡黄色；菌体形态呈杆状；芽孢椭圆形，端生，尺寸为0.84×0.52μm；

所述的解淀粉芽孢杆菌菌肥的制备方法包括以下步骤：

（1）将解淀粉芽孢杆菌HFJ-7接种到装有灭菌的种子培养基的种子罐中，37℃培养10h，形成种子培养液，所述种子培养基组分包括：糖蜜，24.5~25.0 g/L；蛋白胨，13.5~13.7 g/L；磷酸二氢钾，1.7~1.8 g/L；柠檬酸钠，1.5~1.6 g/L；硝酸铵，1.5~1.6 g/L；硫酸镁，0.5~0.52 g/L；调节起始pH 至7.2；

（2）将所述种子培养液转接至装有发酵培养基的生产罐进行发酵培养，37℃培养24h，当孢子率超过95%时，停罐，获得发酵液，所述发酵培养基组成包括：豆粕粉，25.0~25.5 g/L；玉米浆干粉，18.5~19.4 g/L；氯化钠，4.0~4.2 g/L；磷酸二氢钠，2.8~2.9 g/L；磷酸氢二钾，1.2~1.3 g/L；氯化镁，0.55~0.58 g/L；硫酸锰，0.15~0.16 g/L；中性蛋白酶，2.0~2.1g/L；糖化酶，1.5~1.6 g/L；消泡剂，1.3~1.4g/L；调节起始pH 至 7.4，所述发酵液中解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的菌量达到450×10⁸ CFU/g~500×10⁸ CFU/g；

（3）将所述发酵液添加载体后进行喷雾干燥，获得含菌量为2000×10⁸ ~2200×10⁸CFU/g的解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉，所述载体为轻质碳酸钙，添加载体的量占所述发酵液的质量比为10%-15%；

（4）按菌粉与复配载体质量比1:750--1:800比例将所述解淀粉芽孢杆菌HJF-7菌粉添加到复配载体中，混合保证均匀，最终控制菌肥中解淀粉芽孢杆菌含菌量不低于2.4×10⁸CFU/g；

所述步骤（3）喷雾干燥的进风温度145℃-150℃，出风温度65℃-70℃；

所述步骤（4）中的复配载体制备过程如下：鸡粪作为主要原料进场，水分为60%-70%之间，辅料选用蘑菇棒、锯末，以主料：辅料=6:4的质量比进行原辅料混合，配合后水分含量介于50%-55%，堆积成长10米、高1米的条垛，采用条垛式发酵工艺进行发酵；发酵15d，发酵过程中，采用翻抛机每3天翻抛一次，然后进入后熟处理；后熟处理时间为冬季30d，夏季20d，之后进行摊开晾晒，保证水分低于15%，然后进行养分调配，保证有机质含量超过53%，氮、磷、钾三者相加不低于10%，然后进行筛选与质检得到复配载体。

2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌肥在制备促进辣椒生长的肥料中的应用，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌能拮抗立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、根腐病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌和辣椒疫霉病原菌。

3.根据权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌菌肥在制备促进辣椒生长的肥料中的应用，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌菌肥能显著提高辣椒苗的株高、茎粗和根干重。

4.根据权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌菌肥在制备促进辣椒生长的肥料中的应用，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌菌肥能显著提高辣椒果重与辣椒亩产。